黄精多糖对肝癌H22移植瘤小鼠的抑瘤作用及机制研究.pdf

《黄精多糖对肝癌H22移植瘤小鼠的抑瘤作用及机制研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

中药新药与临床药理2014年1月第25卷第1期·5·黄精多糖对肝癌H移植瘤小鼠的抑瘤作用及机制研究段华，王保奇，张跃文2(1．南阳市中心医院药剂科，河南南阳475000；2．河南中医学院药学院，河南郑州450046)摘要：目的研究黄精多糖对H盟移植瘤小鼠的抑瘤作用，并探讨其作用机制。方法建立H丝移植瘤小鼠模型。将模型小鼠随机分为5组：模型组，环磷酰胺组(20mg·)，黄精多糖高、中、低剂量组(400，200，100mg·kg--)，连续灌胃给药10d。测定瘤体质量，计算抑瘤率。新鲜瘤组织制备单细胞悬液，流式细胞术分析细胞周期分布，酶联免疫吸附法(ELISA)检测瘤组织中Caspase一3，8，9活性。结果黄精多糖各剂量组均能显著抑制肿瘤生长，高剂量组抑瘤率为54．5％，其作用接近环磷酰胺组(57．7％)。黄精多糖各剂量组能显著提高肿瘤组织中Caspase-3，8，9活性，与模型组比较差异有统计学意义(P<0．01)。黄精多糖中、高剂量组可显著增加G0／G期细胞(尸<0．05)，减少G2／M期细胞(P<0．01)，高剂量组还可减少S期细胞(Jp<0．05)。结论黄精多糖对肝癌H丝移植瘤小鼠具有显著的抑瘤作用，其作用机制可能是通过影响细胞周期分布，将肿瘤细胞阻滞于G0／G期，抑制细胞增殖，并通过激活Caspase系统诱导肿瘤细胞凋亡。关键词：黄精多糖；H细胞株；细胞凋亡；细胞周期中图分类号：R285．5文献标志码：A文章编号：1003—9783(2014)01—0005—03doi：10．3969~．issn．1003—9783．2014．01．002Anti—tumorEffectsandMechanismofRhizomaPolygonatiPOlysaccharideonH22TumorBearingMiceDUANHua，WANGBaoqi．ZHANGYuewen(1．DepartmentofPharmacy，NanyangCentralHospital，Nanyang475000Henan，China；2．CollegeofPharmacy，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046Henan，China)Abstract：ObjectiveToinvestigatetheanti-tumoreffectsofRhizomaPolygonatipolysaccharide(RPP)onH22tumorbearingmiceandtoexploreitsmechanisms．MethodsH22tumorbearingmicemodelwasestablishedandthemodelmiceweredividedinto5groups，modelgroup，cycl0phosphamide(CTX)group(20mg。kg)，andhigh一，middle—andlow—dose(400，200，100mg。kg一)RPPgroups．Afteroraladministrationforsuccessive10days，allmicewerekilled．andthetumortissuewasdissectedandweighted．Thetumorinhibitionratewascalculated．Thecellcyclewasdeterminedbyflowcytometry，andtheactivityofCaspase一3，8，9wasdetectedbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)．ResultsAlldosesofRPPsignificantlyinhibitedthetumorgrowth，andthetumorinhibitionrateinhigh—doseRPPwas54．5％，closeto57．7％intheCTXgroup．Moreover，RPPsignificantlyenhancedtheactivityofcaspase一3，8。9inthetumortissue(P<0．01comparedwiththatinthemodelgroup)．TheratioofGdG1cellswassignificantlyincreased(P<0．05)，andtheratioofGJMcellswassignificantlyreducedinmiddle-andhigh—doseRPPgroupsascomparedwiththecontrolgroup(P<0．01)．Furthermore．400mg。kg—RPPalsoreducedtheSphasecellscount(P<0．05)．ConclusionRPPhasobviousanti—tumoreffectonH22tumorbearingmice．Themechanismmayberelatedtoregulatingthecellcycledistribution，arrestingthetumorcellinG【／G1phase，inhibitingthecellproliferationandactivatingthecaspasesystemtoinduceapoptosis．Keywords：RhizomaPolygonatiPolysaccharide；H22cellline；Apoptosis；Cellcycle收稿日期：2013-06—20作者简介：段华，女，主管药师，研究方向：临床药学。Email：Dh76111l@sina．con。通讯作者：王保奇，副教授，博士研究生，研究方向：中药药理学。Email：wangbqi@126．com。 。6’TraditionalChineseDrugResearch&ClinicalPharmacology，2014January，Vo1．25No．1黄精是多年生草本姜形黄精的干燥根茎，具有补疫吸附法(ELISA)试剂盒测定Caspase一3，8，9活性。气养阴、健脾润肺益肾之功效。黄精多糖是黄精的主1．8细胞周期的测定[61瘤组织剪碎并研磨，采用200要活性成分，具有降血糖、降血脂、免疫调节等作目过滤网过滤后制成单细胞悬液。PBS漂洗，1000g用[。近年来，黄精多糖抗肿瘤研究日益增多，江离心后弃上清。细胞重悬于预冷的75％乙醇中，置华等『3_发现黄精多糖能明显抑制Heps和Eac移植瘤。于一20℃下固定24h。常规PI染色后，采用流式细张峰等发现黄精多糖对H实体瘤和S踟腹水瘤小鼠胞术检测细胞周期分布。具有显著的抗肿瘤作用，但具体作用机制均未见报1．9统计学处理方法实验数据以均数±标准差(±s)道。本研究以肝癌H丑移植瘤小鼠为模型，观察黄精表示，采用SPSS18．0统计软件，用单因素方差分析多糖的体内抑瘤作用，并探讨其作用机制。方法进行统计分析。以P<0．05为差异有统计学意义。l材料与方法2结果1．1细胞及试剂小鼠H细胞株由上海药物研究所2．1黄精多糖的抑瘤作用黄精多糖低、中、高剂量提供。黄精购自郑州市张仲景大药房，经河南中医组的瘤体质量均显著低于模型组(P<0．05，P<0．01)，学院生药学科董诚明教授鉴定为多年生草本姜形黄抑瘤率分别为29．3％、39．8％和54．5％，表明黄精精(PolygonatumcyrtonemaHua)。环磷酰胺(CTX)，多糖的抑瘤作用呈剂量依赖l生，其中高剂量黄精多糖上海华联制药有限公司，批号：120706；Caspase一的抑瘤率与CTX接近，见表1。3，8，9活性检测试剂盒，深圳晶美生物工程有限公表1黄精多糖对H移植瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=lO)司，批号：20130407。碘化丙啶(PI)，上海生工生物Table1Theanti-tumoreffectsofRhizomaPolygonatipolysac—技术有限公司，批号：130109。eharideOilH22tumorbearingmice1．2动物清洁级ICR小鼠，雌雄各半，8周龄，体质量18～22g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)一2007—0001。1．3黄精多糖的制备称取干燥黄精1kg，烘干粉碎后按1：10加水煎煮2次，第1次1h，第2次30min，合并滤液。3000r·min离心10min，取出上清注：与模型组比较，<0．05，P<0．O1。液。浓缩后真空干燥，得黄精粗多糖。经葸酮一硫酸比色法检测，多糖含量为l7．2％。2．2黄精多糖对Caspase一3，8，9活性的影响与模1．4H移植瘤小鼠模型的建立取腹腔接种H细胞型组比较，黄精多糖各剂量组、CTX组Caspase一6～7d的肝癌H丝小鼠，无菌条件下抽取腹腔积液，3，8，9活性均显著升高，差异有统计学意义(P<采用无血清培养基混匀制成单细胞悬液，调整细胞浓0．01)，表明黄精多糖可提高Caspase系统活性，见度至1xl0mL～。取0．2mL细胞液，接种于ICR小表2。鼠右前肢腋窝皮下，制备H：移植瘤小鼠模型l5】。1．5分组及给药接种24h后，将模型小鼠随机分表2黄精多糖对H移植瘤组织中Caspase一3，8，9活性的影响(±s，U·mg～，n=lO)为5组(n=lO)：模型组，CTX组，黄精多糖低、中、Table2EffectsofRhizomaPolygonatipolysaccharideon高剂量组。其中黄精多糖低、中、高剂量分别为Caspase一3，8，9activityinH22tumortissueofthebearingmice100，200，400mg·kg-I，CTX剂量为20mg·kg-，均灌胃给药，连续10d，模型组灌胃等体积生理盐水。1．6对H移植瘤的抑制作用停药24h后处死小鼠并分离肿瘤组织，称瘤体质量，计算抑瘤率。将新鲜肿瘤组织分为2份，分别用于测定Caspase活性和细胞周期分布。注：模型组比较，<0．01。1．7Caspase一3，8，9活性的测定肿瘤组织按1：10加入裂解液，匀浆后12000g离心20min，取上2．3黄精多糖对肿瘤细胞周期分布的影响与模型组清液。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，采用酶联免比较，黄精多糖中、高剂量组GJG期细胞显著增加 中药新药与临床药理2014年1月第25卷第1期·7·(P<0．05)，高剂量组s期细胞显著减少(P<0．05)，一致，表明CTX可将肿瘤细胞阻滞于有丝分裂后期。低、中、高剂量组G2／M期细胞显著减少(P<0．0l，这也提示了黄精多糖和CTX抗肿瘤机制的不同。P<0．05)。CTX组Go／G期细胞显著减少(P<0．01)，Caspases家族的蛋白水解功能是细胞凋亡机制中而增加G2／M期细胞(P<0．01)。表明黄精多糖可改变的核心。Caspase蛋白可分为两类：一类是位于上游肿瘤细胞周期分布，但与CTX对肿瘤细胞周期的影的引发者，如Caspase一8，9，10；另一类是位于下游响有不同，见表3。的执行者，如Caspase一3，6，7。细胞凋亡中最关键的步骤是Caspase一3的激活[91，其中Caspase一8和表3黄精多糖对H移植瘤小鼠肿瘤细胞周期的影响(-+S，Caspase-9是Caspase一3的重要上游激活因子。％．n=10)Table3EffectsofRhizomaPolygonatipolysaccharideOilcellcycleCaspase一8可通过死亡受体途径激活Caspase一3，而0fH22tumorbeanngmiceCaspase一9可通过线粒体途径活化Caspase一3。活化后的Caspase～3可诱导肿瘤细胞凋亡[10-11l。本研究结果表明，黄精多糖可显著提高Caspase一3，8，9的活性，进而促进细胞凋亡。提示黄精多糖诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与激活线粒体和死亡受体途径，导致caspase家族的级联效应，最终活化Caspase一3有关。注：与模型组比较，