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时间:2020-07-05
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1、甲胎蛋白异质体甲胎蛋白异质体(VariantsofAFPormolecularheterogeneticofAFP)是一种单链糖蛋白,含糖量约为4%左右。不同组织细胞合成的AFP,其糖链结构有所不同,对植物凝集素的结合能力也不相同,此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体,也称为AFP分子异质体。近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。有资料表明,AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP分为4种亚型;用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP可分为分子量72kD和kD
2、两种成分;等电聚焦结合交叉免疫电泳可使胎儿AFP分成10种等电点不同的异质体。这表明AFP异质体存在着电泳不无一性,这与其一级结构差异有关。其C-末端结构基本相同,N末端至少有3种不同结构,这能否产生AFP电泳异质性有待于证实。AFP结构中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖和唾液酸,并以寡糖单位的形式组成。AFP异质体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同,刀豆素A(ConA)结合型和非结合型AFP异质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无-GLcNAc-Gal-NeuNAc结构。对人肝癌AFP糖链结构电泳研究发现,其寡糖分为中性(N
3、)、酸性(A1,A2)三种成分。进一步研究证实N两分支末端均由半乳糖组成,A1两分支末端分别为半乳糖和N-乙酰神经氨酸,A2则均为N-乙酰神经氨酸。卵黄囊肿瘤的AFP其ConA亲和性组占50%左右,肝癌腹水中与LCA结合的AFP糖链中具有与Asn连接的N-乙酰基葡萄糖胺残基,而在非结合型异质体的糖链中无此成分。根据AFP与外源性凝集素(Lectin)结合能力的差异,可分为不同的变异体。采用扁豆凝集素(LCA)/刀豆素A亲和电泳或层析技术能将AFP分为LCA/ConA非结合型AFP(AFP-N-L/AFP-N-C)和LCA/ConA结合型AFP(
4、AFP-R-L/AFP-R-C)两种。新的Lectin的应用,使AFP在糖链结构上异质体达9种之多。AFP异质体的命名方法为:从阴极开始在LCA亲和电泳上AFP的条带依次为L1、L2、L3;在E-PHA亲和电泳上AFP的条带依次为P1、P2、P3、P4、P5;用ConA时按AFPC1、C2命名;alloA时按AFPA1、A2、A3命名。AFPL2、L3完全不能分离,存在中间成分时按AFPL2、L3命名,AFPP4、P5分离不充分时命名为AFP-P4+AFP-P5。因此,AFP对不同的Lectin反应所表现的异质体不同,故可用于疾病的鉴别诊断。A
5、FP异质体亲和交叉免疫电泳检测法【原理】根据AFP对刀豆素(ConA)或小扁豆凝集素(LCA)结合能力的不同,可区别原发性肝细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP升高,提高AFP对肝癌的诊断价值。此法原理是将检样于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳,与LCA结合型AFP在电泳时被阻留,而非结合型AFP则向阳极侧泳动。然后,与首次电泳的方向垂直,在含抗AFP的琼脂糖胶中作第二次电泳。此时被首次电泳分离的AFP异质体,将分别于含抗AFP的凝胶板中形成沉淀峰,根据峰的大小即可了解结合型或非结合型AFP所占的比例。【试剂】1.小扁豆凝集素(LCA)。2.抗AFP血清
6、:同ELISA法。3.10.0g/L琼脂糖:琼脂糖1.0g加0.25mol/LpH8.6巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶,加入NaN3使达1.0g/L,按需要量分装后密塞,4℃保存。4.125I-AFP。 【试剂】 1.小扁豆凝集素(LCA)。 2.抗AFP血清:同ELISA法。 3.10.0g/L琼脂糖:琼脂糖1.0g加0.25mol/LpH8.6巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶,加入NaN3使达1.0g/L,按需要量分装后密塞,4℃保存。 4.125I-AFP。 【操作】 1.将10.0g/L琼脂糖融化后,在6cm×1
7、2cm洁净玻板之一侧浇注2cm×12cm(厚1.6cm)凝胶条(约需3.84ml凝胶液),凝固后于距内缘2~3mm处切割一0.5cm×10cm的槽。 2.用巴比妥缓冲液将LCA稀释成2mg/ml(-20℃可保存1个月),取80μl加入冷至56℃的已融化琼脂糖凝胶1ml中,混匀后浇注于上述槽中。待凝固后,于此胶条上距阴极端0.5cm处打一直径0.2~0.3cm的孔,距此孔4.5cm处打第二个孔(第二份检样)。 3.两孔内各加一份待测血清,加样量5~10μl。以1.0g/L溴酚蓝为指示剂,10V/cm稳压电泳,至白蛋白泳出4cm时关闭电源。4.
8、将抗AFP血清按效价与融化并冷至56℃的琼脂糖胶液混合(琼脂糖最终浓度为9.0g/L,抗AFP达最适浓度),并浇注玻板的其余部分(4cm×12cm),
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