蛋白质分离纯化技术课件.ppt

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1、第八章蛋白质分离纯化技术①溶解度不同②分子大小不同③带电荷的性质不同④物理吸附性质不同⑤生物学的亲和性不同第一节利用溶解度差别的分离方法一、溶液pH值的影响当溶液的pH值与蛋白质的等电点相同时，蛋白质分子呈现出电中性，分子间无斥力作用，易于积聚和沉淀，蛋白质的溶解度最小不同的蛋白质由不同的氨基酸组成，因此其等电点也不同达到粗分蛋白质组分的目的二、某些蛋白质沉淀剂的作用有些离子型的表面活性剂，可以通过改变蛋白质带电性质使其沉淀下来三、溶液中盐离子浓度的影响盐离子对蛋白质溶解度的影响随其浓度不同而不同加入中性盐使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶作用盐浓度增大，

2、盐离子可与蛋白质离子竞争溶液中的水分子，从而降低了蛋白质分子的水合程度。失去水化层的裸露的蛋白质分子易于积聚而沉淀，此现象称为盐析不同的蛋白质分子发生盐析所要求的盐离子的浓度不同，因此可以通过在蛋白质溶液中加入不同量的中性盐，使要分离的蛋白质与杂质分离开来常用做盐析的中性盐是硫酸铵硫酸铵分级沉淀法四、溶剂极性的影响加入有机溶剂沉淀蛋白质是粗提蛋白质常用的方法之一，但应用时一定要注意控制温度，因温度较高时蛋白质分子易变性五、温度的影响蛋白质的溶解度随温度的升高而增加六、分配层析分配层析的原理是每种物质在不同的溶剂相中的溶解度不同。当物质在两溶剂相中达到溶解

3、平衡时，其在两相间的溶解浓度的比为一常数，此常数为分配系数不同的蛋白质在同样的两种溶剂中的分配系数不同分配系数相差越大，分离效果愈好，且抽提的次数愈少第二节利用分子大小不同的分离纯化方法一、透析透析是利用蛋白质分子比较大，不能穿过半透膜的性质设计的。在透析过程中，大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内。小分子的物质可以自由进出透析袋，利用透析袋还可浓缩蛋白质稀溶液。浓缩蛋白质稀溶液时透析液采用高浓度的高分子惰性物质(如PEG4000等)二、超过滤：利用压力使样品溶液通过半透膜(超滤膜)三、离心分离根据物质不同的分子、大小、形状和质量，在离心场中表现

4、出不同的行为而达到相互分离的目的沉降速度法主要用于分离沉降系数不同的物质。这种方法采用差速离心，即逐步分级加大离心力。沉降平衡法用于分离密度不同的物质。在离心管中造成一个密度环境，分离物在离心力的作用下，便各自停留在与其密度相同的区域而达到分离目的四、凝胶过滤第三节根据蛋白质分子带电性质不同的分离方法一、电泳携带电荷的性质向不同的电极方向以不同的速度移动而得以互相分离二、离子交换层析第四节利用蛋白质吸附性质不同的分离方法第五节利用蛋白质的特异性配体分离方法——亲和层析血清γ－球蛋白的分离、纯化及鉴定(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。(二)了解柱层析

5、技术。蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。一、粗提（盐析法）盐析的定义。常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠等，由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清中含有清蛋白和球蛋白。用半饱和的(NH４)２SO４盐析可使球蛋白沉淀，而清蛋白仍留在溶液中，经离心而分离。原因：一、清蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5

6、.1，γ球蛋白等电点是7.1。二、清蛋白的分子量远小于球蛋白二、脱盐（凝胶层析法）盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各分子的扩散移动速度不同，使混合物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合成凝胶。DEAE纤维素是一种阴离子交换剂。因球蛋白中α及β球蛋白的pI＜6.3而γ球蛋白的pI＞6.3(pI7.3)在pH6.3缓冲液中为正离子而不与DEAE纤维素进行交换结合，直接从层析柱流

7、出。故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分蛋白质为纯化的γ球蛋白。三、纯化（离子交换法）被柱层析交换结合的α及β球蛋白可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱液的pH值(也可两者同时改变)，使其部分洗脱下来而被纯化纯化前后的γ球蛋白用电泳法进行鉴定。操作一、盐析<1>取血清1ml，<2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。<3>混匀后于室温中放置10分钟。<4>3000rpm离心10分钟，并小心吸去上清<5>沉淀加pH6.5缓冲液0.5ml，使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。二、G－25凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶G－25层析柱的制备：

8、1、取层析柱，关紧下端出口加蒸馏水少许。2、缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，预先经