蛋白质的分离纯化ppt课件.ppt

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1、蛋白质的理化性质及分离纯化第一节蛋白质的理化性质第二节蛋白质的分离纯化第三节蛋白质的分子量测定第四节蛋白质的含量测定与纯度鉴定第一节蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的胶体性质和沉淀一、蛋白质的酸碱性质在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。没有其他盐类干扰时,蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点。蛋白质等电点：蛋白质等离子点：二、蛋白质的紫外吸收性质蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主

2、要是由带芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力的强弱顺序为：色（Trp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）三、蛋白质的胶体性质和沉淀蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）。蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及不能通过半透膜。半透膜：多是由用赛咯吩（cellophane）制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。（一）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的沉淀蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变,破坏了蛋白质的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀

3、出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。沉淀蛋白质的方法有以下几种:中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法.盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如：硫酸铵,硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。1.中性盐沉淀法（盐析法）注意：盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后,蛋白质又可溶解。2.有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(如甲醇,乙醇或丙酮等)引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质

4、点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点（pI）时,蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)结合成不溶性盐而沉淀。应用：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救,然后再服用催吐剂排出体外。4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：如：鞣酸（单宁酸,tannicacid)钨酸(tungsticacid，H2WO4)、苦味酸(picricacid)即2,4,6-三硝基酚,碘化钾等。某些酸类:三氯醋酸,磺基水杨酸（sulfosalic

5、ylicacid）和硝酸等.当pH

6、质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。蛋白质变性后的特性：生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变五、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应反应名称试剂颜　色反应有关基团双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键酚试剂反应碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基第二节　蛋白质的分离纯化一、蛋白质分离纯化的一般步骤1.蛋白质样品的前处理2.蛋白质粗提液的粗分级分离3.浓缩蛋白质的细分级分离4.蛋白质的结晶二、蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。分子大小溶解度电荷

7、吸附性质对配体分子的生物学亲和力（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法主要方法：1：透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）透析流程透析装置超过滤装置使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。装好具备密度梯度的介质溶液离心收集分离后的各组分加入：混和蛋白质样品离心装置2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。

8、凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合