高分子量小麦谷蛋白亚基.ppt

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1、实验一小麦高分子量谷蛋白亚基测定10/5/20211●实验内容：测定小麦高分子量谷蛋白亚基●实验目的:①掌握利用不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）方法；②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法；③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱。10/5/20212小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目前分离小麦HMW-GS的

2、主要方法，此方法具有准确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤其是可以分析半粒无胚籽粒的HMW-GS组成，所剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选的重要方法。10/5/20213●实验原理：小麦高分子量谷蛋白亚基不连续SDS-PAGE系统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分子量大小分离开来。以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就可以对待测小麦品种的HMW-GS组成进行鉴定。10/5/20214①电荷效应各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定的速

3、度泳动。迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子的形状等因素。10/5/20215②分子筛效应由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛分能力即分子筛效应。③浓缩效应蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。10/5/20216●实验材料、药品和器材实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。实验药品：丙

4、烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、甘油、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝等。10/5/20217试剂配制：①麦谷蛋白提取液：4gSDS+1gDTT+250ml0.5MTris-HCl(PH=6.8)+20ml甘油+30mg溴酚蓝+蒸馏水定溶至100ml。②10×电极缓冲液：Tris-HCI30.3g+甘氨酸144g+SDS10g+蒸馏水定溶至1000ml。③30%丙烯酰胺：30g+蒸馏水定溶至100ml。④2%甲叉双丙烯酰胺：2g+蒸馏水定溶至100ml。10/5/20218⑤1MTris-HCI（PH=6.8）:

5、12.1gTris+蒸馏水定溶至100ml,用1NHCI调PH=6.8。⑥3MTris-HCI（PH=8.8）:36.3gTris+蒸馏水定溶至100ml,用1MHCI调PH=8.8。⑦10%SDS：SDS10g+蒸馏水定溶至100ml。⑧10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+蒸馏水定溶10ml。⑨染色液：100mgG-250+12g三氯乙酸+蒸馏水定溶至200ml。10/5/20219●实验操作步骤1、小麦谷蛋白提取程序①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器上混合均匀；②将离心管放入65℃水浴锅中水浴45min后取出离心管放，室温冷却；③

6、将冷却后的离心管12000转/min离心30min，保存于4℃冰箱备用。10/5/2021102电泳程序①封板：利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶；②凝胶配制：见表1。③制胶：按表1的配方分别配制8%和15%两种分离胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经混匀的15%分离胶，加到玻璃板之间，再向15%分离胶中加入8%的分离胶0.5ml，充分混匀后，从中吸取1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，10/5/202111直至距玻璃板上缘约3cm处时，向胶面上加一层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。倒置胶板，流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽多余水。按表

7、1配制5%浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气泡，静置至胶凝。待浓缩胶凝固后，垂直取出梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶。10/5/202112成分8%分离胶50ml15%分离胶50ml5%浓缩胶10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71MTris-HCl(pH8.8)12.512.5------1MTris-HCl(pH6.8)------------1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5(0.25)0.5(0.25)0.1TEMED0.03(0.02)0.02