棉花黄萎病抗菌肽基因的克隆与表达研究.pdf

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1、分类号：密级：$435．62l单位代码：学号：100862008087棉花黄萎病抗菌肽基因的克隆与表达研究ResearchonCloningandExpressionoftheAntimicrobialPeptidesGeneofCottonVerticilliumWilt学位申请人：李成翠指导教师：朱宝成教授学科专业：生物化学与分子生物学．学位类别：理学硕士，授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年六月四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已

2、经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得泣j丝壅些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：杏破翠签字日期：加f1年6月r日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解泣j匕壅些太堂．有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权通j壁壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论

3、文作者签名：存成翠导师签名：签字日期：≯11年b月r日签字日期：学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：＆拍年摘要由大丽轮枝菌(Vertici胁umdahliaeKIeb．)引起的黄萎病是棉花的主要病害之一，它严重影响了棉花的生产。本实验室武翠红硕士分离筛选出了一株对大丽轮枝菌有较强抗菌活性的新菌株一解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)RS．25，对此菌株的蛋白进行了分离纯化，得到表观分子量为9kD的单一活性组分，命名为A2，EDMAN降解法测得其N端序列为ASGGTVGIYGANMRS。本论文在此工作基础上进

4、行后续研究，重点研究了棉花黄萎病抗菌肽全长基因和成熟肽基因的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。将A2的N端15个氨基酸在NCBI上进行比对，结合菌株的16SrDNA结果，得到一段100％同源蛋白序列。根据此同源蛋白对应的编码序列对新型抗菌肽全长基因进行引物设计，构建重组质粒pET-30a．aeq，，并对其进行了测序。结果表明：此抗菌肽基因aeq，全长354bp，编码117个氨基酸，其中第42～56位氨基酸与武分离纯化的抗菌肽A2的N端15个氨基酸完全相同。本研究得到的蛋白在N端比抗菌肽A2多出41个氨基酸，分析这41个氨基酸可能起调控作用，而武分离纯化的抗

5、菌肽A2为成熟肽。将重组质粒pET-30a-a2qJ『利用热激转化法转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后，SDS．PAGE显示胞内具有目的条带，表达产物表观分子量为19kD。用镍柱亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化，SDS．PAGE显示在19kD有单一条带。大丽轮枝菌抑菌试验检测，发现其无抑菌活性。本研究克隆表达的目的蛋白A2Ql比武分离纯化的抗菌肽A2多41个氨基酸，为验证是否是此41个氨基酸影响蛋白活性，以及获得具有抗菌活性的重组蛋白，对成熟肽片段进行了研究。对成熟肽基因设计引物，构建重组质粒pET-30a-a2c，转化大肠杆菌BL21，经诱导表达，镍柱亲

6、和层析，SDS-PAGE显示在14kD有单一条带，由于成熟肽A2C与载体His标签融合，故表观分子量比武分离纯化的抗菌肽A2(9kD)略大。经检测，发现A2C也无抑菌活性。综上分析可能是由于抗菌肽A2为糖蛋白(武报道)，而大肠杆菌表达系统缺乏糖基化功能，所以表达的蛋白A2Q1、A2C没有活性。酵母表达系统具有糖基化功能，故选取毕赤酵母表达系统进行以下研究。对全长基因设计引物(引入组氨酸标签)，构建重组质粒pPIC9K-a2q2，线性化后，用电击转化法转化毕赤酵母GSl15，经甲醇低温诱导，镍柱亲和层析，SDS．PAGE显示在19kD有单一条带。经检测，发现表

7、达蛋白AZQ2有抑菌活性。由此说明，本研究克隆表达的蛋白质，需经过糖基化，才能发挥抑菌活性，进一步验证其为糖蛋白。本试验成功对抗菌肽A2进行了克隆表达，表达产物有拮抗大丽轮枝菌的活性。这不仅为研究棉花黄萎病抗菌肽的功能、作用机理提供了一定的研究材料，更进一步为转基因棉花及棉花抗病基因工程等方面的研究奠定了必要的理论与实践基础。关键词：棉花黄萎病；抗菌肽；大肠杆菌；毕赤酵母；克隆表达；蛋白纯化ResearchonCloningandExpressionoftheAntimicrobialPeptidesGeneofCottonVerticilliumWntAu

8、thor：Licheng-cuiSupervisor