最新蛋白质分离纯化课件ppt.ppt

《最新蛋白质分离纯化课件ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、蛋白质分离纯化蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能够把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，但是对任何一种蛋白质都有可能选择适当的分离程序以获得高纯度的制品。目前蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用，但基本原理均是以蛋白质的性质为依据

2、的。（等电点、分子量、溶解性、稳定性）蛋白质的预处理分离纯化某一蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来，并目保持原有的天然状态，不丢失活性物质。因此，根据分离纯化的原料不同，要采取不同的方法进行预处理。例如，动物材料要去掉结缔和脂肪组织，细菌要将细胞壁进行破碎。破碎主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲溶液将目的蛋白质提取出来，细胞碎片等不溶物质用离心或者过滤的方法除去蛋白质的预处理一般条件下，碱性蛋白或碱性酶、肽在酸性环境下较碱性环境稳定，反之亦然。因此，利

3、用酶对蛋白质进行预处理时，要选择合适的酶以及操作环境，以达到较好的提纯效果。盐析沉淀法盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1~100nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大盐析沉淀法亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水

4、膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。蛋白质的等电点(pI)即蛋白质的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相

5、互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏蛋白质的水化膜，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。即与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离了强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局

6、部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法，而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueoustwophaseextraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离物在两相中分配的不同，便可实现分离，被广泛用于生物化学和细胞生物学领域中蛋白质的分离和提取。此方法可以在室温环境下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性，收率较高

7、。对于细胞内的蛋白质，需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分了量及浓度、溶液pH值、离了强度、盐类型及浓度的影响。反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。层析(chromatography)①离子交换柱层析。是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离

8、子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换柱层析当蛋白质处于不同的pH值条件下，其带电状况也不同。当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，阴离了交换基质结合带有负电荷的蛋白质，被留在层析柱上，通过提高洗脱液中的盐浓度，将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来，其