整理)慢病毒稳转细胞株步骤

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1、..-稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体〔详细信息见附录及?质粒的扩增提取?〕〔大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年〕〔1〕载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别局部〔2〕包装质粒〔psPAX2〕：包含了pol、gag包装成分〔3〕包膜质粒〔pMD2.G〕：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：

2、XTREME-GENE〔-20℃保存，不可分装〕，一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂〔配好后4℃保存，原材料室温保存〕：5XPEG8000/NaCl溶液〔聚乙二醇〕：NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液〔-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天〕：滴度一般为108TU/ml6、10mg/mlpolybrene〔-20℃分装保存〕：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞外表的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常参加polybrene能提高感染效率2～10倍。有一定细

3、胞毒性，需要摸索浓度〔1～10μg/ml〕7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞〔复后3代以上的细胞〕..word.zl-..-9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集〔中皿，转染步骤类似于瞬转〕第一天1、种板，10×105个293T细胞，参加全培养基双抗DMEM4-5ml，过夜2、配制5XPEG8000/NaCl溶液称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在4℃第二天1、配管试剂加样量/μl推荐量/μl、μg合计A管PLKO.

4、1/pCDH3206psPAX21pMD2.G2Opti200B管XTREME-GENE6206Opti200A+B混合室温静置20min2、参加2ml全培养基DMEM3、将1参加2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml〔-80℃保存〕..word.zl-..-2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、参加5ml5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干剩余液

5、体3、参加120-150μlPBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。<二>慢病毒转染靶细胞前期预实验MOI〔步骤同正式试验〕〔见三2,直接订购病毒液时才需要〕细胞种类DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1MOI2422前期测病毒滴度〔稀释法，还有一种qPCR法见资料〕1、第一天：准备96孔板，每孔参加10000个293T，为每个病毒准备20个孔〔稀释10个浓度，各2个副孔〕。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。2、第二天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管参加207

6、µl培养液，往第一个管中参加23µl病毒原液，混匀后，吸取23µl参加第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度〔10~10-8〕。吸取96孔板中原有的培养基，参加含稀释好的病毒液。并做好标记。3、第三天：换液4、第四天：观察结果并计算滴度..word.zl-..-在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，那么滴度〔TU/ml〕=〔X+Y×10〕/2/X孔的病毒液的含量〔µl〕×1000。〔前面算出的是没μl病毒量，所以乘于1000〕第一天：1、种板〔12/24孔板〕需第二天为50%-70%，大约12孔板1×105细胞种类种板数收获细胞

7、数DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1第二天1、准备病毒液〔可在第一天做〕：在冰上融解2、准备完全培养基和Polybrene混合物〔1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10μg/ml之间〕，参加相应培养板中〔6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl〕3、参加浓缩病毒液〔12孔板30μl-50μl〕〔如果是直接购置病毒液需根据MOI确定病毒液量参加病毒液，自己包的病毒可以〕4、培养过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液第三天1、对细胞进展换液..word.zl-..-第五天1、用药物进展稳定株的筛选〔具体筛选药物根据载

8、体的基因定