分离线粒体

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1、从组织培养细胞中分离线粒体原理：细胞在低渗缓冲液中会膨胀，这是在Dounce匀浆器中用与匀浆器紧密吻合的研杵研磨几下就会破裂。然后即可在差速离心线分离线粒体。需注意：溶液、试管、匀浆器都应在冰上预冷。所有离心步骤要在4°C进行。所需物品：10ml玻璃离心管，冰冷的PBS，Dounce匀浆器，1.5ml离心管，4°C离心机。RSB低渗缓冲液:10mmol/LNaCl2.5mmol/LMgCl210mmol/LTris-Hcl,pH7.52.5XMS缓冲液525mmol/L甘露醇175mmol/L蔗糖12.5mmol/LTris-Hcl,pH7

2、.52.5mmol/LEDTA，pH7.51XMS缓冲液210mmol/L甘露醇70mmol/L蔗糖5mmol/LTris-Hcl,pH7.51mmol/LEDTA，pH7.5实验步骤：实验开始前，准备足够的RSB缓冲液（1ml/次）：每毫升RSB、MS缓冲液中加入2μl蛋白酶抑制剂和1μlDTT。1.用10ml玻璃离心管收集5x107个细胞。2.PBS洗细胞一次，将细胞在4°C下，600gx5min离心一次；3.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml冰冷的PBS；4.细胞在4°C下，600gx5min离心一次；5.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml冰冷的

3、RSB缓冲液，冰上孵育10min；6.将细胞重悬液全部转移到合适的已预冷的Dounce匀浆器中，用研杵上下研磨30～50次左右。注：可在显微镜下检测匀浆的效果。取2～3μl匀浆液滴在载玻片上，显微镜下观察，若70～80％的细胞核周围不存在一圈亮环，则说明匀浆效果较好，否则再研磨10次。1.立刻加入0.8ml2.5XMS缓冲液至终浓度为1XMS，用封口膜封住匀浆器顶端，混匀；2.将匀浆液转移到1.5ml离心管中，4°C，1000gx10min离心一次；3.将上清液转移到另一干净的1.5ml离心管中，4°C，17，000gx20min离心一次；

4、4.收集上清液（即细胞浆部分），将离心后的细胞沉淀重悬于0.1mlMS缓冲液；5.Bradford法测定蛋白浓度。6.WesternBltoing.