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《帕金森病大鼠在特定运动状态下GPe和GPi电生理学特征变化及相关性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
－早＇．气，．■〇．？■－、，．．＊＊一、一－－－．＇＇．一：、－＇＇、；；＾单位代码１０４４５￣￣￣￣￣２椒妃麻疫＾分类号０４２６全曰衝ｊ巧丈研巧生类别＾东抑耗乂ｆ硕±学位论文（学术学位）论文题目帕金森病大鼠在特定运动状态下ＧＰｅ和ＧＰｉ电生理学特征变化及相关性分析学科专业名称动物学申请人姓名王敏教授指导教师２０１６６６文提交时间年月日？－ 独创声明本人声Ｗ所节交的宁位论义足本人化巧师巧守Ｋ进巧的研巧Ｔ．作々取衍的研巧化１；：．论义巧。拋化所知，除／义中将別加１小巧和玻谢的地乂外１Ｍ包含巧化人ｄ巧化ＩＩ，（巧Ｊ或撰写过的研ｆＤ龙巧化不包含为获巧：如巧軒巧化巿竖特别声Ｊｕ的）或巧他教巧机构的学位或Ｗ；。Ｉ；，本矜ｊ空．书巧用过的材料化作的Ｎ山对本研冗所做的化何方献巧ｄ么论义中化／刚确的说Ｗ巧农巧谢思。学位论文化者签知＾＼我炎羊学位论文版权使用授权书，軒权保巧巧向本学化於义作者亢令／解学校軒关保稱、使用巧位论文的规山｜均家有关部ｎ诚机构巧义论文的巧印件和磁盘，允许论文被巧阅和巧阅。本人巧权学校ｗｉａ将学化论义的全部诚部分内容编入行关数据昨进巧检索ｉ、，ｗａ采Ｗ影印缩印或争Ｊ？（）描等巧制下保密；＾（边本授权书段保巧、汇编学位论义。的学位论义么解密用学位论义者签：：名巧签作师字、皆泉斗链字；综Ｈ朋：＾Ｎ字期年ｎＭ１）１若也２６；；＾俗 目录摘要..................................................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................................IV英文简写及中英文对照表..........................................................................................................VII第一部分文献综述.......................................................................................................................11.1帕金森病与基底神经节...................................................................................................11.2苍白球外侧部...................................................................................................................31.3苍白球内侧部...................................................................................................................61.4苍白球外侧部与苍白球内侧部的相关性.......................................................................8第二部分实验研究.....................................................................................................................102.1前言.................................................................................................................................102.2实验材料.........................................................................................................................102.2.1实验动物、实验试剂和主要仪器.......................................................................102.2.2自制跑步机结构和行为学量化测评指标...........................................................132.2.3自制16通道镍铬合金丝电极阵列.....................................................................132.3实验方法.........................................................................................................................142.3.1建立PD大鼠模型实验........................................................................................142.3.2PD大鼠行为学量化测评实验..............................................................................162.3.3基于Plexon多通道信号采集系统的电生理学实验..........................................172.3.4统计学分析...........................................................................................................222.4实验结果.........................................................................................................................232.4.1PD大鼠模型鉴定结果..........................................................................................232.4.2PD大鼠行为学量化测评结果..............................................................................242.4.3组织学位点鉴定和细胞构筑分析.......................................................................262.4.4PD大鼠GPe动作电位分析结果.........................................................................282.4.5PD大鼠GPi动作电位分析结果..........................................................................332.4.6PD大鼠GPe局部场电位分析结果.....................................................................342.4.7PD大鼠GPi局部场电位分析结果......................................................................372.4.8PD大鼠GPe与GPi相关性分析结果.................................................................392.5讨论.................................................................................................................................44I 2.5.1根据上游核团信号确定电极植入位点...............................................................442.5.2GPe、GPi神经元放电特征分析..........................................................................462.5.3PD大鼠GPe电生理学实验结果的探讨.............................................................472.5.4PD大鼠GPi电生理学实验结果的探讨..............................................................492.5.5PD大鼠GPe与GPi相关性实验结果的探讨.....................................................50总结...............................................................................................................................................51参考文献.......................................................................................................................................52攻读硕士期间发表的文章...........................................................................................................56攻读硕士期间申请的发明专利...................................................................................................57攻读硕士期间申请及参与的项目...............................................................................................58致谢...............................................................................................................................................59II 摘要帕金森病大鼠在特定运动状态下GPe和GPi电生理学特征变化及相关性分析帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)病变的主要部位在中脑黑质和基底神经节。在基底神经节中，苍白球外侧部(globuspallidusexternalsegment，GPe)是重要的中继核团，苍白球内侧部(globuspallidusinternalsegment，GPi)是主要的输出核团。研究目的：本研究旨在探究PD大鼠GPe、GPi电生理学特征的变化以及两个核团之间局部场电位(localfieldpotential，LFP)相关性的变化，包括：1、对PD大鼠运动障碍进行量化测评。2、探究PD大鼠在清醒静止和连续运动两种状态下GPe、GPi动作电位和LFP的变化。3、探究PD大鼠GPe与GPi之间LFP相关性的变化。研究方法：建立PD大鼠模型，通过大鼠脑立体定位手术，将两束电极阵列分别植入同一只PD大鼠GPe、GPi内，使用Plexon多通道信号采集系统采集PD大鼠在清醒静止和连续运动两种状态下的动作电位和LFP。将采集到的动作电位导入OfflineSorter软件进行聚类分析，使用NeuroExplorer软件分析每类神经元放电率和放电模式的变化；将采集到的LFP导入Matlab，使用LFPAnalysisSoftware2009软件分析每个核团时频、功率谱密度和频段分布的变化，使用LFPAnalysisSoftware2009软件和Chronux软件分析两个核团之间LFP相关性的变化，包括交叉相关分析和一致性分析。研究结果：1、行为学量化测评结果PD大鼠运动障碍测评结果：与正常大鼠相比，PD大鼠在跑步机上的最长运动时间(min)变短(20r/min：18.00±2.74vs26.98±0.91，P=0.03；30r/min：3.33±1.45vs26.67±0.71，P<0.01)，步频(steps/min)降低(20r/min：73.33±7.00vs95.50±4.94，P=0.04；30r/min：76.33±7.41vs110.33±7.58，P<0.01)，失误次数(times)增多(9r/min：1.50±0.55vs0.67±0.33，P=0.04；15r/min：2.50±0.76vs0.83±0.48，P=0.04；20r/min：7.50±0.76vs1.50±0.43，P<0.01；30r/min：10.00±0.00vs2.00±0.58，P<0.01)。跑步机转速筛选结果：在12r/min时，两组大鼠不连续运动频率均较低，适宜采集大鼠在连续运动状态下的脑电信号。I 2、GPe动作电位分析结果GPe根据放电率和放电模式分为伴随暂停的高频率放电(highfrequencypausers，HFP)和伴随爆发的低频率放电(lowfrequencybursters，LFB)两类神经元。在清醒静止和连续运动两种状态下，与正常大鼠相比，PD大鼠HFP放电率(spikes/s)降低(静止：11.89±0.98vs18.63±1.50，P<0.01；运动：16.08±1.51vs23.25±1.27，P<0.01)，变异系数(coefficientofvariation，CV)值增大(静止：1.06±0.05vs0.72±0.04，P<0.01；运动：1.33±0.03vs1.00±0.03，P<0.01)；PD大鼠LFB放电率降低(静止：6.11±0.39vs10.33±0.79，P<0.01；运动：10.18±0.51vs13.15±0.66，P<0.01)，CV值增大(静止：2.31±0.23vs1.54±0.08，P<0.01；运动：2.48±0.21vs1.62±0.15，P<0.01)。与清醒静止状态相比，在连续运动状态下，正常大鼠和PD大鼠HFP放电率升高(正常：23.25±1.27vs18.63±1.50，P=0.03；PD：16.08±1.51vs11.89±0.98，P=0.03)，CV值增大(正常：1.00±0.03vs0.72±0.04，P<0.01；PD：1.33±0.03vs1.06±0.05，P<0.01)；LFB放电率升高(正常：13.15±0.66vs10.33±0.79，P=0.01；PD：10.18±0.51vs6.11±0.39，P<0.01)。3、GPi动作电位分析结果GPi只有一类神经元。在清醒静止和连续运动两种状态下，与正常大鼠相比，PD大鼠GPi放电率升高(静止：27.05±1.66vs23.18±1.25，P<0.01；运动：29.93±0.68vs25.16±0.65，P<0.01)，CV值增大(静止：1.04±0.08vs0.72±0.03，P<0.01；运动：1.12±0.04vs0.89±0.03，P<0.01)。与清醒静止状态相比，在连续运动状态下，正常大鼠和PD大鼠GPi放电率升高(正常：25.16±0.65vs23.18±1.25，P=0.03；PD：29.93±0.68vs27.05±1.66，P<0.01)，CV值增大(正常：0.89±0.03vs0.72±0.03，P<0.01；PD：1.12±0.04vs1.04±0.08，P=0.03)。4、PD大鼠GPe、GPi局部场电位分析结果在清醒静止状态下，与正常大鼠相比，PD大鼠GPe、GPi的LFP在0.5~12Hz频段的能量占总能量(0.5~200Hz频段的能量)的百分比降低(GPe：59.27±3.28vs74.44±1.68，P<0.01；GPi：67.99±1.60vs80.88±1.80，P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(GPe：28.32±1.94vs18.74±1.54，P<0.01；GPi：26.32±2.16vs11.45±1.07，P<0.01)。在连续运动状态下，与正常大鼠相比，PD大鼠GPe、GPi的LFP在0.5~12Hz频段的能量占总能量的百分比降低(GPe：66.76±1.83vs79.11±2.80，P<0.01；GPi：62.69±1.79vsII 76.79±1.19，P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(GPe：24.53±1.64vs13.65±1.91，P<0.01；GPi：27.15±1.51vs16.10±0.80，P<0.01)，在35~70Hz频段的能量占总能量的百分比升高(GPe：3.03±0.48vs1.07±0.46，P=0.04；GPi：4.77±0.65vs2.03±0.34，P<0.01)。5、PD大鼠GPe与GPi之间LFP相关性分析结果与正常大鼠相比，PD大鼠GPe与GPi之间LFP在0.5~12Hz和12~35Hz频段的最大交叉相关系数增大(0.5~12Hz：0.81±0.02vs0.37±0.03，P<0.01；12~35Hz：0.81±0.03vs0.43±0.07，P<0.01)，平均相位一致性值增大(0.5~12Hz：0.69±0.03vs0.25±0.01，P<0.01；12~35Hz：0.73±0.04vs0.30±0.06，P<0.01)。研究结论：行为学量化测评实验结果显示，PD大鼠出现运动障碍，表现为运动协调性差，尤其对高转速控制能力差；12r/min适宜大鼠在跑步机上连续运动。电生理学实验结果显示，PD大鼠GPe神经元放电率降低，GPi神经元放电率升高；二者CV值都增大，表明放电规则性降低，放电模式发生变化。PD大鼠GPe、GPi的LFP在0.5~12Hz频段的能量降低，在12~35Hz频段的能量升高。PD大鼠GPe与GPi之间LFP在0.5~12Hz和12~35Hz频段的同步性都增强。与此同时，在连续运动状态下，GPe和GPi神经元放电率升高，CV值增大，提示GPe、GPi与运动相关。关键词：帕金森病；动作电位；局部场电位；苍白球外侧部；苍白球内侧部III AbstractResearchaboutthealterationsofthefiringcharacteristicofGPeandGPiandtheirrelationshipinratsofParkinson’sdiseaseunderaspecificlocomotionThemainlylesionedlocationofParkinson’sdisease(PD)isthesubstantianigraandbasalganglia,ofwhichtheglobuspallidusexternalsegment(GPe)isanimportantrelayingnucleusandtheglobuspallidusinternalsegment(GPi)isamainoutputnucleus.Aims:Thisresearchaimedtostudythealterationsofspikesandlocalfieldpotentials(LFPs)inGPeandGPiandtheircorrelationinPDrats.1.ThisresearchtriedtoquantitativelyevaluatethemotordeficitsympotomsofPDrats.2.ThisresearchtriedtostudythealterationsofspikesandLFPsinGPeandGPiofPDratsinsilentandcontinuouslocomotorstatus.3.ThisresearchtriedtostudythealterationsofcorrelationbetweenGPeandGPiinPDrats.Methods:Inthisstudy,themodelofPDratwasbuiltup.TwomultichannelelectrodearrayswereimplantedintoGPeandGPiinaPDratrespectivelywiththestereotaxictechnique,thensignalsofspikesandLFPsinratsundersilentandcontinuouslocomotorstatuswererecordedsimultaneouslyusingthe16-ChannelOmniPlex®NeuralDataAcquisitionSystem(Plexon,Inc.,Dallas,USA).ThecollectedspikesignalswereimportedtoOfflineSortertodocluster-sortinganalysisandthenimportedtoNeuroExplorertoanalyzethechangesofthefiringpatternandfiringrateofeachtypeofneuron.ThecollectedLFPsignalswereimportedtoMatlabtoanalyzetheLFPpowerspectra,thetime-frequencyspectrogramsandtheassessmentofrelevantLFPpower.ThealterationsofcorrelationbetweenGPeandGPiwereevaluatedbymeansofcrosscorrelationanalysisandcoherenceanalysisusingChronuxinMatlab.Results:1.TheeffectofPDonthebehavioraltests:Comparedtocontrolrats,thelongestmovingtime(min)ofPDratswasshorter(18.00±2.74vs26.98±0.91,P=0.03and3.33±1.45vs26.67±0.71,P<0.01,respectively),stepfrequency(steps/min)waslower(73.33±7.00vs95.50±4.94,P=0.04and76.33±7.41vs110.33±7.58,P<0.01,respectively),theslipuptimes(times)werehigher(7.50±0.76vs1.50±0.43,P<0.01and10.00±0.00vs2.00±0.58,P<0.01,respectively)undertherotationspeedof20r/minand30r/min.Thediscontinuousmovingfrequencyofthesetwogroupsofratswaslowerunder12r/min.Thus,the12r/minisusedtorecordsignalsofratsincontinuouslocomotorstatus.IV 2.TheeffectofPDonthespikesinGPe:AccordingtothefiringrateandfiringpatternofneuronsinGPe,therecordedneuronscouldbedividedintotwotypes,includinghighfrequencypausers(HFP)andlowfrequencybursters(LFB).Comparedtocontrolrats,HFPtypeofneuroninPDratsshowedalowerfiringrate(spikes/s)(11.89±0.98vs18.63±1.50,P<0.01and16.08±1.51vs23.25±1.27,P<0.01,respectively)andahigherCVvalue(1.06±0.05vs0.72±0.04,P<0.01and1.33±0.03vs1.00±0.03,P<0.01,respectively),LFBtypeofneuronshowedalowerfiringrate(6.11±0.39vs10.33±0.79,P<0.01and10.18±0.51vs13.15±0.66,P<0.01,respectively)andahigherCVvalue(2.31±0.23vs1.54±0.08,P<0.01and2.48±0.21vs1.62±0.15,P<0.01,respectively)insilentandcontinuouslocomotorstatus.Comparedtosilentstatus,HFPtypeofneuronofcontrolandPDratsincontinuouslocomotorstatushadahigherfiringrate(23.25±1.27vs18.63±1.50,P=0.03and16.08±1.51vs11.89±0.98,P=0.03,respectively)andahigerCVvalue(1.00±0.03vs0.72±0.04,P<0.01and1.33±0.03vs1.06±0.05,P<0.01,respectively),LFBtypeofneuronhadahigherfiringrate(13.15±0.66vs10.33±0.79,P=0.01and10.18±0.51vs6.11±0.39,P<0.01,respectively).3.TheeffectofPDonthespikesinGPi:TherewasonlyoneGPitypeofneuron.Comparedtocontrolrats,GPitypeofneuroninPDratsshowedahigherfiringrate(27.05±1.66vs23.18±1.25,P<0.01and29.93±0.68vs25.16±0.65,P<0.01,respectively)andahigherCVvalue(1.04±0.08vs0.72±0.03,P<0.01and1.12±0.04vs0.89±0.03,P<0.01,respectively)insilentandcontinuouslocomotorstatus.Comparedtosilentstatus,GPitypeofneuronofcontrolandPDratsincontinuouslocomotorstatushadahigherfiringrate(25.16±0.65vs23.18±1.25,P=0.03and29.93±0.68vs27.05±1.66,P<0.01,respectively)andahigherCVvalue(0.89±0.03vs0.72±0.03,P<0.01and1.12±0.04vs1.04±0.08,P=0.03,respectively).4.TheeffectofPDonLFPactivitiesinGPeandGPi:Insilentstatus,comparedtocontrolgroup,thepercentagepowerof0.5~12HzofGPeandGPiinPDratswaslower(59.27±3.28vs74.44±1.68,P<0.01and67.99±1.60vs80.88±1.80,P<0.01,respectively)andthepercentagepowerof12~35Hzwashigher(28.32±1.94vs18.74±1.54,P<0.01and26.32±2.16vs11.45±1.07,P<0.01,respectively).Incontinuouslocomotorstatus,comparedtocontrolgroup,thepercentagepowerof0.5~12HzofGPeandGPiinPDratswaslower(66.76±1.83vs79.11±2.80,P<0.01and62.69±1.79vs76.79±1.19,P<0.01,respectively)andthepercentagepowerof12~35Hzwashigher(24.53±1.64vs13.65±1.91,P<0.01and27.15±1.51vs16.10±0.80,P<0.01,respectively)andthepercentagepowerof35~70Hzwashigher(3.03±0.48vs1.07±0.46,P=0.04and4.77±0.65vs2.03±0.34,P<0.01,respectively).V 5.TheeffectofPDoncorrelationbetweenGPeandGPi:Comparedtocontrolgroup,thecorrelationcoefficientsbetweenGPeandGPiinPDratswasmuchhigherinfrequencybandsof0.5~12Hzand12~35Hz(0.81±0.02vs0.37±0.03,P<0.01and0.81±0.03vs0.43±0.07,P<0.01,respectively)andtheaveragephasecoherencevaluewasalsohigher(0.69±0.03vs0.25±0.01,P<0.01and0.73±0.04vs0.30±0.06,P<0.01,respectively).Conclusions:thebehavioraltestsshowedthat,PDratshadmotordeficitsympotomsanddisabilityofmovementcontrolandmovementcoordinationinhighrotationspeed.12r/minwasanappropriaterotationspeedtorecordmovingsignals.TheresultsofspikesandLFPsinGPeandGPisuggestedthatthesetwonucleiwererelatedtoPDandlocomotion.ThecorrelationbetweenthesynchronouslyrecordedsignalsofGPeandGPiincreased.Keywords:Parkinson’sdisease;actionpotential;localfieldpotential;globuspallidusexternalsegment;globuspallidusinternalsegmentVI 英文简写及中英文对照表英文简写英文全称中文名称6-OHDA6-hydroxydopamine6-羟基多巴胺APOapomophine阿扑吗啡BGbasalganglia基底神经节BLbasolatamygdaloidnucleus基底外侧杏仁核Cecentralamygdaloidnucleus中央杏仁核CPucaudateputamen纹状体CVcoefficientofvariation变异系数D3Vdorsal3rdventricle第3脑室DADopamine多巴胺DBSdeepbrainstimulation深部脑刺激EPNentopeduncularnucleus脚内核GPglobuspallidus苍白球GPeglobuspallidusexternalsegment苍白球外侧部GPiglobuspallidusinternalsegment苍白球内侧部icinternalcapsule内囊ISIHinterspikeintervalhistogram放电间隔直方图LFPlocalfieldpotential局部场电位LHblateralhabenula外侧僵核LVlateralventricle侧脑室MFBmedialforebrainbundle内侧前脑束VII PDParkinson’sdisease帕金森病PFparafascicularnucleus束旁核PPNPedunculopontinenucleus脚桥核PSDpowerspectraldensity功率谱密度SNcsubstantianigraparscompacta黑质致密部SNrsubstantianigraparsreticulata黑质网状部STNsubthalamicnucleus底丘脑核TStriangularseptalnucleus三角隔核VIII 第一部分文献综述苍白球外侧部、苍白球内侧部与帕金森病1.1帕金森病与基底神经节帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)也称“震颤麻痹”，是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病[1-2]。1817年，英国医生JamesParkinson首先描述了PD患者肌僵直、运动迟缓和姿势步态异常等临床症状[3]。据不完全统计，我国PD患者的数量超过200万[4]。由于患者存在生理、认知和心理障碍，导致正常生活受到严重影响[5]。PD的致病因素主要有α-synuclein、氧化应激、铁代谢异常和遗传等[6-9]。此外，环境、人口老龄化和其他一些因素也会导致PD[10]。目前，对于PD的干预治疗主要有药物治疗和深部脑刺激术(deepbrainstimulation，DBS)两种方法。治疗药物主要包括左旋多巴、罗匹尼罗、苯海索和雷沙吉兰等，尽管药物治疗具有一定的作用，但是长期服药会导致药效降低，并且具有较大的副作用[11-14]。DBS通过抑制大脑的异常放电活动，可以减轻患者的肢体障碍，但是在手术过程中很难将电极准确植入大脑深部核团，在一定程度上限制了DBS在临床上的应用[15]。基底神经节(basalganglia，BG)位于大脑白质深部，由纹状体(caudateputamen，CPu)、苍白球外侧部（globuspallidusexternalsegment，GPe）、苍白球内侧部（globuspallidusinternalsegment，GPi）、底丘脑核(subthalamicnucleus，STN)、黑质致密部(substantianigraparscompacta，SNc)和黑质网状部(substantianigraparsreticulate，SNr)等6部分组成[16]。在功能上，与皮层和丘脑共同组成“皮层-基底神经节-丘脑”环路(图1-1)，该环路的主要功能是处理来自皮层的信号，然后将处理后的信号通过丘脑返回皮层，实现对运动的调控[17]。图1-1“皮层-基底神经节-丘脑”环路示意图1 在“皮层-基底神经节-丘脑”环路中，主要存在3条与PD相关的通路，直接通路：皮层-纹状体-苍白球内侧部-丘脑-皮层，间接通路：皮层-纹状体-苍白球外侧部-底丘脑核-苍白球内侧部-丘脑-皮层，快速通路：黑质-纹状体[18]。如图1-2，在PD病变时，由于黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元受损，导致释放到CPu中的DA含量降低，对与直接通路相关的D1型γ-氨基丁酸能神经元兴奋作用减弱，进而释放到输出核团GPi/SNr的γ-氨基丁酸减少，导致GPi/SNr异常活跃；对间接通路相关的D2型γ-氨基丁酸能神经元抑制作用减弱，释放到GPe的γ-氨基丁酸增多，进而释放到STN的γ-氨基丁酸减少，导致STN释放到输出核团GPi/SNr的谷氨酸增多，使GPi/SNr异常活跃，最终，通过椎体外系影响到肢体活动，出现PD临床症状[19-20]。图1-2帕金森病病变原理图（引自Galvanetal，2015）注：红色箭头表示兴奋性突触联系，蓝色箭头表示抑制性突触联系，箭头粗细程度代表神经递质含量的高低，黑色错号表示SNc受到损伤。MOTORCORTEX：运动皮层，PUTAMEN：壳核，GPe：苍白球外侧部，GPi：苍白球内侧部，STN：底丘脑核，SNc：黑质致密部，SNr：黑质网状部，CM/PF：中央中核-束旁核，PPN：脚桥核，D1：多巴胺受体1，D2：多巴胺受体2。本研究中涉及的GPe是BG中重要的中继核团，GPi是BG中重要的输出核团，与PD病变直接相关。因此，探究PD病变时两个核团放电特征的变化对于深入研究PD发病机制具有重要的意义。同时，GPe和GPi之间存在直接的纤维投射，两者在功能上联系密切，分析PD病变时两者相关性的变化意义更大。2 1.2苍白球外侧部1、苍白球外侧部组织学Mallet等对PD大鼠研究发现，GPe具有2类主要的γ-氨基丁酸能神经元，prototypic神经元和arkypallidal神经元[21]。prototypic神经元符合传统观点对GPe的认识，释放伴随递质小清蛋白(PV)，向下投射支配STN等。但是，arkypallidal神经元，作为一种新发现的神经元，释放伴随递质前脑啡肽(PPE)，只向上投射支配CPu[21]。Kita和Hoover等对正常大鼠GPe的PV和PPE进行免疫荧光标记，观察GPe神经元的数量、种类和分布[22-24]。结果表明，PV+神经元的数量占所有GPe神经元数量的59%，PPE+神经元的数量比PV+神经元的数量少，占所有GPe神经元数量的28%，PV+/PPE+神经元数量非常少，仅占0.2%，PV-/PPE-神经元数量占10%。对PV-/PPE-神经元进行乙酰胆碱免疫荧光标记，发现只有4%的神经元为类胆碱能神经元，据此可以判断，绝大多数的GPe神经元为γ-氨基丁酸能神经元，类胆碱能神经元只占GPe神经元的一小部分。PV+神经元、PPE+神经元和PV-/PPE-神经元混合分布于GPe喙部、中间部和尾部[25]。虽然绝大多数GPe神经元可以通过上述方法标记出来，但是PV特异性不强，不能准确的区分GPe神经元类型。prototypic神经元起源于胚胎时期中间神经节隆突部位，释放PV和特异性转录因子Nkx2-1，arkypallidal神经元起源于胚胎时期侧部或尾部神经节隆突部位，特异性释放PPE和转录因子FoxP2[21,26]。Dodson等通过对转录因子、PV和PPE进行特异性免疫荧光标记，有效的解决了上述问题。研究结果表明，prototypic神经元特异性释放转录因子Nkx2-1，非特异性释放PV，Nkx2-1+神经元的数量占所有GPe神经元数量的68%，其中2/3的Nkx2-1+神经元同时释放PV。所有PPE+神经元同时释放转录因子FoxP2，PPE+/FoxP2+的arkypallidal神经元的数量占所有GPe神经元数量的20%。但是几乎没有神经元同时释放Nkx2-1和FoxP2。上述各类神经元在GPe喙部、中间部和尾部混合分布[26]。GPe位于BG多个前馈反馈通路中心，是BG间接通路关键的组成部分，接受来自CPu的γ-氨基丁酸能神经元抑制性投射和来自STN的谷氨酸能神经元兴奋性投射[21,27-28]。Mallet等利用细胞旁染色技术对记录到的神经元进行组织学重建，证实PD大鼠GPe有2类主要的γ-氨基丁酸能神经元，即prototypic神经元和arkypallidal神经元。如图1-3，2类神经元投射到BG不同的区域，大多数prototypic神经元向下投射支配STN和GPi/SNr，少数prototypic神经元向上投射支配CPu，但是arkypallidal神经元只向下投射支配CPu[21]。3 图1-3prototypic(左)和arkypallidal(右)神经元投射图（引自Malletetal，2012）Vicente报道，皮层处于不同状态时，GPe中的γ-氨基丁酸能神经元活跃程度不同，据此可以将2类GPe神经元分别命名为GP-TI和GP-TA。GP-TI主要在皮层震荡波负电荷阶段放电，与prototypic神经元相对应，绝大多数该类神经元只向下投射支配STN等，少数同时向下投射支配STN，向上投射支配CPu；GP-TA主要在皮层震荡波正电荷阶段放电，与arkypallidal神经元相对应，该类神经元只向上投射支配CPu(图1-4)，GP-TA神经元的发现使GPe神经元投射图更为复杂[29]。图1-4GPe神经元投射图（引自Vicenteetal，2012）注：GP-TI神经元(绿色)主要投射到下游STN等区域，少数投射到上游CPu；GP-TA(洋红色)不投射到STN，只投射到CPu，支配CPu中间神经元和投射神经元。2、苍白球外侧部电生理学Mallet课题组细胞外记录6-羟基多巴胺单侧损伤的麻醉大鼠GPe神经元的放电活动，4 把皮层兴奋状态时不活跃的神经元叫做GP-TI，把皮层兴奋状态时活跃的神经元叫做GP-TA[30]。Delong和Gardiner细胞外记录清醒状态下灵长类GPe神经元放电活动，将神经元分成2种类型，第1类神经元表现为伴随自发暂停的高频率放电(HFP)，第2类神经元表现为伴随爆发的低频率放电(LFB)[31-32]。对PD患者的GPe神经元进行分类，得到与灵长类和啮齿类相似的结果[33]。根据放电率和放电模式不同，将清醒大鼠GPe神经元分成prototypic神经元和arkypallidal神经元2类。prototypic神经元放电率高，放电模式规则，arkypallidal神经元放电率低，放电模式不规则[21]。Deister等对正常麻醉大鼠GPe神经元的放电特征进行研究，在麻醉状态下，控制大脑皮层处于慢波电位状态，GPe神经元表现为不同的放电特征，主要有2种类型，第1类神经元的放电率高，平均放电率可以达到50spikes/s，第2类神经元放电缓慢，甚至不放电，平均放电率低至0.02spikes/s[34]。Abdi等利用特异性免疫荧光标记技术，对每类GPe神经元的放电特征进行分析。研究结果显示，释放不同伴随递质和转录因子的GPe神经元往往表现为不同的放电率和放电模式，所有Nkx2-1+/PV+神经元平均放电率高(>10spikes/s)，放电模式较为规则(CV+/PV-神经元放电模式与Nkx2-1+/PV+神经元相似，但ISI<0.9)；Nkx2-1是放电率显著降低；所有FoxP2+神经元平均放电率低(<2spikes/s)，放电模式不规则(CV[25]。ISI>1)Bugaysen等通过细胞外记录自由活动状态下灵长类GPe神经元的信号，探究GPe神经元的放电特征。结果显示，GPe主要有2种类型的神经元，LFB神经元的显著特征是放电率低，爆发放电频率高；HFP神经元的显著特征是放电率高，出现自发的放电暂停现象[35]。Benhamou等用相同的方法记录清醒状态下大鼠和灵长类GPe的脑电信号，并且进行种属间比较。结果表明，尽管大鼠GPe神经元的放电率显著低于灵长类，但是其放电模式与灵长类是相似的[36]。Dodson等对正常大鼠GPe神经元在特定运动阶段的放电特征进行分析。结果显示，绝大多数prototypic神经元(40/43)在运动阶段的放电率发生显著变化，超过一半的该类神经元(22/40)放电率降低，剩余的18个该类神经元放电率升高；所有的arkypallidal神经元在运动阶段表现为放电率显著升高[26]。这表明GPe神经元与运动相关，推测GPe通过控制神经元的放电率调控运动。在大脑慢波电位状态下，PD大鼠GPe神经元的放电活动是多种多样的，一些神经元5 的放电率高达40spikes/s，但是另外一些神经元几乎不放电，放电率低至0.01spikes/s。与正常大鼠相比，PD大鼠GPe神经元的平均放电率显著降低，而且arkypallidal神经元的放电率(<3spikes/s)显著低于prototypic神经元的放电率；prototypic神经元的放电模式更加不规则，CV[25]。ISI显著升高，arkypallidal神经元的放电模式更加不规则，但是变化程度较小由此可以推测，慢性DA的丢失主要改变了prototypic神经元的放电模式，对arkypallidal神经元放电模式的影响相对较小。1.3苍白球内侧部1、苍白球内侧部组织学传统观点认为，啮齿类BG输出核团只有γ-氨基丁酸能神经元一种类型的神经元，并且将GPi分成喙部和尾部两部分，喙部具有生长激素抑制剂阳性(SOM+)神经元，尾部具有小清蛋白阳性(PV+)神经元[37-38]。Miyamoto等通过对SOM和PV进行特异性免疫荧光标记，同时用谷氨酸脱羧酶标记γ-氨基丁酸能神经元，观察GPi神经元的类型和分布范围。结果表明，45.7%的GPi神经元为SOM+/PV-神经元，28.6%的GPi神经元为PV+/SOM-神经元，25.7%的GPi神经元为SOM-/PV-神经元，这是一类新发现的神经元。在啮齿类中，绝大多数的GPi神经元表现为谷氨酸脱羧酶阳性，即绝大多数的神经元为γ-氨基丁酸能神经元，但是仍然有11.3%的神经元表现为谷氨酸脱羧酶阴性，即为非γ-氨基丁酸能神经元[39]。PV+神经元主要集中在尾部2/3的范围内，多数的PV-神经元分布在喙部，少数分布在尾部，并且围绕在PV+神经元的外侧，形成“壳核”结构[39]。此外，Miyamoto等通过对P物质(SP)进行免疫荧光染色，观察GPi的边界范围。如图1-5显示，GPi在喙-尾轴方向长约800μm，呈“壳核”状分布[39]。6 图1-5啮齿类GPi(EPN)及周围区域免疫荧光标记图（引自Miyamotoetal，2015）注：红色：PV，绿色：NeuN，蓝色：SP。灵长类动物BG的输出核团包括GPi和SNr，在啮齿类动物中，EPN相当于GPi。对大鼠BG神经元进行纤维追踪标记，结果显示，GPi接受来自GPe和CPu抑制性γ-氨基丁酸输入和STN兴奋性谷氨酸输入，将抑制性γ-氨基丁酸输出到外侧僵核(lateralhabenula，LHb)、丘脑腹前侧核、中央中核-束旁核复合体和被盖脚桥核，并且后面的3个核团由相同的GPi神经元支配[40]。GPi喙部SOM+神经元投射到LHb，PV+神经元投射到丘脑[38]。2、苍白球内侧部电生理学在清醒状态下，灵长类动物GPe和GPi在解剖学上都处于BG中心部位，但是根据GPe神经元细胞外放电特征，GPe有2类神经元，即HFP和LFB，但是GPi只有1类神经元[41]。Benhamou等根据正常大鼠GPi神经元放电率和异氟烷浓度的关系将GPi神经元分为2类。如图1-6，第1类神经元对异氟烷反应敏感，在高浓度麻醉状态下放电率显著降低；第2类神经元对异氟烷反应相对不敏感，在高浓度麻醉状态下放电率没有显著变化[42]。7 图1-6GPi神经元放电率与麻醉剂浓度关系图（引自Benhamouetal，2014）注：左侧图(上)为第1类神经元随着麻醉剂浓度升高，放电率降低；左侧图(下)为第2类神经元放电率在麻醉剂浓度为1%时突然下降，对高浓度麻醉剂反应不敏感。右侧图中1条竖线表示1次动作电位。Chan等报道，PD动物GPi神经元典型的异常放电活动表现为爆发放电和震荡放电，对来自14个PD患者的132个GPi神经元进行分析，结果显示，只出现爆发放电异常的神经元占49%，只出现震荡放电异常的神经元占8%，既出现爆发放电又出现震荡放电异常的神经元占33%，既不出现爆发放电又不出现震荡放电的神经元占10%[43]。灵长类动物在清醒状态下GPi神经元表现为连续的高频率放电，平均放电率高达107spiks/s，波动范围10~107spikes/s，放电模式规则，放电间隔直方图(interspikeintervalhistogram，ISIH)呈现为典型的泊松分布，没有放电暂停现象[43]。GPi参与运动的调控，主要调控运动起始、运动的连续性组织和行为的选择[44]。GPi损伤会引起运动失调，比如降低速度和加速度，导致运动伸展障碍[45]，但是目前还没有关于运动状态下大鼠GPi神经元放电特征的报道。Kaneoke等研究发现，PD动物GPi神经元表现为异常的放电活动，包括放电率的异常升高和放电模式的异常不规则[46]。对PD患者和PD动物模型的研究均发现，GPi典型的病理生理学标志是爆发放电增多和α波段(8~13Hz)、β波段(13~30Hz)出现震荡放电[47-48]。1.4苍白球外侧部与苍白球内侧部的相关性在大鼠的BG中，按照大脑皮层、纹状体、苍白球外侧部、苍白球内侧部/黑质网状部的顺序，神经元数量逐级递减。单侧大脑半球有17000000个“皮层-纹状体”神经元支配CPu活动，2800000个CPu神经元对身体同侧的46000个GPe神经元产生抑制性作用，8 其中一半的轴突形成直接通路支配3200个GPi神经元和26300个SNr神经元。如图1-7，在GPe和GPi之间存在着直接的纤维投射[49]。由于GPe与GPi之间存在直接的纤维投射，因此可以分析PD病变时两个核团之间相关性的变化，这对于PD发病机制的研究具有重要的意义。由于受到技术的限制，同时记录两个脑区的脑电信号比较困难，截至目前，还没有文献报道PD病变后GPe和GPi两个核团动作电位和局部场电位相关性的变化。图1-7啮齿类基底神经节神经纤维投射图（引自Wilsonetal，2013）注：图中红色矩形框显示GPe和GPi之间存在直接的纤维投射。对于GPe和GPi两个核团之间相关性的分析可以从以下3个角度进行：1、两个核团之间局部场电位相关性的分析，2、两个核团之间动作电位相关性的分析，3、两个核团之间局部场电位与动作电位相关性的分析。本研究主要分析了两个核团之间局部场电位的相关性，包括交叉相关分析和一致性分析，一致性分析包括相位一致性分析、线性一致性分析和时频一致性分析。交叉相关分析和相位一致性分析用基于Matlab主程序的LFPAnalysisSoftware2009软件完成，线性一致性分析用NeuroExplorer软件完成，时频一致性分析用基于Matlab主程序的Chronux软件完成，将多只大鼠的信号构建成数据库，得到平均化的实验结果。此外，可以用Chronux软件编写程序分析两个核团之间动作电位的相关性和局部场电位与动作电位的相关性。9 第二部分实验研究帕金森病大鼠在特定运动状态下GPe和GPi电生理学特征变化及相关性分析2.1前言伴随着人口老龄化社会的到来，PD发病率逐年升高。患者表现为肢体障碍，严重困扰着日常生活。目前关于PD确切的发病机制尚不完全清楚，导致临床上缺乏有效的治疗手段，无法根治此病。近年来，从电生理学角度对PD发病机制的研究再次成为热点，以期探究出高效治疗该病的药物。在BG中存在着3条与PD相关的通路，直接通路：皮层-纹状体-苍白球内侧部-丘脑-皮层，间接通路：皮层-纹状体-苍白球外侧部-底丘脑核-苍白球内侧部-丘脑-皮层，快速通路：黑质-纹状体。本研究中涉及的GPe是BG中重要的中继核团，GPi是BG中两大输出核团之一[9]。前人研究发现，PD病变后GPe和GPi的电生理学特征发生病变[25,46-48]，但是受到技术的限制，大多数的研究是通过采集麻醉状态下动物的脑电信号完成的，由于麻醉剂对神经元的放电活动产生影响，导致实验结果不准确，不能很好的模拟PD患者。与此同时，有研究人员发现正常动物GPe和GPi与运动相关[26,44]，但是在PD病变时GPe和GPi是否与运动相关，是否发生放电异常，不得而知。组织学研究发现，GPe和GPi具有直接的纤维投射[49]，因此，探究PD病变时2个核团之间相关性的变化具有重要的意义。由于受到技术的限制，截止目前，还没有文献报道同时记录2个核团的脑电信号。本研究使用Plexon多通道信号采集系统同时记录清醒静止和连续运动2种状态下PD大鼠GPe和GPi的脑电信号，将有效的解决上述问题。2.2实验材料2.2.1实验动物、实验试剂和主要仪器1、实验动物健康成年雄性Wistar大鼠，购买于山东大学实验动物中心，饲养环境恒定，通风良好，温度控制在25℃左右，湿度控制在50%左右。实验前将大鼠体重控制在280~310g，对大鼠进行行为学检测，确保行为正常。随机选取对照组大鼠15只，实验组大鼠25只。由于10 此实验为慢性实验，实验周期在1~2个月，实验过程中伴有麻醉死亡、行为学训练失败、造模失败、电极脱落、信号不良以及记录位点错误等各种因素的影响，最后选取身体状况良好、信号较好且位点正确的对照组大鼠9只，实验组大鼠14只进行统计学处理(图2-1，图2-2)。6%7%麻醉死亡13%行为学训练失败电极脱落信号不良60%7%记录位点错误成功7%图2-1对照组大鼠实验周期跟踪记录图注：本图仅对成功或失败原因明确的大鼠进行了统计，实际操作中，存在不明原因死亡的大鼠，本图未做统计。8%8%造模失败麻醉死亡12%行为学训练失败电极脱落56%信号不良4%记录位点错误4%成功8%图2-2实验组大鼠实验周期跟踪记录图注：本图仅对成功或失败原因明确的大鼠进行了统计，实际操作中，存在不明原因死亡的大鼠，本图未做统计。2、实验试剂本实验用到的试剂主要有6-羟基多巴胺(美国Sigma公司)、阿扑吗啡(中国药品生物品检定所)、尼氏染液(碧云天生物制药)、水合氯醛(北京精求化工有限责任公司)、甲醛溶液(国11 药集团化学试剂有限公司)、亚铁氰化钾(上海试剂一厂)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)、青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)、自凝牙托水(上海新世纪齿科材料有限公司)、义齿基托树脂(上海医疗器械股份有限公司)和包埋剂(美国赛默飞世尔科技公司)。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)：浓度4µg/µL，用生理盐水配制，其中含有1%的维生素C，以防氧化。配好的试剂用EP管分装，注意避光，放在-80℃冰箱中。阿扑吗啡(apomophine，APO)：浓度0.01%，用生理盐水配制，其中含有0.1%的抗坏血酸。水合氯醛：浓度4%，将4g水合氯醛颗粒溶解于100mL生理盐水中。甲醛溶液：浓度4%，量取40%甲醛母液100mL，溶解于900mL蒸馏水中。75%乙醇：量取95%乙醇75mL，溶解于20mL蒸馏水中。3、主要仪器Plexon多通道信号采集系统(美国Plexon公司)、冰冻切片机(美国赛默飞世尔科技公司)、大鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)、高速直流可调速颅骨钻(韩国Saeshin公司)、-80℃冰箱(济南源畅商贸有限公司)、眼科显微镜(苏州六六视觉眼科股份有限公司)、5µL微量注射器(上海高欣玻璃仪器厂)、显微成像系统(上海徕卡显微系统贸易有限公司)、解剖镜(上海徕卡显微系统贸易有限公司)、冷光源(深圳瑞沃德生命科技有限公司)和电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。如图2-3，Plexon多通道信号采集系统包括信号采集器、显示器、前端放大器、转向器、HeadstageCables和Headstages等。主要的信号分析软件包括OfflineSorter软件和NeuroExplorer软件等。图2-3Plexon多通道信号采集系统12 2.2.2自制跑步机结构和行为学量化测评指标自制跑步机由转轮、红外探测器、滚筒(直径0.54m)、阻挡杆、转杆、木质框架和数据传输线组成(图2-4)。木质框架具有绝缘作用，可以避免电磁场的干扰。红外探测器经过数据传输线与Plexon多通道信号采集系统数字输入端口(DigitalInput)连接。红外打标原理：设置PlexonDigitalInputConfiguration为低电平触发，红外探测器正常处于导通状态，输出高电平(5V)，当阻挡杆跨越红外路径时，由于电路中断，输出低电平(0V)，该低电平触发Plexon多通道信号采集系统自动打标，并以“事件”的形式同步记录在原始信号中。图2-4跑步机结构示意图注：1、转轮，2、红外探测器，3、滚筒，4、阻挡杆，5、转杆，6、木质框架，7、数据传输线，与Plexon多通道信号采集系统数字输入端口相连。行为学量化测评指标包括最长运动时间、步频、失误次数和不连续运动频率等4项[50]。最长运动时间是指从大鼠开始连续运动(T1)到大鼠跌落(T2)所持续的时间，Tmax=T2-T1，Tmax≤30min；在连续运动状态下，大鼠右(左)后肢迈1次定义为1步，步频=步数/时间；失误是指大鼠在30min内由于自身失去控制而从跑步机上跌落，30min内未跌落视为成功，失误次数是指10次重复测评中，大鼠跌落的次数；不连续运动是指大鼠在运动过程中由于跑步机转速相对较慢，大鼠暂停或着由于跑步机转速相对较快，大鼠跳动，暂停1次或跳动1次记为1次不连续运动，不连续运动频率=不连续运动次数/时间。2.2.3自制16通道镍铬合金丝电极阵列1、制作材料13 25μm镍铬合金丝、电极排母座、焊锡、水溶性蜡、绝缘胶棒、地线和近端参考。2、制作过程(1)截取16根镍铬合金丝，一端去绝缘层。(2)将镍铬合金丝、近端参考和地线缠绕在排母座金属杆上，用焊锡固定。(3)将排母座金属杆用绝缘胶包被，将水溶性蜡均匀涂在镍铬合金丝阵列周围，增强机械强度(图2-5)。图2-5镍铬合金丝电极阵列3、电极阵列规格将16根镍铬合金丝分成长短不同的2束，每束8根。较长的1束为4×2排列，即使用正方形排列的4根引导管，每根管内2根镍铬合金丝，内含近端参考；较短的1束为2×4排列，即使用相邻的2根引导管，每根管内4根镍铬合金丝(图2-5)。2.3实验方法2.3.1建立PD大鼠模型实验1、微量注射6-OHDA手术(1)实验准备：检查大鼠脑立体定位仪和微量注射器等实验设备能否正常使用，用医用酒精对手术器械和大鼠脑立体定位仪等进行消毒。14 (2)麻醉：实验组大鼠用于PD大鼠模型的建立，腹腔注射4%水合氯醛将大鼠麻醉。麻醉成功的标准：大鼠呼吸均匀，全身松弛，四肢肌肉无牵张反射[51]。(3)大鼠脑立体定位：将大鼠上颚固定在牙托上，用左手拇指和食指夹住大鼠头部，将左侧耳杆插入大鼠左侧外耳道内，用右手将右侧耳杆插入大鼠右侧外耳道内(图2-6)。固定成功的标准：大鼠出现眨眼反射，颅骨表面处于水平位置，鼻尖正，左右晃动大鼠头部比较困难[52]。图2-6大鼠脑立体定位(4)暴露颅骨：在大鼠眼睛上涂上红霉素眼药膏，用遮眼纸将大鼠双眼遮挡。用剪毛剪将大鼠颅骨表面的毛发剔除干净，沿中线剪开皮毛，开口1cm左右，用医用棉球蘸生理盐水擦拭颅骨表面的软组织，暴露颅骨。(5)确定MFB位点及开窗：内侧前脑束(medialforebrainbundle，MFB)呈条带状分布，分布范围广，根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱(第6版)[53]和与GPe、GPi的相对位置关系确定MFB位点：前囟后1.72mm，旁开2.13mm，深度8.5mm和8.7mm。用颅骨钻定点垂直开窗，用针灸针剥掉窗口处大脑表面的硬脑膜。(6)注射6-OHDA：用5μL微量注射器抽取3μL6-OHDA，将微量注射器固定在大鼠脑立体定位仪单侧臂上(图2-7)，主要操作步骤如下：15 1)将微量注射器尖端移动至MFB窗口处，按照1mm/min的速度将微量注射器尖端向下移动至距颅骨表面8.5mm深度处，停针10min。2)按照1μL/min的速度注射1.5μL6-OHDA，留针10min。3)按照1mm/min的速度将微量注射器尖端向下移动至距颅骨表面8.7mm深度处，停针10min。4)按照1μL/min的速度注射1.5μL6-OHDA，留针10min。5)按照1mm/min的速度将微量注射器尖端向上移动至颅骨表面。图2-7微量注射神经毒素6-OHDA(7)缝合伤口及注射抗生素：将颅骨表面清理干净，用缝合针将伤口缝合，在伤口处涂抹云南白药。手术后将大鼠放在恒温箱内，连续3天皮下注射抗生素，观察大鼠状态。2、APO诱发旋转鉴定手术2周后，选取状态良好的大鼠，颈部肌肉注射0.01%APO诱发旋转。PD大鼠模型成功的标准：恒定向健侧脑方向旋转，30min内平均旋转速度>7r/min[54]。失败的PD大鼠模型表现为，旋转方向不恒定或者向损伤侧脑方向旋转，旋转不连续，旋转速度较慢或不旋转。将该部分大鼠舍弃，不用于后续实验。2.3.2PD大鼠行为学量化测评实验所有对照组大鼠和APO鉴定成功的实验组大鼠用于行为学量化测评，主要步骤如下：1、实验者匀速旋转跑步机训练：以12r/min为例，实验者目视秒表，控制跑步机5s16 匀速旋转1周，每次训练30min。2、大鼠连续运动训练：将大鼠放置在跑步机上，实验者向大鼠头部方向缓慢旋转跑步机，由于恐惧，大鼠迅速转身并跑动，经过多次训练后，大鼠学会连续运动并且消除恐惧心理。训练成功的大鼠，跑动自如，胡须摆动自然，无大小便失禁现象(图2-8)。图2-8训练成功的大鼠连续运动模型3、获取实验数据：实验需要3人配合完成，实验者1匀速旋转跑步机，将2组大鼠分别放在跑步机上，大鼠开始连续运动时，实验者1计时1次，大鼠从跑步机上跌落时，再次计时，两次时间差即为大鼠最长运动时间。在此过程中，实验者2记录大鼠步数，实验者3记录失误次数和不连续运动次数。4、统计分析：实验过程中对9~30r/min进行量化测评，每次增加1r/min。由于相邻转速间各项指标差异不大，所以选取9r/min、15r/min、20r/min和30r/min，分别代表低转速、中转速、高转速和极高转速，用于统计作图。2.3.3基于Plexon多通道信号采集系统的电生理学实验1、植入电极阵列手术(1)实验准备、麻醉、脑立体定位及暴露颅骨：方法与微量注射6-OHDA手术相同。(2)确定GPe、GPi位点及开窗：根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱(第6版)[53]，确定GPe中心位点，前囟后1mm，旁开3mm，深度6.6mm；GPi中心位点，前囟后2.4mm，17 旁开2.9mm，深度7.7mm。在颅骨表面，两个位点距离非常近，仅1.4mm(图2-9)。开窗方法与微量注射6-OHDA手术相同。图2-9GPe、GPi相对位置(3)植入螺钉：在颅骨表面距离目标核团位点相对较远的位置，植入5个螺钉，螺钉尖端刚刚与硬脑膜接触即可，开窗侧2个，对侧3个。(4)植入电极阵列：将电极阵列与Headstage相连，固定在大鼠脑立体定位仪单侧臂上(图2-10)。主要步骤如下：图2-10植入电极阵列手术1)将两根地线“8”字形缠绕在螺钉上，两根地线相互导通。2)将较长的一束电极阵列尖端移动到GPe窗口处，与颅骨平面处于同一水平面上(图2-10)，按照<1mm/min的速度将该束电极阵列缓慢植入GPe，向GPe窗口内注入少量琼脂糖，用速凝型牙科水泥将该束电极阵列固定在颅骨表面的螺钉上。待牙科水泥凝固后，用生理盐水将该束电极阵列外周的水溶性蜡溶解。18 3)将较短的一束电极阵列尖端移动到GPi窗口处，植入电极阵列的过程与GPe相同。4)两束电极阵列植入完毕后，将电极排母调整至颅骨中央，刚刚与颅骨接触，将未植入核团的镍铬合金丝和地线压在电极排母下面，用速凝型牙科水泥将整个电极固定在颅骨表面的螺钉上。(5)手术后处理：手术后将大鼠放在恒温箱内，连续3天皮下注射抗生素，观察大鼠状态，保证食物和水的供应。对于手术后体质下降严重，恢复慢的大鼠，人工喂食，适当延长抗生素注射天数。2、采集脑电信号(1)设置Plexon多通道信号采集系统参数用高阻抗镍铬合金丝可以同时记录到动作电位和局部场电位，通过设置滤波器可以将二者分开。设置动作电位的带通为300~8000Hz，采样率40000Hz；设置局部场电位的带通为0.5~200Hz，采样率为1000Hz。(2)设置PlexControl软件参数设置Gain值为2000；设置阈值线，使信噪比>1:2.5；设置参考类型，A为地线，B为近端参考，根据实际情况选择；勾选目标通道的动作电位、局部场电位和原始信号；设置快捷键，A为暂停，S为开始，Z为停止。(3)采集清醒静止状态下大鼠的脑电信号根据大鼠生活习性和实验经验，在采集信号前一天晚上，保证大鼠食物和水的供应，在采集信号当天上午，大鼠较为安静，适宜采集大鼠在清醒静止状态下的脑电信号。采集信号时，将大鼠放在屏蔽箱内，待大鼠处于清醒静止状态时，开始记录脑电信号，记录时长2~3min。清醒静止状态标准：大鼠清醒，呼吸平稳，安静不动，没有肢体活动(图2-11)。19 图2-11采集清醒静止状态下大鼠的脑电信号(4)采集连续运动状态下大鼠的脑电信号实验需要两人配合完成，实验者1控制跑步机旋转速度为12r/min，实验者2将大鼠放置在跑步机上，大鼠连续运动时，开始记录，记录时长2~3min。与此同时，对大鼠的特定运动进行打标标记，同步记录在原始信号中(图2-12)。图2-12采集连续运动状态下大鼠的脑电信号3、组织学观察组织学观察包括PD大鼠SNc神经元损伤情况的观察，GPe和GPi位点鉴定以及GPe和GPi细胞构筑观察3部分。主要步骤如下：(1)甲醛固定取脑1)试剂配制：将2.5g亚铁氰化钾溶于250mL4%甲醛溶液当中，将溶解好的甲醛溶液倒入点滴瓶中，将250mL生理盐水倒入另一个点滴瓶中。20 2)电刺激：腹腔注射大剂量4%水合氯醛将大鼠处死，迅速将恒压电刺激器(图2-13)连接到大鼠头部的排母座上，通电10s，断电10s，重复5~8次。图2-13恒压电刺激器3)甲醛固定：将大鼠胸腔从胸骨剑突处打开，将输液管针头通过左心室插入主动脉，剪破右心耳，先用生理盐水快速冲血，后用4%甲醛缓慢固定。4)断头取脑：甲醛固定结束30min后，将大鼠头部从颈部剪断，剥取脑组织。(2)后固定、脱水及冰冻切片1)后固定：将脑组织置于4%甲醛溶液中浸泡1周左右。2)脱水：将脑组织转入30%蔗糖溶液中浸泡，3天左右沉入瓶底。3)冰冻切片：冰冻切片机温度控制在-20℃，对脑组织进行连续冠状切片，切片厚约20µm，按照前后顺序贴在载玻片上。(3)尼氏染色1)将尼氏染液用38℃水浴加热。2)将贴有脑组织切片的载玻片置于盛有尼氏染液的染缸中，染色30min。3)将脑组织切片依次经过清水去浮色，75%酒精3s，95%酒精3s，无水乙醇1级1s，无水乙醇2级1s，二甲苯1级3min，二甲苯2级3min。4)加盖盖玻片，用中性树胶封片。(4)显微观察21 分别在40倍、100倍和400倍镜下，观察PD大鼠SNc冠状切面神经元的损伤情况；在40倍镜下，观察GPe和GPi冠状切面针道和蓝点情况；分别在40倍、100倍和400倍镜下，观察GPe和GPi冠状切面神经元细胞构筑。4、分析脑电信号对组织学位点鉴定正确的大鼠进行脑电信号分析。(1)动作电位分析1)将Plexon多通道信号采集系统采集到的动作电位导入OfflineSorter软件，设置滤波器类型，调整阈值线至>1:2.5处，先自动分类，后手动处理，剔除掉干扰信号，根据波形、放电模式和放电率等指标将神经元进行分类。2)将分类后的动作电位信号导入NeuroExplorer软件，分析PD病变后每类神经元放电特征的变化。用于评价放电特征的参数主要包括：波形时程、波形振幅、放电频率、放电间隔直方图、CV值、爆发放电百分含量、放电间隔众数、放电间隔平均数、放电间隔中位数和偏离因子等。(2)局部场电位分析将Plexon多通道信号采集系统采集到的局部场电位导入Matlab，使用LFPAnalysisSoftware2009软件分析PD大鼠GPe和GPi时频、功率谱密度和频段分布的变化；使用LFPAnalysisSoftware2009软件和Chronux软件分析PD大鼠两个核团之间交叉相关性、相位一致性和时频一致性的变化；使用NeuroExplorer软件分析PD大鼠两个核团之间线性一致性的变化。2.3.4统计学分析_采用SPSS16.0软件进行统计分析，数据资料以x±SEM表示。比较对照组和实验组大鼠在不同旋转速度下最长运动时间、步频、失误次数和不连续运动频率的差异用双因素方差分析；比较对照组静止、对照组运动、实验组静止和实验组运动状态下放电率、CV值、ModeISI、偏离因子和爆发放电百分含量的差异用双因素方差分析；比较对照组和实验组大鼠局部场电位各个频段的能量占总能量百分比的差异用重复测量方差分析。两两比较，除了比较CV值用非参数U检验，其余用独立样本T检验，P<0.05为差异有统计学意义。22 2.4实验结果2.4.1PD大鼠模型鉴定结果1、APO诱发旋转鉴定结果在25只实验组大鼠中，由于麻醉剂注射失误，导致2只大鼠死亡。在微量注射6-OHDA手术2周后，对剩余23只大鼠进行APO诱发旋转鉴定，如图2-14A，21只大鼠首尾相连，恒定向健侧脑方向旋转，且30min内平均旋转速度>7r/min(波动范围：9.3~17.6r/min)，视为成功的PD大鼠模型。2只大鼠旋转方向不恒定，舍弃。图B显示，在21只PD大鼠模型中，有4只大鼠出现咬尾自残现象。图2-14APO诱发旋转鉴定图注：所有实验组大鼠右侧脑注射6-OHDA，右侧为损伤侧，左侧为健侧。图B为咬尾自残现象。2、组织学鉴定结果对21只PD大鼠模型SNc进行连续冠状切片，尼氏染色，观察损伤侧脑SNc神经元的损伤情况。对比图2-15A、B，在40倍镜下，PD大鼠健侧脑SNc神经元呈明显的条带状分布；损伤侧脑SNc神经元分布离散，条带消失。对比图C、D，在100倍镜下，PD大鼠健侧脑SNc神经元数量多，排列密集，着色较深；损伤侧脑SNc神经元数量少，排列稀疏，着色较浅。对比图E、F，在400倍镜下，PD大鼠健侧脑SNc神经元结构完整，轴突明显，个体较大，核质分明，数量较多；损伤侧脑SNc神经元受到损伤，没有完整的神经元结构，胞质萎缩，细胞核不明显，出现大量个体较小的胶质细胞。23 图2-15PD大鼠黑质尼氏染色冠状切片图注：图A，图C，图E为健侧脑黑质冠状切片，放大倍数分别为40倍，100倍，400倍；图B，图D，图F为损伤侧脑黑质冠状切片，放大倍数分别为40倍，100倍，400倍；图A中箭头指示SNc神经元呈条带状分布，图B中箭头指示SNc神经元条带状分布消失。2.4.2PD大鼠行为学量化测评结果行为学训练成功的13只对照组大鼠和18只实验组大鼠用于统计分析。对2组大鼠在不同旋转速度下的各项指标进行分析，结果如下：表2-1，图2-16A显示，在20r/min和30r/min时，PD大鼠最长运动时间变短(P=0.03，P<0.01)。图B显示，在20r/min和30r/min时，PD大鼠步频降低(P=0.04，P<0.01)。图C显示，在9r/min，15r/min，20r/min和30r/min时，PD大鼠失误次数增多(P=0.04，P=0.04，24 P<0.01，P<0.01)。图D显示，在9r/min和30r/min时，PD大鼠不连续运动频率降低(P=0.03，P<0.01)；在15r/min和20r/min时，PD大鼠不连续运动频率升高(P=0.02，P<0.01)。在12r/min时，2组大鼠不连续运动频率较低，适宜采集大鼠在连续运动状态下的脑电信号。_表2-1行为学量化测评指标统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01，对照组n=13只，实验组n=18只。图2-16行为学量化测评指标统计图注：图D中箭头指示处对应的旋转速度为12r/min。25 2.4.3组织学位点鉴定和细胞构筑分析1、组织学位点鉴定经过5~8次间断性电刺激后，镍铬合金丝尖端释放大量的铁离子，与亚铁氰化钾形成蓝色络合物普鲁士蓝，在电极尖端可见蓝色痕迹。化学反应式如下：4FeCl+3KFe(CN)→[Fe(CN)]+12KCl。3463图2-17A、B中箭头指示处，可见明显的蓝色痕迹，此处即为镍铬合金丝尖端位点。经与Paxinos和Watson大鼠脑图谱(第6版)[53]比对，电极位点准确。图C、D显示，对照组大鼠有7个正确的GPe位点，6个正确的GPi位点；实验组大鼠有8个正确的GPe位点，8个正确的GPi位点。图2-17GPe、GPi组织学位点鉴定图注：图A、图B中箭头指示处为镍铬合金丝尖端位点，图C、图D中1个黑色或灰色点代表1个核团位点。BL：基底外侧杏仁核，CPu：纹状体，Ce：中央杏仁核，D3V：第3脑室，ic：内囊，LV：侧脑室。26 2、GPe、GPi细胞构筑分析对9只对照组大鼠和14只实验组大鼠的GPe、GPi冠状切片进行尼氏染色，因为电极植入侧脑组织受到电刺激被损伤，所以观察对侧脑的细胞构筑情况。图2-18GPe、GPi细胞构筑对比图注：图A，图C，图E为GPe冠状切片，尼氏染色，放大倍数分别为40倍，100倍，400倍；图B，图D，图F为GPi冠状切片，尼氏染色，放大倍数分别为40倍，100倍，400倍；图C，图D分别为图A，图B中方框的放大图。Ce：中央杏仁核，CPu：纹状体，ic：内囊，LV：侧脑室，TS：三角隔核。对比图2-18A、B，GPe位于CPu内侧，CPu神经元密集，着色较深，GPe神经元相27 对稀疏，着色较浅，故称为苍白球，CPu与GPe的边界线较为清晰；GPi位于ic脚的位置，故称脚内核，周围没有其他核团，神经元聚集成堆。对比图C、D，GPe、GPi神经元均呈网格状分布，GPe的网格近似矩形，GPi的网格近似圆形，网孔更加清晰。对比图E、F，GPe、GPi神经元的形状相似，主要有(椭)圆形、梭形和多角形3种形状。2.4.4PD大鼠GPe动作电位分析结果1、GPe神经元分类(1)GPe神经元原始信号及波形对比对2组大鼠GPe神经元原始信号及波形进行比较，GPe神经元表现为2种类型，如图2-19A为第1类，其特征是放电率高，出现放电暂停现象，故将其命名为伴随放电暂停的高频率放电(highfrequencypausers，HFP)；图B为第2类，其特征是放电率低，出现爆发放电现象，故将其命名为伴随爆发放电的低频率放电(lowfrequencybursters，LFB)。HFP和LFB在PD病变后仍然可以根据上述特征进行区分，但是2类神经元的波形时程没有差异。因此，根据放电率和放电模式的不同，将GPe神经元分为2类，即HFP和LFB。图2-19GPe神经元原始信号及波形对比图注：图中红色箭头表示自发的放电暂停现象，图中绿色箭头表示爆发放电现象，图中黑色箭头表示1次动作电位的展开图，2条浅灰色线之间持续的时间表示时程(Duration)。(2)GPe神经元分类依据对来自7只对照组大鼠的47个GPe神经元进行分析，其中28个神经元为HFP，19个神经元为LFB，所占比例分别为59.57%和40.43%。28 分析指标：1)放电率：单位时间内神经元产生动作电位的次数。2)聚类分析：综合神经元动作电位的多项指标，将不同的神经元各自聚集成堆，直观的反应神经元的种类。3)变异系数(coefficientofvariation，CV)：用于表示神经元放电的规则程度，数值越大表示放电越不规则。4)爆发放电百分含量：表示爆发放电中动作电位的次数占全部动作电位次数的百分含量。5)放电间隔直方图(interspikeintervalhistograms，ISIH)：放电间隔是指相邻2次动作电位之间间隔的时间，ISIH表示放电间隔的分布，能够直观的反应放电模式。表2-2，图2-20A显示，HFP平均放电率高于LFB，HFP放电率分布较为离散，LFB放电率分布较为集中；图B显示，HFP和LFB聚集成2堆，表明是2种不同类型的神经元；图C显示，LFB的CV值大于HFP，表明LFB放电模式更加不规则；图D显示，LFB的爆发放电百分含量较高，HFP的爆发放电百分含量较低，表明LFB中存在大量的爆发放电，HFP中爆发放电较少；图E显示，HFP放电间隔直方图呈现为典型的“泊松分布”，表明放电较为规则；图F显示，LFB放电间隔直方图呈现为典型的正态分布，表明含有大量的爆发放电，放电不规则。_表2-2GPe神经元分类依据指标统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。29 图2-20GPe神经元分类依据指标统计图注：HFP用浅绿色表示，LFB用浅蓝色表示；图B中PC1、PC2表示坐标纬数，1个点代表1次动作电位。2、PD大鼠GPe动作电位的变化对照组共采集到HFP(28)+LFB(19)=47个神经元，来自7只大鼠，其中HFP和LFB的比例分别为59.57％和40.43％；实验组共采集到HFP(24)+LFB(16)=40个神经元，来自8只大鼠，其中HFP和LFB的比例分别为60％和40％。分析指标：放电率、CV值、放电间隔众数和爆发放电百分含量。放电间隔众数(ModeISI)：是指出现次数最多的放电间隔，表示放电间隔的平均水平。将PD损伤因素和运动状态因素对HFP、LFB放电活动的影响进行双因素方差分析，结果如下：(1)PD大鼠HFP动作电位的变化30 表2-3，图2-21A显示，PD大鼠HFP的放电率降低(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠HFP的放电率升高(Pcontrol=0.03，Plesioned=0.03)；图B显示，PD大鼠HFP的CV值增大(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠HFP的CV值增大(Pcontrol<0.01，Plesioned<0.01)；图C显示，PD大鼠HFP的Mode值增大(Pstill<0.01，Pmovement=0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠HFP的Mode值减小(Pcontrol<0.01，Plesioned<0.01)；图D显示，PD大鼠HFP的爆发放电百分含量升高(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)。_表2-3HFP动作电位分析指标统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01，对照组与实验组对比分析；#P＜0.05，##P＜0.01，静止状态与运动状态对比分析。图2-21HFP动作电位分析指标统计图31 (2)PD大鼠LFB动作电位的变化表2-4，图2-22A显示，PD大鼠LFB的放电率降低(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠LFB的放电率升高(Pcontrol=0.01，Plesioned<0.01)；图B显示，PD大鼠LFB的CV值增大(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)；图C显示，PD大鼠LFB的Mode值增大(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠LFB的Mode值减小(Pcontrol<0.01，Plesioned=0.04)；图D显示，PD大鼠LFB的爆发放电百分含量升高(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)。_表2-4LFB动作电位分析指标统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01，对照组与实验组对比分析；#P＜0.05，##P＜0.01，静止状态与运动状态对比分析。图2-22LFB动作电位分析指标统计图32 2.4.5PD大鼠GPi动作电位分析结果1、GPi神经元放电特征对2组大鼠GPi神经元的原始信号及波形进行分析，GPi只有1种类型的神经元。如图2-23A显示，GPi神经元放电率高，放电规则，在PD病变后出现放电暂停和爆发放电现象；图B显示，GPi神经元放电间隔直方图呈现为典型的“泊松分布”，表明放电规则；图C显示，GPi神经元聚集成1堆，表明只有1类神经元。图2-23GPi神经元放电特征图注：图A中箭头a指示放电暂停现象，箭头b指示爆发放电现象；图C中PC1、PC2、PC3表示坐标维数，1个点代表1次动作电位。2、PD大鼠GPi动作电位的变化对照组共采集到27个GPi神经元，来自6只大鼠；实验组共采集到21个GPi神经元，来自8只大鼠。分析指标：放电率、CV值、放电间隔众数和偏离因子。偏离因子(AsymmetryIndex)：是指放电间隔众数(ModeISI)与放电间隔平均数(MeanISI)的比值，该值越接近1表示放电越规则。将PD损伤因素和运动状态因素对GPi放电活动的影响进行双因素方差分析，结果如下：表2-5，图2-24A显示，PD大鼠GPi的放电率升高(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠GPi的放电率升高(Pcontrol=0.03，Plesioned<0.01)；图B显示，PD大鼠GPi的CV值增大(Pstill<0.01，Pmovement<0.01)，在连续运动状态下，2组大鼠GPi的CV值33 增大(Pcontrol<0.01，Plesioned=0.03)；图C显示，在清醒静止状态下，PD大鼠GPi的Mode值减小(Pstill=0.045)，在连续运动状态下，其Mode值不变(Pmovement=0.89)；图D显示，在清醒静止状态下，PD大鼠GPi的偏离因子减小(Pstill=0.04)，更偏离1，在连续运动状态下，其偏离因子不变(Pmovement=0.71)。_表2-5GPi动作电位分析指标统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01，对照组与实验组对比分析；#P＜0.05，##P＜0.01，静止状态与运动状态对比分析。图2-24GPi动作电位分析指标统计图2.4.6PD大鼠GPe局部场电位分析结果7只对照组大鼠和8只实验组大鼠的GPe局部场电位信号用于统计分析。对2组大鼠34 不同频段的能量占总能量(0.5~200Hz频段的能量)的百分比的差异进行重复测量方差分析。分析指标：(1)时频(Spectrogram)：横坐标表示时间，纵坐标表示频率，从蓝色至红色表示能量逐渐升高，颜色越深表示能量越高，可以直观的反应不同时间不同频段能量的高低。(2)功率谱密度(powerspectraldensity，PSD)：横坐标表示频率，纵坐标表示功率值，线性表示不同频率对应功率值的大小，本研究使用Welch算法。(3)频段分布(SpectralDecomposition)：横坐标表示频段，纵坐标表示百分含量，用于表示不同频段的能量占总能量的百分比，本研究分析的频段为0.5~12Hz、12~35Hz、35~70Hz和70~100Hz。1、清醒静止状态下，PD大鼠GPe局部场电位的变化对比图2-25A、B，与正常大鼠相比，PD大鼠在0.5~12Hz频段颜色变浅，表明能量降低；在12~35Hz频段颜色变深，表明能量升高；图C显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段功率值降低，在12~35Hz频段功率值升高，在18Hz附近功率值显著升高；表2-6，图D显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段的能量占总能量的百分比降低(P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P<0.01)。_表2-6清醒静止状态下，PD大鼠GPe局部场电位变化情况统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。35 图2-25清醒静止状态下，PD大鼠GPe局部场电位变化情况统计图2、连续运动状态下，PD大鼠GPe局部场电位的变化对比图2-26A、B，与正常大鼠相比，PD大鼠在0.5~12Hz频段颜色变浅，表明能量降低，在12~35Hz和35~70Hz频段颜色变深，表明能量变高；图C显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段功率值降低，在12~35Hz和35~70Hz频段功率值升高，在35Hz附近功率值显著升高；表2-7，图D显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段的能量占总能量的百分比降低(P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P<0.01)，在35~70Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P=0.04)。_表2-7连续运动状态下，PD大鼠GPe局部场电位变化情况统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01。36 图2-26连续运动状态下，PD大鼠GPe局部场电位变化情况统计图2.4.7PD大鼠GPi局部场电位分析结果6只对照组大鼠和8只实验组大鼠的GPi局部场电位信号用于统计分析。对2组大鼠不同频段的能量占总能量(0.5~200Hz频段的能量)的百分比的差异进行重复测量方差分析。分析指标：时频、功率谱密度和频段分布。1、清醒静止状态下，PD大鼠GPi局部场电位的变化对比图2-27A、B，与正常大鼠相比，PD大鼠在0.5~12Hz频段颜色变浅，表明能量变低，在12~35Hz频段颜色变深，表明能量变高；图C显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段功率值降低，在12~35Hz频段功率值升高，在20Hz附近功率值显著升高；表2-8，图D显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段的能量占总能量的百分比降低(P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P<0.01)。37 _表2-8清醒静止状态，PD大鼠GPi局部场电位变化情况统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。图2-27清醒静止状态，PD大鼠GPi局部场电位变化情况统计图2、连续运动状态下，PD大鼠GPi局部场电位的变化对比图2-28A、B，与正常大鼠相比，PD大鼠在0.5~12Hz频段颜色变浅，表明能量变低，在12~35Hz和35~70Hz频段颜色变深，表明能量变高；图C显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段功率值降低，在12~35Hz和35~70Hz频段功率值升高，在15~45Hz附近功率值显著升高；表2-9，图D显示，PD大鼠在0.5~12Hz频段的能量占总能量的百分比降低(P<0.01)，在12~35Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P<0.01)，在35~70Hz频段的能量占总能量的百分比升高(P<0.01)。38 _表2-9连续运动状态下，PD大鼠GPi局部场电位变化情况统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。图2-28连续运动状态下，PD大鼠GPi局部场电位变化情况统计图2.4.8PD大鼠GPe与GPi相关性分析结果将同时记录到GPe与GPi信号的大鼠用于相关性分析，对照组大鼠4只，实验组大鼠4只。相关性分析包括交叉相关分析和一致性分析，一致性分析包括线性一致性分析、相位一致性分析和时频一致性分析。GPe、GPi局部场电位分析结果提示，无论正常大鼠还是PD大鼠，局部场电位信号主要分布在0.5~12Hz和12~35Hz频段，并且PD大鼠主要在0.5~12Hz和12~35Hz频段发39 生异常。因此，选取0.5~12Hz和12~35Hz频段的信号用于分析PD大鼠GPe与GPi之间局部场电位相关性的变化。1、Cross-CorrelationAnalysis(1)两组大鼠GPe与GPi局部场电位分频段信号对比对2组大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段的信号进行对比分析。对比图2-29A、B，与正常大鼠相比，PD大鼠GPe与GPi在0.5~12Hz频段的波形重叠性增强，表现为“同上同下”；对比图C、D，PD大鼠GPe与GPi在12~35Hz频段的波形重叠性更强，几乎完全同步。表明PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段的同步性都增强。图2-29两组大鼠GPe与GPi局部场电位分频段信号对比图(2)PD大鼠GPe与GPi局部场电位交叉相关性分析表2-10，图2-30显示，与正常大鼠相比，PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz频段的交叉相关系数增大(P<0.01)；在12~35Hz频段的交叉相关系数增大(P<0.01)。表明PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段的同步性都增强。40 _表2-10PD大鼠GPe与GPi局部场电位交叉相关系数变化情况统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。图2-30PD大鼠GPe与GPi局部场电位交叉相关系数变化情况统计图2、CoherenceAnalysis(1)相位分析对2组大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段的相位差进行比较。用玫瑰图直观显示相位差，以GPe为参考，显示GPi的分布范围，分布范围越狭窄，越集中在小角度(30°~330°)范围内，表明GPe与GPi局部场电位的同步性越强。1)两组大鼠GPe与GPi局部场电位分频段相位差对比对比图2-31A、B和图C、D，在0.5~12Hz和12~35Hz频段，正常大鼠GPe与GPi局部场电位相位差分布离散，分布范围广；PD大鼠GPe与GPi局部场电位相位差分布范围狭窄，主要集中在小角度范围内。表明PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和41 12~35Hz频段的同步性都增强。图2-31两组大鼠GPe与GPi局部场电位分频段相位差对比图(玫瑰图)2)PD大鼠GPe与GPi局部场电位平均相位一致性分析表2-11，图2-32显示，与正常大鼠相比，PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz频段的平均相位一致性值增大(P<0.01)；在12~35Hz频段的平均相位一致性值增大(P<0.01)。表明PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段的同步性都增强。_表2-11PD大鼠GPe与GPi局部场电位平均相位一致性值变化情况统计表(x±SEM)注：**P＜0.01。42 图2-32PD大鼠GPe与GPi局部场电位平均相位一致性值变化情况统计图(2)线性分析图2-33显示，在0.5~35Hz频段，PD大鼠GPe与GPi局部场电位的线性一致性曲线位于正常大鼠的上方，表明PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~35Hz频段的线性一致性值增大，同步性增强。图2-33PD大鼠GPe与GPi局部场电位线性一致性值变化情况统计图43 (3)时频分析对比图2-34A、B，正常大鼠在0.5~35Hz频段颜色较浅，表明正常大鼠GPe与GPi局部场电位在该频段相关性较弱；PD大鼠在0.5~35Hz频段颜色较深，表明PD鼠GPe与GPi局部场电位在该频段相关性较强。由此说明，PD大鼠GPe与GPi局部场电位在0.5~35Hz频段的同步性增强。图2-34PD大鼠GPe与GPi局部场电位时频一致性变化情况统计图2.5讨论2.5.1根据上游核团信号确定电极植入位点在电生理学实验中，研究人员首先根据大脑图谱确定核团中心位点，然后将电极植入，由于核团位置较深，导致电极植入准确率较低[55-56]。在临床上，利用电子计算机断层扫描(computedtomography，CT)[57]和磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)[58]技术，可以较好的解决上述问题，但是由于手术费用昂贵，无法应用于动物学实验。为了提高电极植入的准确性，一方面需要熟练的掌握实验操作技术，另一方面可以根据目标核团上游核团的放电特征判断电极植入位点是否准确[59]。本研究对GPe、GPi部分上游核团的放电特征进行分析，结果如下：根据大脑图谱，GPe中心位点的坐标为：前囟后1mm，旁开3mm，深度6.6mm。在植入电极的过程中，在0.4~2.8mm深度范围内，监测到神经元放电，根据Ungerleider等对第一躯体感觉皮层(primsomatosenshindlimb，S1HL)神经元放电特征的报道，证实该区域为S1HL[60]。如图2-35(上)所示，本研究记录到的S1HL神经元放电模式不规则，伴有爆发放电，波形时程较短，振幅较高。在3.4~5.0mm深度范围内，再次监测到神经元放电，根据WuJF等对纹状体(caudateputamen，CPu)神经元放电特征的报道，证实该区域为44 CPu[61]。如图2-35(下)所示，本研究记录到的CPu神经元放电率高，放电模式规则，波形时程较长，振幅较高。从5mm开始进入GPe，根据S1HL和CPu神经元的波形和放电模式，可以动态监测电极植入位点是否正确。图2-35GPe上游核团放电模式和波形图根据大脑图谱，GPi中心位点坐标为：前囟后2.4mm，旁开2.9mm，深度7.7mm。在植入电极的过程中，在2.9~3.6mm深度范围内，监测到神经元放电，根据KatonL等对海马(hippocampus，CA)神经元放电特征的报道，证实该区域为CA[62]。图2-36(上)显示，本研究记录到的CA神经元放电率高，放电模式不规则，伴有放电暂停和爆发放电现象，波形时程较长，形似“对号”。在5.8~6.9mm深度范围内，再次监测到神经元放电，根据KimuraA等对丘脑腹后外侧核(ventralposterolatthalamicnu，VPL)神经元放电特征的报道，证实该区域为VPL[63]。图2-36(中)显示，本研究记录到的VPL神经元放电率较低，放电模式不规则，波形时程较长。在6.9~7.18mm深度范围内，再次监测到神经元放电，根据PazoJH等对丘脑网状核(reticularthalamicnu，Rt)神经元放电特征的报道，证实该区域为Rt[64]。图2-36(下)显示，本研究记录到的Rt神经元放电模式不规则，波形时程较长。在7.2~7.5mm深度范围内为内囊(internalcapsule，ic)，没有神经元放电活动，从7.5mm开始进入GPi。根据CA、VPL、Rt和ic的放电特征可以动态监测电极植入位点是否正确。45 图2-36GPi上游核团放电模式和波形图2.5.2GPe、GPi神经元放电特征分析本研究共采集到3种不同类型的神经元，对放电率和放电模式进行分析，发现3种神经元存在差异。GPi神经元放电率高，放电模式规则(图2-23)；LFB神经元放电率低，放电模式不规则，伴有爆发放电(图2-19B)；HFP神经元放电率较高，介于GPi和LFB之间，放电模式较规则，伴有放电暂停现象(图2-19A)。本研究得到的结果与Benhamou等对大鼠GPe、GPi放电特征的研究结果一致[36,42]。对3种神经元的波形进行分析，发现2种GPe神经元的波形时程没有差异(图2-19)，但是与GPe相比，GPi神经元时程(ms)较长(0.23±0.007vs0.12±0.004，P<0.01)。Azzedine等对大鼠GPe神经元进行特异性荧光标记，证实几乎所有的GPe神经元都为γ-氨基丁酸能神经元，主要有2种亚型，释放不同的伴随递质，1种释放PV，另1种释放PPE[25]。因此，根据Azzedine等的研究结果，从组织学上可以推测，由于2种GPe神经元都是γ-氨基丁酸能神经元，所以从波形上无法将二者区分开；但是由于2种神经元释放不同的伴随递质，所以二者具有不同的放电率和放电模式。观察图2-18发现，GPe和GPi神经元形状相似，主要有(椭)圆形、梭形和多角形3种形状。从7个GPe核团和14个GPi核团中随机选取各种形状的神经元各20个，对其大小进行测量。表2-12显示，GPi每种形状神经元的大小都大于GPe对应形状神经元的大小，GPi神经元的平均大小大于GPe神经元的平均大小。46 _表2-12GPe、GPi神经元形状、大小(μm)统计表(x±SEM)注：*P＜0.05，**P＜0.01，括号里面的数字表示个数，本实验未对GPe、GPi神经元数量进行统计。将GPe、GPi神经元大小与其波形时程进行对比分析，图2-37显示，与GPe相比，GPi神经元大(过核最短直径)，其波形时程长，推测GPi神经元波形时程长与神经元大有关。图2-37GPe、GPi神经元大小与波形时程对比图2.5.3PD大鼠GPe电生理学实验结果的探讨本研究根据放电率和放电模式将GPe神经元分成2种类型：HFP和LFB。HFP数量较多，约占60%，放电率高，放电模式规则；LFB数量较少，约占40%，放电率低，放电模式不规则，伴有爆发放电。Mallet和Dodson等采用组织学与电生理学相结合的方式对GPe进行研究，图1-3，图1-4和图2-38显示，GPe主要有2种亚型的γ-氨基丁酸能神经元，第1种神经元主要向下投射到STN、GPi和SNr，少数向上投射到CPu，主要负责调控下47 游的BG核团，该类神经元放电率高，放电模式规则，数量较多，约占66%；第2种神经元只向上投射到CPu，起到反馈调控的作用，该类神经元放电率低，放电模式不规则，数量较少，约占33%[21,26]。上述研究，根据功能不同将GPe神经元分成2种类型，这为本研究从电生理学角度将GPe神经元分成2类提供了依据。此外，上述研究证实高频率放电神经元的数量较多，解释了本研究中采集到HFP较多的现象。图2-38GPe神经元放电模式对比图（引自Dodsonetal，2015）注：Dodson等对转录因子进行特异性荧光标记，用于识别神经元种类。本研究发现，PD大鼠GPe神经元放电率降低，放电模式规则性降低，局部场电位在α频段(0.5~12Hz)能量异常降低，在β频段(12~35Hz)能量异常升高。本研究得到的结果与Azzedine等报道的麻醉状态下PD大鼠GPe的变化趋势一致[25]。由于GPe的放电活动受到麻醉剂的抑制作用，其神经元放电率、放电模式和LFP都会受到影响，因此，本研究得到的结果与Azzedine等的结果不完全一致。本研究通过记录清醒状态下GPe的脑电信号，避免了麻醉剂的影响，研究结果更加准确。如图1-2，在正常状态下，来自黑质的DA递质与CPu中D2受体结合，对CPu中间接通路相关的γ-氨基丁酸能神经元起到抑制作用。在PD病变时，由于SNc受到损伤，导致通过“黑质-纹状体”通路释放到CPu中的DA递质减少。DA递质的减少对CPu中D2受体的抑制作用减弱，导致相应的γ-氨基丁酸能神经元异常兴奋，将过量的γ-氨基丁酸释放到GPe中，最终导致GPe的放电活动受到抑制。推测上述病变导致了PD大鼠GPe神经元放电率异常降低，放电模式异常不规则，局部场电位β频段能量异常升高。本研究发现，在运动状态下，2种GPe神经元平均放电率均升高，放电模式规则性均降低。统计结果显示，大约50%的HFP放电率升高，8%的HFP放电率不变，42%的HFP放电率降低，HFP平均放电率升高；所有LFB放电率都升高。上述结果与GalvanA等对正常大鼠GPe在运动状态下放电特征的研究结果基本一致[26]。此外，本研究还对PD大鼠GPe在运动状态下的放电特征进行研究，研究结果表明，PD大鼠HFP放电率表现为部分升高，部分降低，部分不变，比例与正常大鼠相似，平均放电率升高；所有LFB放电率都升高。据此可以推测，正常大鼠和PD大鼠GPe神经元的放电活动都受到运动的影响，GPe48 与运动相关，大鼠通过控制GPe神经元放电率的变化，调控运动。2.5.4PD大鼠GPi电生理学实验结果的探讨本研究只采集到1种类型的GPi神经元，其放电率高，放电模式规则。Miyamoto等利用特异性免疫荧光标记技术证实，90%以上的GPi神经元为γ-氨基丁酸能神经元[39]，这为本研究从电生理学角度将GPi神经元归为1类提供了证据。Vanessa等对猴子GPi神经元的放电活动进行研究，结果表明，按照GPi神经元的电生理学特征，只有1类神经元[43]。该研究从其他种属的角度进一步为本研究将GPi神经元归为1类提供了证据。本研究发现，在植入电极的过程中，GPi神经元几乎没有放电活动，但是大鼠苏醒后，GPi神经元放电活动恢复。Benhamou等研究发现，异氟烷等麻醉剂可以抑制GPi神经元的放电活动，并且随着麻醉剂浓度的升高，抑制作用更加明显[42]。据此可以推断，本研究中使用的水合氯醛抑制了GPi神经元的放电活动，由此提示，在手术过程中应该适当降低麻醉剂的注射剂量。本研究发现，PD大鼠GPi神经元放电率升高，放电模式规则性降低，局部场电位在α频段(0.5~12Hz)能量异常降低，在β频段(12~35Hz)能量异常升高。受到技术的限制，之前对GPi的研究大多是通过记录动物麻醉状态下的脑电信号进行的，Kaneoke，GalvanA等对麻醉状态下PD大鼠GPi神经元的放电特征进行研究[46,65]，本研究得到的结果与Kaneoke，GalvanA等得到的趋势基本一致，但结果相差较大。Benhamou等报道麻醉剂对GPi神经元的放电活动产生明显的抑制作用，尤其在高浓度麻醉剂状态下，GPi神经元几乎不放电[42]，因此，在动物麻醉状态下得到的研究结果准确性较低，无法得出可靠的结论。本研究通过采集清醒状态下大鼠GPi的动作电位和LFP，大大提高了实验的准确性，能更准确的探究PD病变后GPi放电特征的变化，能更好的模拟PD患者，为临床治疗PD提供更加可靠地研究结论。在正常状态下，来自黑质的DA递质与CPu中D1受体结合，对CPu中与直接通路相关的γ-氨基丁酸能神经元起到兴奋作用。在PD病变时，SNc中DA能神经元受到损伤，通过“黑质-纹状体”通路释放到CPu中的DA递质减少，对CPu中D1受体的兴奋作用减弱，导致释放到GPi中的γ-氨基丁酸减少。与此同时，在PD病变时GPe抑制性增强，从GPe释放到GPi的γ-氨基丁酸减少。两种因素共同导致GPi的抑制作用降低，最终导致GPi放电活动异常升高。推测上述病变导致了PD大鼠GPi神经元放电率异常升高，放电模式异常不规则，局部场电位β频段能量异常升高。49 2.5.5PD大鼠GPe与GPi相关性实验结果的探讨本研究发现，PD大鼠GPe与GPi之间局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段交叉相关系数增大，平均相位一致性值增大，线性一致性值增大，表明PD大鼠GPe与GPi之间局部场电位在0.5~12Hz和12~35Hz频段同步性都增强。Wilson研究发现，GPe与GPi之间存在直接的纤维投射[49]，这为本研究探究PD大鼠GPe-GPi同步性的变化奠定了基础。本研究对GPe、GPi局部场电位的研究发现，GPe、GPi局部场电位绝大多数信号都分布在0.5~12Hz和12~35Hz频段，PD大鼠在0.5~12Hz和12~35Hz频段发生异常，据此可以推测，PD大鼠GPe、GPi局部场电位的异常导致GPe与GPi之间局部场电位同步性的异常增强。50 总结1、本研究创建了一套较为完善的PD大鼠行为学量化测评体系，能够有效的评价PD大鼠运动障碍症状，并且筛选出了适宜PD大鼠连续运动的跑步机旋转速度。2、本研究使用Plexon多通道信号采集系统同时记录PD大鼠GPe、GPi动作电位和局部场电位，然后用OfflineSorter软件、NeuroExplorer软件、Matlab软件对信号进行分析。得到如下结论：PD大鼠GPe神经元放电率降低，放电模式规则性降低，局部场电位β波段能量异常升高；PD大鼠GPi神经元放电率升高，放电模式规则性降低，局部场电位β波段能量异常升高；PD大鼠GPe与GPi之间局部场电位在α波段和β波段同步性都异常增强。创新点：1、实验技术方面的创新：创建了一套基于红外线识别系统的动物行为学量化测评体系，能够对大鼠等小个体动物的行为进行量化测评，可用于建立动物运动模型。制作简单，操作方便，能够灵活控制转速。2、实验结果方面的创新：使用Plexon信号采集系统同时记录清醒状态GPe、GPi脑电信号，首次得出PD大鼠GPe-GPi同步性增强的结论，为临床治疗PD提供了更为可靠的电生理学依据。进一步实验的建议：1、通过药物干预，进一步研究与GPe、GPi相关的PD发病机制，例如向CPu核团内注射D1受体、D2受体阻断剂或激动剂。2、开展膜片钳实验，细胞内记录神经元信号，将细胞内记录与细胞外记录相结合，增强研究的准确性和科学性。3、将组织学技术应用到电生理学实验中，例如使用细胞旁标记技术，特异性免疫荧光标记技术，能够准确的确定神经元类型。51 参考文献[1]RijkMC,MoniqueMB,GravelandGA,etal.PrevalenceofParkinson’sdiseaseintheelderly:Therotterdamstudy.Neurology,1996,45(12):2143-2146.[2]ChlondM,BergmannF,GüthlinC,etal.PatienteducationforpatientswithParkinson’sdisease:Arandomisedcontrolledtrial.BasalGanglia,2016,6(1):25-30.[3]ChekaniF,VishalMD,RajenderMS,etal.QualityoflifeofpatientswithParkinson’sdiseaseandneurodegenerativedementia:Anationallyrepresentativestudy.ResearchinSocialandAdministrativePharmacy,2015,28:1-10.[4]CuboE,RojoA,RamosS,etal.TheimportanceofeducationalandpsychologicalfactorsinParkinson’sdiseasequalityoflife.EuropeanJournalofNeurology,2002,9(6):589-593.[5]张丽娟,邵海涛,王跃秀,等.帕金森病研究进展.生命科学,2014,26:560-570.[6]FarrerMJ,KachergusJ,FornoLS,etal.Comparisonofkindredswithparkinsonismandalpha-synucleingenomicmultiplications.AnnNeurol,2004,55(2):174-179.[7]JandaE,IsidoroC,CarresiC,etal.DefectiveautophagyinParkinson’sdisease:Roleofoxidativestress.MolecularNeurobiology,2012,46(3):639-661.[8]郭春彦,陈忻.铁与帕金森病关系研究进展.中国实验动物学报,2011,19(4):S3-S8.[9]VerstraetenA,TheunsJ,BroeckhovenCV.ProgressinunravelingthegeneticetiologyofParkinsondiseaseinagenomicera.CellPress,2015,31(3):140-149.[10]SleemanI,BoshoffEL,DutyS.Fibroblastgrowthfactor-20protectsagainstdopamineneuronlossinvitroandprovidesfunctionalprotectioninthe6-hydroxydopamine-lesionedratmodelofParkinson’sdisease.Neuropharmacology,2012,63(7):1268-1277.[11]WarrenC,OlanowMD,KieburtzMD,etal.Factorspredictiveofthedevelopmentoflevodopa-induceddyskinesiaandwearing-offinParkinson’sdisease.MovementDisorders,2013,28(8):1064-1071.[12]PerezS,ReyMV,MontastrucJL,etal.Adversedrugreactionswithselegilineandrasagilinecomparedtolevodopaandropinirole:AstudyintheFrenchpharmacovigilancedatabase.NeurologicalSciences,2013,333:e129-e130.[13]SchapiraAHV.ComplexI:Inhibitors,inhibitionandneurodegeneration.ExperimentalNeurology,2010,224:331-335.[14]RobertA,HauserMD,MarkF,etal.Long-termoutcomeofearlyversusdelayedrasagilinetreatmentinearlyParkinson’sdisease.MovementDisorders,2009,24(4):564-573.[15]DrouotX,OshinoS,JarrayaB,etal.FunctionalrecoveryinaprimatemodelofParkinson’sdiseasefollowingmotorcortexstimulation.Neuron,2004,44(5):769-778.[16]ObesoJA,LanciegoJL.Past,present,andfutureofthepathophysiologicalmodelofthebasalganglia.FrontiersinNeuroanatomy,2011,5(39):1-6.52 [17]BlandiniF,NappiG,TassorelliC,etal.FunctionalchangesofthebasalgangliacircuitryinParkinson’sdisease.ProgressinNeurobiology,2000,62:63-88.[18]YangSN,WangJ,LiSN,etal.Cost-efficientFPGAimplementationofbasalgangliaandtheirParkinsoniananalysis.NeuralNetworks,2015,71:62-75.[19]Thibeault,SrinivasaCM.Usingahybridneuroninphysiologicallyinspiredmodelsofthebasalganglia.FrontiersinComputationalNeuroscience,2013,7(88):1-17.[20]ZhangHJ,TongRS,BaiL,etal.EmergingtargetsandnewsmallmoleculetherapiesinParkinson’sdiseasetreatment.Bioorganic&MedicinalChemistry,2016,24(4):220-225.[21]MalletN,MicklemBR,HennyP,etal.Dichotomousorganizationoftheexternalglobuspallidus.Neuron,2012,74(6):1075-1086.[22]KitaH,KitaST.Themorphologyofglobuspallidusprojectionneuronsintherat:Anintracellularstainingstudy.BrainResearch,1994,636(2):308-319.[23]KitaH,KitaT.Number,origins,andchemicaltypesofratpallidostriatalprojectionneurons.ComparativeNeurology,2001,437(4):438-448.[24]HooverBR,MarshallJF.FurthercharacterizationofpreproenkephalinmRNA-containingcellsintherodentglobuspallidus.Neuroscience,2002,111(1):111-125.[25]AbdiA,MalletX,MohamedFY,etal.Prototypicandarkypallidalneuronsinthedopamine-intactexternalglobuspallidus.Neuroscience,2015,35(17):6667-6688.[26]DodsonPD,LarvinJT,DuffellJM,etal.Distinctdevelopmentaloriginsmanifestinthespecializedencodingofmovementbyadultneuronsoftheexternalglobuspallidus.Neuron,2015,86:501-513.[27]JaegerD,KitaH.Functionalconnectivityandintegrativepropertiesofglobuspallidusneurons.Neuroscience,2011,198:44-53.[28]KitaH.Globuspallidusexternalsegment.ProgressinBrainResearch,2007,160:111-133.[29]VicenteAM,CostaRM.Lookingatthetreesinthecentralforest:Anewpallidal-striatalcelltype.Neuron,2012,74(6):967-969.[30]MalletN,PogosyanA,MartonLF,etal.Parkinsonianbetaoscillationsintheexternalglobuspallidusandtheirrelationshipwithsubthalamicnucleusactivity.Neuroscience,2008,28(52):14245-14258.[31]DelongMR.Activityofpallidalneuronsduringmovement.Neurophysiol,1971,34:414-427.[32]GardinerTW,KitaiST.Single-unitactivityintheglobuspallidusandneostriatumoftheratduringperformanceofatrainedheadmovement.ExperimentalBrainResearch,1992,88(3):517-530.[33]MagninM,MorelA,JeanmonodD.Single-unitanalysisofthepallidum,thalamusandsubthalamicnucleusinParkinsonianpatients.Neuroscience,2000,96(3):549-564.[34]DeisterC,DodlaR,BarrazaD,etal.Firingrateandpatternheterogeneityintheglobuspallidusarisefromasingleneuronalpopulation.Neurophysiol,2013,109:497-506.[35]BugaysenJ,BronfeldM,TischlerH,etal.Electrophysiologicalcharacteristicsofglobuspallidusneurons.53 PlosOne,2010,5(8):e12001.[36]BenhamouL,BronfeldM,Bar-GadI,etal.Globuspallidusexternalsegmentneuronclassificationinfreelymovingrats:Acomparisontoprimates.PlosOne,2012,7(9):e45421.[37]ShabelSJ,ProulxCD,PirizJ,etal.GABA/glutamateco-releasecontrolshabenulaoutputandismodifiedbyantidepressanttreatment.Science,2014,345:1494-1498.[38]RajakumarN,ElisevichK,FlumerfeltDBA.Compartmentaloriginofthestriato-entopeduncularprojectionintherat.ComparativeNeurology,1993,331(2):286-296.[39]MiyamotoY,FukudaT.Immunohistochemicalstudyontheneuronaldiversityandthree-dimensionalorganizationofthemouseentopeduncularnucleus.NeuroscienceResearch,2015,94:37-49.[40]KooyDVD,CarterDA.Theorganizationoftheefferentprojectionsandstriatalafferentsoftheentopeduncularnucleusandadjacentareasintherat.BrainResearch,1981,211(1):15-36.[41]DelongMR.Activityofpallidalneuronsduringmovement.Neurophysiol,1971,34:414-427.[42]BenhamouL,CohenD.Electrophysiologicalcharacterizationofentopeduncularnucleusneuronsinanesthetizedandfreelymovingrats.FrontiersinSystemsNeuroscience,2014,8:1-9.[43]ChanV,StarrPA,TurnerRS.BurstsandoscillationsasindependentpropertiesofneuralactivityintheParkinsonianglobuspallidusinternus.NeurobiologyofDisease,2011,41:2-10.[44]HorakFB,AndersonME.Influenceofglobuspallidusonarmmovementsinmonkeys.I.Effectsofkainicacid-inducedlesions.Neurophysiol,1984,52:290-304.[45]TurnerRS,DesmurgetM.Basalgangliacontributionstomotorcontrol:Avigoroustutor.CurrentOpinioninNeurobiology,2010,20(6):704-716.[46]KaneokeY,VitekJL.Burstandoscillationasdisparateneuronalproperties.NeuroscienceMethods,1996,68(2):211-223.[47]BrittainJS,BrownP.Oscillationsandthebasalganglia:Motorcontrolandbeyond.NeuroImage,2014,85:637-647.[48]WeinbergerM,MahantN,HutchisonWD,etal.BetaoscillatoryactivityinthesubthalamicnucleusanditsrelationtodopaminergicresponseinParkinson’sdisease.Neurophysiology,2007,96(6):3248-3256.[49]WilsonCJ.Activedecorrelationinthebasalganglia.Neuroscience,2013,250:467-482.[50]曲庆洋,何婷婷,向冬生,等.帕金森病大鼠行为学评价体系的创建及在电生理学中的应用.中华老年心脑血管病杂志,2015,17(9):972-976.[51]SunYM,ZongW,ZhouMR,etal.Pre-conditionedplacepreferencetreatmentofchloralhydrateinterruptstherewardingeffectofmorphine.PharmacologyBiochemistryandBehavior,2015,135:60-63.[52]SunagawaK,NagamineS,FujinoT,etal.Stereotaxicatlasofthegoatbrainforanaccurateapproachtothehypothalamicnuclei.Physiology&Behavior,2015,145:91-105.[53]PaxinosG,WatsonC.Theratbraininstereotaxiccoordinates[M].sixthedition.USA:Sandiego.AcademicPress,2007:1-451.54 [54]NezhadiA,SheibaniV,EsmaeilpourK,etal.Neurosteroidallopregnanoloneattenuatescognitivedysfunctionsin6-OHDA-inducedratmodelofParkinson’sdisease.BehaviouralBrainResearch,2016,305:258-264.[55]ChanC,WheelerDS,WheelerRA.Theneuralencodingofcocaine-induceddevaluationintheventralpallidum.NeurobiologyofLearningandMemory,2016,130:177-184.[56]TorresEM,LaneEL,HeuerA,etal.Increasedefficacyofthe6-hydroxydopaminelesionofthemedianforebrainbundleinsmallrats,bymodificationofthestereotaxiccoordinates.NeuroscienceMethods,2011,200:29-35.[57]MatsuuraY,UedaM,HigakiY,etal.Noninvasiveevaluationofnicotinicacetylcholinereceptoravailabilityinmousebrainusingsingle-photonemissioncomputedtomographywith[123I]5IA.NuclearMedicineandBiology,2016,InPress.[58]PengSL,WangFN,YangTC,etal.Phase-contrastmagneticresonanceimagingfortheevaluationofwallshearstressinthecommoncarotidarteryofaspontaneouslyhypertensiveratmodelat7T:Location-specificchange,regionaldistributionalongthevascularcircumference,andreproducibilityanalysis.MagneticResonanceImaging,2016,34(5):624-631.[59]StarrPA,TurnerRS,RauG,etal.Microelectrode-guidedimplantationofdeepbrainstimulatorsintotheglobuspallidusinternusfordystonia:Techniques,electrodelocations,andoutcomes.Neurosurgery,2006,104(4):488-501.[60]UngerleiderJL,JohnsonTD,HernandezBS,etal.Extracellularmatrixhydrogelpromotestissueremodeling,arteriogenesis,andperfusioninarathindlimbischemiamodel.BasictoTranslationalScience,2016,1:32-44.[61]WuJF,HanD,HuL,etal.Contralateral80-280HzEEGripplesandhippocampalsingleunitdischargeinhibitioninresponsetoacutetetanizationofratrightcaudateputameninvivo.EpilepsyResearch,2006,70(1):59-72.[62]KatonL,LaprayD,VineyTJ,etal.Sleepandmovementdifferentiatesactionsoftwotypesofsomatostatin-expressingGABAergicinterneuroninrathippocampus.Neuron,2014,82(4):872-886.[63]KimuraA,YokoiI,ImbeH,etal.Distinctionsinburstspikingbetweenthalamicreticularnucleuscellsprojectingtothedorsallateralgeniculateandlateralposteriornucleiintheanesthetizedrat.Neuroscience,2012,226:208-226.[64]PazoJH,BarcelóAC,BellantonioE,etal.Electrophysiologicstudyofglobuspallidusprojectionstothethalamicreticularnucleus.BrainResearchBulletin,2013,94:82-89[65]GalvanA,DevergnasA,WichmannT.Alterationsinneuronalactivityinbasalganglia-thalamocorticalcircuitsintheParkinsonianstate.FrontiersinNeuroanatomy,2015,9:1-21.55 攻读硕士期间发表的文章1、MinWang*(导师),QingyangQu,TingtingHe,etal.Distincttemporalspikeandlocalfieldpotentialactivitiesinthethalamicparafascicularnucleusofparkinsonianratsduringrestandlimbmovement.Neuroscience,Availableonline26May2016.2、曲庆洋,何婷婷,向冬生,等.帕金森病大鼠行为学评价体系的创建及在电生理学中的应用.中华老年心脑血管病杂志,2015,17(9):972-976.3、曲庆洋,谢金鹿,耿希文,等.不同造模时间帕金森大鼠旋转行为的变化.中国科技论文在线精品论文,2015,8(19):2027-2033.4、XiwenGeng,...,QingyangQu,etal.Alteredneuronalactivityinthepedunculopontinenucleus:AnelectrophysiologicalstudyinaratmodelofParkinson’sdisease.BehaviouralBrainResearch,2016,305:57-64.5、MinWang*,...,QingyangQu,etal.Alteredneuronalactivityintheprimarymotorcortexandglobuspallidus.NeurologicalSciences,2015,348:231-240.56 攻读硕士期间申请的发明专利1、一种大鼠行为红外线识别系统及其使用方法和应用，专利号201510412844.1，第1发明人。2、一种治疗糖尿病的中药制剂及制备方法，专利号201510188449.x，证书号1907989，第3发明人。3、一种多通道阵列微电极的制作模具及其工作方法，专利号201510452157.2，第7发明人。4、一种能同时刺激和采集信号的电极及其制备方法，专利号201510532596.4，第7发明人。5、一种帕金森病大鼠模型的制备方法及其应用，专利号201510516069.4，第7发明人。57 攻读硕士期间申请及参与的项目1、帕金森病大鼠苍白球相关发病机制研究及干预治疗建议，山东师范大学硕士研究生科研创新基金立项，项目编号SCX1526，负责人。2、帕金森病大鼠内侧苍白球对丘脑束旁核脑电活动调控及信号通路研究，国家自然科学基金资助项目，项目编号31571104，参与人。3、内侧前额叶与伏隔核亚区拓扑投射环路在吗啡成瘾记忆及复吸中的作用，国家自然科学青年基金，项目编号81501149，参与人。4、多巴胺对前额叶-伏隔核突触传递时序依赖性调节机制与可卡因成瘾，山东省自然科学青年基金，项目编号ZR2015HQ004，参与人。5、脑起搏器相关信号研究，山东省科技发展计划项目，项目编号2011GSF12115，参与人。6、神经芯片及脑电信号分析与特征提取，山东省科技发展计划项目，项目编号2010GGX10133，参与人。58 致谢时光如梭，光阴似箭。研究生生活马上就要结束了，回想过去三年的研究生生活，我收获了很多，成长了很多。感谢我的母校山东师范大学为我创造了优良的学习环境，感谢我的老师、同学、家人和朋友对我的关心、支持和帮助。首先，我要感谢我的导师王敏老师，从论文的选题，到实验技术的指导，到论文的写作和修改，王老师都倾注了大量的心血和精力。与此同时，在学习、工作和生活的各个方面，王老师都给予了我很大的关心和帮助。王老师用她渊博的学识、严谨的治学态度、高尚的人格以及平易近人的待人作风深深的打动和感染着我，这将是我人生中最宝贵的财富，必将对我未来的人生道路起到深远的影响。值此毕业之际，我特别想对王老师说，您是我人生的领路人，是我一生的导师，由衷的感谢您给予我无私的帮助和关怀。然后，我还要感谢实验室其他的老师和同学们，特别向艾洪滨老师、崔希云老师、孙海基老师、祝建平老师、王秀松老师、何峰老师、赵东芹老师、丁乃峥老师和刘树真老师对于我实验的指导和理论的教学表示感谢，向我的师哥师姐谢金鹿、张晓、李传芬、杨茂全、光奎、丁方香、路致远、计义正、王晓清、耿希文和李敏，向我的搭档何婷婷，向我的师弟师妹李敏、类成东、侯亚兵、姚晓萌、王雪楠和韩红玉给予我的关心和帮助表示感谢。在此，特别要感谢我的父母和家人，感谢他们对我的支持与鼓舞，感谢刘晓娟对我的鼓励和陪伴，没有你们的支持就没有我今天的成绩。在未来的日子里我必将加倍努力，不辜负你们对我的期望。最后，再一次感谢所有帮助过我的老师、同学、朋友和家人。祝你们身体健康，一切如意！曲庆洋2016年6月6日59
