伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因组测序分析

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符号及缩略词英文缩英文全称中文名称Ampampicillin氨卞青霉素PK15PorcineKidneyCellLine猪肾细胞系bpbasepair碱基对CPEcytopathiceffect细胞病变DMEMdulbecco'smodifiedeagle'smediumDMEM培养基DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FBSfetalbovineserum胎牛血清ULUniquelongregion长独特区USUniqueshortregion短独特区IRSInternalrepeatsequence内部倒转重复序列TRSTerminalrepeatsequence末端倒转重复序列ggram克hhour小时kDkilodalton千道尔顿Lliter升LBluria-bertinimediumLB培养基MEMminimumessentialmediumMEM培养基minminute分钟mLmilliliter毫升nmnanometer纳米PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应rpmroundperminute每分钟转数ssecond秒TaqThermusaquaticus水生热栖酶TCID50tissuecultureinfectivedose组织培养半数感染μLmicroliter微升 目录中文摘要............................................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................................................III1引言................................................................................................................................................11.1伪狂犬病的流行状况...............................................................................................................11.2PRV分子生物学特性................................................................................................................31.2.1PRV病毒粒子的结构.............................................................................................................31.2.2PRV基因组结构.....................................................................................................................41.2.3PRV毒力相关基因.................................................................................................................51.2.4PRV保护性抗原基因.............................................................................................................71.3PRV的侵入与复制.................................................................................................................101.4PRV潜伏感染与免疫抑制......................................................................................................111.5PR的防控.................................................................................................................................121.6本研究的目的和意义.............................................................................................................132材料和方法.................................................................................................................................142.1材料...........................................................................................................................................142.1.1病料来源...............................................................................................................................142.1.2细胞、菌株、载体和和试验动物.....................................................................................142.1.3主要仪器设备和试剂..........................................................................................................142.1.4试验中相关溶液..................................................................................................................142.1.5引物设计...............................................................................................................................162.2试验方法..................................................................................................................................162.2.1山东地区PRV毒株的分离与鉴定...................................................................................162.2.2全序列测定...........................................................................................................................202.2.3全基因序列分析及主要保护性抗原基因序列分析........................................................233结果与分析.................................................................................................................................253.1病毒分离和鉴定......................................................................................................................253.1.1病料检测...............................................................................................................................253.1.2PRV的分离与鉴定...............................................................................................................25 3.2Qihe547全基因组测序...........................................................................................................273.2.1Qihe547株各片段的扩增....................................................................................................273.2.2Qihe547株各扩增片段阳性质粒的鉴定...........................................................................283.2.3Qihe547株全基因序列拼接................................................................................................293.2.4Qihe547株全基因序列分析................................................................................................293.2.5Qihe547株各基因比对分析................................................................................................343.2.6Qihe547株主要保护性抗原基因的变异分析..................................................................374讨论..............................................................................................................................................414.1PRV分离鉴定..........................................................................................................................414.2PRVQihe547株基因组中各基因的变异分析.....................................................................414.3Qihe547株主要保护性抗原的变异分析..............................................................................435.结论.............................................................................................................................................456.参考文献....................................................................................................................................467.附录.............................................................................................................................................598.致谢.............................................................................................................................................829.攻读硕士学位期间发表论文情况..........................................................................................83 山东农业大学硕士学位论文中文摘要猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的猪的急性致死性传染病。PR广泛分布于世界各国，是当前危害养猪业的一种最为严重的病毒性疾病，给养猪产业造成巨额经济损失。20世纪90年代以来通过基因缺失疫苗的广泛使用及鉴别诊断方法的应用使PR在我国猪场得到有效控制，但自2011年底以来，我国多省份的免疫Bartha-K61疫苗的猪场陆续暴发PR，山东各地区免疫Bartha-K61疫苗的猪场也相继发生PR，造成母猪繁殖障碍，新生仔猪出现神经症状和高死亡率。2014年11月份至2015年3月，本研究从山东4个地区的5个疑似PR发病的规模化猪场采集的病料样品中分离多株PRV野毒株，对其中分离自山东齐河地区的PRV毒株进行了全基因组测序及遗传变异分析。1、猪伪狂犬病病毒分离和鉴定2014年11月份至2015年3月，样品采集自山东济南、齐河、沂水、费县4个地区5个疑似PR发病猪场。将组织样品匀浆，应用荧光定量PCR方法检测，确定为PRV野毒感染。组织匀浆上清过滤除菌，接种到PK15细胞上，接种约8h细胞开始出现变圆、合胞体等典型病变。分离病毒经蚀斑纯化，在PK15细胞上连续传代增殖，并提取收获的细胞培养液的DNA，使用gE基因特异性引物鉴定显示所分离的PRV毒株为野毒株。将分离5株PRV分别命名为Qihe547、SDYS1、SDYS2、SDFX、SDJN，其中Qihe547株在PK15细胞上TCID50达到10-7.0/0.1ml。将PRV分离株细胞培养液接种体重2㎏母兔出现奇痒、啃咬接种部位、尖叫等典型临床症状，并很快死亡。2、Qihe547分离株全基因组测序本研究根据PRVBecker（JF797219）全基因组序列先后共设计200多对引物，每对引物之间均包含重叠序列。以提取的PRVQihe547株DNA为模板，应用PCR方法进行扩增、测序。将各片段序列拼接，得到全长为143404bp的Qihe547基因组序列，并对全基因组中的基因进行了定位和注释。3、Qihe547分离株基因组中各基因的比对分析为了解Qihe547株基因组中各基因的变异情况，我们对Qihe547株的全基因组序列与GenBank中登陆的PRV全基因组序列进行比对分析并筛选各基因序列与参考序I 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析列进行比对分析。基于Qihe547株全基组序列比对分析发现，Qihe547株与国内PRV分离株的同源性高于其与国外PRV分离株的同源性，同时在系统发生树中其与国内其他PRV分离株处于独立分支中，同时发现Qihe547株属目前PRV基因分型中的基因Ⅱ型。我们对Qihe547株的主要的保护性抗原基因gB、gC、gD基因进行比对分析，同时对gB、gC、gD的糖基化位点和抗原表位进行分析。结果显示，Qihe547分离株gB、gC、gD的氨基酸序列中均存在氨基酸的插入或缺失，gB75SPG773个氨基酸的缺失，94G的插入；gC63AAASTPA697个氨基酸的插入；gD278RP2792个氨基酸的插入。与Bartha株相比，Qihe547分离株在gB的优势抗原表位区(aa59~aa126)、gC膜外区（aa23~aa453）和gD主要抗原表位区，潜在的抗原位点及潜在O-糖基化位点存在明显变异，推测这些变异可能影响Qihe547分离株的抗原性，可能利于病毒逃避宿主免疫反应。对Qihe547株基因组中其他结构蛋白基因和非结构蛋白的分析发现，这些基因的氨基酸序列中存在不同程度的变异，其中与PRV复制、基因表达调节相关的非结构蛋白基因的变异较大。对PRVQihe547及其他国内外PRV分离株基因组中重复序列统计分析显示，其在国内外PRV分离株的编码区和非编码区的分布存在差异，这些差异可能影响到基因的表达、转录及蛋白质功能的发挥。本研究促进了对目前PRV流行毒株遗传变异情况的了解和认识并为PR的防控及PRV疫苗的研制提供了依据。关键词:伪狂犬病病毒；Qihe547；分离鉴定；全基因组测序；PRV变异；免疫失败II 山东农业大学硕士学位论文GenomicSequencingandSequenceAnalysisofaFieldPseudorabiesVirusQihe547StrainAbstractPorcinepseudorabies(PR)iscausedbyPseudorabiesvirus(PRV).PRisoneofthemostseriousporcineinfectiousdiseasewhichresultsingreateconomiclossesinswineindustry.Itisprevalentallovertheworld.Since1990s,duetotheapplicationofPRVgE-deletedvaccineinmostswineherdsandthemethodofidentificationdiseasedaniamlsfromimmunizedanimals,PRhadbeeneffectivelycontrolledinChina.However,sincelate2011,manyswinefarmsvaccinatedwithBartha-K61inChinaoutbreakedPR.Meanwhile,manyswinefarmsvaccinatedBartha-K61inShandongprovincealsooccurredPR.Theclinicalsymptomsarecharacterizedasneuralsymptomsinthepigletsandmiscarriageinpregnantsows.FivefieldPRVstrainswereisolatedfromdifferentareasinShandongprovince.Inthisstudy,weamplifiedandsequencedonestrainnamedQihe547isolatedfromswineherdinQihearea.1.IsolationandidentificationoffieldPRVstrainsFromDecember2014toMarch2015,lesiontissueswerecollectedfromfiveswineherdsvaccinatedwithBartha-K61vaccinethathaveemergedaseriousdiseasewhichwassuspectedofoccurringPR.WefirstdetectedthepathogeninfectionoftheselesiontissuesusingQuantitativeReal-timeRT-PCR/PCR.WeidentifiedthepathogenasPRV,nothogcholeravirus,porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusorporcinecircovirus.ThesupernatantofgrindedtissuesampleswerefilteredtoinfectPK15cellsandthetypicalcytopathogeniceffectsofPRVappearedpostinfection8hours.Afterpurification,theisolateswerepropagatedinPK15cellsandidentifiedbyPCRusinggEgenespecificprimers.ThedetectionresultsshowedthatallisolatesarePRVpositive.WenamedtheseisolatesQihe547,SDYS1,SDYS2,SDFX,SDJN.TherabbitsinfectedwithPRVisolatesappearedclassicalsymptomsofPRanddiedfinally.ThetitterofQihe547isolateinPK15cellswasupto10-7.0/0.1ml.III 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析2.ThecompletegenomesequencingofQihe547strainInthisstudy,wedesignedmorethan200pairofprimerstoamplifythefragmentsbyPCR.Aftersuccessfullysequencingandremovingtherepetitivesequences,wejoinedsequencesofallfragmentstogether.Finally,weobtainedthecompletesequenceofQihe547andlocatedgenessites.Thefulllengthis143404bp.3.ThegeneticvariationanalysisofQihe547strainToanalyzethegeneticvariationofPRVQihe547,weperformedthecomparisonbetweenQihe547andthereferencePRVstrainsfromGenBank.ThecomparisonresultsbasedoncompletesequencesofPRVstrainsshowedthat,comparedwithChinesePRVstrains,Qihe547sharedlowernucleotideidentitywithforeignPRVstrains.PhylogeneticanalysisbasedoncompletesequencesofPRVstrainsindicatedChinesePRVstrainsbelongtoanindependentbranchinevolutionarytree.Meanwhile,wefoundthatQihe547belongedtogenotypeⅡ.Wealsoconductedvariationanalysis,potentialglycosylationsitesandantigenicsitesanalysis.Theanalysisresultsshowthatglycoprotein(g)B,gC,gDgenevariesgreatly.gBhavethreeaminoaciddeletion(75SPG77)andoneinsertion(94G);gChavesevensuccessiveaminoacidinsertion(63AAASTPA69);gDhavetwoaminoacidinsertion(278RP279).ComparedwithBarthastrain,thedifferencesofpotentialantigenicsitesandO-glycosylationsitesofglycoprotein(g)B,gC,gDofQihe547mainlyexistedinthedominantantigenicepitoperegionsofgB(aa59-aa126),theextracellularregionofgC（aa23-aa453）andgD.ThesedifferencesmightresultinantigenicdriftoftheisolateandcontributetoPRVevadethehostimmuneresponse.PRVstructuralproteingenesandnonstructuralproteingeneshavedifferentvariations.Amongthesegenes,generegulationandreplicationrelatedgenesvarygreater.WeperformedanalysisonrepeatsequencesofPRVcodingregionsandnon-codingregions.Therearedifferencesinthedistributionincodingregionsandnon-codingregionsandthesemayaffectgeneexpression,transicriptionandproteinfunction.ThevariationanalysiscontributetothepreventionandcontrolofPRandprovidethefoundationforthestudyofPRVvaccines.KeyWords:PRV;isolation;Qihe547;completegenomesequencing;PRVvariation;immunefailureIV 山东农业大学硕士学位论文1引言伪狂犬病（Pseudorabies,PR），又称为Aujeszky'sdisease是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的多种动物共患的一种以发热、奇痒(除猪外)和神经症状为特征的急性的高度致死性的传染病(陈溥言,2006;殷震,1997）。感染猪的临床特征为新生仔猪主要表现神经临诊症状和高死亡率，育肥猪主要表现严重的呼吸道症状，妊娠母猪感染引起流产、死胎和木乃伊胎，无奇痒，而其它感染动物表现神经临诊症状、奇痒（Pensaertetal.,1989;Wittmannetal.,1989）。该病发生后易导致猪继发感染多种疾病，如繁殖障碍性疾病、仔猪断奶多系统衰竭综合征、呼吸道综合征等，给感染猪场造成巨大的经济损失（王利军,2012;Lglesiasetal.,1992;Yuetal.,2014）。PRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae），疱疹病毒甲亚科（Alphaherpesvirinae），猪疱疹病毒Ⅰ型。PRV宿主范围广范，包括猪、野猪、牛、绵羊、山羊、猫、狗、水貂、狐狸和浣熊等家畜以及多种野生动物（Pomeranzetal.,2005;Mettenleiteretal.,2008;Fonsecaetal.,2010），但猪是PRV主要的宿主、自然储存宿主和传播者（斯特劳等，2000;Marcaccinietal.,2008;Sozzietal.,2014）。实验动物中以家兔最为敏感，小鼠也可感染。PRV可通过空气、呼吸道、精液、胎盘、仔猪吃奶等多途径感染猪（李春华,2008;陈溥言,2006）。PRV在感染猪体内易形成潜伏感染，成年猪感染可耐过并可向外界排毒（姚敬明,2011）。PRV有较强的抵抗力，对热抵抗力较强，对紫外线敏感，阳光直射可将其灭活(殷震,1997)。国际兽医局将PR列为B类传染病，我国农业部兽医局将其列为二类疫病；另外，PRV是研究疱疹病毒生物学的重要的模型，也被用作神经细胞线路的“活”的追踪器，因此许多病毒学家、神经生物学家及猪病防控专家均格外关注PRV。1.1伪狂犬病的流行状况有关PR的最早记录是在1813年，美国牛群发生的“疯痒症（”Hansonetal.,1954）。在欧洲，Strebel报道了类似的病例（Strebel,1889）。在1902年，匈牙利医师Aujeszky首次证明PR由病毒引起的，并通过将处理后的病牛组织上清接种兔子，导致兔子出现神经症状并在48h内死亡，由此认为导致PR的病毒区别于狂犬病病毒（Aujeszky,1 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析1902）。1934年，Sabin和Wright才确定PR病原为疱疹病毒并且在免疫学上与单纯疱疹病毒和疱疹病毒B群有关（陈溥言,2006;赵德民,2000）。在1920至1940年间，人们认为猪的散发疾病与伪狂犬病病毒相关，并确认猪为该病的宿主（Köhleretal.,2003）。1940年以后，伪狂犬病开始在欧洲特别是欧洲中东部呈现地方流行性。1960年之前，感染猪症状比较温和，发病病例比较少见，未给养猪业造成严重的经济损失。但是自1960s开始，在美国中西部地区出现伪狂犬病病毒强致病力毒株，感染动物表现严重的临床症状，而且PR发病数量明显增加且各日龄猪均可感染（郭万柱等,1998）。由于与欧洲报道的PR病例极为相似，所以人们认为美国PR的暴发可能是由PRV强毒株的引入导致的(Saundersetal.,1964)。据报道，1974年至1984年间，PR在美国的流行程度增强了15倍，而且这种变化趋势存在于世界范围内（MorrisonandThawley,1989）。由于该病传播迅速，造成严重的危害，许多国家采取大规模免疫gE基因缺失疫苗和DIVA（区分野毒感染和疫苗免疫）战略以控制并逐渐清除、净化PRV。在欧洲很多国家，如德国、丹麦、荷兰、瑞典、卢森堡等，猪群中PRV已经基本被净化(Mülleretal.,2011;Pomeranzetal.,2005)。虽然PRV在猪场得到净化，但仍需采取严格的防控措施防止PRV重返猪场。2014年，Cramer等报道一例猎犬感染PRV的病例，说明PRV在野猪群中仍然存在，仍是猪场一种潜在威胁，需要严密地监测、控制（Crameretal.,2014）。随着一些国家清除计划的实施，PR的病例越来越少，但PR仍是一种很重要的传染病，特别是规模化养殖较发达的地区(Mülleretal.,2011;MacDiarmid,2000)。在我国，刘永纯首次报道了家猫感染PRV的病例（刘永纯,1948）。之后，猪发生PR时有报道（周圣文和孙鲁石,1956;关伟杰和徐家宰,1959）。黄寿森和程由铨首次报道了发生于牛群的PR，并从病牛组织中分离得到经典PRV毒株MinA株（黄寿森和程由铨,1966）。20世纪80年代，随着规模化养殖的兴起和发展，PR病例逐年增加，呈现上升趋势；90年代以后，PR在我国广泛流行并且引起母猪流产，产死胎、木乃伊胎，仔猪高致死率，公猪繁殖障碍，育肥猪呼吸道症状和生长发育受阻。2006年时，已波及我国31个省、市和地区（邓仕伟等,2006）。1979年，为了控制PR，我国从匈牙利引进了Bartha-K61疫苗株；1990s后，我国养殖场广泛采用基因缺失苗对猪群进行免疫，而且80%以上猪场均免疫了Bartha-K61疫苗，该疫苗在该PR防控上起到重要作用且效果显著（赵鸿远等,2014）。王戈平和徐宁化对青海省两个种猪场103血清采用Dot-ELISA方法检测，结果显示检测阳性率5.82%（王戈平和徐宁化,2 山东农业大学硕士学位论文2004）。史岩对2002～2004年间江苏、浙江、安徽、江西、福建和上海等省市的47个大中型猪场送检的285份病料进行PCR检测，结果显示病料检测阳性率为26.67%（史岩,2005）。赵海山等普查北京顺义区65.36万头猪，结果显示免疫数达65.24万头份，免疫密度99.81%，免疫抗体阳性率92.39%，阳性检出率为9.02%，这表明疫苗免疫取得良好效果，猪群对PRV野毒有抵抗力（赵海山等,2004）。但是，自2011年底，PR在我国免疫Bartha-K61疫苗的猪场中暴发，新生仔猪致死亡率高，猪群gE抗体检测阳性率也明显增高，并迅速波及我国多个省市，呈流行趋势。解伟涛等对2013年来自河南不同地区的347个猪场13275份血清样品进行gE-ELISA检测，结果显示样品检测阳性率31.3%，猪场检测阳性率83.6%，种猪群带毒严重，育肥猪PRV感染状况尤为严重（解伟涛等,2014）。此次PR爆发流行的特征：发病猪场均免疫伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗，猪群gE抗体阳性率显著升高；新分离PRV流行毒株较以往毒株发生明显变异，对小鼠、猪的致病性明显增强；发病仔猪出现瘙痒症状，嗜内脏组织增强。1.2PRV分子生物学特性1.2.1PRV病毒粒子的结构PRV的病毒粒子具有疱疹病毒共有的一般形态特征（殷震,1997）。电镜下，PRV粒子呈椭圆或者圆形外观，位于细胞核内无囊膜的病毒粒子大小约110-150nm，位于胞浆内含囊膜的病毒粒子大小约150-180nm。衣壳壳粒大小，长约12nm，宽9nm，空心部分大小约4nm（殷震,1997;Granzowetal.,2001）。成熟病毒粒子包含四部分：核心、衣壳、皮层和囊膜。核心由双股线状DNA和蛋白质缠绕而成；衣壳呈20面体对称，外观呈六角形，可能由三层组成，内层和中层为无特定形态的蛋白质薄膜，外层衣壳由162个互相连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒构成，这一形态结构是疱疹病毒科重要特征（Mettenleiteretal.,2000）。病毒最外层是囊膜，是病毒从细胞膜上获得的脂质双分子层膜，其上含有病毒编码的糖蛋白。囊膜表面有长约8～10nm，呈放射状的纤突（Newcombetal.,1993;Mettenleiter,1996）。囊膜虽然与病毒感染密切相关，但无囊膜的核衣壳同样具有感染性(图1-1)。3 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析图1-1PRV粒子结构（NauwynckHetal.,2007）Fig.1-1ThestructureofPRVvirion1.2.2PRV基因组结构PRV基因组为线性双股DNA，长度约150kb，G+C含量约为73%。基因组由长独特区片段（Uniquelong,UL）、短独特区片段（Uniqueshort,US）以及US两侧末端反向重复序列（TR）和内部反向重复序列（IR）四部分组成，US位于IR和TR之间（李柠等,1995）（图1-2）。因US两端有重复序列存在，US的方向与UL的方向可以一致，也可以相反，从而使PRV基因组具有两种表现出相同的生物学活性的异构体。在野生型病毒中存在约近5%的UL反向的的PRV基因组（Mettenleiter,1994）。PRV基因组中含有77个开放阅读框，编码大约100种蛋白质，包括结构蛋白、毒力蛋白、酶类和转录调节因子等。UL区56个基因已经被定位了，包括糖蛋白gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN基因，胸苷激酶基因（TK）、核苷酸还原酶基因（RR）、碱性磷酸酶基因（AN）、DNA多聚酶基因（POL）、主要衣壳蛋白基因（MCP）、ICP18.5蛋白等基因。US区序列被全部测定，其中有七种基因被定位，即编码糖蛋白gD、gG、gI和gE的基因，11kD和28kD基因基因以及蛋白激酶基因（PK）（Rea,1985）。IR区段中已经被测序和鉴定的基因是EPO、IE180和RSP10（Marchiolietal.,1987）。US1基因和IE180基因分别位于TRS和IRS中，因此它们都有两种拷贝序列，而US3由于能形成两种大小不同的形式，而且功能也不相同也被称为两种基因（VanMinnebruggenetal.,2003;Geenenetal.,2005）。UL区中，除UL26.5和UL46之间较大的内部反向序列外，PRV基因组与其他HSV-1和α-疱疹病毒均有较高的同源性（Bras4 山东农业大学硕士学位论文etal.,1999）。PRV基因组中的ORF1、ORF1.2及UL3.5在HSV-1基因组中没有发现，同时至少16个HSV-1基因组中的基因在PRV基因组中并为发现。PRV基因组中有三个复制起点已经被描绘出来，即位于UL区的OriL及位于两个反向重复序列的OriS（Fuchsetal.,2000）。PRV复制起点由被43bp的富含AT（A+T含量约为76%）的片段隔开的两个起始结合蛋白UL19的反向结合位点（GTTCGCAC）组成。该结构的三个不完整重复序列组成了OriS，这种基本结构首次在OriL中发现。图1-2PRV基因组结构示意图Fig.1-2ThegenomepatternofPRV1.2.3PRV毒力相关基因PRV毒力是受多基因控制和影响，研究其毒力目的是为了揭示PRV的致病过程，为生产更加安全、高效的疫苗提供理论依据。与PRV毒力相关的基因主要有：某些糖蛋白基因，如gE、gC等基因；代谢酶类基因，如PK、TK、RR等基因；其它基因，如UL21基因。1.2.3.1TK基因TK基因是决定PRV毒力的最主要基因，其编码的蛋白质产物是胸苷激酶，催化脱氧胸苷磷酸化。Kit等首先确认TK基因对PRV毒力影响（Kitetal.,1987）。TK基因位于UL23区，全长963bp，编码321个氨基酸，为PRV体外复制非必需蛋白，但在感染动物病理生理学上起重要作用。TK参与合成DNA所需物质dTTP的合成，间接促进dATP、dGTP、dCTP的合成。它与病毒在机体神经组织中的增殖和长期保持潜伏感染以及激活处于潜伏感染状态的病毒粒子等过程密切相关，与病毒在细胞中的增殖无关。缺失TK基因能够引起PRV毒力丧失或显著降低，同时也可削弱PRV在神经组织中复制、传播以及致脑组织病变的能力。TK基因缺失的疱疹病毒毒力降低但不影响其免疫原性，而且能保护小鼠抵抗100～1000倍致死剂量亲本毒的攻击，同时TK基因的缺失不影响病毒的生长增殖，可用外源基因置换。因此，TK基因缺失的PRV毒株被广泛地应用到了PRV基因缺失疫苗的研究中（Ferrarietal.,2000;Kitetal.,1987），也被用于构建病毒活载体疫苗和外源基因表达体系（Bowman,2001;Brown,2000）。5 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析1.2.3.2gE基因gE基因是PRV主要的毒力基因，位于US区，约编码578到581个氨基酸的蛋白质，与病毒在神经元间的传播至关重要（Mettenleiter,1978,1994;Knappetal.,1997;Mulderetal.,1997）。其编码的gE蛋白为典型的Ⅰ型跨膜蛋白，分为N端信号肽、N端403个氨基酸组成的胞外区、47氨基酸（多数为疏水氨基酸）组成的跨膜区、C端123个氨基酸组成的胞内区等部分（Roetal.,1995）。gE糖蛋白可促进感染细胞与邻近非感染细胞的融合，影响PRV的组织趋向性，从而有助于病毒在神经系统中扩散，是PRV经三叉神经节侵入中枢神经组织所必须的（Tirabassietal.,1998;VandeWalleetal.,2003;Tirabassietal.,1997）。gE蛋白和gI蛋白形成异源二聚体在病毒组装、传播等方面起重要作用。gE蛋白胞内区，存在两个YXXL基序的保守性氨基酸残基，其中Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，L为疏水性氨基酸，其对病毒糖蛋白在细胞膜上的分布、信号在细胞内的传导有重要作用（Tirabassi,1998,1999）。gE蛋白第125位缬氨酸、第126位半胱氨酸与PRV的嗜神经性有关，对gE蛋白和gI蛋白形成二聚体有影响，对病毒的生物学功能有重要的影响。gE蛋白最主要的6个抗原表位位于N端52-238个氨基酸（Jacobsetal.,1990,1994）。构建PRV基因缺失疫苗常将gE作为靶基因，缺失gE后可以防止病毒侵入神经系统，使缺失疫苗更安全（VanOirschotetal.,1990）。另外，野毒株均含有gE基因，表达gE糖蛋白，因此常将gE蛋白作为标志，以区分疫苗接种动物和野毒感染动物，为PR的净化、根除提供了技术手段。1.2.3.3gI基因最早于1983年，Hampl等就已报道Rice株US7区存在与HSV的gI基因的同源基因（Hampletal.,1984）。在1986年，Petrovskis等克隆并测定了gI基因的全序列，确定了其基因产物（Petrovskisetal.,1986）。gI基因位于gE基因上游，其表达的gI糖蛋白也属于Ⅰ型膜蛋白。gI对病毒在细胞中的增殖是非必需的，但对病毒体外培养仍有影响(Granzowetal.,1997;Hampletal.,1984)。在细胞中，缺失gI基因的PRV毒株与PRV野毒株虽然复制效率上相同，但gI可能影响PRV的释放。gI糖蛋白可以诱导细胞融合，促进病毒在细胞间的扩散(Dingwelletal.,1994)。gI基因的缺失会使PRV的毒力降低，对宿主的致病力也会降低(Pensaertetal.,1990;Petrovskisetal.,1986)。gI6 山东农业大学硕士学位论文基因在病毒侵入过程中促进PRV在神经组织中的复制，对病毒的神经嗜性有很大的影响(Whealyetal.,1993)。gI蛋白和gE蛋白形成异源二聚体，影响PRV的毒力，影响其在神经组织中的传播和组织嗜性。1.2.3.411K基因11K基因的表达产物是98个氨基酸、磷酸化的Ⅱ型膜蛋白，是DNA多聚酶结合到复制起点所必需的(Brideauetal.,1998;Brideauetal.,1999;Brideauetal.,2000)。11K蛋白能够靶向外源蛋白到病毒囊膜并将它们递呈到病毒粒子表面。11K蛋白对PRV在神经轴突中的顺向传导起着关键的作用，11K蛋白与细胞膜上的脂筏结合后(Lymanetal.,2008)，与神经轴突内微管驱动蛋白3马达分子的作用下，可以将PRV病毒核蛋白分选至轴突(Kratchmarovetal.,2013)。11K蛋白的酸性结构域中两个相邻的酪氨酸对其功能是必需的，两个磷酸化的丝氨酸影响依赖11K的在体内顺行扩散比率。1.2.3.5其它毒力基因除上述PRV重要的毒力基因外，其它病毒编码酶的基因的缺失也会影响PRV的毒力。蛋白激酶（PK）基因缺失，减弱PRV毒力且PK蛋白对诱导机体产生针对PRV的完全保护是必需的(Zhang,1990;vanZijl,1990)；核糖核苷酸还原酶（RR）基因对PRV在分裂细胞上的增殖是非必需的，但对PRV在静止细胞上产生成熟病毒粒子是必需的。对有效的病毒DNA合成，RR活性要比TK活性更重要，因为RR突变株较TK突变株在鼻咽组织的繁殖更受到的阻碍更严重(Mulder,1995,1997)。碱性磷酸酶（AN）是磷酸化的早期蛋白，对病毒的增殖非必需但对病毒的有效增殖是必需的(Dijikstraetal.,1997;Hsiang,1996)。AN基因的缺失严重影响病毒在细胞上的增殖，使病毒毒力大大降低(DeWind,1994)。其它如脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶（S/T）和尿嘧啶糖苷化酶（UDG）等基因同样也具有重要的作用。1.2.4PRV保护性抗原基因目前PRV中已有十一种糖蛋白被发现，这些糖蛋白在诱导宿主产生保护性免疫力方面具有重要作用（如表1-1）（Mettenleiter,2000;Daneiletal.,2005）。糖蛋白gB、gC、gD已确认是PRV主要的免疫原，诱导宿主产生的中和抗体，不管补体存在与否，7 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析抗gB、gC和gD的抗体均能中和PRV。抗gB、gC和gD的抗血清都能被动保护小鼠、猪抵抗强毒的攻击。gE仅能诱导宿主产生补体依赖性抗体，在体内中和作用较小。表1-1PRV部分蛋白在免疫中的作用（Mettenleiter,1996）Table1-1RoleofPRVproteinsinimmunity1.2.4.1gB基因gB基因是PRV的一个重要的保护性抗原基因，其表达的gB糖蛋白是PRV重要的囊膜组分和免疫原，位于PRV基因组的UL区，ORF长约2.8kb。gB基因是PRV中最保守的基因，不同的疱疹病毒gB糖蛋白具有相似的功能，gB基因可以在不同疱疹病毒间互相代替（Kluppetal,1997;Mettenleiteretal.,1993）。gB糖蛋白是PRV必需糖蛋白，对PRV的感染必不可少。gB在PRV感染过程中，介导病毒囊膜与细胞膜的融合，是PRV囊膜与宿主细胞膜融合过程中不可缺少的四种糖蛋白之一（gB、gD、gH、gL），使PRV核衣壳释放进入宿主细胞细胞质，完成穿入过程。gB和gC形成的糖蛋白复合物介导了病毒与细胞表面肝素受体的特异性结合。同时，其也可以介导未感染细胞与感染细胞的膜融合，产生多核巨细胞。gB在诱导宿主机体产生免疫应答方面具有重要的作用，能够直接参与病毒复制或病毒毒力的表达，是抗病毒的重要成份。新合成糖蛋白通过高尔基体由内质网转运到8 山东农业大学硕士学位论文细胞膜后，同其他表面糖蛋白经内吞作用，可适应性地或自发地与抗体结合（Nixdorfetal.,2000;Favoreeletal.,2002），而受抗体调节的gB等表面糖蛋白可通过内吞作用调节免疫反应，阻止感染细胞大量地裂解（VandeWalleetal.,2003）。PRV侵入宿主机体后，gB能够刺激宿主产生依赖补体和不依赖补体的中和抗体，同时是抗体的主要靶标。研究发现，注射抗gB、gC、gE单克隆抗体的小鼠和猪，均能抵抗PRV致死性攻击。但是，gB、gC、gE在引发中和抗体的某些结构域上是可变的，即会呈现抗原漂移，使PRV更好地逃避宿主免疫防御机制（Robbinsetal.,1989）。1.2.4.2gC基因gC基因位于UL区，BamHI片段2和片段9之间，长约1464bp。gC基因表达产物gC糖蛋白，是PRV11种囊膜糖蛋白十分重要的一种，含有8个N-糖基化位点。其可分为gC-M与gC-N两段，其中gC-M中的156aa~290aa是主要抗原区域，gC-N中的44aa~156aa是主要抗原区域。gC糖蛋白因糖基化程度不同而可呈现51kDa、74kDa、92kDa3种形式（Robbinsetal.,1986）。gC为典型的1型膜蛋白，包括信号肽（1aa~22aa）、膜外区（23aa~453aa）、跨膜区(456aa~470aa)三个区（Robbinsetal.,1986）。gC信号肽是gC定位在细胞膜和病毒包膜所必需的。编码信号肽的碱基发生突变，会影响gC糖蛋白的细胞膜定位。糖蛋白gC的膜外区25aa～157aa在介导病毒与细胞肝素样受体的有效吸附上起主要作用，且gC膜外区与中和抗体的产生、中和病毒密切相关。虽然gC是PRV增殖非必需的，但在病毒的吸附、释放和影响病毒毒力以及作为重要的免疫原方面都起重要作用。PRV与靶细胞的吸附依赖于gC蛋白的氨基端1/3部分，该部分缺失时，仅有少量的病毒可与细胞膜结合。Flynn等发现，缺失gC蛋白N端1/3编码区的病毒粒子在肝素酶处理和未处理的细胞上具有相同的感染能力，这说明缺失gC蛋白N端1/3编码区，PRV病毒粒子与细胞膜的结合对肝素的竞争不敏感（Flynnetal.,1993）。进一步研究发现，此段含有76RRKPPR81，96HGRKR100和133RFYRRGRFR1413个肝素结合位点。当缺失其中的一个或两个肝素结合位点，PRV仍可以介导有效吸附，只是吸附效率存在差异，3个肝素结合位点的作用可以相对独立而且功能丰富（FlynnandRyan,1996;Trybalaetal.,1998）。此外，PRV感染细胞过程中还存在由gD介导的不依赖gC的稳定吸附，其在gC缺失后效率很低而且会发生逆转，因此gC介导的是一种快速有9 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析效的吸附。gC基因是PRV的毒力基因之一，缺失以后，不影响病毒的增殖，但能影响病毒毒力。单独缺失gC基因并不能引起PRV毒力的显著降低，但gC基因与gD基因同时缺失或者gE、gI和gC同时缺失大大降低病毒的感染能力（Nixdorfetal.,1999;Metenleieeretal.,1989;Kargeretal.,1998;Whealyetal.,1988）。1.2.4.3gD基因gD基因位于PRV基因组的US区，长约1203～1209bp，编码大约400个氨基酸的多肽，在不同的毒株中是高度保守的。gD是存在于成熟的病毒粒子囊膜表面O-糖基化蛋白，是病毒感染必需的糖蛋白，是中和抗体的目标之一，也是病毒刺激宿主机体产生免疫力的主要免疫原性蛋白（Jonesetal.,1996;Mettenleiter,1994;Spear,1993）。gD蛋白也具有信号肽、跨膜区和细胞膜结合位点的糖蛋白的典型特征。糖蛋白gD能识别另一种称为脊髓灰质炎病毒受体的细胞表面受体，介导病毒与靶细胞的结合，参与病毒穿入宿主细胞与病毒复制的过程，但其对感染细胞同相邻未感染细胞的融合是不必需的（Peetersetal.,1992;陈懿和聂奎,2006）。gD蛋白与非乙酰肝素类受体的结合可以调节PRV野毒株感染细胞与非感染细胞的粘合，对PRV在细胞间的传播不起作用。研究表明，注射抗gD抗体的猪只或小鼠，能够抵抗致死性攻击。1.3PRV的侵入与复制PRV侵入宿主细胞的过程，就是病毒与细胞成分间相互作用的过程，该过程是一个级联反应过程。病毒与敏感的宿主细胞接触时，病毒囊膜表面糖蛋白gC与敏感细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合而吸附到细胞上，这种结合不稳定。随后，PRV糖蛋白gD与敏感细胞上的受体特异性结合，与病毒结合的细胞受体有CD55、粘连蛋白1及粘连蛋白2，PRV至少与其中一个相互作用从而使病毒紧密结合到细胞表面（Mettenleiter,2002;Spearetal.,2000）。最后，在PRV糖蛋白gB和gH/gL进一步参与下促进病毒与细胞的融合，但是这几个蛋白的作用靶点尚未证实（Rauhetal.,1991;Kluppetal.,1997）。病毒囊膜与宿主细胞膜融合后，病毒外壳蛋白(UL11、UL46、UL47、10 山东农业大学硕士学位论文UL48和UL49)迅速与病毒壳体分离，壳体与动力蛋白相互作用，通过微管转运进入核内（Smithetal.,2002）。PRV基因组中基因分为：立早期（IE）基因、早期（E）基因和晚期（L）基因。病毒衣壳到达细胞核后，PRV的基因组以级联反应的方式进行转录（Ben-Porat,1985）。立早期基因可在病毒衣壳入核后2h开始转录，基因启动子US4、UL12、UL22、UL23和UL41可以激活PRV唯一的立早期蛋白IE180，同时其也可被其他病毒的启动子以及宿主细胞基因的启动子交叉激活（Wongetal.,1997;Ouetal.,2002;Changetal.,2004）。在立早期基因激活后，早期基因被激活。早期基因（如：EPO、UL54和UL48）的表达产物可以调节病毒和细胞的基因表达（Fuchsetal.,2002;Schwartzetal.,2006）。其他早期基因翻译的蛋白质，可作用于病毒DNA的复制，如胸苷激酶催化脱氧胸苷三磷酸的合成（Kalimanetal.,1994）。由UL8、UL52和UL5基因翻译产生的蛋白质形成解旋酶-引物酶复合体，同蛋白质UL9识别DNA合成起始位点，促进DNA解旋（Lehmanetal.,1999）。PRVDNA以滚环复制形式产生多联体DNA。最后表达晚期基因，主要产生组装病毒粒子所需的结构蛋白。多联体DNA被剪接为单体DNA被空衣壳上的UL6表达的圆形孔道拉入衣壳形成核衣壳。核衣壳在宿主细胞核内膜开始初次囊膜的合成，此时电镜下可观察到“光滑”的病毒囊膜，并在宿主细胞核外膜脱掉囊膜（Mettenleiteretal.,2006;Granzowetal.,2005）。随后，核衣壳可能在US3，UL36和UL37基因表达的被膜蛋白的参与下被转运到高尔基体并进行二次囊膜的过程。此时病毒囊膜上在电镜下可以清晰地看到其上的纤突。该过程需要UL3.5基因表达翻译的蛋白质的参与（Kluppetal.,2002;Fuchsetal.,2004）。最终，病毒形成了成熟的病毒粒子，通过囊泡移至胞浆膜，被释放到细胞外。缺失UL21基因时，病毒粒子经囊泡转运至细胞膜的过程会被阻断（Granzowetal.,1997）。1.4PRV潜伏感染与免疫抑制潜伏感染是疱疹病毒科成员的共同特征。PRV急性感染后期会有一个潜伏感染期，这是由于PRV感染宿主机体后，即使临床症状消失，宿主机体恢复健康，PRV的基因组仍被保留在宿主细胞中，但不能观察到与原发性感染有关的生理过程，也检测不到感染性病毒粒子及病毒的结构蛋白。处于潜伏感染状态的动物在应激因素和地塞米松、乙酰胆碱等免疫抑制剂能够激活处于潜伏状态的病毒，产生并排出具有感染性11 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析的病毒粒子，导致其它易感动物的感染。这对PR的防治带来很大困难，同时人们也极为重视PRV的潜伏感染(Tanakaetal.,1996)。发生急性感染时，病毒粒子从口咽粘膜进入中枢神经末端，在上颌神经、三叉神经和舌咽神经逆向运输（Maesetal.,1997）。三叉神经节和骶神经节是PRV潜伏感染的主要位点，HSV-1和HSV-2的潜伏神经感染与此类似(Whitley,2001)。处于潜伏感染的动物，在其脑干和嗅球能够检出PRV的DNA基因组（Wheeleretal.,1991）。扁桃体淋巴结是另一个潜伏感染位点（Brockmeieretal.,1993;Cheungetal.,1994;Brittleetal.,2004）。另外，扁桃体中PRV基因组的检测率低，其是不是潜伏感染位点还需确认（Maesetal.,1997）。有研究发现，免疫基因缺失疫苗的动物三叉神经节内的潜伏负载与未免疫动物相比有所减少(Thieryetal.,1994;1996)。已经建立潜伏感染的神经元抵抗其它病毒重复感染的机制还不清楚，但是建立潜伏感染的弱毒活疫苗株可以阻止野毒株的重复感染(Cheungetal.,1989)。PRV是溶细胞病毒，可致细胞裂解死亡，但其分子机制尚不清楚。PRV宿主范围广泛，可感染不同来源的多种组织细胞和动物。PRV感染后导致免疫系统细胞功能损伤和细胞死亡，如肺泡巨噬，这可能会引起局部免疫抑制。PRV还可以感染活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞（Mettenleiter,1996）。有体外试验表明，在感染细胞中PRV能抑制MHCI类抗原的表达，但其在动物体内是否有效还需进一步研究（Mellencampetal.,1991）。1.5PR的防控PRV宿主范围广泛，可感染多种动物。除猪外，其它动物感染PRV后多呈急性死亡，排毒量小。育肥猪和成年猪耐过后终身带毒成为PRV的贮存宿主。鼠类可带毒形成顽固传染源，因其活动范围广阔可致PRV在不同的场间传播。该病可通过直接接触或间接接触传播。一头症状明显的病猪可排出105.3TCID50病毒，成为最危险的传染源（赵德民等,2008）。鼻液、口腔分泌物、呼吸道飞沫、污染的饲料和饮水以及猪只鼻端接触均可造成PRV在猪群间的传播。感染公猪的精液中也含有病毒，病猪精液进行人工授精，可造成母猪感染。环境因素、饲养管理不良和免疫抑制病的存在等可诱发该病。一旦在大型猪场发生PR，很难根除。目前，该病的防治主要是依靠接种疫苗和采12 山东农业大学硕士学位论文取综合防控措施。不论有无发生PR，应当制定和执行PRV感染调查计划，以掌握猪群中PR的分布和病原的存在情况；采用gE基因缺失疫苗对猪群进行免疫，种母猪每年普免3~4次、种公猪普免3次，仔猪根据检测母源抗体水平决定首免日期，可在初生48h内滴鼻免疫，可避免母源抗体干扰，提高粘膜免疫预防感染；通过抗原或抗体检测猪野毒感染请况，并对PRV野毒阳性的猪只淘汰；加强和改善饲养管理，实施严格的生物安全措施；加强消毒措施，给猪只提供良好的生活环境。该病重在预防，对猪场管理人员的预防控制传染病的观念要求较高，只有将其从源头上净化，才可以避免PR的发生。同时，PR防控不是单个猪场的事情，需要各个机构的协调配合，联防联控。1.6本研究的目的和意义20世纪90年代，我国通过基因缺失苗的广泛应用以及gE-ELISA方法区分疫苗免疫动物和野毒感染动物，使猪伪狂犬病得到了有效的控制。但自2011年以来，PR在我国许多省份的规模化猪场相继暴发，造成母猪流产，产死胎，仔猪高死亡率，给养殖企业造成了巨大损失。山东各地区的规模化猪场也相继发生了PR，出现免疫失败的现象，但对免疫失败的原因尚不清楚。为了了解PR的流行情况和PRV的变异情况，本研究开展了PRV的分离鉴定，并对PRV分离株进行全基因组测定，分析其主要的保护性抗原基因和毒力基因的变异情况，以期找到免疫失败的原因，为PR的疫苗的研制和PR的科学防控提供依据。13 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析2材料和方法2.1材料2.1.1病料来源样品来源于2014年11月份至2015年3月，采集自山东齐河、济南、沂水、费县4个地区的5个疑似PR发病的规模化猪场。2.1.2细胞、菌株、载体和和试验动物PK15细胞为本实验室保存；pMD18-T载体购自Takara公司；感受态大肠杆菌DH5α由本实验室制备保存；2kg试验用雌兔购于山东省农业科学院。2.1.3主要仪器设备和试剂高精度电子天平购于奥豪斯仪器有限公司；倒置光学显微镜CKX41购于Olympus；CO2培养箱mco-15AC购于Panasonic；A2型生物安全柜HR40-Ⅱ42购于青岛海尔特种电器有限公司；台式冷冻高速离心机Primer购自Thermoscientific；PCR仪ALS1296购自BIO-RAD。实时荧光定量PCR仪购自Roche。MLS-3020高压锅购于SANYO公司；HYQ-2110涡旋混匀器购于精骐有限公司；移液器购于吉尔森公司；DK-8D电热恒温水槽购于上海都康仪器设备有限公司；GelDocXR紫外成像凝胶系统购于BIO-RAD。AxyPrep小量核酸提取试剂盒购于康宁生命科学有限公司；猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒Ⅱ型荧光PCR检测试剂盒购于北京生科尚仪科技有限公司；DMEM、MEM培养基是海克隆生物化学制品有限公司产品，胎牛血清购于上海衣科赛生物制品有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购与上海生工生物有限公司；细胞培养瓶、6孔板、96孔板、0.22μm滤器购于Biofile公司；其他试剂均为分析纯2.1.4试验中相关溶液0.01MPBS溶液：分别称Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g、NaCl8g、KCl0.2g，溶于800mL蒸馏水中，调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，高压蒸气灭菌，室温或4℃冰箱保存备用。1x104U/mL双抗（青、链霉素）溶液：青、链霉素各1×106U溶于100mL超纯水14 山东农业大学硕士学位论文中即为1x104U/mL双抗溶液，滤器（0.22μm）过滤除菌，分装于高压灭菌的5mL离心管，-20℃保存备用。含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液：DMEM培养液中加入44mL胎牛血清，按细胞培养液体积的1%加入配好的1×104U/mL双抗溶液即可。含2%胎牛血清的MEM细胞维持液：MEM培养液中加入10mL胎牛血清，按细胞维持液体积的1%加入配好的1×104U/mL双抗溶液即可。0.05%胰酶工作液：分别称取1.12gNaH2PO4、2gNaHCO3、0.8gKCl、16gNaCl、2.24g柠檬酸钠、2g葡萄糖、5g胰酶溶于800mL去离子水中，加入1.5mL1%酚红溶液，用去离子水定容至1000mL，配成0.5%胰酶保存液，过滤除菌后分装-20℃保存备用。取0.5%胰酶保存液20mL加入180mL0.01MPBS中，混匀4℃保存即为胰酶工作溶液。50×TAE缓冲液：称242gTrisBase，37.2gNa2EDTA•2H2O置烧杯中，向烧杯中加入去离子水800mL，充分搅拌混匀后加入醋酸57.1mL，混匀后去离子水定容至1L，室温保存备用；用时，将其用去离子水稀释成1×TAE缓冲液。1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖加入250mL锥形瓶中，量筒量取100mL1×TAE缓冲液加入锥形瓶，微波炉加热至无颗粒状物即可。0.1MCaCl2溶液：称取无水CaCl21.1099g，溶解于90mL去离子水中并用去离子水定容于100mL，过滤除菌分装10mL每份，-20℃冻存备用。100mg/mL氨苄青霉素（Amp+）保存溶液：称取5g氨苄青霉素溶于50mLddH2O，充分混合溶解后过滤除菌，1ml/份分装，-20℃保存备用。24mg/mLIPTG保存溶液：称取IPTG1.2g溶于50mL灭菌ddH2O，充分混匀溶解后过滤除菌，1ml/份分装，-20℃保存备用20mg/mLX-Gal保存液：称取1gX-Gal，溶于40mL二甲基甲酰胺（DMF），混匀完全溶解后定容至50mL，1ml/份分装，-20℃避光保存备用LB液体培养基：分别称取10gNaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母粉，溶解于800mL去离子水中，调节pH至7.0，定容1L后分装，121℃高压灭菌20min，冷却后4℃保存备用。LB/Amp/X-Gal/IPTG固体培养基：别称取10gNaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母粉溶解于800mL去离子水，搅拌溶解后用NaOH调节pH至7.0，去离子水定容至1L，称取15g琼脂加入，高温高压灭菌后，冷却至60℃左右加入1mL氨苄青霉素保存液、15 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析1mLIPTG保存液、2mLX-Gal保存液。2.1.5引物设计参考GeneBank中PRVBecker的全基因组序列（登录号JF797219）应用PrimerPremier5.0生物软件设计扩增Qihe547基因组的引物，每段的引物均保证有重叠序列，引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。应用PRVgE基因特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定（gE2F：5’-CCACCATCGCAGAGGAACAATAA-3’/gE2R：5’-CCACCGCCACAAAGAACACG-3’；gE7F：5’-CCCAACGACACGGGCCTCTA-3’/gE7R：5’-GGGCCGGTTCTCCCGGTATT-3’）。2.2试验方法2.2.1山东地区PRV毒株的分离与鉴定2.2.1.1样品处理病料（脑、肺、肝、脾、淋巴结），加少许PBS，用灭菌组织匀浆器研磨匀浆，用PBS将组织匀浆稀释成乳剂，置-20℃冰箱反复冻融3次，4000rpm4℃离心3min，将上清保存于-80℃冰箱。2.2.1.2DNA的提取组织匀浆上清液，参照AxyPrep核酸小量提取试剂盒说明书提取病毒DNA。具体操作过程如下：（1）取处理好的组织匀浆上清液200μL，加入1.5mL离心管中；（2）向1.5mL离心管中加入200μL试剂BufferV-L，振荡混匀，在室温下静置5min；（3）向1.5mL离心管中加入75μL试剂BufferV-N，振荡混匀，12000g离5min；（4）弃沉淀取上清加入新的2mL离心管中，并向2mL离心管中加入300μL含有1%冰乙酸的异丙醇，缓慢地上下颠倒6～8次混匀；（5）将准备好的制备管放入新的2ml离心管中，把步骤4中的混合液转移入置备管中，6000g离1min；（6）倾弃滤液，把置备管放回2mL离心管中，加500μL试剂BufferW1A，在室温下静置1min，12000g离1min；16 山东农业大学硕士学位论文（7）再次倾弃滤液，把置备管放回2mL离心管中，加入800μL试剂BufferW2，12000g离1min；（8）把置备管放回2mL离心管中，12000g离2min；（9）把置备管放到试剂盒内提供的1.5mL离心管中，向置备管膜中央加40～60μL试剂BufferTE。在室温下静置1min，然后12000g离心1min，洗脱核酸，把洗脱的核酸-20℃保存备用。2.2.1.3荧光定量RT-PCR/PCR检测以提取的DNA为模板，应用猪瘟病毒（Hogcholeravirus,HCV）、猪蓝耳病病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRSV）荧光RT-PCR检测试剂盒检测HCV和PRRSV，用猪圆环病毒Ⅱ（Porcinecircovirus,PCV）、伪狂犬病病毒荧光PCR检测试剂盒检测PCV和PRV。具体操作方法参照试剂盒说明书进行，操作方法如下：（1）样本处理检测用的核酸采用2.2.1.2中所提取的核酸，不再细述试剂说明书中的样品处理及核酸提取步骤。（2）扩增试剂的准备与配置在室温下融化试剂盒中的RT-PCR/PCR反应液、Taq酶，振荡混匀后，2000rpm5s离心。每个检测反应需设阴性对照和阳性对照，样品总数为n（包含被检样品，阴、阳性对照）。荧光定量RT-PCR检测方法的反应体系：15μLRT-PCR反应液，0.25μLTaq酶；荧光PCR检测的反应体系：23μLPCR反应液，0.25μLTaq酶。计算好各试剂的用量，加入同一个离心管中，涡旋振荡混匀，2000rpm离心10s。（3）加样荧光定量RT-PCR检测方法：向n个向PCR反应管中，分别加入15μLRT-PCR反应液，加入10μL所提的待检核酸、阴性对照、阳性对照。荧光定量PCR检测方法：向n个PCR反应管中，分别加入23μLPCR反应液，并分别加入2μL待检核酸、阴性对照、阳性对照。盖紧盖，2000rpm离心10s。（4）荧光定量PCR检测荧光定量RT-PCR反应条件：42℃，30min；92℃，3min；92℃10s，45℃30s，72℃1min，5个循环；92℃10s，60℃30s，40个循环；40℃30s。反应体系25μL，在第二个17 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析循环的60℃收集荧光，需要时将荧光信号收集设为Fam荧光素。荧光定量PCR反应条件：94℃3min；94℃5s，60℃30s，共40个循环。反应体系为25μL，在循环步骤的60℃收集FAM荧光信号，淬灭基团“NONE”。（5）质控标准阴性对照Ct值应为none，阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，将此次实验作为无效。（6）结果判断Ct值为none的样本为阴性；Ct值小于等于35.0的样本为阳性；Ct值大于35.0的样本建议重做，重做结果Ct值为none则样本为阴性，否则为阳性。某些未呈S形曲线，但本底较高的样品作为阴性。2.2.1.4病毒分离2.2.1.4.1细胞复苏及传代取液氮罐中保存PK15细胞的冻存管一支，取出后迅速放入37℃水浴融化；用酒精棉球擦拭冻存管，将冻存管中细胞全部洗入细胞培养瓶中，加入约10mL含8%胎牛血清的DMEM细胞培养基，置于5.0%CO2，37℃培养箱中静置培养；2h后，倒置显微镜下观察复苏细胞是否贴壁；细胞贴壁后倒出全部培养基以去除冻存液，PBS洗涤一次，再次加入细胞培养基，置于培养箱中培养。视细胞生长情况，适当更换培养基。待复苏的PK15细胞长成单层致密细胞培养物后，倾弃细胞培养液，加入约2mL0.05%胰酶工作液，洗涤以除去细胞培养瓶中残存的血清，倾弃胰酶溶液；再次加入1mL0.05%的胰酶工作液进行消化，消化过程中注意观察细胞瓶中细胞层（PK15较难消化，所需时间稍长）；当单层细胞出现空隙时，倾弃消化液，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞培养基终止消化；随后加入10mL左右细胞培养基，用胶头吸管反复吹打单层细胞，使细胞脱落并吹打呈单个细胞，进行细胞计数，按细胞数量分装于细胞瓶中，补充细胞培养液。2.2.1.4.2接毒18 山东农业大学硕士学位论文当PK15细胞培养成单层细胞后，倾弃细胞培养液，用2mLPBS洗涤两次；组织匀浆上清液经0.22μm微孔滤器过滤后，接种到PK15单层细胞上；置5%CO2，37℃培养箱中吸附2h，倾弃接种液，用PBS洗涤；加入10mL含2%胎牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养；每日观察细胞病变（CPE）1~2次。待80%左右PK15细胞出现CPE后收获病毒，取上清继续接种单层的PK15细胞；未出现CPE的细胞培养物，盲传3代，依旧没有出现CPE，不再继续传代。2.2.1.4.3病毒纯化将长成单层的PK15细胞，用0.05%胰酶溶液消化，吹打成单个细胞；将吹散的PK15细胞铺于六孔板，当培养成80%融合细胞时接毒；将分离到的病毒进行10倍倍比稀释，稀释成10个梯度；吸弃六孔板各孔的细胞培养基，PBS洗涤2次，接种稀释病毒液800μL；置5%CO2，37℃培养箱中吸附1h；吸出病毒液，PBS洗涤2次。提前将高压好的2％低熔点琼脂糖和含4%胎牛血清的MEM培养基置37℃水浴锅中恒温。当吸附完成后，吸弃病毒液，PBS洗2次；迅速将2％低熔点琼脂溶液和含4%胎牛血清的MEM细胞培养基等体积混合，并快速加5mL到各孔中；在室温下凝固后，在37℃细胞培养箱中倒置培养4~6天。每天观察CPE的变化，当蚀斑达到合适大小，用剪去枪头尖的枪头挑出蚀斑，反复冻融后进行下一轮纯化操作。经过3次纯化获得的病毒接种细胞，收获病毒液并传代。2.2.1.5病毒gE基因特异性引物PCR鉴定使用AxyPrep核酸小量提取试剂盒提取收获病毒液的病毒DNA，方法如2.2.1.2所述，以提取的病毒DNA为模板，用gE基因特异性引物进行PCR鉴定。PCR反应体系25μL：上、下游引物（10mmol/μL）各1μL、2倍GCBufferI12.5µL、dNTP（2.5mmol/μL）4μL、DNA模板2μL、LATaq酶0.25μL、ddH2O4.5μL。PCR反应条件：95℃10min；95℃2min，65℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.1.6TCID50的测定将长成单层的PK15细胞用用0.05%胰酶溶液消化并吹打成单个细胞；细胞计数19 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析后，稀释至1×105个∕mL，吸100μL铺到96孔细胞培养板中，细胞培养箱中培养；将病毒液用无血清的MEM10倍倍比稀释，稀释成10个梯度；待96孔细胞培养板中细胞达80%左右融合时，吸弃细胞培养液，PBS洗涤2次，将各梯度病毒液接种100μL于细胞上，每个梯度接八个孔，每排最后两孔加维持液不接毒作对照，置于5%CO2，37℃培养箱中培养；每天观察细胞病变，培养4天后按Reed-Muench法计算病毒TCID50。2.2.1.7兔感染试验体重约2kg的6只健康母兔，平均分为A、B两组；在A组兔肢前侧肌肉接种病毒液0.1mL；B组接种等量细胞维持液作对照；试验过程中以相同的条件隔离饲养，定时观察发病情况。2.2.2全序列测定2.2.2.1目的片段扩增使用AxyPrep核酸小量提取试剂盒提取收获的纯化病毒液的总DNA，以其为模板用梯度PCR方法扩增各片段。PCR反应体系50μL：上、下游引物（10mmol/μL）各1μL、2倍GCBufferI25µL、dNTP（2.5mmol/μL）8μL、DNA模板2μL、LATaq酶0.5μL、ddH2O12.5μL。梯度PCR的反应条件：95℃10min；95℃1min，50℃~70℃50s，72℃70s，共38个循环；72℃延伸10min。2.2.2.2目的片段的回收PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下观察，将目的片段胶回收，胶回收操作参照胶回收试剂盒说明书进行，其步骤如下：（1）准备工作在WashSolution加入乙醇；检查BufferB2是否有沉淀，有沉淀可适当加热；打开水浴锅，温度调至50℃。（2）从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的凝胶块，置于离心管中，称重。（3）向离心管中加入胶块重量3~6倍的BufferB2，50℃水浴5~10min（琼脂糖凝胶1g按1mL计算）。20 山东农业大学硕士学位论文（4）（选做）目的片段小于500bp时，加入1/3BufferB2体积的异丙醇。（5）将吸附柱放入收集管中；将溶胶液加入吸附柱中，8000g离心30s，倾弃收集管中的液体。（6）向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000g离心30s，倾弃收集管中的液体。（7）重复步骤（6）。（8）空吸附柱于9000g离心1min。（9）将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15~40μLElutionBuffer，在室温下静置1min，9000g离心1min，-20℃保存回收DNA液。2.2.2.3目的片段与克隆载体的连接胶回收的目的片段，测量浓度后与pMD18-T载体连接，连接操作参照pMD18-T载体说明书，连接反应体系为10μL：SolutionI5μL；回收产物4μL；pMD18-T载体1μL。反应条件：16℃连接2h。连接后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。2.2.2.4大肠杆菌感受态细胞的制备操作过程中，要在生物安全柜无菌操作。（1）取-80℃冰箱保存的大肠杆菌DH5α菌种，用放凉的灼烧灭菌接种环蘸取菌液，在TSA培养基平板上划线，37℃培养12h左右；（2）从长出菌落的TSA平板上挑取单菌落，接种于含5ml无抗生素的LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm过夜培养。（3）取摇好的菌1ml，接入含100ml无抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇2h左右至培养基呈半浑浊状态（此时吸光度约0.4~0.6）。（4）在生物安全柜中将菌液分装入50ml离心管，冰浴30min后，4℃5000rpm，离心10min，弃去培养基。（5）用10ml预冷0.1mol/LCaCl2重悬菌体，冰浴30min。（6）4℃，5000rpm，离心10min，弃上清回收细菌。（7）用2ml预冷0.1moL/LCaCl2重悬各管菌体，4℃保存备用或者再加入15%~20%灭菌甘油，每管100μL小管分装，-80℃保存。21 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析2.2.2.5连接产物转化连接产物转化步骤简述如下：（1）吸取10μL连接产物加入100μL制备的感受态细胞中，小心吹打混匀，冰浴30min。若是-80℃保存的感受态细胞，需要在冰上融化后再操作。（2）将感受态细胞在42℃水浴中热激90s。（3）迅速将热激的感受态细胞转移至冰上，冰浴2min。（4）在生物安全柜中，向各管加入800μL无抗生素的LB培养基，放入37℃，200rpm摇1h，使细菌复苏。（5）3000g离心3min，弃大部分上清，保留约100μL，吹打重悬菌体。（6）将重悬菌液涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG固体培养基平板进行蓝白斑筛选，37℃温箱过夜培养。取出平板置4℃冰箱2~4h，挑取平板上白色单菌落，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基5ml的试管中，37℃，200rpm过夜培养，提取质粒。2.2.2.6质粒提取质粒提取的方法参照质粒小量提取试剂盒说明书进行，操作步骤如下：（1）准备工作：BufferP1中加入RNaseA，4℃冰箱储存；在WashSolution中按规定量加入乙醇；检查BufferP2、BufferP3中是否有沉淀。（2）将过夜培养的5ml菌液，分装入1.5mL离心管，8000g离心2min，弃尽全部培养基，收集菌体。（3）在菌体沉淀中加入250μLBufferP1，涡旋振荡重悬菌体。（4）向离心管中加入250μLBufferP2，温和颠倒混匀5~10次混匀，室温静置2~4min。（5）向离心管中加入350μLBufferP3，温和颠倒混匀5~10次混匀。（6）12000g离心5~10min，将上清吸入吸附柱，弃沉淀；8000g离心30s，倾弃收集管中的液体。（7）向吸附柱加入500μLWashSolution，9000g离心30s，倾弃收集管中的液体。（8）重复步骤（7）。（9）空的吸附柱，9000g离心1min。（10）将吸附柱置于干净的1.5mL离心管，在吸附膜中央加入50~100μLElution22 山东农业大学硕士学位论文Buffer，室温静置1min，-20℃保存DNA溶液备用。2.2.2.7质粒酶切鉴定提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶进行双酶切，酶切体系20μL：提取质粒10μL、BufferM2μL、EcoRⅠ和HindⅢ各0.5μL、H2O7μL。37℃酶切2h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.2.8阳性克隆的测序酶切鉴定含目的基因片段的阳性质粒送济南铂尚生物技术有限公司测序，每个片段均挑取三个阳性克隆进行测序。2.2.3全基因序列分析及主要保护性抗原基因序列分析2.2.3.1全基因序列拼接每个片段均用DNASTAR中的SeqMan（DNASTAR,Madison,WI）去除载体序列，并拼接；拼接并检查的各片段序列再导入SeqMan拼接。拼接完成的全基因组序列经Blast，并参考已有的PRV序列信息，对Qihe547各基因进行定位和注释。2.2.3.2基于全基因序列的比对分析应用基因分析工具mVISTA，将Qihe547与国内外部分PRV全基因组序列用多序列全基因组序列比对方法LAGAN进行比对分析(Brudnoetal.,2003)。使用DNASTAR对其进行进化分析。应用TandemRepeatsFinder(TRF)(Benson,1999)和ImperfectMicrosatelliteExtractor(IMEX)(Mudunurietal.,2007)寻找国内外PRV分离毒株的重复序列（Simplesequencerepeat,SSR），分析其在基因组编码区和非编码区的分布情况。重复序列搜寻参数参考叶超等的研究（Yeetal.,2015）.2.2.3.3PRVQihe547基因组中各基因比对分析用软件Megalign，对Qihe547基因组中各个基因同选自GenBank的参考基因序列23 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析用ClustalW方法进行比对分析。2.2.3.4Qihe547株主要保护性抗原基因的变异分析将测序后拼接的Qihe547株的主要保护性抗原基因gB、gC、gD基因的序列与GenBank中选取的参考序列应用DNAStar软件进行比对分析。同时，利用NetNGlyc1.0Server(Guptaetal.,2004)和NetOGlyc3.1Server(Juleniusetal.2005)分别预测Qihe547株和Bartha株糖蛋白gB、gC、gD的N-糖基化位点和O-糖基化位点；利用ImmunomedicineGroup预测其3种糖蛋白的抗原位点。24 山东农业大学硕士学位论文3结果与分析3.1病毒分离和鉴定3.1.1病料检测将采集的疑似PR病料进行匀浆后，取组织匀浆上清提取核酸，应用荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR方法检测，检测结果显示HCV、PRRSV、PCV均是阴性，PRV是阳性（图3-1）。V图3-1荧光定量RT-PCR/PCR检测结果Fig.3-1IdentificationresultsofQuantitativeReal-timeRT-PCR/PCR3.1.2PRV的分离与鉴定荧光定量PCR检测结果为PRV阳性的组织匀浆上清液，过滤除菌后接种PK15单层细胞培养物，接种后PK15出现变圆、形成合胞体等CPE（图3-2）。当CPE达80%左右时收获病毒液，取上清继续在PK15单层细胞上传代。将分离病毒经过3轮蚀斑纯化，并扩大培养后收获5株PRV的病毒液。提取病毒液的DNA，用PRVgE特异性引物采用PCR方法对分离病毒进行检测，检测结果显示分离的5株PRV病毒均为PRV野毒株（图3-3）。将5株PRV分别命名为Qihe547、SDYS1、SDYS2、SDFX、SDJN。选用PRVQihe547株进行后续全基因组测序。将分离得到的Qihe547分离株接种含PK15细胞的96孔细胞培养板测定TCID50，测定结果显示Qihe547分离株TCID50为10-7.0/0.1ml。25 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析将PRV分离株的病毒液，接种体重约2kg的健康母兔，接种24h后，兔出现烦躁、精神不佳、啃咬接种部位、尖叫，最终死亡。死亡兔呈角弓反张状，接种部位因啃咬导致被毛脱落，皮肤出血。剖检见脑膜充血、肺肿大淤血、脾肿大、肾有出血点（图3-4）。图3-2PRV细胞分离A.PK15细胞对照;B.PRVCPEFig.3-2TheisolationofPRV.A.Negativecontrolcell;B.PRVCPE图3-3PRVgE基因鉴定Fig.3-3ThedetectionofPRV图3-4剖检病变Fig3-4Pathologicalchanges26 山东农业大学硕士学位论文3.2Qihe547全基因组测序3.2.1Qihe547株各片段的扩增提取分离纯化的PRVQihe547株病毒液的DNA，以其为模板，应用设计的引物对Qihe547各片段采用梯度PCR进行扩增。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示扩增得到预期的目的片段，Qihe547株部分扩增结果如图3-5、3-6。图3-5Qihe547株部分片段扩增结果（一）Fig.3-5PartialfragmentamplificationresultsofQihe547(1)27 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析图3-6Qihe547株部分片段扩增结果（二）Fig.3-6AmplificationresultsofQihe547(2)3.2.2Qihe547株各扩增片段重组质粒的鉴定经LB/Amp/X-Gal/IPTG固体培养基平板蓝白斑筛选后，挑取5个白色单菌落，接种含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，过夜培养，提取质粒，应用EcoRⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶酶切提取的质粒，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据检测结果挑取包含目的片段的阳性质粒并送至济南铂尚生物技术有限公司测序。部分片段阳性质粒的酶切鉴定结果如图3-7。28 山东农业大学硕士学位论文图3-7部分质粒酶切鉴定结果Fig.3-7Identificationresultsofrestrictionendonucleasedigestion3.2.3Qihe547株全基因序列拼接由于PRV基因组的GC含量很高，且存在复杂的高级结构和许多重复序列致使PRV的扩增和测序难度很大，不易获得其全长基因组，目前GenBank中也仅有少量的PRV全基因组序列。本研究参考PRVBecker株全基因序列，先后共设计合成200多对引物扩增Qihe547株全基因组序列。将测序得到的各个片段的序列用DNAStar中SeqMan拼接，获得Qihe547株全长143404bp的基因组序列。3.2.4Qihe547株全基因序列分析3.2.4.1拼接得到的Qihe547株基因组的特征由各个片段序列拼接得到PRVQihe547的基因组序列，长度为143404bp，基因组的GC含量较高，达73.59%，用GenMarks工具预测有74个ORF，其基因组的结构与PRV29 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析基因组结构相似。PRVQihe547基因组序列长度与GenBank上所登陆的国内外PRV全基因序列的长度大体相当，但其不是PRV完整的基因组序列。PRV基因组gB基因的上游存在一长的重复序列，其重复单元可能是5’-GGGGAGAGGGGAGACGAGA-3’，因该段重复序列的重复单元数目较多且可能的重复单位的GC含量高达66.67%，导致该片段不能测通，测序仅获得该片段两端的各一部分序列。将Qihe547的基因组序列提交到GenBank，登录号：KU056477。3.2.4.2Qihe547株基因组中各基因的定位与注释应用数据库NCBI中Blast工具对Qihe547序列进行比对，参考GenBank中已经登陆的PRV全基因序列（Becker、Kaplan等）的基因位置信息，确定Qihe547株基因组中各基因的位置信息。Qihe547各基因位置如表3-1所示。PRV各基因功能如附录表S1。表3-1Qihe547株基因位置Table3-1GenelocationofQihe547基因基因位置基因基因位置基因基因位置GeneLocationsiteGeneLocationsiteGeneLocationsiteORF-11679-2302UL4049399-50310UL884978-87044UL543061-4146rUL4150843-51940rUL787246-88046rUL534225-5163rUL4252069-53226UL687937-89874rUL525118-8024rUL4353286-54407UL589873-92410UL518011-8742UL4454474-55937UL492468-92905UL508943-9752rUL2656231-57829rUL3.593081-93749rUL49.59673-9972UL26.556231-57091rUL393746-94471rUL4910010-10750UL2557881-59491rUL294528-95499rUL4810814-12055UL2459590-60105rUL195477-95947rUL4712165-14381UL2360098-61060EP097059-98159rUL4614400-16484UL2261196-63253IE180103882-108276r30 山东农业大学硕士学位论文UL2716958-19702rUL2165073-66674rUS1116469-117743UL2819573-21744rUL2066781-67278US3118718-119722UL2921892-25434rUL1967367-71359US4119782-121281UL3025733-28879UL1871534-72424US6121465-122673(72606-73748;UL3128800-29615rUL15US7122694-12379476633-77745)rUL3229608-31023rUL1773799-75598US8123898-125637UL3331022-31378UL1675625-76611US9125695-125991UL3431550-32335UL1477744-78223US2126245-127015UL3532390-32701UL1378193-79368US1127406-128680rUL3633144-42725rUL1279334-80785IE180136873-141267UL3742763-45522rUL1180743-80934IRS101745-117945UL3845579-46685UL1081267-82448rTRS127203-143404UL3947023-49389UL982447-849813.2.4.3基于PRVQihe547全基因序列的比对分析将PRVQihe547提交到基因组比对工具mVISTA，用于全基因序列比对的国内外毒株（JS-2012、TJ、HeN1、Bartha、Kaplan、Becker）通过其登陆号从GenBank中获得。比对结果显示，国内PRV分离株之间的差异较小，国内PRV分离株与国外PRV分离株的差异较为明显，个别基因表现出的差异较大如UL36、US1；这些差异主要集中基因组中基因间的非编码序列（图3-8）。PRVQihe547株与国内其他PRV分离株同源性在96.3%~98.4%之间，与国外PRV分离株同源性在94.3%~94.5%之间，其与国内PRV分离株的同源性高于其与国外PRV分离株同源性（图3-10）。Qihe547株系统发生树表明，国内PRV分离株和国外PRV分离株位于不同的独立分支（图3-9）。31 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析图3-8PRVQihe547株与国内外PRV毒株的比较Fig.3-8ThecomparisonbetweenQihe547strainandotherPRVstrains.图3-9Qihe547株系统发生树Fig.3-9Thephylogenetictreebasedonthewhole-genomesequences.32 山东农业大学硕士学位论文图3-10PRVQihe547株同源性分析Fig.3-10ThehomologousanalysisofPRVQihe547应用IMEX和TRF搜寻不同毒株的重复序列，分析其在编码区和非编码区的分布情况(如表3-2)。统计结果显示，国内PRV分离株3种重复序列具有一致的分布特点，在编码区和非编码区的分布数量的差异不显著。与国外PRV分离株相比，均聚体在编码区和非编码的分布基本一致；微卫星序列，国内PRV分离株在数量上较国外分离株的更多；国内外PRV分离株在小卫星序列上表现出了相反的分布特点。PRV基因组gB基因的上游存在一长的重复序列，其重复单元可能是5’-GGGGAGAGGGGAGACGAGA-3’，而PRVBecker、Bartha、Kaplan在该处的重复序列的重复单元为5’-GGGACGGAGGGGAGA-3’。表3-2不同重复序列数量比较Table3-2ComparisonofsimplesequencerepeatsinPRVstrains.毒株均聚体微卫星序列小卫星序列StrainsHomopolymersMicrosatellite（<10bp）Microsatellite(≧10bp)编码区非编码区编码区非编码区编码区非编码CodingregionNon-codingregionCodingregionNon-codingregionCodingregionNon-codingregionQihe547972401551147893HeN1962401541287486JS-2012932481621077691TJ9825215112875100Becker103224125518165Bartha101225122768262Kaplan10323811972815733 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析3.2.5Qihe547株各基因比对分析由Qihe547株序列中筛选出各基因的序列，与GenBank中的参考序列应用DNAStar中的MegAlign软件进行核苷酸序列和氨基酸序列比对分析。核苷酸序列分析结果显示，与国外PRV分离株（Becker、Kaplan、Bartha）相比较，国内的PRV分离株存在相对一致的变异，这些差异多与PRV基因组序列中氨基酸的重复有关。PRVQihe547株中氨基酸插入或缺失序列如图3-11~图3-18。gC、gB、gD、gH和gL与PRV吸附、侵入和病毒与细胞融合有关。比对结果显示，与国外PRV分离株相比，糖蛋白gH、gL的氨基酸变异较少，gH中有2个氨基酸发生了替换V59D、A201S，在aa481~aa487处的连续的谷氨酸序列的重复数量与国外PRV分离株存在差异；gL中有8氨基酸发生了替换。其他糖蛋白中，与PRV免疫逃避有关的gN的氨基酸序列中存在5S插入；gE中48D插入，aa490~aa500之间连续的天冬氨酸序列发生变异；gI中存在172H的缺失，238G的插入。Qihe547分离株的其他糖蛋白的氨基酸变异主要是氨基酸的替换。外膜蛋白中UL20存在7V，19AAV21的插入。被膜蛋白中UL13、UL21、UL36、UL46、UL47、UL49、UL51中均存在氨基酸的插入或缺失，其中UL36的变异程度最大。衣壳蛋白中UL3变异较大，有92DEGT954个氨基酸的插入，UL6、UL25也存在氨基酸的插入或缺失。对Qihe547株基因组中与PRV复制、基因表达调节的非结构蛋白基因进行比对分析。比对结果显示，编码调节蛋白的US1基因的变异最大，且Qihe547分离株与其他参考毒株的差异显著；EP0变异较小，仅存在个别氨基酸的缺失和替换；IE180存在多个位点的插入或缺失，且这3个基因的氨基酸序列的变异多存在于氨基酸重复序列的位置上。与PRV复制有关的基因中，UL52基因、脱氧尿苷三磷酸酶基因UL50基因、UL28、UL29、UL15、UL9、UL5均存在氨基酸的插入或缺失；与DNA修复相关的基因UL2存在44AGAGAGAG518个氨基酸的插入。核糖核苷酸还原酶编码基因UL39（RR1）基因存在2个氨基酸的缺失，碱性磷酸酶基因UL12基因存在1个氨基酸的缺失。而UL40（RR2）基因、胸苷激酶基因TK基因、蛋白激酶基因PK基因、编码具有RNAse活性产物的UL41基因等的氨基酸突变较少。Qihe547分离株各基因的氨基酸变化见附录图S2。34 山东农业大学硕士学位论文图3-11UL3、UL5、UL13基因氨基酸序列比对结果Fig.3-11ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL3,UL5,UL13gene图3-12UL15、UL20基因氨基酸序列比对结果Fig.3-12ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL15,UL20gene图3-13UL21、UL26.5、UL28基因氨基酸序列比对结果Fig.3-13ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL21,UL26.5,UL28gene图3-14UL29、UL33、UL39基因氨基酸序列比对结果Fig.3-14ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL29,UL33,UL39gene35 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析图3-15IE180、UL46基因氨基酸序列比对结果Fig.3-15ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofIE180,UL46gene图3-16UL36基因氨基酸序列比对结果Fig.3-16ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL36gene36 山东农业大学硕士学位论文图3-16UL49、UL51基因氨基酸序列比对结果Fig.3-17ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL49,UL51gene图3-18UL47、UL52基因氨基酸序列比对结果Fig.3-17ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofUL47,UL52gene3.2.6Qihe547株主要保护性抗原基因的变异分析为了了解PRVQihe547株主要保护性抗原基因（gB、gC、gD基因）变异情况，将这3个基因进行PCR扩增测序。将测序后得到的gB、gC、gD基因的序列提交到Genbank，登录号分别为KT818618、KT818619、KT818620。37 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析3.2.6.1Qihe547株gB、gC、gD基因核苷酸序列分析利用DNAStar将Qihe547株gB、gC、gD基因序列与选自GenBank的参考序列比对分析，并构建系统发生树（图3-19），比对结果显示Qihe547株gB、gC、gD基因的系统发生树均可分为两个大群（Group），且均位于各自进化树中的Group1；PRVQihe547株这3个基因均与国内新近分离株的亲缘关系最近，而与国外毒株的亲缘关系较远，表明Qihe547分离株为目前我国流行的PRV野毒株。目前PRV分离株分为基因Ⅰ型（genotypeⅠ）和基因Ⅱ型（genotypeⅡ）两个基因型，结合Qihe547株gC基因系统发生树，发现Qihe547株所在的Group1属于genotypeⅡ，Group2属于genotypeⅠ。图3-9Qihe547株gB、gC、gD基因系统发生树Fig.3-9ThephylogenetictreesofgB,gC,gDgeneofPRVQihe5473.2.6.2Qihe547株gB、gC、gD推导氨基酸序列比对分析将Qihe547株gB、gC、gD基因序列转为氨基酸序列后，应用MegAlign软件与参考序列进行比对。氨基酸序列比对结果显示，与欧美、日韩等国外分离株相比，国内PRV分离株的糖基化蛋白gB、gC、gD氨基酸序列同样存在相对一致的氨基酸变化38 山东农业大学硕士学位论文（图3-10）。Qihe547分离株gB、gC、gD氨基酸序列中的插入、缺失序列，如gB75SPG773个氨基酸的缺失，94G的插入、gC63AAASTPA697个氨基酸的插入、gD278RP2792个氨基酸的插入，与国内其他PRV分离株相一致。但是，Qihe547株gB575S与国外参考病毒株一致，与2012年以来的国内分离株不同。另外，Qihe547、TJ和BJ/YT分离株915N、921P与其它参考病毒株不同，这些氨基酸变化的影响尚不确定。图3-10PRVQihe547分离株gB、gC和gD氨基酸序列比对结果Fig.3-10ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofQihe547gB,gC,gD3.2.6.3Qihe547株糖基化蛋白gB、gC、gD抗原表位及糖基化位点分析将糖基化蛋白gB、gC、gD氨基酸序列提交到NetNGlyc1.0Server(Guptaetal.,2004)、NetOGlyc3.1Server(Juleniusetal.2005)和ImmunomedicineGroup分别预测Bartha、Qihe547及新近分离HeN1、JS等分离株的糖基化位点和潜在抗原位点。预测结果显示，与Bartha株相比，Qihe547分离株gB、gC、gD潜在的抗原位点发生了变39 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析化，同时其潜在的O-糖基化位点也发生了变化而N-糖基化位点与前者一致并未出现变化。Qihe547分离株与HeN1、JS等分离株相比，这些新近分离的PRV毒株的潜在抗原位点和糖基化位点是一致的。gB、gC、gD抗原表位预测结果见附录表S2；gB、gC、gD潜在O-糖基化位点预测结果如附录图S1。与Bartha株相比，Qihe547株gB预测增加了89IDGAVSP95潜在抗原位点，但缺失了65ASASPTPVPGSP76，79TPNDVSAE86，433EAIDAIYQ4403个潜在抗原位点。Qihe547分离株gB缺失第66、70位的潜在O-糖基化位点，增加第73、504、519位的潜在O-糖基化位点。Qihe547株gB的这些变化主要发生在gB优势抗原表位区aa59~aa126和aa507~aa734中。Qihe547分离株gC在aa43~aa59处预测有43AGELSPSP50和52STPEPVSG59两个潜在的抗原位点，而Bartha株在其gC的aa43~aa57处仅有一个潜在的抗原位点43AGELSPSPPPTPAPA57，两个PRV毒株的在gC中的这一变异显著。与Bartha株相比，Qihe547分离株gC的潜在O-糖基化位点发生了变化，Qihe547分离株gC缺失第26位，增加第52、60、61、66、67位的潜在O-糖基化位点。Qihe547株gC的这些变化主要处在对病毒与细胞的结合以及对中和抗体的产生具有重要作用的gC的膜外区（aa23~aa453）。与Bartha株相比，Qihe547分离株gD与gC潜在抗原位点的变化类似，Qihe547分离株gD在aa62~aa88预测有62LEDPCGVVALISDPQVDR79和81LNEAVAHR88两个潜在的抗原位点，而Bartha株gD在该位置仅有一个潜在的抗原位点62LEDPCGVAALISDPQVDRLLSEAVAHR88。在O-糖基化位点上，Qihe547株gD缺失第59位，增加第344位的潜在O-糖基化位点。40 山东农业大学硕士学位论文4讨论4.1PRV分离鉴定20世纪90年代后，全国80%以上猪场使用从匈牙利引进的Bartha-K61疫苗对PR进行免疫预防，免疫效果良好使PR得到了有效控制。2011年底某种未知的猪疫病在我国大规模爆发并给养猪业造成巨大经济损失，后研究证实该疫病的病原为PRV（Yuetal.,2014;Anetal.,2013）。PR暴发后，迅速波及我国多个省份，许多原为gE抗体阴性的规模化猪场转阳，仔猪出现神经症状并表现高死亡率，育肥猪表现严重的呼吸系统症状，妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎。自2011年底以来，山东省各地区规模化猪场也相继发生了PR，而且发病症状严重，影响猪场的生产，造成重大经济损失。为了解山东地区PRV流行野毒株的变异情况，本研究从2014年11月至2015年3月采自山东齐河、济南、沂水、费县4个地区5个疑似PR发病规模化猪场的样品中分离得到5株PRV野毒株，分别命名为Qihe547、SDYS1、SDYS2、SDFX、SDJN。组织匀浆上清液接种约8h后，PK15细胞即开始出现细胞病变，这可能说明目前流行的PRV毒株在细胞内的增殖速度较快。这些PRV分离株为研究山东地区PRV流行毒株变异情况研究、PR防制研究、新型疫苗研究等提供了研究素材。4.2PRVQihe547株基因组中各基因的遗传变异近年来，PRV有不断变异，毒力、致病力增强的趋势，分离PRV野毒株并对其基因组中各基因进行突变分析对该病的防制具有重要意义。陈超等测定在2013年12月至2014年5月间分离自山东地区的12株PRV毒株TCID50，结果显示这些毒株TCID50与PRVEa和MinA的TCID50相当并推测近年来流行的PR可能不是由毒力增强引起的(陈超等,2015)。为了解Qihe547株各基因的变异情况，分段扩增其全基因序列，测序得到143404bp的序列，GC含量高达73.59%。PRV高GC含量及高级结构和重复序列的存在给PCR扩增和测序制造了困难。各片段序列拼接过程中对序列进行校对并针对部分插入缺失序列再次设计引物进行扩增并测序验证。基于全基因序列的比对发现，Qihe547分离株与国内分离株的同源性高于其与国外PRV分离株的同源性，基于PRV41 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析全基因序列构建的系统发生树显示中国PRV分离株和国外的PRV分离株分处两个独立分支。目前PRV毒株分为基因Ⅰ型（genotypeⅠ）和基因Ⅱ型（genotypeⅡ）两个基因型（Yeetal.2015），Qihe547分离株属genotypeⅡ。对Qihe547株基因组中各基因进行了氨基酸序列的比对分析，发现与PRV复制和其基因调控相关的基因存在更为广泛的变异。IE180基因是PRV唯一的立早期基因，其表达产物IE180为感染初期立即表达的一种多功能调控蛋白，控制病毒所有的必需和非必需蛋白质的转录复制，是病毒的关键蛋白质，在体外能够激活能够激活gG、gH、TK、UL12、UL41等基因启动子驱动的基因的表达（Taharaguchietal.,1994;Changetal.,2004）。IE180的N末端有一强的酸性激活区域（aa1~aa34）（Martinetal.,1990）。与国外PRV毒株相比，Qihe547株的IE180在该酸性激活区域的连续的丙氨酸序列中插入两个丙氨酸，同时还存在多个氨基酸的替换，这些变异可能影响到病毒早期基因的转录激活和表达。EP0发挥转录激活功能所必需的含环指结构域的氨基末端（aa1~aa84）和酸性氨基酸区域（aa114~aa242）存在多个氨基酸的替换，可能影响EP0的转录激活功能进而影响PRV的基因表达和复制。US1基因表达产物作为调节蛋白，能够与早期基因表达产物相互作用来促进PRV基因的反式激活（Derbignyetal.,2002）。在US1蛋白氨基酸序列中，表现出了高度的变异性，在不同的PRV分离株中其氨基酸序列均有差异，而且这些表现出高度变异的区域与氨基酸的重复有关。编码PRV复制相关的酶的基因中，组成解旋酶-引物酶复合体的UL5、UL8和UL52均含有氨基酸的插入或缺失，同时存在许多氨基酸的替换，这些氨基酸的变异是否影响解旋酶-引物酶复合体的功能或者是否与3个蛋白质结合构成该复合体有关尚需研讨。在早期病毒感染和晚期病毒粒子成熟中发挥重要作用的UL36，与国外PRV分离株相比，发生极大的变异。UL16和UL21被认为在疱疹病毒壳皮蛋白中很保守，两者互作在病毒成熟过程中发挥重要作用（Kluppetal.,2005）。PRVQihe547分离株的UL21中存在2个连续5个氨基酸的插入（364NGDGG368和410PIVSA414），UL16存在16个氨基酸的变异。UL36、UL21、UL16等的变异可能影响病毒的成熟和释放过程。在PRV侵入宿主细胞的过程中，糖基化蛋白gC，gB，gD，gH，gL负责病毒附着于宿主细胞的表面和随后病毒囊膜与细胞膜的融合（Orkideetal.,2013）。有研究证实，将Bartha株gH的59D和438S分别替换为59V和438P能让gH完全恢复活性（Schrteretal.,2014）。Qihe547株gH的438位氨基酸仍是Pro（P），而Qihe547株gH的59位是Asp（D），这可能说明目前流行毒株Qihe47的gH活性并未完全发42 山东农业大学硕士学位论文挥。但是，Qihe547株gHaa481~aa487处的连续的谷氨酸序列对gH的活性的影响需要进一步的研究。糖蛋白gN信号肽序列区的氨基酸变化对病毒的免疫逃避的影响也需进一步的研究。gE中与PRV的嗜神经性有关的第125位Val和第126位Cys保守。重复序列作为生物基因组中的重要组成部分，其具有高突变率。在激活序列上游存在的重复序列能够与各种调节蛋白结合，从而影响基因的转录转录和翻译；编码区内的重复序列可能对基因的转录有影响，可能影响蛋白质功能的发挥（Lueetal.,1989）。在对Qihe547分离株各基因的比对分析过程中，发现许多氨基酸的变异与氨基酸的重复相关。对国内外PRV分离株不同类型重复序列统计分析，发现在编码区和非编码区不同种类重复序列的数量有所差异，国内分离株较国外PRV分离株，在微卫星序列数量和小卫星序列分布上存在差异。重复序列在Qihe547株编码区和非编码区的分布数量的差异可能与PRV变异有关，也可能影响到PRV的基因表达调控及蛋白质功能的发挥。4.3Qihe547株主要保护性抗原基因的遗传变异gB、gC、gD是PRV的主要的保护性抗原，能够诱导宿主产生保护性的细胞免疫反应，注射gB、gC、gD单克隆抗体的猪只能够抵御强毒株的攻击，同时gB、gC、gD基因也是研究新型疫苗的主要的靶基因。另外，gB、gC、gD的变异性有利于PRV逃避宿主机体的免疫防御机制（Takadaetal.,1995）。有研究报道，目前广泛应用的Bartha-K61疫苗对目前流行的PRV变异毒株的攻击不能提供完全的保护（Anetal.,2013）。因此，对gB、gC、gD基因的变异分析具有十分重要的意义。通过对gB、gC、gD基因比对分析发现，Qihe547分离株与新近分离的PRV毒株的亲缘关系最近，与2012年之前的分离的国内PRV分离株亲缘关系较近，与国外PRV分离株亲缘关系较远。氨基酸序列的比对分析结果显示，相较于其他糖基化蛋白gB、gC、gD的变异较大，均存在氨基酸的插入或缺失及大量的氨基酸替换。与PRVBartha株相比，Qihe547株gB潜在抗原表位和潜在O-糖基化位点的差异主要在其优势抗原表位区aa59~aa126，该区域也具有抗体结合位点的特征；gC的潜在抗原表位和潜在O-糖基化位点的差异主要在其重要的功能区膜外区aa23~aa453，也在gC的抗体结合位点区域aa44~aa290（Oberetal.,2000），另外gC氨基酸序列中存在的7个连续氨基酸序列的插入，可能改变该区域抗体结合位点的结构；gD潜在抗原表43 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析位和潜在O-糖基化位点也集中在gD的主要抗原表位区。O-糖基化能遮盖抗原决定簇或者自身形成抗原决定簇，从而影响蛋白质的抗原性，中和抗体与抗原的结合及抗原与宿主细胞上抗原受体的结合。Qihe547株gB、gC、gD在主要功能区潜在抗原位点和潜在O-糖基化位点变化可能导致Qihe547分离株的抗原性的变化，可能影响抗原抗体的结合，可能导致疫苗免疫所产生的中和抗体不能完全有效地中和病毒，从而导致免疫失败。总之，Qihe547株gB、gC、gD这些变异可能有利于Qihe547分离株逃避宿主免疫防御机制，可能是导致该病免疫失败的原因之一。44 山东农业大学硕士学位论文5.结论1）从山东多个地区的免疫Bartha-K61疫苗的猪场分离到5株PRV，并测序得到PRVQihe547分离株的全基因组序列。2）与国外PRV分离株相比，包括PRVQihe547株在内的国内PRV分离株表现出了相对一致的氨基酸变异，国内PRV分离株间的同源性较高且均属于基因Ⅱ型。3）与PRVBartha株相比，PRVQihe547株在gB优势抗原表位区（aa59~aa126和aa507~aa734）、gC膜外区（aa23~aa453）和gD的主要抗原表位区的变异可能是导致免疫失败原因之一。45 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山东农业大学硕士学位论文7.附录表S1PRV基因功能TableS1PRVgenefunctions(fromPomeranzetal.,2005)分子量统称基因结构作用核心功能SizeCommonProposedfunction(s)GeneStructuralroleCore(kDa)nameORF1.235.3UnknownVirionNoORF121.8UnknownVirionNoUL5440.4ICP27Transcriptionmodulation;cell-cellspread;RNA-bindingproteinNonstructuralYesViralegress(secondaryenvelopment);glycoproteinK;typeIIIVirionUL5333.8gKmembraneprotein;gK/UL20togetherinhibitglycoproteinNo(envelope)mediatedmembranefusionUL52103.3DNAreplication;primasesubunitofUL5/UL8/UL52complexNonstructuralYesViralegress(secondaryenvelopment);tegumentprotein,VirionUL5125Yespotentiallypalmytoilated(tegument)UL5028.6dUTPasedUTPaseNonstructuralYesImmuneevasion(TAPinhibitor);glycoproteinN;typeIVirionUL49.510.1gNYemembraneprotein;complexedwithgM(envelope)InteractswithC-terminaldomainsofgE&gM;VirionUL4925.9VP22NoTegumentprotein(tegument)VP16Generegulation(transactivator);viralegress(secondaryVirionUL4845.1No,α-TIFenvelopment);tegumentprotein(tegument)Virion(tegumentUL4780.4VP13/14Viralegress(secondaryenvelopment);tegumentproteinNo)VirionUL4675.5VP11/12Unknown;tegumentproteinNo(tegument)59 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析Viralentry(fusion);cell-cellspread;glycoproteinB;VirionUL27100.2gBYestypeImembraneprotein(envelope)DNAcleavageandpackaging;CapsidUL2878.9ICP18.5YescomponentoftheUL15/UL28terminaseprecursorUL29125.3ICP8DNAreplicationandrecombination;bindssinglestrandedDNANonstructuralYesDNAreplication;UL30115.3NonstructuralYesDNApolymerasesubunitofUL30/UL42holoenzymeViralegress(nuclearegress);presentonlyinprimaryenvelopedPrimaryvirionUL3130.4Yesvirion;interactswithUL34(tegument)DNApackaging;efficientlocalizationofcapsidstoreplicationCapsidUL3251.6YescompartmentsprecursorUL3312.7DNAcleavageandpackaging;associateswithUL28andUL15NonstructuralYesViralegress(nuclearegress);presentonlyinprimaryenvelopedPrimaryvirionUL3428.1virion;tail-anchoredtypeIInuclearmembraneprotein;interactsYes(envelope)withUL31UL3511.5VP26SurfacecapsidproteinVirion(capsid)YesViralegress(capsidtegumentation);largetegumentprotein;VirionUL36324.4VP1/2YesinteractswithUL37andcapsid(tegument)VirionUL3798.2Viralegress(capsidtegumentation);interactswithUL36Yes(tegument)UL3840VP19cMinorcapsidprotein;UL38/UL18/UL18triplexcomponentVirion(capsid)YesUL3991.1RR1Nucleotidesynthesis;largesubunitofribonucleotidereductaseNonstructuralYesUL4034.4RR2Nucleotidesynthesis;smallsubunitofribonucleotidereductaseNonstructuralNoVirionUL4140.1VHSGeneregulation,RNAse,degradeshostandviralmRNAsNo(tegument)DNAreplication;polymeraseaccessorysubunitofUL30/UL42UL4240.3NonstructuralYesholoenzymeInhibitsglycoprotein-mediatedmembranefusion;typeIIIVirionUL4338.1Nomembraneprotein(envelope)60 山东农业大学硕士学位论文gCViralentry(virionattachment);glycoproteinC;typeIVirionUL4451.2Nomembraneprotein;bindstoheparansulfate(envelope)pre-VP22Majorscaffoldprotein;substrateforUL26protease;CapsidUL26.528.2YesaCapsidformationandmaturationprecursorCapsidUL2654.6VP24Minorscaffoldprotein;capsidmaturationproteaseYesprecursorUL2557.4Capsid-associatedprotein;requiredforcapsidassemblyVirion(capsid)YesUL2419.1Unknown;typeIIImembraneprotein?YesNucleotidesynthesis;thymidinekinase;selectivelyactivatesUL2335TKNonstructuralNoacyclovirViralentry(fusion);cell-cellspread;glycoproteinH;typeIVirionUL2271.9gHYesmembraneprotein;complexedwithgL(envelope)Unknown,capsid-associatedtegumentprotein;VirionUL2155.2interactswithUL16Yes(tegument)Viralegress;typeIIImembraneprotein;requiredforgKUL2016.7processing;gK/UL20togetherinhibitglycoprotein-mediated?NomembranefusionUL19146VP5Majorcapsidprotein;formshexonsandpentonsVirion(capsid)YesUL1831.6VP23Minorcapsidprotein;UL38/UL18/UL18triplexcomponentVirion(capsid)YesVirionUL1764.2DNAcleavageandencapsidationYes(innercapsid)VirionUL1634.8Unknown;tegumentprotein;interactswithUL21Yes(tegument)DNAcleavage/encapsidation;terminasesubunitoftheCapsidUL1579.1YesUL15/UL28terminase;interactswithUL33,UL28&UL6precursorUL1417.9Unknown?YesVirionUL1341.1VP18.8Unknown;protein-serine/threoninekinaseYes(tegument)61 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析UL1251.3ANDNArecombination;alkalineexonuclease?YesViralegress(secondaryenvelopment);VirionUL117Yesmembrane-associatedtegumentprotein(tegument)Inhibitsglycoprotein-mediatedmembranefusion;glycoproteinVirionUL1041.5gMM;typeIIImembraneprotein;CterminusinteractswithYes(envelope)tegumentproteinUL49;complexedwithgNSequence-specificori-bindingprotein,UL990.5OBPNonstructuralNoATP-dependenthelicasemotifUL8.551OPBCC-terminaldomainofUL9?NoDNAreplication;UL871.2NonstructuralYespartofUL5/UL8/UL52helicase/primasecomplexUL729Unknown?YesUL670.3Capsidprotein;portalprotein;dockingsiteforterminaseVirion(capsid)YesDNAreplication;partofUL5/UL8/UL52UL592.1NonstructuralYeshelicase/primasecomplex;helicasemotifUL415.8Unknown?NoViralegress(secondaryenvelopment);UL3.524?Nomembrane-associatedproteinUL325.6UnknownNonstructuralNoUL233UNGDNArepair;Uracil-DNAglycosylaseNonstructuralYesViralentry(fusion);cell-cellspread;glycoproteinL;membraneVirionUL116.5gLYesanchoredviacomplexwithgH(envelope)Generegulation(transactivator);earlyprotein;ND10EP043.8ICP0VirionNostructuremodulation;containsRINGfingermotifIE180148.6ICP4Generegulation(transactivator);immediate-earlyproteinNonstructuralNoRSp40/Unknown;HSV-1homolog(ICP22)actsasUS139.6?NoICP22regulatorofgeneexpressionUS3Minorformofproteinkinase(53-kDamobility);42.9PK?No(minor)Inhibitsapoptosis;mitochondrialtargetingmotif62 山东农业大学硕士学位论文Viralegress(nuclearegress);inhibitsapoptosis;majorformofUS3Virion36.9PKproteinkinase(41-kDamobility);foundinbothprimaryandNo(major)(tegument)secondaryenvelopedvirionsUS453.7gGUnknown;glycoproteinG(secreted)SecretedNoViralentry(cellularreceptorbindingprotein);VirionUS644.3gDNoglycoproteinD;typeImembraneprotein(envelope)Cell-cellspread;glycoproteinI;VirionUS738.7gINotypeImembraneprotein;complexedwithgE(envelope)Cell-cellspread;glycoproteinE;typeImembraneprotein;VirionUS862.4gEcomplexedwithgI;C-terminusinteractswithUL49;ProteinNo(envelope)sortinginaxonsVirionUS911.311KProteinsortinginaxons;typeIItail-anchoredmembraneproteinNo(envelope)VirionNoUS227.728KTegumentprotein;membraneassociatedprotein(tegument)表S2PRVgB、gC、gD潜在抗原位点TableS2PotentialantigensitesofPRVgB,gC,gDPRVQihe547gBPRVBarthagB序号序列序号序列序号序列序号序列nSequencenSequencenSequencenSequence123GLGRLWPAPHHAA20469ISNELAQLYA123GLGRLWPAPHH21453RPEVYLARGGFAARGAVALALLLLA478AAAARGAVALALVVAFRP469LAATPTCGAAAVTR6LLLALAAAPPCGA3AAVTR63289IDGAVSP9521482ERLGLAGVV265ASASPTPVPGSP7622471ISNELAQLYA480GPASPAA4973110ARTAVRA11622530EFARLQFTY379TPNDVSAE8623484ERLGLAGVVGP63 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析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 山东农业大学硕士学位论文FLSNPFGALAIGLLVLAGLVAAFLAYRHIS82316357RMPHFTVAW36535830MKALYPVTT816331RFQQVEHYYPI36766QGLGDVGAAV38DL343GKVVLGATGAVISAVGGMVSFLSNPFGALAIGLLVLAGLVAAFLAYRHIS82517370KTRRVCSL37736864RYMSIVSALE17358LRTPHFTVAW3637832MKALYPVTT840Q874718399TSRALGASFVSDVT37885GPALLASRV8918372KTRRVCSL37938866RYMSIVSALEQ8QLDLQRVHLGDCVL376R42719450DKPEVYLARGGFV19401TSRALGASFVSD39887GPALLASRV895VAFRP467VTQLDLQRVHLGDCVLR42920433EAIDAIYQ440PRVQihe547gCPRVBarthagC序号序列Sequence序号序列Sequence序号序列Sequence序号序列Sequencennnn14LARAMLALLALYTA10259PFRAVCVVR14LARAMLALLAPY10263YPRRSVRL270AIAAAPSST26D268AAAIAAA22243AGELSPSP5011270YPRRSVRL277243AGELSPSPPPTP11275DEHPVDAAFVTAPA57N286352STPEPVSG5912282DEHPVDAAF360EAGAVSTPRAPP12297TRVSVVNVTRAVTN293PSVSR76DVPGLAA314464AASTPAAVSTPRVP13304TRVSVVNVT498RKRIVCRERLFS13317DADALAPSLRCPPSVSR83RADVPGLAA321ARVGDAVSFGCAEAVWYRDSVAS33865 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析VFP1245105RKRIVCRERLFSA14324DADALAPSLR5159PRERLLFSSANA14341FSEALRPHVYHRVGDAVSFGCAVVPCEAVWYRDSVSLAHADALTPVVEPAAVSVRFVEGFR132AS345183AVCDGLCVPPEARLAWS3806166PRERLLFSSANASL15348FSEALRPHVY6190TVANVSGEVSV15383AADTVYHLGAAHADALASAVVVE192HPAAVSVRFVERVAA204CAEHPGLLNVRSGFAVCDGLCVPARPLSDLDGPVDPEARLAWS387YTCRLEGLPSQLPVF4317197TVANVSGEVSVRV16390AADTVYHLG7213YTWRVLS21916437YDASPASVSWPAA211ACAEHPGLLNVVVSSMIVVIAGIGIRSARPLSDLDGLAIVLVIMATCVYPVDYTC426Y4758220YTWRVLS22617446ASPTSVSWPV8226RSANVSLLLYSVTSMITVIAGIAQPEFGLSAPPVLFILAIVLVIMATCG250VYY4829233RSANVSLVLYHQP9252PFRAVCVVRD261EFGLSAPPVLFG257PRVQihe547gDPRVQihe547gD序号序列序号序列序号序列序号序列nSequencenSequencenSequencenSequence14AALLAALVAR1311185EGQECPFAR14AALLAALVAR1311213RGVDVMRFLTVDQ196PFYQQ227216LGADVDAVPAPTFP12211FKRGVDVMR216LGADVDAVPAP12229PHREVVNY236PPAYPY35FLTPFYQQ227TFPPPAYPY35339WQLTLTTVPSPFVG13229PHREVVNY236339WQLTLTTVPSPF13245LPRAYAAATPYPADVYHT59VGPADVYHT59AIDPAR26166 山东农业大学硕士学位论文462LEDPCGVVALISDP14245LPRAYAAAT462LEDPCGVAALIS14279PEPAPVTP286QVDR79PYAIDPAR261DPQVDRLLSEAVAHR88581LNEAVAHR8815281PEPAPATP288591TYRAHVAWY9915288PPGRLPE294691TYRAHVAWY9916290PPGRLPE2966101IADGCAHLLYFI16317HRPFAPPAVVPEYADCDP119S3287101IADGCAHLLYFIEY17319HRPFAPPAVV7148ELGLLMVAP15617343AAPGVSRHRSVADCDP119PS330IVG3568148ELGLLMVAP15618345AAPGVSRHR8164YRRLVSVDGVN18361MGALLVGVCVSVIVG358I175YIFFR3759164YRRLVSVDGVNI17519363MGALLVGVC9177TDFMVAL18319380KGYRLLG386VYIFFR37710177TDFMVAL18320382KGYRLLGG38910185EGQECPFARVDQ196图S1PRVgB、gC、gDO-糖基化位点预测结果FigS1PredictedO-glycosylationsitesofPRVgB、gC、gD67 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析图S2PRVQihe547分离株各基因氨基酸序列比对结果FigS2ThecomparisonresultsofaminoacidsequencesofPRVQihe547genes68 山东农业大学硕士学位论文69 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析70 山东农业大学硕士学位论文71 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析72 山东农业大学硕士学位论文73 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析74 山东农业大学硕士学位论文75 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析76 山东农业大学硕士学位论文77 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析78 山东农业大学硕士学位论文79 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析80 山东农业大学硕士学位论文81 伪狂犬病病毒Qihe547分离株全基因测序分析8.致谢本论文是在田夫林研究员和谢之景副教授的悉心指导下完成的。三年来，导师严谨务实的治学态度、对科学前沿敏锐的洞察力、博大精深的学识、活跃的科学思维、敬业的工作作风一直深深地激励着我，使我终生受益。导师为我的成长倾注了大量心血，在学习和科研上给予我耐心细致的指导，使我能够克服困难顺利毕业。在此谨向两位恩师致以崇高的敬意和诚挚的谢意感谢山东省动物疫病预防与控制中心的张洪杰副主任、廉爱玲副主任、陈静老师、兰邹然老师、李云岗老师、陈书民老师、王贵升老师、孙圣福老师、马慧玲老师对我的关怀与帮助。感谢山东农业大学预防兽医专业的崔治中教授、赵孝民教授、柴同杰教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、崔言顺教授、常维山教授、孙淑红副教授、胡敬东副教授、赵鹏副教授给予我的热情无私的指导、关心和帮助！感谢陈超、李鹏、陈晨、孙振、薛瑞雪、张月、李艳荣、张力燕、汪晓飞、李德庆等师兄师姐对我的帮助和指导，感谢宗晓晨、韩恺怿、李海娥、李秀丽、姜常青、古静、杨青、张璐、赵永峰、刁菲菲、隋超、崔学沛、苏中渠、孙厚法等同学在学习和生活上的关心和照顾！感谢山东省动物疫病预防与控制中心的李玉杰、蔺晓月、徐聪、尹斐斐、刘丽萍、刘娜、徐鸿，孔祥华等在科研过程中给予的帮助。特别感谢我深爱的父母及家人，感谢他们这么多年来对我的理解、支持、关怀和鼓励。他们深挚、宽厚、无私的爱，使我能够顺利完成学业。在论文完成之际，衷心地感谢育我成才的山东农业大学，再一次向所有关心、帮助过我的老师和朋友们表示衷心的感谢！82 山东农业大学硕士学位论文9.攻读硕士学位期间发表论文情况1.刘存,陈书民,刘砚涵,韩铠怿,李玉杰,陈超,田夫林,谢之景.伪狂犬病病毒Qihe547分离株主要保护性抗原基因序列的变异分析[J].中国预防兽医学报，2016，38（4）：331-334.83