五味子叶枯病菌拮抗菌筛选、分离鉴定及其发酵特性研究

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分类号：R931.71单位代码：10193密级：学号：20130333硕士学位论文五味子叶枯病菌拮抗菌筛选、分离鉴定及其发酵特性研究IsolationandIdentificationofantagonisticactinomycetesagainstleafblightpathogensofSchisandrachinensisandtheoptimizationofitsfermentationconditions作者姓名：王壮学位类别：医学硕士专业名称：生药学研究方向：植物药指导教师：张爱华副教授张连学教授所在学院：中药材学院2016年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要五味子叶枯病为真菌性病害，病原菌细极链格孢[Alternariatenuissmia(Fr.)Wiltshire]，主要为害部位为叶片，可导致早期落叶、落果、果实品质下降、产量降低等严重后果，是五味子主要病害之一。现阶段叶枯病病害多采用化学农药进行防治，然而随着人们对药材质量要求增高，化学农药产生的抗药性、残留性及环境污染终将成为难题。放线菌广泛存在于大自然中，其次生代谢产物抗生素可特异性作用于某些病原菌，作为生物农药作用于病害防治中。本文分离并筛选拮抗五味子叶枯病病原菌的放线菌株，鉴定、研究该拮抗菌的发酵特性，并测定其防治效果。1.从集安五味子叶枯病典型病叶分离致病真菌细极链格孢，经柯赫氏法则验证其确为该病害病原菌。生物学特性表明：PDA及PDBA为最适培养基；果糖为最适碳源；蛋白胨为最佳氮源；光照条件下菌丝生长较为迅速，黑暗条件中产孢量有所增加；菌丝生长最适pH值为5-7之间；最适温度为25℃；孢子致死温度为54℃。2.从五味子根际土中分离得到27株放线菌，初筛后得到两株高效拮抗菌分别为A-25-8菌株及A-38菌株，三线法测定拮抗率分别为66.26%和66.10%，A-25-8菌株为针对五味子叶枯病的拮抗菌，A-38菌株为能拮抗五味子及人参多种病害的广谱拮抗菌。A-25-8及A-38菌株发酵菌液及无菌发酵滤液接入五味子叶枯病病原菌菌块，病原菌在三角瓶发酵液及无菌发酵液内均无生长，对叶枯病病原菌抑菌效果显著。3.拮抗放线菌对五味子叶枯病的防治效果测定，发现A-25-8菌株对五味子叶枯病离体叶片预防效果最好。A-25-8菌株生长在叶片伤口表面，有效的阻隔叶枯病病原菌对五味子叶片的侵害，复接叶枯病病原菌后病害无明显生长。A-25-8治疗实验及A-38防治实验效果相对较弱，均在50%以上，能在一定程度上控制叶枯病侵染程度。4.本研究对放线菌A-25-8菌株及A-38菌株进行形态学、生理生化及16SrDNA测定，确定放线菌A-25-8菌株为Streptomycesanulatus(环圈链霉菌)，A-38菌株与Streptomyceslactacystinicus亲缘关系最近。5.拮抗菌A-25-8发酵条件实验表明，马铃薯葡萄糖液体培养基为最适培养基，葡萄糖为最适碳源，KNO3为最适氮源，7.5为最适初始pH，28℃为最适温度，3d为最适时间，10%为最适接种量，160r/min为最适摇床转速。拮抗菌A-25-8活性稳定性实验表明，菌株A-25-8发酵滤液随紫外线照射时间增长及环境温度升高导致抑菌活性降低；酸碱对发酵滤液的抑菌活性有所影响，且随着酸碱浓度增加拮抗活性降低。在室温条件下，随贮藏时间的延长，发酵滤液的活性逐渐降低。关键词：生物防治；拮抗放线菌；五味子叶枯病；鉴定；发酵特性I AbstractLeafblightwhichcausedbyAlternariatenuissmiaisafungaldiseaseandoneofthemaindiseaseinSchisandrachinensis.Thisdiseasemainlyharmpartsforbladeandleadtodefoliation,abscissionoffruits,decreaseoffruitqualityandproductionofSchisandrachinensis.Usingchemicalpesticidetocontrolthediseasesisprincipalpathwayinagriculturenowadays.However,asthehigherrequirementofpeopleforforqualityofmedicinalmaterials,chemicalpesticideresistance,persistentandenvironmentalpollutionwillbecomeadifficultquestion.Actinomycetes,asabiologicalpesticideexistwidelyinnature.Thesecondarymetabolitesantibioticsofstrainscanaffectonsomepathogenicbacteria.Inthispaper,IsolationandIdentificationofantagonisticactinomycetesagainstleafblightpathogensofSchisandrachinensisandtheoptimizationofitsfermentationconditionsanditsbiocontrolefficacywereresearched.1.ThepathogenAlternariatenuissmiawasseparatedfromtypicalleafblightofSchisandrachinensisfromJiʹanandwasidentifiedbyKoch'srules.ThebiologicalcharacteristicsresultsshowedthatmyceliagrewfasterandsporegeneratedmoreinmediumPDAandPDBA.Fructoseandpeptonewerethebestcarbonsourceandnitrogensourceforthepathogen.Darkconditionwassignificantlybeneficialforsporegenerationandlightconditionwasbeneficialformyceliagrowth.pH5-7wasmostsuitableforthepathogen.Theoptimumtemperatureformyceliagrowthandsporegenerationwas25℃.Deadlytemperatureforthesporewas54℃．2.Twenty-sevenactinomycetesstrainswerescreenedfromrhizospheresoilofSchisandrachinensis.Twostrains(A-25-8andA-38)hadhighantagonisticeffectsagainstleafblightpathogenandtheirinhibitionratewas66.26%and66.10%bythreelinemethod，respectively.StrainsA-25-8aimedatleafblight,andstrainsA-38hadabroad-spectruminhibitoryactiontoagainstmorepathogenofSchisandrachinensisandGinseng.NoneofthepathogenhadthecapacityforgrowthwhenmixedA-25-8andA-38strainsorantibacterialactivityoffermentationfiltrate.3.A-25-8strainhadthebetterinhibitoryeffectonleafblightdisease.A-25-8straingrowedinwoundofthebladesurface.Itcaneffectivelyinhibitthegrowthofleafblightpathogen.TreatmentexperimentofA-25-8andcontroleffectofA-38wererelativelyweak.Theycancontroltheleafblightinfectiontoacertainextent:bothofthecontrollingeffectsweremoreII than50%controleffectmorethan50%.4.Twoactinomycetesstrainswereidentifiedbasedonits16SrRNAsequence,togetherwiththemorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristics.TheantagonisticactinomycetesA-25-8wasidentifiedasStreptomycesanulatus.TheA-38appearedasisterlineagetoStreptomyceslactacystinicus.5.TheoptimumfermentationconditionsforthestrainA-25-8wereasfollows:PDculturemedium;carbonsources,glucose;nitrogensources,KNO3;pH,7.5;temperature,28℃;culturetime,3d;inoculationamount10%(v/v)androtationalspeed,160r/min.TheactivityandstabilityexperimentofantagonisticbacteriaA-25-8showedthattheantimicrobialactivityofthefermentationfiltratedecreasedwhentheultravioletirradiationtimewasprolongedandtheambienttemperaturewasincreased;theantibacterialactivityoffermentationfiltratedecreasedwiththeacid-baseconcentrationincreased.Atroomtemperature,withtheincreaseofstoragetime,thefermentationfiltrateactivitygraduallyreduced.Keyword：BiologicalControl；AntagonisticActinomycetes；SchisandrachinensisLeafblight；Identification；FermentationCharacteristicsIII 目录摘要....................................................................IAbstract...................................................................II目录...................................................................IV前言....................................................................1第一章文献综述.............................................................21.1五味子叶枯病的发生与防治............................................21.1.1五味子叶枯病的发生.............................................21.1.2五味子叶枯病的防治.............................................21.2放线菌概述..........................................................31.2.1放线菌拮抗机制.................................................31.2.2放线菌生物多样性...............................................41.3植物病害生物防治....................................................61.3.1植物病害生物防治现状...........................................61.3.2植物病害生物防治机制...........................................61.3.3放线菌在生物防治中的应用.......................................7第二章五味子叶枯病病原菌分离及其生物学特性研究............................92.1方法与材料...........................................................92.1.1病原菌的分离与培养.............................................92.1.2五味子生物学特性研究..........................................102.2结果与分析.........................................................112.2.1病原菌的分离与培养............................................112.2.2五味子生物学特性研究..........................................112.3结论与讨论.........................................................14第三章五味子叶枯病拮抗放线菌的筛选与防治效果测定.........................163.1材料与方法..........................................................163.1.1试验材料......................................................163.1.2拮抗菌分离....................................................163.1.3拮抗菌筛选....................................................163.1.4拮抗菌发酵滤液对叶枯病病原菌的影响............................173.1.5拮抗菌对五味子叶枯病的防治效果测定............................17IV 3.2结果与分析.........................................................183.2.1拮抗菌分离筛选................................................183.2.2拮抗菌发酵滤液对叶枯病病原菌的影响............................193.2.3拮抗菌对五味子叶枯病的防治效果测定............................203.3结论与讨论.........................................................20第四章五味子叶枯病拮抗菌的鉴定...........................................224.1材料与方法.........................................................224.1.1拮抗菌形态学鉴定..............................................224.1.2拮抗菌生理生化鉴定............................................224.1.3拮抗菌分子鉴定................................................224.2结果与分析.........................................................224.2.1拮抗菌形态学鉴定..............................................224.2.2拮抗菌生理生化鉴定............................................244.2.3拮抗菌分子鉴定................................................254.3结论与讨论..........................................................26第五章拮抗菌A-25-8菌株发酵条件优化及发酵产物活性稳定性..................285.1材料与方法.........................................................285.1.1供试菌株......................................................285.1.2培养基........................................................285.1.3种子液的配置..................................................285.1.4A-25-8的液体培养与发酵滤液制备...............................285.1.6优化A-25-8菌株发酵培养基及培养条件...........................295.1.7菌株A-25-8发酵滤液拮抗活性的稳定性...........................295.2结果与分析.........................................................305.2.1拮抗菌发酵培养筛选结果........................................305.2.2拮抗菌A-25-8发酵产物稳定性筛选结果...........................335.3结论与讨论.........................................................35结论...................................................................37参考文献...................................................................39作者简介...................................................................46致谢...................................................................47V 前言五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.为木兰科多年生藤本植物，是东北的道地药[1][2-7]材，习称北五味子，具有保肝、抑菌、消炎、抗肿瘤和免疫等多种药理作用和功效。做为重要植物资源，五味子在医药保健产业中发展前景良好。近年来，市场上日益扩大的五味子需求量，及野生资源的日益减少，对五味子进行人工栽培已是大势所趋。随着五味子栽培面积的扩大及多种病虫害的发生及蔓延，导致五味子主要病害叶枯病及白粉病、茎基腐病已经成为五味子质量及产量发展的限制因素。且五味子叶枯病菌前期防治大量应用化学药剂，其防治效果逐年下降，并造成严重环境污染，其药材质量及有害物质残留程度也不能得到有效保证，五味子病害生物防治已成为必然趋势。放线菌作为农用抗生素的重要生物来源，在自然界中广泛存在，其在植物病害生物防治已有较好的成果，并且前景良好。应用高效生防放线菌拮抗五味子叶枯病，将为五味子病害防治研究提供一定借鉴及实际作用。本研究以五味子叶枯病菌为目标病原菌，对叶枯病病原菌生物学特性进行研究，分离、筛选高效拮抗五味子病害病原菌的土壤放线菌菌株，确定拮抗放线菌的所属类群，优化高效拮抗菌的培养条件，研究拮抗菌菌液及发酵滤液的防治方法并观察其效果，初步探讨拮抗菌株防治叶枯病的作用方式，为进一步开发利用拮抗放线菌及其发酵产物对五味子病害防治研究打下良好基础。1 第一章文献综述1.1五味子叶枯病的发生与防治1.1.1五味子叶枯病的发生五味子叶枯病为五味子主要病害之一，广泛分布于中国的吉林、辽宁、黑龙江省等五[8]味子产区，是由链格孢属细极链格孢[A.tenuissmia(Fr.)Wiltshire]引起的真菌病害。链[9-11]格孢属真菌大多寄生于植物上，可引起包括核桃叶枯病、高粱叶斑病、红枣叶斑病等多种病害。其中，细极链格孢可以引起小麦黑胚病、大连银杏叶斑病、棉花黑斑病、苹果[12-17]霉心病等病害的发生，造成严重的经济损失。五味子叶枯病初期病害发生部位主要为叶片，症状明显。病害从基部叶片向上蔓延，产生部位出现明显的暗褐色的斑点，病斑多数从叶尖或叶缘扩向两侧，再向中央扩展，叶片表面产生许多近圆形或不规则形的褐色小斑。发病后期小斑逐渐相连形成不规则的大斑，大斑蔓延导致整片暗褐色叶片干枯脱落。随之果实萎蔫皱缩，造成早期落果，其症状特点常可能因五味子的品种不同导致差异，严重时可导致果穗脱落，产收急剧降低。叶枯病病原菌多以菌丝体或分生孢子器的形式存在于土壤中，随病叶越冬后于隔年春天产生孢子，借助风、雨传播并侵染五味子植株。高湿多雨的环境可导致发病几率增高，[18]其发生和流行盛期多为5月下旬到7月上旬。1.1.2五味子叶枯病的防治目前对五味子叶枯病的防治措施主要分为两方面。一是从种植角度研究合理种植及合理用药对病害的防治，二是研究农药及生物防治对病害的防治。合理种植及合理用药包括选择合适位置及时间种植、消灭菌源及针对五味子叶枯病用[19-21]药等。刘凤菊等从合理种植角度进行实践研究，认为五味子种植时应注意以下几点：一是选用科学栽培方法。即栽种地点通风良好、远离污染源，最好为肥沃、湿润、疏松土层连片种植；选取优良种苗，并进行种苗消毒。二是加强田间管理。落叶后清除枯枝落叶，并对枝叶进行一定修剪，避免重叠，尽量让植株通风透光，改善植株光照及湿度等条件。三是及时拔除中心病株。发现病害时摘除病叶、减少浸染源，待秋季清理时，深埋或烧掉病害植株枝叶。四是合理施肥与保温。对五味子植株适当施肥，增加营养并增强抗病力；秋季在五味子田间加盖稻草或松针等物品，用于冬季植株防寒及春季保温。2 五是合理用药。在夏季等病虫害高发时间，提早喷药进行预防，发现病虫害后尽早防治。选择农药时针对其病害种类及抗药性进行筛选并交替使用。[22]目前针对五味子病虫害防治多以化学农药防治为主，相关研究较多。关天舒等经试验发现发现喹啉铜对五味子叶枯病防治效果最好，同时嘧霉胺等农药对叶枯病也有有较[23]为明显的抑制作用，可交替使用。王品等认为波尔多液为五味子叶枯病多种防治农药[24]中效果较好的一种，其倍量式效果显著。陈霞等同样采用波尔多液进行防治，并认为[25]甲安唑等药剂喷雾防治，效果同样较好。迟淑香等针对合理用药进行考察，应用农药预防治理五味子叶枯病，病情初期及时摘除病叶深埋并用波尔多液、代森锰锌、甲基托布[26]津等农药交替喷施，以7-10d一次的频率，多次喷施；刘辉认为发病时可用70%的代[27]森锰锌的对其进行防治，喷药次数依据病情增减。徐爱艳认为喷2-3次甲基托布津、代森锰锌、代森铵喷雾能有效防治五味子叶枯病的发生。[28-29]生物防治优点明显，如周期短、便于生产、无毒无害等，近年来受到人们的广泛关注。目前国内对五味子病害的生物防治大致分为两类，即植物源的生物防治和微生物源的生物防治这两方面。其中，五味子叶枯病生物防治相关研究见文献者较少，立枯病、[30-31]茎基腐病等生防研究见部分报道。徐丽及金岩等从五味子植株中分离内生细菌，测定其对五味子病害病原菌体外拮抗活性及抑菌活性，筛选得到拮抗率较高的菌株作为可开发[32]拮抗菌资源。邓勋等筛选测定木霉菌对立枯丝核菌的防治效果，对8株木霉菌进行了室内筛选及室外防治试验，确定绿木霉菌株T-43能显著控制五味子立枯病发生，同时可[33]促进苗木的生长。潘争艳等对五味子根际土壤微生物进行了初步研究，并对拮抗菌株进行了筛选，得到11株五味子茎基腐病拮抗菌，这些菌株均能在不同程度上影响靶标菌菌丝生长。现今五味子病害防治多使用化学农药，其优点在于化学农药防治见效快、效果明显，但其缺点同样明显，如植株内残留有害成分、产生抗药性及环境污染等。随着植物病虫害防治技术的发展及对药材品质的要求，中药的无公害栽培必将受到重视，植物病虫害生物防治具有较高的发展潜力。1.2放线菌概述放线菌（actinomycete）因菌落多呈放射状得名，具发育良好的分枝状菌丝体，为革[34]兰氏阳性细菌，具有广泛用途及巨大价值。1875年由Cohn自人泪腺感染病灶中首次分离，因形态呈丝状命名为链丝菌（Streptothrix），两年后Harz自牛颈肿病病灶中分离出[35]另一种同类型菌株，命名为牛型放线菌(actinomycesbovis)。随着对放线菌研究的不断深入，其分类方法由最开始的经典分类，到针对放线菌化学特性鉴别的化学分类，发展至如今以基因本质为鉴别方式的分子分类，对放线菌的实际开发应用有了巨大进步。1.2.1放线菌拮抗机制3 放线菌通过代谢等途径可产生多种产物，其中应用最广泛的为抗生素类物质，目前广[36-37]泛应用的抗生素70%以上是由各类放线菌发酵产生，这类物质可特异性的作用于特[38-41]定病害病原菌，降低该病害发作的程度。作为放线菌代谢中产生的最重要的产物，对于拮抗病原菌，抗生素具有多种作用机理。(1)部分抗生素能对一些微生物共同的代谢途径产生抑制作用，如蛋白质和核酸的合成和复制，所以可同时对多种微生物的生长产生抑制作用。部分抗生素能对微生物细胞代谢中的某些酶系统或环节进行抑制，微生物无法进行正常代谢过程，继而影响微生物的生[42-44]理活动，严重时可导致微生物的死亡。(2)部分抗生素可作用于细胞壁或水解细胞膜，通过阻断细胞壁生物合成的相关环节或抑制肽聚糖的形成，从而抑制或杀死病原微生物；或打破细胞膜的选择性屏障，导致细[45]胞膜通透性的增加、主要成分产生泄漏，从而抑制或杀死病原微生物。如李欣欣认为放线菌E001发酵滤液活性物质能影响灰霉病病原菌菌丝细胞和分生孢子，导致病原菌菌丝短粗、顶端膨大、形成空泡及分枝增多，从而影响病菌菌丝的生长，抑制病原菌的正常生理活动。同时，部分放线菌在代谢途中产生的酶和有机酸等物质也对防治植物病虫害及提高植[46-49]株产量起到重要作用。这也证实了放线菌在植物病害生物防治方面具有巨大潜力和作用。除了通过代谢产物对植物病害防治，放线菌自身也可以降低病原侵染植物的概率。放线菌同其他土壤微生物对土壤中的营养及资源存在竞争利用关系，有时可有效抑制病原微生物的生长和繁殖，从而降低病害发病率，减轻植物病害程度。竞争方式有两种：(1)空间竞争：放线菌自身存在生长优势或抢占了有力的生物位点，有害病原菌无法与生物位点进行对接，因此病原菌难以侵染宿主，从而达到生防的目的。(2)营养竞争：多种微生物在同一环境中争夺营养物质、生长因子及氧气等生长必须物质，能有效降低病原微生物的生长和繁殖速度，以达到防治植物病害的目的。拮抗放线菌对碳源的竞争利用能有效的抑制病原菌的生长与繁殖，进而减缓病原菌对植株的侵染及危害[50]。土壤中铁离子是微生物发育生长的必须因素，其他微生物对铁离子生长的利用可直接影响病原菌生长，链霉菌分泌的嗜铁素可鳌合铁离子，从而限制其他微生物尤其是病原[51]菌对铁离子的吸收利用，以抑制病原菌的生长。1.2.2放线菌生物多样性放线菌广泛以孢子或菌丝状态分布在自然界中，主要由土壤放线菌、植物内生放线菌及海洋放线菌等构成，除此之外，动物体内同样存在放线菌。其中，从所含放线菌的数量及类别上来看，土壤为其最主要的生活场所。1.2.2.1土壤放线菌放线菌作为广泛分布于土壤中的微生物类群，占土壤有益微生物的4 70%以上，是好气性放线菌生存的主要场所，存在着大量的放线菌群落，同时也是传统放线菌分离的主要来源。土壤放线菌在世界各地均有所分布，并有大量相关研究及成果。[53]汪江峰等从贵州高坡土壤中筛选一株高拮抗活性放线菌，对多种植物病害病原菌[53-54]有拮抗作用，最高拮抗率可达97%。张晓红、胡霞等分别从新疆艾比湖及四川峨眉[55]山分离不同典型植被的根际土壤，以研究当地土壤放线菌多样性。靳振江等分析验证[56]得到桂林溶洞湿地土壤生物量与土壤pH、碳氮等因素的关系呈正向分布。戴雅婷等对蒙古地区不同深度土壤进行测定，发现土壤中所含速效钾和全氮能影响放线菌生物量。[57]Arif等从印度尼西亚岛上发现有益于农渔及人体健康的抗菌放线菌菌株，有待进一步开发利用。1.2.2.2植物内生放线菌植物内生菌最早在1937年由Unger提出，随后研究表明其作为植物内生态系统的重要组成部分，在健康的植物组织中，通过代谢活动及产物，维持植物的生态系平衡。近年来，以不同的研究目的和地方特色为目标，大量研究从经济作物、药用植物或地方特有植物中分离内生放线菌菌株，以满足不同需要。[58]廖红东等从湖南湘矮早7号水稻中筛选到一株内生白色链霉菌，该菌对水稻稻瘟[59]病菌抑制效果显著。杜晓宁等分离枸杞内生真菌及放线菌29株，发现其中曲霉属菌株[60]抗氧化活性较强。Merzaeva等从小麦中分离的内生放线菌，在代谢过程中产生的酸性[61]化合物对冬季小麦的生长发育有所促进。Yacine等研究撒哈拉沙漠本地植物，从根内[62]分离抑菌放线菌株34株。邱鹏等分离四川的13种药用植物内生菌，得到80株放线菌菌株，其中链霉菌属放线菌66种，大部分菌株具有抗菌活性。1.2.2.3海洋放线菌海洋占据地球71%面积，作为生命进化的起源，具有丰富的生物多样性。海洋微生物也因其环境特殊，具有独有的代谢方式，其代谢产物化学结构复杂多样。海洋放线菌活性中最早被发现的抗肿瘤活性成为海洋微生物研究的重点。随着研究的不断深入，海洋放线菌的其他活性也逐渐被发现。作为当今放线菌研究热点，国内外对海洋内放线菌的均有所报道。[63]杨小梅等从斜阳岛柳珊瑚中分离得到放线菌23株，绝大部分分离得到的放线菌具[64]一定的生物毒活性，其中一株毒性显著。王皓等从大连海域海泥中分离放线菌95株，[65]其中菌株YH91抑制黄瓜枯萎程度最强。欧阳永长等发现中国南海底泥存在新的[66]angucycline类抗生素，丰富了原有的angucycline类抗生素资源。宋春凤等对中国南海深海沉积物分离得到链霉菌12A35，并通过活性导向分离并鉴定出一个新lobophorins[67]类抗菌活性产物。Gartner等从地中海深海沉淀物中分离到一株放线菌，该菌可分离出[68]两种大环内酯类化合物，其中一种化合物对多种肿瘤细胞有中度的抗性。Dasari等从海洋沉淀物中分离出一株放线菌，该菌能产生抗生素和细胞毒素类物质，对宫颈癌、乳腺癌[69]和脑癌细胞等癌细胞产生很强的体外细胞毒活性。Carlson等从一株海洋放线菌的发酵产物中提取到一种具有增强还原酶活力作用的大环内脂类化合物，具潜在的化学防癌活5 [70]性。Gebreselema等对埃塞俄比亚塔纳湖底的沉积物进行分离，筛选得到31株放线菌，发现其抗菌活性良好。1.3植物病害生物防治植物病害生物防治（biocontrolofplantdisease）是指应用有益生物或物质对植物病害进行防治，其作用主要包括抗生、竞争、重寄生、溶菌和捕食等，影响、抑制、杀死病原物，应用有益生物或物质以保护、促生等方式增强植物的抗病性，从而实现绿色、无公害[71]防治植物病害的目的。1.3.1植物病害生物防治现状应用科学手段进行植物病虫害的生物防治最早起源于19世纪末。1870年deBary研究白粉寄生孢（Ampelomycesquisqualis）对白粉菌的重寄生作用，1872年由Cohn正式命名的枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌科Bacillaceae模式菌种。其后，在对线虫进行生物防治的过程中，发现液体培养微生物间具拮抗作用，应用有益微生物可有效防治生物病害。随着研究的不断深入，生物防治研究逐渐增多，得到大量成果。直至今日，人们意识到化学防治带来的污染问题，生物防治的重要性得到认识，生物农药应运而生，针对植物病虫害生物防治研究日益增多。现今对植物病害生物防治主要应用的是植物病害生物防治因子，其中包括生防菌、微生物代谢产物及植物提取物等。生防菌包括生防真菌、生防细菌以及生防放线菌。生防真[72-74][75-77][78-80][81]菌主要有酵母、木霉菌、腐霉菌等。生防细菌包括地衣芽孢杆菌、枯草[82-83][84]杆菌等。生防放线菌主要为链霉菌属放线菌。微生物代谢产物包括抗生素类产物[85-86][87-88][89]、抗菌蛋白类产物及细菌素等。植物提取物通常为抑菌植物的提取物，这类[90-91]化合物对病原菌通常具有天然的抗性及一定的抑菌效果。植物病虫害生物防治发展到如今，已研制出大量生防治剂，随着生防技术的不断进步，人们对生物防治的认识也不断加深。通过生物防治能有效避免化学防治带来的"3R"(Residlue残留、Resistance抗性、Resurgence再度猖獗)和"3致"(致畸、致癌、致突变)问题，并能重建以自然为核心的生态系统，利用生物的多样性、微生态结构及相生相克等方式保证生态环境安全。1.3.2植物病害生物防治机制微生物之间通过多种不同的作用方式可产生相互抑制作用，其方式包括：重寄生、竞争、抗生和捕食等。生物防治机制指应用生防因子控制病害的原理，机制包括：抗生作用、竞争作用、重寄生作用、捕食作用、溶菌作用及诱导抗病性等。植物病害生物防治中，有些防治因子应用机制是单一的，有些则具有多种生防机制，其中最常见为以下三种。1.3.2.1拮抗作用生物产生具有抗生物质或有毒的代谢产物可对植物病害病原菌的生长6 发育产生的抑制或致病作用，主要包括拮抗微生物、抗生素类及具拮抗作用的植物提取物，这类拮抗物质研究范围广，发现成果多。[92]段琦梅等对广谱拮抗菌S-159-06菌株活性产物的抑菌机理进行研究，发现其可导致病原菌菌丝扭曲、分枝顶端膨大成串珠状并增多，细胞壁破裂、原生质外溢，萌发率降低，很大程度上抑制病原菌菌丝生长及孢子萌发。[93]魏林等发现哈茨木霉T2-16菌株发酵产物对病原菌具有较好的抗菌作用，能使病原菌营养菌丝失活，气生菌丝生长混乱、变黄，原生质出现了浓缩、液泡化并伴随外渗现象产生，菌丝隔膜处断裂、解体，以至于出现自溶现象。[94]陈曼等筛选并鉴定1株高效拮抗黑曲霉病菌的菌株，为地衣芽孢杆菌。该菌可导致病原菌菌丝扭曲畸形，表面产生大量囊状突起。[95]杨鹏斌等对绿色木霉菌发酵液成分对细胞膜的损伤进行研究，实验证明正丁醇萃取物可增加金黄色葡萄球菌细胞裂解率，同时阻碍该菌细胞膜蛋白质的正常表达，从而破坏菌体细胞膜的结构，增加其细胞膜通透性，抑制该菌生长。1.3.2.2重寄生作用在植物病害生物防治中，重寄生指致病寄生物被另一寄生物寄生的现象，其应用研究早且多，1931年即有利用腐生真菌进行土传病害防治的研究。[96]周利等对疱锈病进行林间防治实验，发现2株重寄生菌均能成功在患病植株的病部锈子器上定殖，以达到控制病害发展及蔓延流行的目的。[97]叶利芹等发现重寄生菌赭红枝顶孢分生孢子自然条件下可越冬，该菌分生孢子通过媒介可进行进行多次再侵染，对锈病菌夏孢子的萌发及锈病病斑的扩展有较强的抑制作用。同时，室内及野外防治试验表明，重寄生菌赭红枝顶孢防治竹叶锈病效果良好，能有[98]效减轻病害。1.3.3.3诱导抗病性指植物受到诱导因子刺激后，其形态及生理发生变化，对病原物侵染产生抗性，其诱导因子主要分为生物因子、物理因子及化学因子。[99]Nzojiyobiri等用哈茨木霉NF9菌株进行种子处理，诱导水稻幼苗对稻瘟病和白叶枯病的抗病性，发现处理后水稻幼苗接种病害病原菌后，过氧化物酶及苯丙氨酸转氨酶活性增强，具一定的诱导抗病性。[100]赵娟等通过盆栽试验证实生防菌在一定接种量下，与TF共接时可大幅度提高叶片PPO活性、根系活力及甜瓜根系质量，具有防病促生作用。[101]刘丁等认为萎缩芽孢杆菌可提高花生SOD和POD酶活性，降低CAT酶活性，以清除超氧化物阴离子自由基，维持活性氧代谢平衡，保护细胞完整性，从而提升花生种子的抗病能力。1.3.3放线菌在生物防治中的应用放线菌是生物活性物质如抗生素、嗜铁素等的主要生产者，有70%以上微生物来源7 活性物质由其产生。单以抗生素来说，医用抗生素的2/3来源于放线菌，同时放线菌也是多种重要农用抗生素的来源。多种放线菌对植物病原微生物、线虫及害虫等具有拮抗活性，有些放线菌的代谢产物还具有促生长、促抗性及增产等作用。放线菌在生物防治植物病虫害的过程中，按其类别可分为三大类，分别是生物菌剂、农用抗生素及其他代谢物。1.3.3.1生防菌剂的开发与利用活菌制剂通常具有无毒、与环境兼容性好、不伤害非靶标微生物及无残留等特点。放线菌菌剂对丝核菌、腐霉菌和镰刀菌等多种土传病害均具有良[102]好的抑制作用。[103]齐艳春研究高效拮抗甜叶菊斑枯病的菌株A01和A64，认为两种链霉菌混合构成[104]的抗生菌剂对该病害抑制效果更强。牛瑞生等实验证明康照1号放线菌制剂通过分泌[105]有益物质，可对植物酶的活性进行增强，同时刺激根系生长，进而防病、促生。陈秦等同样发现放线菌对部分植株可起到防病促生的作用。1.3.3.2农用抗生素抗生素为微生物在代谢过程中产生的非酶类活性物质，低浓度时具抑制或杀灭其它微生物的作用。农用抗生素通常为针对病原微生物具有抑制作用，有些可杀[106]灭病原菌，如溶菌作用，即溶解病原微生物的细胞壁，使菌体破裂解体，原生质体外渗。[107]冯亚平等实验证明山东链霉菌抗菌素对黄瓜、番茄多种病害均有较好的抑制效果。[108]魏刚等从放线菌JWH-09中分离出一种对水稻纹枯病等多种病害拮抗效果良好的化合[102]物。姜其华等分离鉴定高效拮抗菌1356菌株抑菌活性成分鲁丝霉素。潭悠久、Clermont[109-110]等均发现生防链霉菌所产生的抗生素类产物对多种革兰氏阳性细菌和真菌都具有拮抗作用。1.3.3.3其他代谢产物链霉菌有多种具生物活性的代谢产物，主要包括：抗生素、嗜铁素、有机酸、胞外水解酶、甾体化合物等。其中应用较广的除了抗生素外，还包括胞外水解酶及嗜铁素。[111]Baharlouei得到放线菌菌株，该菌株分泌的胞外几丁质酶可抑制多种病害病原菌[112]菌丝生长。Easa分离筛选到3株放线菌，具有抑菌、增强诱导抗性的作用，且能产生几丁质酶。[113]陈双雅等发现拮抗细菌CS121在限铁条件下能产生嗜铁素，含该嗜铁素的培养上清液可使病原菌菌落边缘粗糙，缩短菌丝分支并抑制菌丝的生长，保护叶片减少侵染。余[114]贤美等对不同培养条件枯草芽孢杆菌Bs-15所产生的嗜铁素含量进行研究。刘艳萍等[115]根际土中分离到一株嗜铁素，对黄瓜幼苗具有显著的促生作用。8 第二章五味子叶枯病病原菌分离及其生物学特性研究五味子叶枯病（SchisandrachinensisLeafblight）是真菌性病害，主要为害部位为叶片，其病原菌为半知菌纲链孢霉目黑霉科链格孢属细极链格孢[Alternariatenuissmia(Fr.)Wiltshire]，此病原菌同样可导致桂花叶枯病、新疆红枣叶斑病及蚕豆叶斑病的发生。此前该病害多应用合理种植及化学农药进行防治，对其生物防治研究较少。但由于人们对药材质量要求增高，对五味子病害进行生物防治已成为大势所趋。土壤放线菌作广泛存在自然界的重要资源之一，所具有的生物活性备受关注。本试验对集安五味子基地五味子叶枯病病叶进行病原菌分离分离，通过柯赫氏法则验证其病害病原菌，并对其生物学特性进行研究，以期为集安地区五味子叶枯病防治提供借鉴。2.1方法与材料2.1.1病原菌的分离与培养2.1.1.1五味子病叶采集五味子叶枯病病原菌细极链格孢菌（Alternariatenuissmia(Fr.)Wiltshire）株由集安五味子基地发病典型病叶上分离得到。2.1.1.2组织分离法五味子典型病叶清水洗去尘土，用剪刀剪取病健交界处组织若干块，放入0.1％升汞中消毒15min。无菌水冲洗5次，镊子夹取至无菌滤纸，手术刀将病健交2界处病组织切至1×1cm，至不同PDA培养基每皿4块，放置培养箱内培养。2.1.1.3消毒剂筛选由于消毒剂灭菌效果不明，通过预实验进行消毒剂的筛选，筛选消毒剂及时间：75%乙醇溶液及2%次氯酸钠溶液10min，5%次氯酸钠溶液10、15min，0.1%升汞溶液5、10、15min。实验均做3次重复。2.1.1.4菌种纯化培养病叶经培养基培养2-3日后生灰黑色菌丝，待生长至直径为4-5cm时，经镊子切取含菌丝培养基并夹至另一PDA培养基内倒扣培养，放入培养箱内。如此反复纯化2次，得到稳定菌种，置4℃冰箱内贮存备用。2.1.1.5病原菌致病性测定采用离体叶片接种法，将培养基内稳定菌种刮下部分融入9ml无菌水内，经漩涡振荡器震荡10min，摇匀后为病原菌孢子悬浮液。采摘新鲜无病五味子叶，无菌水洗净，叶片两侧分别用接种针刺出均匀孔洞。以滴入无菌水，滴入菌悬液，接种环涂抹菌悬液三种方式互为对照，每个处理5次重复。将所处理叶片置于无菌培养皿内，放置培养箱内培养，观察在此期间发病情况。将其发病叶片病原菌分离，验证其是否为原病害病原菌。2.1.1.6形态及培养特征观察观察其培养皿内菌丝生长情况，并挑取部分菌落置于显微镜9 下观察。2.1.2五味子生物学特性研究2.1.2.1培养基试验将马铃薯蔗糖培养基(PSA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、查氏培养基(Czapek)、胡萝卜琼脂培养基(CA)、琼脂培养基(WA)、燕麦琼脂培养基(OA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、马铃薯胡萝卜培养基(PCA)和马铃薯牛肉膏培养基(PDBA)分别制成平板后，均接种直径7mm菌块，在25℃恒温条件下培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标，5d后刮取培养基内全部菌丝，配置菌悬液并稀释，血球计数板测定稀释状态下病原菌孢子数量。2.1.2.2光照试验在PDA培养基平板上均均接种直径7mm菌块，分别置于光照、黑暗、光照/黑暗交替的生长箱（恒温25℃）中培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标，5d后刮取培养基内全部菌丝，配置菌悬液，稀释后应用血球计数板测定孢子数。2.1.2.3碳源试验分别用等量的蔗糖、乳糖、木糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇、糊精，置换PDA培养基中的葡萄糖，并设无糖作对照，制成不同碳源的培养基平板，均接种直径7mm菌块，在25℃恒温条件下培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标。2.1.2.4氮源试验分别用等量的蛋白胨、酵母浸膏、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4、尿素、KNO3，置换Czapek培养基中的NaNO3，并设无氮作对照，制成不同氮源的培养基，均接种直径7mm菌块，在25℃恒温条件下培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标。-1-12.1.2.5pH值试验用1mol·L的NaOH和1mol·L的HCl，调节PDA培养基的pH值分别为3，4，5，6，7，8，9，10，均接种直径7mm菌块，在25℃恒温条件下培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标，5d后刮取培养基内全部菌丝，配置菌悬液，稀释后应用血球计数板测定孢子数。2.1.2.6温度试验在PDA培养基平板上均接种直径7mm菌块，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、34℃生长箱培养，3次重复，每隔12小时记录菌落直径作为菌丝生长状况指标，5d后刮取培养基内全部菌丝，配置菌悬液，稀释后应用血球计数板测定孢子数。52.1.2.7孢子致死温度试验取无菌水洗脱病原菌配制成1×10孢子悬浮液，注入2mL至无菌试管内，分别置于38℃、42℃、46℃、50℃、54℃、58℃的恒温水浴中处理10min。用移液枪分别将经不同温度处理后的孢子悬浮液接种至经直径为7mm打孔器打孔并移除培养基块的PDA平板上，实验均做3次重复，28℃培养5d后观察有孢子与菌丝生长情况。2.1.3数据处理采用Excel2003对数据进行录入，试验数据统计分析用DPS软件LSD法进行单10 因素方差分析。2.2结果与分析2.2.1病原菌的分离与培养2.2.1.1消毒剂的选择表2-1消毒剂的选择Tab.2-1Thechoiceofdisinfectant消毒剂时间染菌率75%乙醇溶液10min100%2%次氯酸钠溶液10min100%5%次氯酸钠溶液10min100%5%次氯酸钠溶液15min100%0.1%升汞溶液5min100%0.1%升汞溶液10min66.6%0.1%升汞溶液15min33.3%2.2.1.2病原菌致病性测定经柯赫氏法则验证确为五味子叶枯病病原菌。2.2.1.2病原菌形态学观察经五味子叶片分离后为灰黑色菌毛，色较深，菌毛较短。其镜下观察结果为分生孢子梗多单生具分支，直立或略弯曲，淡褐色或暗褐色，基部略膨大。分生孢子褐色，多数为倒棒形，少数为卵形或近椭圆形，具3-7个横隔膜，1-6个纵(斜)隔膜，隔膜处缢缩。喙或假喙呈柱状，浅褐色，有隔膜。2.2.2五味子生物学特性研究2.2.2.1不同培养基对病菌菌丝生长及孢子数量的影响从图2.1（A.PDA、B.PSA、C.OA、D.CMA、E.PCA、F.CA、G.PDBA、H.Czapek、I.WA)可以看出，菌丝在PDA，PSA，PDBA培养基上生长速度较快，121h时菌落半径为30～31mm；OA，CMA其次，在PCA，CA，Czapek上生长较慢，WA培养基上菌落半径只有15mm，大部分培养基生长菌落大小在α=0.05水平上差异显著。其孢子数量于PSA及PDBA培养基中较多，OA及PDA中其次，WA中几乎不存在,不同培养基孢子数量在α=0.05水平上差异显著。比较其菌丝生长量及孢子数量，PDA为最适培养基。11 4020abc)addae16-130ffml(mm)12·bbcfu菌落半径20g78孢子数c/(10菌落半径10c4dde孢子数0e0ABCDEFGHI培养基（cultrualmedia）图2.1不同培养基对病菌菌丝生长及孢子含量的影响Fig.2.1Effectofculturalmediaonmyceliumgrowthandsporegeneration2.2.2.2不同光照对病菌菌丝生长及孢子数量的影响从图2.2可以看出，于25℃时，光照、黑暗及光暗交替处理对菌丝生长影响相对较小，但对孢子产生数量影响较大，黑暗处理时有利于该菌产孢且产孢量最高。其菌丝生长量及孢子数量均在α=0.05水平上差异显著。综合比较其菌丝生长量及孢子数量，黑暗条件更适于病原菌生长。4016caba3012)-1(mm)208菌落半径7cfu·ml孢子数菌落半径104bc孢子数/(1000黑暗光照半光照光照（light）图2.2不同光照对病菌菌丝生长及孢子含量的影响Fig.2.2Effectoflighttreatmentonmyceliumgrowthandsporegeneration2.2.2.3不同碳源对病菌菌丝生长的影响本实验应用PDA培养基检测不同碳源对病原菌生长影响。从图2.3（A.蔗糖、B.葡萄糖、C.麦芽糖、D.果糖、E.木糖、F.无糖、G.糊精、H.甘露醇、I.乳糖、J.淀粉）可以看出，与无糖相比，除木糖外各碳源不同程度上对菌丝生长均有一定促进作用，其中果糖条件下菌落半径为32.13mm，其次为蔗糖、甘露醇及乳糖，菌落半径为30.80mm左右，显著大于可溶性淀粉、木糖、糊精等处理，木糖对菌丝生长几乎无作用。大部分碳源在α=0.05水平上差异显著。比较其菌丝生长量，果糖为最适碳源。12 35abcdbbg30gef)mm252015菌落半径（1050ABCDEFGHIJ碳源（Carbon）图2.3不同碳源对病菌菌丝生长的影响Fig.2.3Effectofdifferentcarbonsourceonmyceliumgrowth2.2.2.4不同氮源对病菌菌丝生长的影响本实验应用Czapek培养基检测不同氮源对病原菌生长影响。从图2.4（A.(NH4)2SO4、B.KNO3、C.尿素、D.NH4Cl、E.酵母浸膏、F.蛋白胨、G.(NH4)2HPO4、H.NH4NO3、I.无碳源）可以看出，不同的氮源对病菌菌丝生长的影响各有不同，其中酵母及蛋白胨均有利于菌丝生长，122h时菌落半径达27-28mm，其他的氮源相较于无氮源对照均不利于菌丝生长。其中，酵母、蛋白胨及无糖在α=0.05水平上差异显著。比较其菌丝生长量，蛋白胨为最适氮源。30ba25cededefeded)mm2015菌落半径(1050ABCDEFGHIJ氮源(Nitrogensources)图2.4不同氮源对病菌菌丝生长的影响Fig.2.4Effectofdifferentnitrogensourcesonmyceliumgrowth2.2.2.5不同pH值对病菌菌丝生长和及孢子数量的影响从图2.5可以看出，病菌菌丝在pH值3-10之间均能生长，其中菌丝生长较快的pH值范围为5-7，122h时菌落半径在30.90～31.40mm，当pH值小于4或大于8时，菌丝生长的速度明显减慢。除pH5-7外，不同pH在α=0.05水平上差异显著。其孢子数量则于pH值6-7之间最高，pH值小于5时孢子含量急剧降低，pH值大于8时，孢子含量降低速度较慢，不同pH在α=0.05水平上差异较为显著。比较其菌丝生长量及孢子数量，pH范围在6-7之间更适于病原菌生长。13 4016baaabac)30fde12-1abml(mm)abcg·20bc87cfu菌落半径cd/(10菌落半径104孢子数dd孢子数00345678910pH图2.5不同pH值对病原菌菌丝体生长及孢子含量的影响Fig.2.5EffectofpHvalueonmyceliumgrowthandsporegeneration2.2.2.6不同温度对病菌菌丝生长和及孢子数量的影响从图2.6可以看出，病菌菌丝在15-30℃之间均能生长，其中菌丝生长较快的温度范围为25℃-30℃，121h时菌落半径约为31mm，当温度为34℃时，菌丝几乎无法生长，不同温度菌落半径在α=0.05水平上差异显著。其孢子数量则于25℃最高，温度降低或升高时孢子数量急剧降低。不同温度孢子数量在α=0.05水平上差异较为显著。比较其菌丝生长量及孢子数量，温度为25℃时更适于病原菌生长。4016aba3012c)-1·ml20b8(mm)d7cfu菌落半径/(10孢子数10c4菌落半径ed孢子数0e034℃30℃25℃20℃15℃温度（temperature）图2.6不同温度值对病原菌菌丝体生长及孢子含量的影响Fig.2.6Effecttemperatureofonmyceliumgrowthandsporegeneration2.2.2.7孢子致死温度测定孢子悬浮液预经38-58℃六个梯度10min处理后，接入PDA培养基内，在38-50℃处理的孢子均能萌发生长，随着温度升高，其菌丝生长量逐渐降低，至54℃时无菌丝生长，表明其孢子致死温度为54℃，其菌落生长半径在α=0.05水平上差异显著。2.3结论与讨论近年来，随着五味子市场需求量的扩大，野生资源已不足以满足需求，人工栽培已是大势所趋。随着五味子栽培面积的扩大，病虫危害逐年加重，严重制约五味子生产发展。其中五味子叶枯病及白粉病、茎基腐病已经成为五味子生产健康发展的关键限制因素。本14 研究重点关注五味子叶枯病病原菌生物学特性，并筛选对叶枯病有效生防菌，以期为五味子病害无公害防治研究打下良好基础。本研究首先对集安五味子叶枯病典型病叶进行致病病原菌分离，得到致病菌株细极链格孢，柯赫氏法则证明其确为叶枯病致病菌，后对其生物学特性进行了系统研究。研究表明，不同培养基中，细极链格孢菌菌丝及孢子适宜在PDA及PDBA培养基上生长；同样温度下，光照条件下有利于菌丝生长，黑暗条件产孢量明显增多，孢子数量剧增；碳源对菌丝生长影响较弱，最适碳源为果糖；氮源对菌丝生长影响较强，蛋白胨为菌丝生长的最佳氮源；菌丝生长最适pH值为5-7之间，弱酸性条件较利于孢子生长，pH6-7之间孢子数量较多；温度对菌丝生长及孢子数量影响较大，34℃以上菌丝无法生长，温度降低菌丝生长减慢，孢子数量减少，最适温度为25℃。本研究发现光照可严重降低该菌的产孢数量但有利于其病原菌菌丝的生长，与但关天舒等研究不同，推测可能是不同病原菌生理小种差异的原因。15 第三章五味子叶枯病拮抗放线菌的筛选与防治效果测定[117]土壤中拮抗微生物为植物病害生物防治的重要组成部分，此前，唐蕊等从小麦田[118]间土中分离得到拮抗白菜软腐病的菌株；赵娟等筛选对甜瓜蔓枯病具有高拮抗作用的[119]青藏高原特殊环境土壤放线菌；李应祥等分离贵州省茶叶根际土放线菌拮抗茶云纹叶枯病。大量实验证明植物根际微生物对植物病害防治具有良好生防潜力与应用前景。本实验分离五味子根际土内放线菌，采用皿内抑菌实验进行初筛并测定其拮抗率，拮抗效果最强的菌株进一步进行抑菌谱的测定、发酵液抑菌实验及离体叶片防治，检测其对五味子叶枯病病原菌的抑制程度，从而筛选高效拮抗五味子叶枯病的放线菌菌株。3.1材料与方法3.1.1试验材料五味子叶枯病病原菌（Alternariatenuissmia）、茎基腐病病原菌(Fusariumoxysporum)，人参疫病病原菌(Phytophythoracactorum)、菌核病病原菌(Sclerotiniaschinseng)、灰霉病病原菌(BotrytiscinereaPers)、黑斑病病原菌(Alternariapanax)、锈腐病病原菌(Cylindrocarpondestructans)、根腐病病原菌(Fusariumsolani)及立枯病病原菌(Rhizoctoniasolani)，由吉林农业大学人参研究工程中心实验室提供。供试土样：五味子根际土，2014年5月不同区域实验田间采集，共采集图样五份，4℃冰箱保存备用。供试作物:五味子叶片，实验田间采集。3.1.2拮抗菌分离实验采用平板稀释法分离根际土壤中放线菌。称取5g五味子根际土土样加入装有-545ml无菌水的三角瓶内，160r/min摇床震荡2h，所得菌悬液按10倍法稀释至10CFU/g。采用混匀法取1ml相应稀释浓度的菌悬液加入对应的培养基内，震荡均匀，置于恒温培养-3-4-5箱内培养，放线菌稀释度分别为10、10、10。待多数放线菌菌落形成后，挑取不同形态菌落，培养并进行多次纯化，常温及零下30℃保存。3.1.3拮抗菌筛选用直径为7mm的打孔器将分别将五味子叶枯病病原菌打成菌块，将其接种于直径为90mm的PDA平板中心，接种环沾取放线菌在距病原菌菌块等距离的两侧划线，对照为只接病原菌的PDA平板，每处理3次重复，26℃培养箱中培养5天，初步筛选出对五味16 子叶枯病病原菌有拮抗作用的拮抗菌株，纯化保存后以待进一步测定。将已知具有拮抗作用放线菌株进一步测定。培养基为PDA培养基，培养皿直径为90mm。在平板中心接种5d的病原菌菌株（直径7mm），用接种针沾取适量放线菌，以病原菌为中心在培养基内划等边三角形，以所划放线菌与病原菌菌株垂线所在直线为标准，以只接病原菌的平板作为对照，26℃培养箱中培养5天，每处理3次重复，用游标卡尺分别测量病原菌半径，取其平均值。计算拮抗率公式如下。对照病原菌生长净半径拮抗菌作用后病原菌生长半径拮抗率100%公式（3.1）对照病原菌净生长半径将拮抗效果较好的放线菌菌株应用三线法进行抑菌谱测定，方法同上，病原菌采用五味子及人参主要病害病原菌共8种。3.1.4拮抗菌发酵滤液对叶枯病病原菌的影响3.1.4.1种子液的配置将高效拮抗放线菌菌株接种于高氏一号固体培养基及PDA培养基上，28℃恒温培养5d，用打孔器打5个直径为7mm的菌饼，接入装有200mL种子液培养基的500mL三角瓶中，温度为28℃，转速为160r/min条件下，每处理3次重复，摇瓶培养适当时间后得到拮抗菌种子培养液。3.1.4.2拮抗菌的液体培养与发酵滤液制备将拮抗菌菌株的种子培养液，按10%(V/V)的接种量接入PD培养基中，于28℃、160r/min条件下，摇瓶培养适当天数，得到菌株的发酵菌液。发酵菌液先用灭菌滤纸过滤，再用两层孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，分别得到拮抗菌菌株的发酵滤液及无菌滤液。3.1.4.3拮抗菌发酵对五味子叶枯病病原菌的影响分别装入含20mL拮抗放线菌菌株发酵滤液的PD培养液(发酵滤液原液、发酵滤液2倍稀释液、无菌滤液、无菌滤液2倍稀释液)于50mL三角瓶内，以PD培养液为对照，重复三个平行。每个三角瓶内分别移接3个直径为7mm叶枯病病原菌菌饼，28℃、160r/min下振荡培养3d后观察其菌块培养情况，过滤菌丝，40℃烘干称重。3.1.5拮抗菌对五味子叶枯病的防治效果测定3.1.5.1预防试验选取大小相近五味子离体叶片，在表面左右两侧对称分别扎取2个圆点缺口，右侧缺口滴入50μL拮抗菌株菌悬液，左侧缺口以等量无菌水为空白对照，24h后在叶片两侧同时接种生长5d叶枯病病原菌菌悬液50μL，设3个叶片为一组重复。将叶片置于25℃光照培养箱中，光照保湿培养3d后测量病斑面积，并计算防效。3.1.5.2治疗试验选取大小相近五味子离体叶片，在表面左右两侧对称分别扎取3个圆点缺口，先在叶片所有缺口上接种生长5d叶枯病病原菌菌悬液50μL，后在叶片右侧缺口滴入等量拮抗菌菌株菌悬液，叶片左侧缺口以等量无菌水为空白对照，设3个叶片为一组重复。将叶片置于25℃光照培养箱中，光照保湿培养3d后测量病斑面积，并计算防效。17 3.1.6数据处理采用Excel2003对数据进行录入，试验数据统计分析用DPS软件LSD法进行单因素方差分析。3.2结果与分析3.2.1拮抗菌分离筛选经初步筛选从五味子根际土中分离得到27株放线菌，其中，几乎无拮抗作用的（其拮抗率低于10%）的放线菌6株，拮抗作用较小（其拮抗率为10%-40%）的放线菌6株，具拮抗效果好（其拮抗率为40%-60%）的放线菌13株，拮抗效果较高（其拮抗率高于60%）的放线菌2株。对拮抗效果较好的放线菌计算拮抗率如下。表3-1放线菌对五味子叶枯病病菌拮抗率Tab.3-1antagonismrateofActinomycetestotheSchisandrachinensisleafblight拮抗菌拮抗菌菌落半径（mm）拮抗率（%）A-1717.35±0.2758.31A-3418.03±0.3856.68B-8-420.67±0.2050.34A-25-814.04±0.3666.26A-25-2317.67±1.5257.55A-25-217.4±0.4658.19A-A-26-117.35±0.4858.30A-6121.23±0.6648.99A-3814.11±0.6166.10A-4220.85±0.1549.89A-9-220.62±0.1150.45A-9-119.82±0.4252.37B-11-5020.91±0.1549.74B-11-5418.42±0.2555.74A-2518.22±1.0556.22ck41.61±0.12--对拮抗活性较高的A-25-8和A-38菌株进行五味子茎基腐病菌和人参主要病害（人参疫病、人参菌核病、人参灰斑病、人参黑斑病、人参锈腐病、人参根腐病及人参立枯病）病原菌菌株抗菌谱测定，结果表明，放线菌A-25-8仅对五味子叶枯病菌拮抗效果较好，其拮抗率在60%以上，对其他病原菌拮抗率均在20%以下，放线菌A-38对其他多种病原菌拮抗效果较好，其中对人参立枯病菌效果最好，其拮抗率为81.08%，对五味子茎基腐病菌、人18 参疫病菌、人参菌核病菌、人参灰斑病菌、人参黑斑病菌拮抗率均在60%以上，对人参锈腐病菌和人参根腐病菌也有一定拮抗作用。经实验证明，放线菌A-25-8对五味子叶枯病菌具有较高的拮抗活性，放线菌A-38对五味子及人参多种病害病原菌具有广谱抗性。3.2.2拮抗菌发酵滤液对叶枯病病原菌的影响含放线菌菌株A-25-8发酵滤液的PD培养液(A-25-8发酵滤液原液、A-25-8发酵滤液2倍稀释液、A-25-8发酵无菌滤液、A-25-8发酵无菌滤液2倍稀释液)与PD培养液相比，菌块与溶液差异极为明显。PD培养液内，叶枯病病原菌正常生长，菌块形成菌块球，体积增长极为显著，溶液内散落大量病原菌菌丝。含放线菌A-25-8菌株发酵滤液的PD培养液中，菌块无明显生长，菌液内含大量放线菌菌丝球；发酵滤液2倍稀释液内菌块同样菌块无明显生长，菌液内放线菌菌丝球含量相对较少。发酵无菌滤液内，菌块无明显生长，菌液内较为清澈，几乎无菌丝球；发酵无菌滤液2倍稀释液内，菌块无明显生长，菌液相较无菌滤液略显浑浊。表3-2A-25-8菌株发酵滤液对五味子叶枯病菌菌丝生长的影响Tab.3-2EffectoftheFAFofstrainA-25-8onthegrowthofthemyceliumoftheSchisandrachinensisLeafblight处理菌丝干重对照0.1347Bb±0.0019发酵滤液原液0.1072Cc±0.0032发酵滤液2倍稀释液0.0573Dd±0.0023发酵无菌滤液0.0629Dd±0.0037发酵无菌滤液2倍稀释液0.6318Aa±0.0191含放线菌A-38菌株发酵滤液的PD培养液(A-38发酵滤液原液、A-38发酵滤液2倍稀释液、A-38发酵无菌滤液、A-38发酵无菌滤液2倍稀释液)与PD培养液相比，菌块与溶液差异极为明显。PD培养液内，叶枯病病原菌正常生长，菌块形成菌块球，体积增长极为显著，溶液内散落大量病原菌菌丝。含放线菌A-38菌株发酵滤液的PD培养液中，菌块无明显生长，菌液内含大量放线菌菌丝球，三角瓶壁上有大量拮抗菌菌丝挂壁生长；发酵滤液2倍稀释液内菌块同样菌块无明显生长，菌液内放线菌菌丝球含量较少，三角瓶壁上有部分拮抗菌菌丝挂壁生长。发酵无菌滤液内，菌块无明显生长，菌液内较为清澈，几乎无菌丝球，三角瓶壁上有大量病原菌菌丝挂壁生长；发酵无菌滤液2倍稀释液内，菌块无明显生长，菌液内略显浑浊，三角瓶壁上有部分病原菌菌丝挂壁生长。19 表3-3A-38菌株发酵滤液对五味子叶枯病菌菌丝生长的影响Tab.3-3EffectoftheFAFofstrainA-38onthegrowthofthemyceliumoftheSchisandrachinensisLeafblight处理菌丝干重对照0.1432Bb±0.0041发酵滤液原液0.1293Bbc±0.0008发酵滤液2倍稀释液0.1039Bbc±0.0025发酵无菌滤液0.0904Bc±0.0009发酵无菌滤液2倍稀释液0.7598Aa±0.05673.2.3拮抗菌对五味子叶枯病的防治效果测定放线菌A-25-8菌株发酵滤液对五味子离体叶片上叶枯病的防治效果试验结果表明，A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病的预防效果要远好于治疗效果，分别为100%与60%。先喷施A-25-8菌株发酵滤液时，放线菌附着于叶片伤口表面，形成一层菌膜，防止叶枯病病原菌侵害，附着放线菌经擦拭可掉落，对伤口无另外影响。后喷施A-25-8菌株发酵滤液时，放线菌对病原菌侵害仍有一定防治作用，但其效果相较预防效果较弱。放线菌A-38菌株发酵滤液对五味子离体叶片上叶枯病的防治效果试验结果表明，A-38菌株发酵滤液对叶枯病的预防效果相对较强为71%，治疗效果相对较弱为56%，相较与A-25-8相比，其预防效果与治疗效果均有不及。图3.1菌株A-25-8的预防（左一）治疗（左二）及菌株A-38的预防（右二）治疗（右一）实验Fig.3.1TheexperimentofstrainsA-25-8withprevention(left)andtreatment(secondfromleft).TheexperimentofstrainsA-38withprevention(secondfromright)andtreatment(right)3.3结论与讨论本实验从五味子根际土中筛选对五味子叶枯病病原菌拮抗效果较好的放线菌菌株，得到两株放线菌菌株分别为A-25-8及A-38，拮抗率分别为66.26%及66.10%，并针对五味子及人参多种病害划线培养确定其抑制率，确定A-25-8菌株为针对五味子叶枯病的拮抗菌，A-38菌株为能拮抗多种五味子及人参病害的广谱拮抗菌。20 A-25-8及A-38菌株发酵菌液均对五味子叶枯病病原菌抑制效果良好，三角瓶内病原菌无明显生长迹象，拮抗放线菌生长显著，具一定的生长优势。A-25-8及A-38菌株无菌发酵滤液随着浓度降低对叶枯病病原菌抑制效果减弱，其发酵滤液内较为清澈，病原菌溶液内无明显生长，少量挂壁，2被稀释液内有大量病原菌挂壁生长。实验证明，A-25-8及A-38菌株对五味子叶枯病病原菌抑制效果良好，其无菌发酵滤液也具一定抑菌活性。拮抗放线菌对五味子叶枯病的防治效果测定结果表明：A-25-8菌株对五味子叶枯病预防防效果最好，其在叶片伤口表面生长，有效的预防叶枯病病原菌对五味子叶片的侵害，复接叶枯病病原菌后病害无明显生长。A-25-8治疗实验及A-38防治实验效果相对较弱，能在一定程度上控制叶枯病侵染程度。土壤内微生物含量丰富，目前仍有大量的土壤微生物资源有待开发。针对五味子病害，其根系土壤内含大量有益菌群，本实验针对五味子主要病害叶枯病，筛选得到两株高效拮抗菌，其中A-25-8菌株生长优势明显，对五味子叶枯病预防效果良好，有望作为生物菌剂加以开发利用。21 第四章五味子叶枯病拮抗菌的鉴定放线菌分类共经历五个阶段，分别为基于细胞水平的传统分类、数值分类、化学分类，和基于分子水平的分子分类、多项分类。其中，鉴定放线菌以采用传统分类中的形态特征鉴定、生理生化鉴定等表观性分类学信息及分子分类的16SrDNA相结合的方式最为常见。本论文在前期研究中筛选得到2株放线菌菌株对五味子叶枯病拮抗效果较好，本章对2株拮抗放线菌进行形态学观察，检测其生理生化指标并进行16SrDNA序列分析，通过系统发育树确定其分类学地位，为拮抗菌株进一步研究奠定基础。4.1材料与方法4.1.1拮抗菌形态学鉴定将放线菌分别划线接种于高氏1号固体培养基、PDA培养基、淀粉铵琼脂培养基、蔗糖察氏琼脂培养基内，26℃5d观察其菌落形态特征及显微结构。4.1.2拮抗菌生理生化鉴定采用碳源利用、明胶液化、牛奶胨化、纤维素生长、淀粉酶活性测定等生理生化特性鉴别两株放线菌，参照放线菌系统学。4.1.3拮抗菌分子鉴定拮抗放线菌DNA提取采用生工Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒。以放线菌DNA作为模板进行PCR扩增，反应在PCR扩增仪上进行，采用放线菌16SrNDA的通用引物A：5'-AGTTTGATCTGGCTCAG-3'和B：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'为引物进行PCR反应。PCR扩增体系(25μL反应体系)：TagBuffer2μL，Taq酶0.25μL，dNTP2μL，去离子水18μL，上下游引物各2μL，DNA模板4μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性4min，94℃扩增45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环数为30次，72℃充分延伸10min，4℃终止反应。PCR反应产物采用琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，将产物测序；将所得序列与NCBI中与己经登录的基因序列比对，确定A-25-8及A-38菌株属种。使用MEGA6.0分析序列比对结果建立进化树。4.2结果与分析4.2.1拮抗菌形态学鉴定放线菌A-25-8在各培养基上生长状况良好，但其菌落大小、菌落形态各有差异。菌22 株在PDA培养基、高氏1号固体培养基、蔗糖察氏琼脂培养基、淀粉铵琼脂培养基菌落直径分别为2.5、3、3.5、4mm左右。在供试的4种培养基上基内菌丝呈现白色至褐色，气生菌丝为白色至黄白色，其可溶性色素也所有差异，在高氏一号固体培养基上颜色为棕褐色；蔗糖察氏琼脂培养基颜色为浅褐色；PDA培养基及淀粉铵琼脂培养基上无水溶性色素。其具体情况见表3-1。表4-1放线菌A-25-8在不同培养基上的培养特征Tab.4-1TheculturalcharacteristicsofstrainA-25-8ondifferentmedia培养基基内菌丝气生菌丝菌落生长情况可溶性色素菌落大小（mm）PDA白色至黄褐白色至淡裙皱，有凸起无中等，直径约为2-3色黄色高氏1号白色至淡褐白色前期平滑、后期棕褐色中等，直径约为色中央开裂2.5-3.5蔗糖察氏灰白色白色裙皱，有凸起浅褐色中等，直径约为3-4淀粉铵琼白色至土黄米白色平滑无较大，直径约为4-5脂色放线菌A-38菌株在供试的4种培养基上培养特征不同。淀粉铵琼脂培养基不适宜A-38生长，培养基内无明显菌落；高氏一号培养基内菌落外侧具凸起菌丝，其内侧无明显菌丝存在，其菌落约为5.5mm左右；蔗糖察氏琼脂培养基内菌落较大，无明显凸起，其菌落约为7mm左右；PDA培养基菌落中等，有明显凸起，颜色有白色转至白灰相间，其菌落约为2.5mm左右。于高氏1号固体培养基、PDA培养基、蔗糖察氏琼脂培养基上，基内菌丝呈现白色、淡黄色至灰色，气生菌丝由白色至灰色。A-38在培养基内均无可溶性色素。表4-2放线菌A-38在不同培养基上的培养特征Tab.4-2TheculturalcharacteristicsofstrainA-38ondifferentmedia培养基基内菌丝气生菌丝菌落生长情况菌落大小（mm）PDA淡黄色至灰白色至灰色裙皱，有凸起中等，直径约为2-3色高氏1号淡黄色白色菌落外侧凸起菌丝，内较大，直径约为5-6侧无明显菌丝蔗糖察氏白色灰白色平滑较大，直径约为6-823 图4.1菌株A-25-8（左）和A-38（右）的形态学鉴定Fig.4.1ThemorphologicalofstrainsA-25-8（left）andA-38（right）4.2.2拮抗菌生理生化鉴定试验结果表明，拮抗放线菌A-25-8菌株能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、果糖、乳糖等7种碳源，明胶液化，牛奶凝固并缓慢胨化，淀粉水解，不利用纤维素。表4-3放线菌株A-25-8生理生化特性Tab.4-3PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainsA-25-8实验项目A-25-8明胶液化+牛奶胨化+纤维素生长–淀粉酶活性测定+无糖–蔗糖++葡萄糖++甘露醇+可溶性淀粉+麦芽糖+果糖+乳糖+A-38菌株能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、果糖、乳糖等7种碳源，明胶不液化，牛奶凝固并缓慢胨化，淀粉水解，不利用纤维素。24 表4-4放线菌株A-38生理生化特性Tab.4-4PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainsA-38实验项目A-38明胶液化–牛奶胨化+纤维素生长–淀粉酶活性测定+无糖–蔗糖++葡萄糖++甘露醇+可溶性淀粉+麦芽糖+果糖+乳糖+4.2.3拮抗菌分子鉴定利用试剂盒提取A-38及A-25-8菌株基因组序列，经电泳观察，可知该菌株基因组序列约为1400bp；以27f和1492r为引物，对A-38及A-25-8菌株的基因组进行PCR扩增。电泳检测PCR产物，获得一段A-38及A-25-8菌株的16SrDNA片段。MKA-25-8A-38图4.2A-25-8及A-38菌株的基因组和PCR反应产物电泳检测图像Fig.4.2ThegenomeofstrainA-25-8andA-38anditsPCRproductelectropHoresisdetection放线菌A-25-8菌株扩增片段序列长度为1406bp。将放线菌A-25-8菌株序列与GenBank数据库中相关序列进行Blast相似性比对，筛选同源性较高的10株菌株，采用25 MEGA软件构建系统发育树(图4.3)。将所得的A-25-8菌株的16SrDNA序列上传到GenBank，申请获得该序列的GeneBank登录号为KR091956。根据比对结果建A-25-8菌株的遗传进化树，基于neighbour-joining算法的进化树中A-25-8菌株(KR091956)与Streptomycesanulatus(环圈链霉菌)处于同一进化分类学等级，二者同源性达98%。84Streptomycesgriseoplanus（KF876852.1）73Streptomycesparvus（JX203385.1）84Streptomycesrubiginosohelvolus(|JN999920.1)Streptomycesanulatus(EU593677.1)10098A-25-8Streptomycesbaarnensis(NR_112440.1)Streptomycesflavofuscus(JQ924407.1)62Streptomycesflavofuscus(NR_115965.1|)Streptomyceslactacystinicus(AB915215.1)Streptomycesindigoferus(NR_041087.1)63Kitasatosporakifunensis(NR_044810.1)0.002图4.3A-25-8菌株的16SrDNA系统发育树Fig.4.3Phylogenetictreeof16SrDNAofstrainA-25-8withrelatedstrains放线菌A-38菌株扩增序列长度为1462bp。将放线菌A-38菌株序列与GenBank数据库中相关序列进行Blast相似性比对，共从中选择同源性较高的9株菌株的序列进行比较，采用MEGA软件构建以16SrDNA序列为基础的系统发育树(图4.4)。将所得的A-38菌株的16SrDNA序列上传到GenBank，申请获得该序列的GeneBank登录号为KR091957。根据比对结果建立A-38菌株的遗传进化树，基于neighbour-joining算法的进化树中A-38菌株(KR091957)与Streptomyceslactacystinicus同源度最高。Streptomycespurpureus（NR_042292.1）91Streptomycesxanthocidicus（NR_112406.1）Streptomycesnigrogriseolus（KF782837.1）58Streptomycesnigrogriseolus（AB184460.2）A-3810040Streptomyceslactacystinicus（AB915215.1）Streptomycesherbaricolor（NR_041212.1）99Streptomycesindigoferus（NR_041087.1）Streptomycessindenensis（NR_115441.1）Streptomycesparvus（JX203385.1）56Streptomycesrubiginosohelvolus（JN999920.1）0.002图4.4A-38菌株的16SrDNA系统发育树Fig.4.4Phylogenetictreeof16SrDNAofstrainA-38withrelatedstrains4.3结论与讨论本研究通过形态学鉴定、生理生化鉴定及16SrDNA测定，确定放线菌A-25-8菌株为链26 霉菌属Streptomycesanulatus(环圈链霉菌)，A-38菌株为链霉菌属Streptomyceslactacystinicus。放线菌形态学鉴定主要以待测菌种在天然或合成培养基内生长状况，生长菌落大小、可溶性色素及菌丝发育状况为其主要指标。生理生化鉴定为测定微生物代谢能力及代谢产物，通过其代谢差异区分不同菌种。通过这两种鉴定方法仅能初步确定微生物分类学地位。决定物种类别的根本是基因，通过分子鉴定微生物类别最为准确。16SrDNA测定为当前放线菌测定最为认同的方法，通过分子鉴定，能得到准确的基因序列，研究及鉴定菌种时采用较多。链霉菌作为抗生素重要来源菌种，广泛用于抗生素的研发生产。此次分离高效拮抗放[120]线菌来源于土壤，其中A-25-8菌株同源菌种较多，国内外均有所报道，陈丼生等从辽[121]宁沈阳市土壤中分离到1株较高的杀线活性放线菌，经鉴定为环圈链霉菌；张秀敏等也从白芍内生菌内分离出与环圈链霉菌相似度较高的广谱拮抗放线菌；OlivierCouillerot等[122]从健康的摩洛哥葡萄根际分离该类放线菌，发现其具有促生及诱导抗病性作用；本实验发现此菌种对五味子叶枯病病原菌拮抗效果良好，并具生长优势。A-38菌株与Streptomyceslactacystinicus相似度最高，关于该菌种研究此前未见报道，本实验发现其对五味子及人参多种病害均有较好抑菌效果。27 第五章拮抗菌A-25-8菌株发酵条件优化及发酵产物活性稳定性生防菌剂为生物农药的重要组成部分，其优点在于安全环保，缺点在于微生物生长条件及活性稳定性具有一定限制。筛选及优化培养高效拮抗微生物，对生防菌剂的研发具有重大意义。菌种大量研发生产的关键在于微生物发酵培养，即在适宜的条件下，将微生物经过特定的生长代谢途径转化，得到所需产物。发酵培养生产水平不仅受菌种本身的遗传特性影响，同时培养条件也是其关键因素。本实验以A-25-8菌株为拮抗菌，五味子叶枯病病原菌为致病菌，对A-25-8菌株液体发酵培养基及条件进行优化，并测定该菌中液体发酵滤液的活性稳定性，旨在为A-25-8菌株液体发酵及大规模培养提供合理条件与技术支持。5.1材料与方法5.1.1供试菌株放线菌A-25-8及五味子叶枯病病原菌：本研究室分离筛选保存。5.1.2培养基培养放线菌A-25-8：高氏1号固体培养基培养五味子叶枯病病原菌：马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基A-25-8种子培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基A-25-8发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基、高氏1号液体培养基、玉米粉液体培养基、小米浸汁液体培养基5.1.3种子液的配置放线菌A-25-8菌株接种于高氏一号固体培养基，28℃恒温培养5d，经打孔器打取直径为7mm的病原菌菌饼多个，选取其中5个接入装有200mL种子培养基的三角瓶中，放入温度为28℃，摇床转速为160r/min摇床内培养24h，得到A-25-8种子培养液。5.1.4A-25-8的液体培养与发酵滤液制备按10%(V/V)的接种量，将A-25-8菌株的种子培养液接入发酵培养基中。于28℃、160r/min，摇瓶培养72h后，得到A-25-8菌株的发酵菌液。经灭菌称重后的滤纸过滤发酵菌液后，再用两层孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，得到A-25-8菌株的发酵滤液，过滤后将滤纸于80℃烘干称重，计算菌丝干重，每处理3次重复。28 5.1.5A-25-8菌株发酵滤液抑菌活性测定以牛津杯法测定发酵滤液抑菌活性，设置三组对照取平均值。5.1.6优化A-25-8菌株发酵培养基及培养条件依照单因子变量的优化法，选取时间、培养基、碳源、氮源、温度、pH、接种量、摇床转速等因素，设定各因素的变化范围和梯度，进行发酵条件的初步优化。发酵培养基：设定培养基分别为马铃薯葡萄糖液体培养基、高氏1号液体培养基、小米浸汁液体培养基、玉米粉液体培养基；时间：设定发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，时间范围为1-4d，梯度为为1d；碳氮源：设定设定发酵培养基为高氏1号液体培养基，碳源分别为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖、甘露醇，设无碳源对照，氮源分别为(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏，设无氮源对照；温度：设定发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，温度范围为25℃-34℃，梯度差为3℃；pH：设定发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，设置pH范围为6.0-6.5，pH梯度为0.5；摇床转速：设定发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，设置摇床转速范围为120-200r/min，梯度为20r/min；接种量：设定发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，设置接种量范围为5%-20%，梯度差5%。以上每处理均采用三次重复。5.1.7菌株A-25-8发酵滤液拮抗活性的稳定性取不同条件稳定性处理，每处理重复三次，以牛津杯法测定处理后发酵滤液对叶枯病病原菌的拮抗效果，根据拮抗带宽考察A-25-8菌株发酵滤液拮抗活性稳定性。5.1.7.1不同温度处理的稳定性测定取A-25-8菌株发酵滤液于灭菌试管中封口，分别置于室温（15℃）、40℃、60℃、80℃、100℃和高压蒸汽灭菌锅中处理20min。每处理均采用三次重复。5.1.7.2不同pH值处理的稳定性测定1mol/LHCl和1mol/LNaOH将发酵滤液pH值分别调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，静置2h后，再用1mol/LNaOH和1mol/LHCl分别缓慢调至中性。每处理采用三次重复。5.1.7.3紫外线处理的稳定性测定取10mLA-25-8菌株发酵滤液置于无菌培养皿中，培养皿距紫外灯60cm处紫外照射分别为0min、5min、15min、30min、45min、1h。每处理采用三次重复。5.1.7.4贮存时间的稳定性测定取发酵滤液装入无菌的密封三角瓶中，在室温条件下分别保存0、5、10、20、30、40天。每处理采用三次重复。5.1.8数据处理采用Excel2003对数据进行录入，试验数据统计分析用DPS软件LSD法进行单因素方差分析。29 5.2结果与分析5.2.1拮抗菌发酵培养筛选结果5.2.1.1发酵培养基对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响试验结果表明，在不同培养基中发酵，可显著影响A-25-8菌株菌量及其抑菌活性。放线菌A-25-8在马铃薯葡萄糖液体培养基中发酵时，供试病原菌的拮抗带宽最大、抑制程度最高，抗菌圈直径为27.24mm，高氏1号液体培养基其次，抗菌圈直径为25.47mm；在玉米粉液体培养基菌丝生长量最大，约为0.52g，高氏1号液体培养基及马铃薯葡萄糖液体培养基其次；小米浸汁液体培养基拮抗带宽最小、抑制率较低。不同培养基菌量及抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异较为显著。比较其菌量及抑菌活性，PD为最适培养基。300.6000aA250.5000）bB）20bB0.4000gmm150.3000bABaAcB拮抗带宽100.2000菌丝干重（菌丝干重拮抗带宽（5dCcC0.100000.0000小米高氏PD玉米粉培养基(cultrualmedia)图5.1不同培养基对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.1ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentmedia5.2.1.2发酵时间对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响如图5.2所示，放线菌A-25-8菌株在最佳发酵培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)中发酵时，发酵时间不同，发酵滤液可显著影响A-25-8菌株对叶枯病病原菌的拮抗效果及菌丝生长量。其发酵滤液对叶枯病菌的抑菌活性在3d时达到最大，抗菌圈直径为24.85mm；发酵4d时其次，抗菌圈直径为22.11mm，此时菌丝干重最大；发酵1d时几乎无抑菌效果。不同天数抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著。比较其菌量及抑菌活性，3d为最适发酵天数。300.5000）25aAaA0.4000）mm20g0.300015拮抗菌带bBaAbB0.200010bB菌丝干重cC5dD0.1000菌丝干重（拮抗带宽（00.00001d2d3d4d天数(days)图5.2不同发酵时间对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.2ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentfermentationtime5.2.1.3碳源对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响如图5.3（A.蔗糖、B.葡30 萄糖、C.可溶性淀粉、D.乳糖、E.麦芽糖、F.甘露醇、G.无碳源）所示，放线菌A-25-8菌株在高氏1号液体培养基中发酵时，碳源不同，A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病病原菌的拮抗效果及菌量有所影响。碳源选择的试验结果表明，在供试的6种碳源中，当以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源时，放线菌A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病菌的抑菌活性最大，抗菌圈直径为24mm左右；甘露醇其次，抗菌圈直径为22.60mm；菌丝干重最大时碳源为可溶性淀粉。不同碳源抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异较为显著。比较其菌量及抑菌活性，最适碳源为葡萄糖。300.700025aA0.60000.500020bBCbB0.4000bcBC15cCDdD0.3000拮抗菌带aAaA10cCbBdD拮抗带宽（mm）cCaA0.2000菌丝干重（g）菌丝干重50.1000eE00.0000ABCDEFG碳源(Carbonsources)图5.3不同碳源对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.3ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentcarbonsources5.2.1.4氮源对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响放线菌A-25-8菌株在高氏1号液体培养基中发酵时，氮源不同，其发酵滤液对叶枯病病原菌的抑菌活性及菌量有所影响。如图5.4（A.(NH4)2SO4、B.NH4Cl、C.KNO3、D.蛋白胨、E.酵母浸膏、F.牛肉膏、G.无氮源）所示，氮源选择的试验结果表明，在供试的6种氮源中，当以KNO3、蛋白胨及酵母浸膏为氮源时，放线菌A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病菌的抑菌活性最大，抗菌圈直径为17mm左右；NH4Cl其次，抗菌圈直径为16.11mm。不同氮源抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异较为显著。比较其菌量及抑菌活性，最适氮源为KNO3。200.600018aA0.500016）14bBbBbBbB）bBC0.4000gmm12cC100.30008aAaAaA拮抗菌带6cBaABdCcB0.2000菌丝干重（菌丝干重拮抗带宽（40.1000200.0000ABCDEFG氮源(Nitrogrnsources)图5.4不同氮源对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.4ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentnitrogrnsources5.2.1.5培养基的初始pH值对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响将种子培养31 液以10%的接种量接入到pH分别为6、6.5、7、7.5、8的最佳发酵培养基中，测定发酵滤液对叶枯病病原菌的拮抗效果。结果如图5.5所示，当pH为7.5时，放线菌A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病菌的抑菌活性最大，抗菌圈直径为23mm左右，随着pH增大或减小，抑菌圈直径均有所减小。不同碳源抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著性较小。比较其菌量及抑菌活性，最适pH值为7.5。250.6000bABabAaA0.500020cCcBC）0.4000）gmm15abAaAabAB0.3000cBbcAB10拮抗菌带0.2000菌丝干重（菌丝干重拮抗带宽（50.100000.000066.577.58pH图5.5不同初始pH对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.5ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentinitialpH5.2.1.6接种量对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响将种子培养液以5%、10%、15%、20%的接种量接入到最佳发酵培养基中，测定发酵滤液对叶枯病病原菌的拮抗效果。结果如图5.6所示，不同接种量选择实验表明，接种量为10%时，放线菌A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病菌的抑菌活性最大，抗菌圈直径为24.48mm左右，菌丝干重最大时接种量为15%。不同碳源抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著性较大。比较其菌量及抑菌活性，最适接种量为10%。300.7400aA0.720025abAbA）0.700020）gmm0.6800150.6600aAbAbAcB0.6400拮抗菌带10拮抗带宽（cB0.6200菌丝干重（菌丝干重50.600000.58005%10%15%20%接种量（inoculationvolumes）图5.6不同接种量对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.6ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentinoculationvolumes5.2.1.7培养温度对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响将A-25-8菌株分别在25℃、28℃、31℃、34℃条件下最佳发酵培养基内培养，测定A-25-8菌株发酵滤液对叶枯病病原菌的抑菌活性。结果如图7所示，放线菌A-25-8在温度为28℃发酵时，供试病原菌的菌丝干重最大、抑制程度最高，其抑菌圈直径为24.19mm，25℃、31℃其次，为22mm左右，并随温度升高抑制程度降低。不同培养温度菌量及抑菌活性在α=0.05及α=0.0132 水平上差异较为显著。比较其菌量及抑菌活性，28℃为最适培养温度。300.5000aA）25bBaAbBcC0.4000）mm20abABbABgbB0.3000150.2000拮抗菌带10菌丝干重50.1000菌丝干重（拮抗带宽（00.000025℃28℃31℃34℃温度(temperatures)图5.7不同温度对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.7ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferenttemperatures5.2.1.8摇床转速对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响如图5.8所示，将摇床转速分别设定为120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min，测定发酵滤液对叶枯病病原菌的抑菌活性，结果表明抑菌活性在转速为160r/min时最高，其抑菌圈直径为24.52mm，随着转速升高或降低，接种量及抑菌圈直径有所降低。其菌量及抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著较小。比较其菌量及抑菌活性，160r/min为最适摇床转速。300.80000.700025aAaA）abAB0.600020bBC）gmm0.5000cC150.4000aAcBabAbA0.3000拮抗菌带10cB拮抗带宽（0.2000菌丝干重（菌丝干重50.100000.0000120r/min140r/min160r/min180r/min200r/min转速(rotatoryvelocities)图5.8不同摇床转速对A-25-8菌株发酵滤液的生长量及抑菌活性Fig.5.8ThegrowthandantibacterialactivityofthestrainA-25-8ondifferentrotatoryvelocitys5.2.2拮抗菌A-25-8发酵产物稳定性筛选结果5.2.2.1温度对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响A-25-8菌株发酵滤液分别置于室温（15℃左右）、40℃、60℃、80℃、100℃和高压蒸汽灭菌锅中处理20min，结果如图9所示，随着温度升高，其拮抗带减小，发酵滤液对五味子叶枯病病原菌的拮抗活性下降，直至丧失活性(121℃处理)。其常温下抑菌半径为21.8mm，60℃以下时随着温度升高20℃，其抑菌半径约下降2mm；60℃以上时，其抑菌半径下降幅度增大。抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著，与室温下处理表现极显著差异。33 25aAbB20cCdD15eE10拮抗带宽（mm）5fF0常温40℃60℃80℃100℃121℃温度(temperatures)图5.9不同温度处理后A-25-8菌株发酵滤液的抑菌活性Fig.5.9DifferenttemperaturetreatmentafterA-25-8strainsfermentationfiltratebacteriostaticactivity2.2.2pH对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响A-25-8菌株发酵滤液分别用1mol/LHCl和1mol/LNaOH将发酵滤液pH值调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，静置2h后，再用1mol/LNaOH和1mol/LHCl分别缓慢调至中性，与不经酸碱处理(自然pH值，pH值约为7.5)的A-25-8菌株发酵滤液作对比，pH4-10之间差异性较小，抑菌圈半径都在20mm以上，pH为2或12时差异性较大，抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著。说明酸碱对发酵滤液抑菌活性有所影响，且随着酸碱浓度增加拮抗活性降低。25aAaABaAbBbAB20cCdD1510抑菌圈直径（mm）5024681012CKpH图5.10不同pH处理后A-25-8菌株发酵滤液的抑菌活性Fig.5.10DifferentpHtreatmentafterA-25-8strainsfermentationfiltratebacteriostaticactivity5.2.2.3紫外线对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响随着紫外线照射时间的延长，A-25-8菌株发酵滤液对五味子叶枯病病原菌的抑菌活性逐渐降低，从0min时21.56mm降至60min时10.85mm，其不同紫外光照时间与无紫外光照相比抑菌活性在α=0.05及α=0.01水平上差异显著。34 25aAbB20cCdD15eEfF10抑菌圈直径（mm）500min5min15min30min45min60min时间(times)图5.11不同紫外处理时间对A-25-8菌株发酵滤液的抑菌活性Fig.5.11DifferentuvprocessingtimeofA-25-8strainsfermentationfiltratebacteriostaticactivity5.2.2.4贮藏时间对A-25-8菌株发酵滤液活性物质抑菌活性的影响菌株发酵滤液对贮藏时间的稳定性试验结果表明，在室温（15℃）条件下，随着贮藏时间的增加，抑菌活性逐渐降低。从0d-10d时，抑菌活性下降速度较快，其抑菌圈半径在α=0.05及α=0.01水平上差异显著；10d以后，抑菌圈半径降低速度明显减缓，第20d抑菌圈半径17.66mm，第40天抑菌圈半径为16.15mm。25aAbBcC20dCDdeDEeE15105抑菌圈直径（mm）00d5d10d20d30d40d天数(days)图5.12不同贮藏天数处理后A-25-8菌株发酵滤液的抑菌活性Fig.5.12DifferentstoragedaystreatmentafterA-25-8strainsfermentationfiltratebacteriostaticactivity5.3结论与讨论通过本研究发现，发酵培养最有条件筛选结果为：A-25-8菌株的最佳发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，最佳发酵条件为：发酵培养基初始pH为7.5，发酵温度为28℃，发酵时间为3d，碳源为葡萄糖，氮源为KNO3，接种量为10%，摇床转速为160r/min。与[123-126]其他拮抗放线菌菌株相比，其发酵温度及发酵培养基初始pH的最适条件相差不大，其最优发酵培养基、碳氮源及摇床转速的筛选结果各有不同，其原因应为所筛选拮抗菌虽同属放线菌，但其科属各有不同，且不同实验条件选择及实验基础器材有所不同导致。抑菌活性物质的稳定性试验结果表明，其菌株发酵滤液的抑菌活性，随着紫外线照射时间延长及外界环境温度升高，显著降低。酸碱对发酵滤液抑菌活性随着浓度增加，拮抗活性降低。在室温条件下，随着贮藏时间的增加，发酵滤液的活性逐渐降低。其不同温度35 [127]稳定性实验结果与朱茂山等研究不符，A-25-8菌株抑菌活性稳定性随着温度升高严重[128]降低，直至无抑菌作用。与张建华等实验结果不同，本实验的拮抗菌株发酵滤液抑菌[129-130]活性下降较快，随着贮藏时间增加，其抑菌圈半径减小幅度明显减弱。与杨静等结果相同，拮抗菌株发酵滤液对酸碱度的稳定性较好，在强酸及强碱下仍保持一定的拮抗活[126-127]性。与其他拮抗放线菌相比，A-25-8菌株发酵滤液短期受紫外线影响较小，长时间紫外线照射对其抑菌活性影响较大。五味子叶枯病为影响五味子资源与质量的主要病害之一，本实验所筛选拮抗菌对五味子叶枯病病原菌拮抗效果较好，并且具有生长周期较短，生长量较大，保存时不易污染等优点。同时其发酵培养所需条件较为简单，抑菌活性稳定性较好，易于大量培养，有望成为五味子叶枯病有效生防菌剂。36 结论1.本实验从集安五味子叶枯病典型病叶分离致病病原菌细极链格孢，回接后证明其确能侵染病叶导致叶枯病的发生。为了进一步研究该病原菌特性，进行了生物学特性实验，发现其最佳生长条件为最适培养基PDA及PDBA；最佳碳氮源果糖、蛋白胨；最适pH值5-7；最适温度25℃；致死温度54℃。同时致病菌菌丝在光照条件下生长速度较快，黑暗条件产孢量加剧；25℃以下随温度降低菌丝生长减慢，孢子量随之降低，病原菌生长繁殖减缓；34℃以上病原菌存活但无无明显生长，至54℃孢子完全失活。其病原菌生长特征与叶枯病发生时间相符，可从该方面降低五味子叶枯病发作程度。2.本实验从土壤放线菌方面对五味子病害防治进行研究，通过分离筛选得到两株高效拮抗五味子叶枯病病原菌的放线菌菌株，分别为拮抗率66.26%的A-25-8及66.10%的A-38。实验同时对两株高效拮抗菌拮抗病原菌种类进行筛选，发现A-25-8菌株仅对五味子叶枯病拮抗效果较强，A-38菌株能拮抗多种五味子及人参病害。液体培养测定A-25-8及A-38菌株发酵菌液及无菌滤液对五味子叶枯病病原菌的抑制效果良好，其抑制效果与发酵滤液浓度呈正相关。拮抗放线菌对五味子叶枯病的离体叶片防治效果测定，A-25-8治疗实验及A-38防治程度高于50%；A-25-8预防实验中复接病原菌无生长。A-25-8预防实验中，先接的A-25-8菌株在叶片伤口表面生长，能有效阻隔复接的叶枯病病原菌对五味子叶片的侵害，从而阻止叶枯病的发生。实验表明，A-25-8菌株菌体对五味子叶枯病具有很强生长优势，其滤液也能对叶枯病病原菌产生较强抑制作用，对五味子叶枯病病害防治前景良好。3.通过形态学鉴定、生理生化鉴定确定两种放线菌均为链霉菌属菌株；16SrDNA得到序列，经Blast比对、MEGA软件构建系统发育树，确定放线菌A-25-8菌株与链霉菌属Streptomycesanulatus(环圈链霉菌)相似度最高，A-38菌株与链霉菌属Streptomyceslactacystinicus亲缘关系最近。前种较为广泛，同类放线菌具杀线、拮抗及促生等多种活性，后种研究较少，有待进一步探索。4.本实验通过单因素实验法，确定五味子叶枯病拮抗菌A-25-8菌株最佳发酵条件，发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，碳源为葡萄糖，氮源为KNO3，发酵培养基初始pH为7.5，发酵时间为3d，接种量为10%，发酵温度为28℃，摇床转速为160r/min。拮抗菌A-25-8活性稳定性实验表明，菌株发酵滤液的酸碱稳定性较好，温度及紫外线照射时间对抑菌活性影响较大，常温下储藏40d后仍具一定抑菌活性。通过以上对五味子叶枯病拮抗菌株A-25-8较为系统的研究，发现A-25-8菌株不易污37 染、生长迅速、生产条件简易，有望开发成为新一代五味子叶枯病生防菌剂。广谱拮抗菌株A-38对生长条件要求有一定限制，但其所具高拮抗活性及广谱抗菌特性，可通过进一步研究，为五味子及人参病害防治产生一定作用。38 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