油茶主要病害高效拮杭菌的分离筛选及鉴定

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1、油茶主要病害高效拮杭菌的分离筛选及鉴定油茶在其牛一长发育过程屮.会受到各种有害牛物的影响，其中影响池茶牛•长和茶油产呈的主要病害有油茶炭疽炳和根腐病，它们常给油茶牛产造成垂大经济损失。但目前在生产上主要依救化学药剂进行防治。持续大崑使用化学药剂会污染环境，病原物产牛抗药性等。随着人们环保意识的提高，人们开始探索利用各种方法来减少化学农药使用址.减少其肘环境的污染。主物农药有低毎、绿色、无公害尊优点.町通过克接或间接作用防治虫害和病害導，井已在植物病'占防治中取得了一迫成效。因此牛物防治被认为是在植物病害防治中最具发展潜力的垂要防

2、治方法，其中获得高效拮抗菌株是植物病勇牛物防治的基砒。丄壤和植物体内外是各类微牛一物牛长发仔的良好环境，其中存在着大量拮抗微牛物.拮抗微生物种类多，其屮以产抗牛素的放线菌和产芽胞的杆菌在植物真菌病害牛•物防治中占主导地位，不同菇抗微生物其拮抗机制不同.确定蔑种風地位.对开发利用抬抗微牛物资魔有重耍意义。微恢物传统分类主箜:是靠菌体形态和生理生化特征等表型分类法，近年来随着分子生物学的快速发展，微牛.物分类己深入到基因型分类水平。核艳体RNA（rRNA）是存在于所有细菌和放线闲中的，其编码的基因在细菌和放线菌中有高度保守性。其中I

3、6SrDNA因其有功能上和木质上商厦保守性、分子大小适合操作、序列变化与进化距离相适应等诸多特点，被越来越多地用于细菌和放线菌的分类鉴定，特别在相近种分类鉴定方面发挥了帀要作用.木戳車点从上壤中筛选细直和放线菌，从健康油茶植林中筛选內牛细繭，以获取对油茶炭疽病菌和油茶根底网闔优良原始拮抗菌株.采用传统农型分类并结合16SrDNA序列分析对筛选得到的高效拆抗细菌和放线菌进行分类鉴定，确定其分类地位，为油茶病吉防治提供优R的生防菌刑.并为进一步怎入研究、开发和利用扌吉抗闔及其在牛物防治匕的应用提供基础於料.1材料与方法t1材料1.1

4、.1供试样本来源健康油茶根、茎、叶、果.采自湖南汕条基地的油茶林中.供试上样：（1）汕茶林根除上样;从油荼基地不同树齡（28年生、9年牛.及2年生)、不同抚育方式(多年未抚育、刀抚、隔年锄抚、连续锄抚)的油茶林内设标旌地6块，按0〜20cm、20〜40cm和40^60cm三个层次从F而上分别采土,共采土样】8份。＜2)其它土样：从湖南环境生物职业技术学院园林植物根际及周围花木地、东菜地、果园地釆集土样20份°供试样品及采源见表3-U表3・1供试样晶及Tt来源Table3・1Thesourcesofsamples编号No.样諾来源

5、Thesourceofsamples1油茶健療植樣■池茶林根麻土壤3花木地根陌十•壌4果园地根际土壌5兔菜地根际土壤・1・2供试植物病原真菌以8种植物病原真菌作为供试菌，具体见农3・2。表3-2供试植物病原茵汇总Table3・2Thesummarytableofphyiopathogens代号病瓯菌No.SviTibolsPhyiopathogens1YCG汕茶炭粧病角(Coiietofrtchumgloeospotioides>2YFP池茶根悄炳菌CFusariumproliferarum>3YCS池茶白皮病函(Coniciu

6、mseurcHa^e)4YPM油茶叶枯倆向(Pestalotiupsismicrospora)5GCGtit拮般如桶W8LFS芦公根疇病菌＜Fusariumsp.)1丄3培养基1」.3」分离筛选用培养基牛肉奋蛋白陈琼B&培养族(NA)和培养液：用于油茶内牛细菌和土壤细®分离和菌种保存。高氏一号培养基：（每300ml加3%羽路酸钾抑制剂】ml,以抑制细菌和霉菌的牛长）。用于土壤放线菌分离

7、和菌种保存。马铃茗葡萄糖琼脂培养基（PDA）：用于拮抗性测定和培养性状观察。甲壳素脱乙酰侮筛选培养基（见附录C）：用于产生甲壳累脱乙醸悔菌抹筛选。1-1.3-2生理生化鉴定用墙养基接触醯试验培养基；牛肉膏蛋白陈培养液：淀粉水解试验堪养基：油脂水解培养基：纤维素水解试验培养基；乙酸甲基甲醇试验（V.P试验）培养基；甲基红试验（M.R试验）培养基：产呼I嗓试验培养基；产硫化氢试验培养基；硝酸盐还原试验培养基：石农牛奶试验培养基：明胶液化试验培养基；耦醇类发酵试验培养基。參考《常见细蘭系统鉴定手册》㈡叭具体配方见附录C.耐盐性试验培养

8、苹：（1）纸菌耐盐性试验培养基：在牛肉膏蛋白豚埒养液中分别加入2%、5%、7%,10%浓度的NaCh（2）放线菌耐盐性试验培养基：在高氏~号培养液中分别加入1%、5%、7%、10%、13%、15%浓度的NaC】。1.133®落形态鉴定用培养基A1：牛肉膏蛋白脖培