中国汉族人群rs13155212变异与冠心病关联分析

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分类号学号M201271546学校代码10487密级硕士学位论文中国汉族人群rs13155212变异与冠心病关联分析学位申请人：杨晓薇学科专业：遗传学指导教师：王擎教授答辩日期：2016年5月18日 AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofscienceAssociationAnalysisbetweenrs13155212andCADinaChinesePopulationCandidate：XiaoweiYangMajor：GeneticsSupervisor：Prof.QingWangHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei430074,P.R.ChinaMay,2016 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 华中科技大学硕士学位论文摘要进入21世纪后，人们的物质条件极为丰富，越来越多的“富贵病”开始成为影响人类健康的难题。心脏是人体十分重要的器官，是人体活动的发动机。冠状动脉是供给心脏动脉网络。当冠状动脉发生动脉粥样硬化，引起动脉血管血管腔狭窄或者完全阻塞，造成心肌整体或部分缺乏血液流通、缺乏氧气补给或者心肌细胞完全坏死的一类疾病称之为冠状动脉硬化性心脏病（CAD）。近十年来，科学家们将研究的主要方向瞄准了冠心病的遗传机制上。其中，与冠心病相关的全基因组关联分析（GWAS）取得了很大的进展，已经有数十篇文献发表，找到了几十个与冠心病相关的位点。目前已发现的CAD易感位点均是在美洲或欧洲人种中发现，为验证这些位点在中国人群中是否可以重复，也希望能发现在中国人群中新的易感位点，国内的很多研究机构开展了一系列的工作。本文旨在验证AGGF1基因上的rs13155212这一个SNP位点是否与冠心病存在显著关联，用病例-对照（3066/2422）的方法进行关联分析。最终发现，在中国人群中，rs13155212与冠心病关联不显著（P=0.365，OR=1.053），经过性别年龄矫正后依旧无显著关联（P=0.395，OR=1.054）。本次研究在较大样本量的中国人群中验证了AGGF1基因上的SNP—rs13155212与冠心病无关联，未来会选择其他SNP做关联分析。关键词：冠心病单核苷酸多态性rs13155212病例-对照关联分析AGGF1I 华中科技大学硕士学位论文AbstractInthe21thcentury,people'sphysicalconditionisveryrich,moreandmore"illnessofaffluence"becameahumanhealthproblem.Coronaryarterydisease(CAD)isagroupofdiseasesthatincludes:stableangina,unstableangina,myocardialinfarction,andsuddencoronarydeath.Itisamemberofcardiovasculardiseases.Fornearly10years,thescientistonCADhasbeenfocusedontothegeneticmechanisms.Genome-wideassociationstudies(GWAS)onCADhasmadeahugebreakthroughwithmorethan20articlespublished,andalotoflocisignificantlyassociatedwithCADhasbeenfound.CurrentlyCADsusceptibilitylocihavebeenfoundintheAmericasorEurope.InordertoverifywhetherthesesitescanberepeatedintheChinesepopulation,alsohopetofindanewsiteinChinesepopulation,manyresearchinstitutionshasdoneaseriesofwork.ThisarticleisintendedtoverifytheSNPrs13155212whichlocatedonthegeneAGGF1whetheritissignificantlyassociatedwithcoronaryarterydisease.Weconductedacase-controlassociationanalysisusing3066-2422samples.EventuallyfoundinChinesepopulation,rs13155212wasnosignificantassociationwithCAD（P=0.365，OR=1.053）.Aftertheadjustmentofcovariates,itstillhasnosignificantassociation（P=0.395，OR=1.054）.ThisstudyhasverifiedtheSNP--rs13155212whetheritissignificantlyassociatedwithCADusingalargersamplesizeinChinesepopulation.IthasnosignificantassociationwithCAD.SointhefuturestudieswillverifyanotherSNPinChinesepopulation.Keywords:Coronaryarterydisease(CAD)SingleNucleotidePolymorphism(SNP)AGGF1rs13155212Case-controlassociationstudyII 华中科技大学硕士学位论文目录摘要.......................................................................................................IAbstract...................................................................................................II1绪论1.1冠心病概述......................................................................................(1)1.2冠心病的症状和诊断.......................................................................(2)1.3冠心病危险因素...............................................................................(3)1.4冠心病的治疗.................................................................................(5)1.5基于SNP的基因分型技术...............................................................(7)1.6AGGF1基因.................................................................................(12)2研究内容2.1与冠心病相关的基因位点..............................................................(13)2.2研究方案........................................................................................(15)2.3实验材料........................................................................................(16)2.4实验方法.........................................................................................(19)3实验结果与讨论3.1研究群体临床信息统计..................................................................(31)3.2基因分型结果................................................................................(31)3.3关联分析结果................................................................................(35)3.4讨论...............................................................................................(37)致谢..............................................................................................(39)参考文献..............................................................................................(40)III 华中科技大学硕士学位论文附录主要缩略语...............................................................................(45)IV 华中科技大学硕士学位论文1绪论1.1冠心病概述当冠状动脉发生动脉粥样硬化，引起动脉血管血管腔狭窄或者完全阻塞，造成心肌整体或部分缺乏血液流通、缺乏氧气补给或者心肌细胞完全坏死的一类疾病称之为CAD。CAD是一种十分复杂的心血管疾病,它的危险因素有很多，大致分为遗[1,2]传因素和环境因素两类，这二者的相互作用也会引发冠心病。冠心病威胁着人类健康，加之冠心病治疗成本较高，每年因冠心病进入医院治疗的人高达百万，耗费[3,4]了大量医疗资源，是世界人民的“无声凶煞”。根据发病时的症状，我们将冠心病分为以下几个大类：稳定型心绞痛，不稳定型心绞痛，心肌梗塞，和心脏猝死。近20年来，我国总人口死亡率下降了20.05%，这一方面彰显着现代医学的进步，也说明了人们对于健康的重视。但是，在这样的大环境下，肿瘤和心脑血管疾病的患病率却呈逐年上升的态势。如下图所示：4539.124035302520百分比16.161512.071050195719892005图1-1心脑血管疾病死亡率占总死亡率百分比1 华中科技大学硕士学位论文因此，世界相关科研机构将关于冠心病的各项研究提上日程。从世界各地收集冠心病病例，找出与冠心病显著相关的基因位点，然后再在人群中验证。在这些工作中，收集冠心病病例，采集其个人信息是最基础、最繁杂的工作。那么，如何确定一个人患有冠心病呢？1.2冠心病的症状和诊断1.2.1冠心病的症状（1）典型胸痛病人因为体力活动或激动的情绪诱发，突然感到心前区疼痛，疼痛从胸骨后或心前区开始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和无名指。稍事休息或者含服硝酸甘油可以缓解。疼痛放射的部位也包含颈部、下颌、牙齿、腹部等。由于冠状动脉发生痉挛，在安静状态下或夜间也可能出现胸痛。（2）心肌梗死剧烈胸痛，持续时间超过半小时，含服硝酸甘油不能缓解，常常伴有恶心、呕吐、出汗、发热等症状，甚至会出现发绀、血压下降、休克、心衰。（3）非典型症状一些患者的症状不够典型，仅有心前区不适、心悸或乏力。也有部分患者没有疼痛症状，例如老年人和糖尿病患者。（4）猝死约有1/3的患者首次发作冠心病的症状为猝死。（5）其他除胸痛以外，冠心病还伴有全身症状，发热、出汗、惊恐、恶心、呕吐等均可出现。1.2.2冠心病的诊断冠脉造影术(CAG)作为CAD诊断的“金标准”，最初的起源充满了戏剧性。1959年，美国克利夫兰医学中心儿科医生索恩斯在给一个患者做心脏造影时,误将导管从肱动脉逆行送入主动脉根部,并注射约30ml的造影剂进入左、右冠状动脉，从而使冠状动脉出现清晰显影。这在当时被认为是十分危险的举动（会引起患者发生室颤），但预料中的室颤并没有发生，他立即认识到这样的技术非常有价值。他于1964[5,6]年成功的完成第一例真正的冠脉造影术。索恩斯采用的是经肱动脉切开的方式，1967年，Judkins采用穿刺股动脉的方式，改进了CAG技术并使其更加利于大范围的推广。现在除了股动脉入路，也能从上肢的桡动脉入路做这个检查，患者术后无2 华中科技大学硕士学位论文需卧床，减轻了不适。CAG主要作用是:（1）、将冠状动脉真实的、直观的展现出来，得出冠状动脉的直观图像，用以评估冠状动脉血管的走向和数量，以及判断冠状动脉是否出现畸形；（2）、评估冠状动脉血管壁是否光滑、有弹性，以及病变灶的狭窄、斑块情况；（3）、是否有狭窄性病变以及病变的程度、部位、长度、数量和特征（如是否有钙化、血栓、溃疡、动脉瘤、内膜夹层，病变是否成角及是否位于血管分叉处，是偏心还是同心性病变等。工欲善其事，必先利其器。只有通过冠脉造影术确定了病情，才能选择介入治疗的方式、时机、器械。介入治疗后成功率的判定也需要通过CAG检测。CAG是目前诊断CAD的最有效、最实惠的方法。1.3冠心病危险因素在现代社会，CAD已经是十分寻常的疾病，人们对CAD的了解也在逐步深入。[7]虽然它依旧威胁着人类的健康，但是对于诱发它的危险因素我们也在逐步阐明。CAD的危险因素很复杂，它不单单是由多种因素导致，这些因素也作用于不同的环节。已经有200多种冠心病危险因素被报道，主要分为以下两类：1.3.1传统危险因素（1）吸烟。在多项抽样调查中显示，烟民的冠心病的发病率和死亡率较不吸烟者增加了2～6倍，其增幅比例又与烟民平均吸烟量呈正比。主动吸烟与被动吸烟并无任何差别。CAD的患病风险与初始吸烟年龄也呈现相关性，初始吸烟年龄越[8]小，风险愈高。（2）血脂异常或者脂质代谢异常。高密度脂蛋白highdensitylipoprotein（HDL）[9]的降低以及载脂蛋白ApolipoproteinA的降低都是冠心病的危险因素。（3）年龄、性别。冠心病一般出现在40岁以上的中老年人。但是由于社会的进步，物质生活的极大丰富，其临床发病年龄越来越年轻化。一般情况下，冠心病在女性中发病率较低，但是这一优势在女性度过绝经期后将不复存在。年龄和性别都是没有办法改变的，只能在其他因素上加以预防。（4）高血压。血压的增高与冠心病密切相关，无论是收缩压还是舒张压的升高都与冠心病的发生具有相关性。3 华中科技大学硕士学位论文（5）糖尿病。糖尿病不仅能独立的引发冠心病，还能与其他因素一起引起冠[10]心病的发生。通常情况下，糖尿病患者患有冠心病的机率远远高于非患者，且在患病后病变速度非常快，愈合能力较差。糖尿病患者还有多种并发症，容易出现多种危险因素并存的情况。(6)遗传因素。CAD的发病有一定的遗传性，当你处在一个遗传性CAD家系，[11,12]你患上冠心病的机会将会大大增加。若家族具有CAD的易感基因，那么其患有冠心病的风险将会大大提升。1.3.2新危险因素（1）糖化血红蛋白（glycosylatedhemoglobin-A1c，GHbA1c）。葡萄糖或者其他糖类同血红蛋白的氨基发生非酶催化反应后生成糖化血红蛋白，它是反映血糖水平的标志，由于血红细胞的寿命有三个月，所以它可以检测三个月内患者的总血糖水[13]平。GHbA1c升高可以导致组织缺氧。组织缺氧后是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，大脑、心脏这些生命器官的缺氧会导致无法挽回的结果（2）脂联素。脂联素大量存在于人的血液循环中，它是一种蛋白质因子，由脂肪细胞分泌，具有生物活性。脂联素在冠心病的发生和发展中发挥保护作用，它与[14]冠心病的发生和发展呈负相关，低脂联素血症是冠心病的危险因素之一。脂联素可直接在内皮和血管平滑肌细胞发挥作用，在人体体内中，脂联素会抑制单核细胞[15]表达粘附分子，促使其远离内皮细胞，达到保护内皮细胞的功能。（3）炎性标志物。白细胞介素18是一种多功能的细胞因子，它主要由单核巨噬细胞分泌，可以和其他多种炎性细胞因子共同导致冠心病。首先，它会诱导干扰[16][17]素γ的产生；其次，它还会促进TNFα和iNOS的表达，最后，它还能诱导NF-κB的表达。有报道证实白细胞介素18通过干扰素γ的产生调节免疫球蛋白，免疫球蛋白可以加速动脉硬化的进程，在已经形成斑块的区域，免疫球蛋白也会在一[18]定程度下稳定斑块并使斑块更大。（4）牙周病。有研究表明，在CAD患者的硬化斑块中存在牙周病相关致病菌；[19]牙周状况较差更易患上CAD。更深入的研究显示，冠心病的发生可具体到细菌种类。Porphyromonasgingivalis数量较多时，更易患CAD。用此细菌定期刺激大鼠，会大4 华中科技大学硕士学位论文[20]大提升大鼠冠脉硬化速度。牙周病影响冠心病的机制可能是：牙周病患者会产生慢性炎症，使血管内皮发生变化，从而促使血栓形成；同时血浆中脂蛋白含量也会发生变化，二者共同作用促使动脉粥样硬化的危险增加。（5）睡眠呼吸暂停低通气综合征。睡眠呼吸暂停低通气综合征会引起低氧血症、高碳酸血症，它比GHbA1c作用更强一些，会直接造成冠脉内皮损伤，与CAD密切[21]相关。在CAD致病基因的研究中,通过候选基因关联分析发现一些CAD易感基因,如[22-25]PCSK9、ALOX5A、CFH、Connexin37等。但是候选基因关联分析策略仍具有很多缺陷,例如：容易出现假阳性结果,可重复性很低;并且在候选基因的选择上容易呈主观性等等。1.4冠心病的治疗冠心病的治疗按轻重程度依次分为：药物治疗，手术治疗两种。药物治疗主要是服用一些溶栓或者扩张血管的药物，比如：硝酸甘油、阿司匹林、他汀类降血脂药等，也有重要可以治疗，比如用红参、桂枝、川穹制成的参桂胶囊。手术治疗包含：冠状动脉搭桥术、支架术和心脏移植。5 华中科技大学硕士学位论文图1-2CAD的手术治疗方式（冠脉搭桥、支架、心脏移植）6 华中科技大学硕士学位论文1.5基于SNP的基因分型技术在一个特定的群体中，发生频率大于1%的，由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性称之为SNP。SNP可落入编码基因的序列、非编码基因的区域、基因间区域。由于遗传密码的简并性，落入编码序列内的SNP不一定改变所产生的氨基酸序列。在编码区的SNP有两种类型，同义和非同义SNP的。同义的SNP不影响蛋白质序列，非同义的SNP会改变蛋白质的氨基酸序列。SNP不在编码区一样会引起蛋白质功能的改变，通过影响基因剪接，与转录因子相结合，促使信使RNA降解等方式影响蛋白质的翻译过程。SNP包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。转换是指同型碱基之间的转换，颠换则发生在嘌呤与嘧啶之间。转换的发生频率大于其他几类，且以C/T转换为主。据报道SNPs存在明显的种族差异，非洲或非裔种族中SNPs数量最多，其他种族的SNPs要少得多，各个种族的结构和进化的研究可以通过比较亚群间等位基因的频率来实现。1.5.1基因芯片基因芯片又称DNA芯片或生物芯片，它的流程简单来说就是先将提前设计好的探针固定在支持物上，然后加入待检测的样品，探针与样本之间进行原位杂交，不同的样品序列会发出不同的荧光信号，通过机器检测荧光信号，我们就可以知道所测DNA样本上目的位点的序列。此项技术主要依赖于基因探针发挥作用，我们知道，基因探针其实是人工合成的一段碱基序列，它可以和待检测的目的序列互补配对，配对成功之后就可以发出相应的荧光，机器可以根据荧光的强度和种类输出目的序列是什么以及量的多少。基因芯片实现了高通量的序列分析。但是也有一些缺点，因为需要制备芯片，[26]成本过高，且有一定的假阳性，20%的SNP不能被证实。7 华中科技大学硕士学位论文图1-3GWAS分析流程图[27]GWAS实验设计时需要考虑以下几点:（1）样本群体的控制。病人的诊断标准要明确，确保每一个病人都是患者，不能滥竽充数，样本量要在可能达到的范围内越大越好，最好是参考其他文献中报道的OR值进行初步计算，实验完成后还需要对样本量进行验证，确定达到足够的统计学效应。（2）SNP分型准确。在使用一种分型方式分完之后，采用其他的分型方法进行验证，如果需要验证的量较小，建议采用最直观的一代测序方式进行实验。对于那些分型不准确的样本，坚决不能采用，会严重影响数据分析。8 华中科技大学硕士学位论文（3）统计分析的控制。选择最科学的统计方法，严格去除那些分型失败的数据、Hardy-Weinberg平衡检验、Logistic回归校正都必须进行，确保统计分析的正确性。也可将所有的数据交给另一个不相关的人进行验算，排除计算时的主观错误，但要注意数据的保密性。1.5.2Taqman探针法Taqman探针法和前面讲的基因芯片法一样，是基于分子杂交原理的SNP分型技术，是通过一种高度特异的荧光定量PCR实现的。简单说就是PCR扩增体系中除了一般的原料和引物外，还要加入特异性的荧光探针，叫做Taqman-MGB探针，这种探针其实是一段设计好的核苷酸序列：5‟端带有报告荧光基团（如VIC或FAM），3‟端则带有猝灭荧光基团（如NFQ），且此段序列可以和DNA模板上的目标序列碱基互补配对。PCR反应开始之前，探针的机构是完整的，基于荧光共振能量转移(FRET)反应的存在，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，这个时候是检测不到荧光信号的；PCR反应进行时，探针会与DNA模板结合，这时催化PCR反应的Taq酶由于自身存在5'-3'外切酶活性，会将探针降解打断，失去原有的完整结构，这样一来报告基团和猝灭基团得以分开，荧光报告基团就会释放出荧光信号，荧光信号可以被灵敏的检测系统记录下来，而不同序列的探针所带的荧光信号是不同的，以SNP为例，两个等位基因各自对应不同的荧光信号，因此可以根据荧光信号来判断模板上[28]特定位点的基因型，从而实现SNP分型的目的。Taqman探针法是一种常见的分子检测技术，可以用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等等。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种结合具有超强的稳定性，可提高探针错配的辨别力，也使探针长度缩减到13个碱基左右，探针长度的缩短为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ），它能完全消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，提高检测灵敏性。9 华中科技大学硕士学位论文图1-4Taqman探针分型法原理Taqman探针设计要点：（1）探针的5‟端避免出现G。（2）Tm值应为65-67℃。（3）TaqmanMGB探针可以尽量缩短，但不得低于13bp。（4）不得出现重复的碱基，特别是G，不得出现4个或4个以上的G。（5）将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方，这样在进行SNP检测时，TaqmanMGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号。注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3‟端移动，但突变位点至少在离3‟端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。。1.5.3高分辨率溶解曲线法高分辨熔解曲线分析(HighResolutionMeltanalysis,HRM)是通过高精度监测10 华中科技大学硕士学位论文DNA双链的解链（熔解）温度，来检测PCR产物中是否存在异源的双链产物，与Taqman探针法相类似的，此方法也是通过特殊的实时定量PCR来达到检测目标，但二者的原理又有较大的不同，高分辨率熔解曲线分析的原理是基于DNA双链中一个碱基的改变，可以对双链解链温度产生0.2-4度的改变，这种改变可以在二维坐标下的温度－熔解曲线中体现出来，同一种基因型的双链DNA的熔解曲线会归为一簇，我们可以根据熔解曲线的情况判断双链DNA的基因型，这一段DNA一般要求只包含一个SNP位点，SNP位点处存在三种基因型，从而呈现三簇不同的熔解曲线。如图1-2、1-3所示。图1-5溶解曲线图1-6三种基因型的差异显示图1.5.4BeckmanSNPgenomestream技术BeckmanGenomeLabSNPstream基因分型系统是一套自动化的多重SNP分析11 华中科技大学硕士学位论文系统，在特制384孔板的每个微孔中可分析12个或48个SNP位点。它可以用于各种样本的检测，动物、植物、细菌都可以检测，它每天可以处理4,600-3,000,000个基因型，准确率高达99%，仅仅0.4ng的DNA就可以出结果，适合微量检测。1.6AGGF1基因2004年Tian等在KTS患者研究中发现了一个新的血管生成相关的基因-AGGF1（VG5Q）。AGGF1定位于5号染色体，该基因全长34kb，有14个外显子，编码714个氨基酸，表达一个81kD的蛋白质。根据该蛋白质结构域特点将VG5Q重新命名为AGGF1（AngiogenicFactorwith[29]G-patchandFHAdomains1）。AGGF1C端的FHA(Forkhead-associated)和[30,31]G-patched这两个序列十分保守，他们对于蛋白质功能具有重要的作用。图1-7AGGF1的结构域Tian将纯化的人重组AGGF1蛋白注射到鸡胚中，观测到鸡胚的血管数量明显增加。与常见的血管生成因子VEGF对比，AGGF1促血管生成效果更好。因此AGGF1具有强烈的促血管新生功能。12 华中科技大学硕士学位论文2研究内容2.1与冠心病相关的基因位点目前冠心病已成为威胁人类健康的一大杀手，是困扰医学界的一大难题，对此，分布在世界各地的医疗机构和研究中心进行了各种尝试，开展了许多研究项目，力求能在冠心病的治疗方面提供有利的帮助。近十年来，对冠心病的研究已深入到分子层面，主要集中在遗传机制的研究上，其中冠心病相关的全基因组关联分析(GWAS)取得了突破性进展，已有十几篇文章发表，从中找到了几十个与冠心病显著相关的[32-46]位点，见图2-1、表2-1。图2-1与CAD显著相关的基因位点（截止2011年）13 华中科技大学硕士学位论文表2-12011之后发现的与冠心病显著相关的位点基因PositionSNPVEGFAchr6:43736496rs1005230ACEchr17:61562309rs4316CST3chr20:23619617rs3827143AGTR1chr3:148415545rs275653THBS4chr5:79329538rs17878919F7chr13:113759754rs510317P2RY12chr3:151102452rs1491974CYP2C19chr10:96523083rs12773342ITGA2chr5:52284386rs26680FGBchr4:155483170rs2227389APOEchr19:45407788rs7259620MLXIPLchr7:73039406rs35493868APOA5chr11:116664040rs10750097APOA5chr11:116663707rs662799SCARB1chr12:125348988rs59358115PON3chr7:95026327rs11770903LEPRchr1:65990422rs6656451ADIPOQchr3：186559474rs266729ANGPTL4chr19：8428999rs4076317PPAP2Bchr1：57046175rs72664392CETPchr16：56994894rs4783961ADIPOR1chr1：202929541rs7523903PCSK9chr1：55504650rs2479409PRKAG1chr12：49412709rs2293446LEPchr7：127879944rs13228377PON2chr7：95065850rs12704796VLDLRchr9：2621482rs7852409ANGPTL3chr1：63061906rs11207997SELPchr1：169598995rs3917655CRPchr1：159685136rs3093059IL1Bchr2：113594867rs16944SELLchr1：169681357rs2205849IL1R2chr2：102615279rs207100814 华中科技大学硕士学位论文CARD8chr19：48760229rs7248320TGFB1chr19：41861674rs2317130TLR2chr4：154603605rs7682814CXCL12chr10：44882105rs11239027IL12RB2chr1：67773351rs12142823SAA1chr11：18287750rs1829575PLA2G7chr6：46703319rs9395208FAM5Cchr1：190446806rs12732361CD40chr20：44746403rs1800686CD36chr7：80230807rs2065666由于中国科技的滞后性，目前与CAD显著相关的基因位点大多是国外研究人员利用欧洲、美洲白人群种族发现。中国是世界人口大国，中国人口高达13.74亿，人口基数大，更容易组建大样本量的群体，因而在GWAS研究上具有很大的优势。2011年3月，由我中心的研究团队发表了第一篇中国汉族人群冠心病GWAS文章，打破了冠心病在中国汉族人群中GWAS相对滞后的局面。由于AGGF1与VEGF功能相似，均为血管生成因子，VEGF与冠心病显著相关。因此我们提出一个假设，AGGF1也与冠心病相关。AGGF1上有多个SNP位点，鉴[47]于目前冠心病GWAS研究状况以及我们研究团队所取得的成就，我们选择了rs13155212，本论文的研究目的是为了确认SNPrs13155212与CAD在中国汉族人群中的关联性,对冠心病的病理机制解析以及临床指导具有重要的意义。2.2研究方案选取1个SNP位点，即rs13155212，在中国群体中确认它是否与冠心病显著相关。我们运用病例-对照的遗传学分析方法，冠心病群体来自于中国人群，3066例冠心病患者对2422例正常人，取他们的DNA样本后使用美国AB公司ABIPrism®9700HT型荧光定量PCR仪支持的Taqman探针分型技术，分型结束后进行遗传分析。详细实验流程见图2-1。15 华中科技大学硕士学位论文临床诊断冠心病病人(case）无冠心病正常人(control）抽取3-5mL外周血提取基因组DNATaqman探针法基因分型测序&HRM验证分型结果汇总病历资料遗传学统计分析图2-2实验流程图2.3实验材料2.3.1冠心病研究群体的收集本次研究所用的样本均来自华中科技大学生科院人类基因组研究中心建立的GeneID遗传样本库。GeneID库现已收集超过10万份DNA样本，样本来源于武汉、北京、大连、山东等各地三甲医院，且仍在不断扩充中，致力于在中国汉族人群中发现与心脑管疾病相关的致病基因。本课题获得了华中科技大学生科院伦理委员会以及样本来源医院伦理委员会的批准，样本提供者均签署了知情同意书，符合赫尔辛基宣言的原则、人道主义原则。16 华中科技大学硕士学位论文本课题共收集冠心病患者3066例，正常对照2422例，冠心病患者的挑选标准遵循绪论中提到的冠心病诊断标准；所有的正常对照采用经诊断证明无冠心病症状的个体。全部个体均由静脉抽取外周血，从中提取人的全基因组DNA。所有参与本研究的个体都有完整的病历资料，资料中包含姓名、年龄、性别、身高、体重、血压，是否冠心病，是否心肌梗塞，是否糖尿病，是否脑卒中，是否高血脂等。2.3.2实验试剂及耗材TaqMan®SNPGenotypingAssays（ABappliedbiosystemsTM,USA）；PremixExTaqTM(ProbeqPCR)(Takara，中国)；BloodGenMiniKit血液基因组柱式中量提取试剂盒(CWBIO康为世纪，中国）；IllustraGenomiPhiV2DNAAmplificationKit(GEHealthcare,USA)；10xTaqPCRReactionBuffer（Takara，中国）；dNTP（Takara，中国）；TaqDNAPolymerase（Takara，中国）；DNAMarkerDM2000（CWBIO康为世纪，中国）；10xLoadingBuffer（CWBIO康为世纪，中国）；氯化钠（上海国药，中国）；Tris（上海国药，中国）；SDS（上海国药，中国）；乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA•2H2O)（上海国药，中国）；盐酸（上海国药，中国）；醋酸（上海国药，中国）；醋酸钾（上海国药，中国）；无水乙醇（上海国药，中国）；异丙醇（上海国药，中国）；琼脂糖（上海国药，中国）；溴化乙锭(EB)（上海国药，中国）；HRM引物（武汉擎科新业生物技术有限公司，中国）；17 华中科技大学硕士学位论文蛋白酶K（美国Promega公司，USA）；测序引物（武汉擎科新业生物技术有限公司，中国）；96孔板（PerkinElmer公司，USA）；384孔板（Bio-rad公司，USA）；0.2毫升PCR管（Robbins公司，USA）；1.5毫升eppendorf管（eppendorf公司，德国）；灭菌橡胶检查手套（桂林乳胶厂，中国）。2.3.3实验仪器NanoDrop2000c超微量紫外-可见分光光度计(ThermoScientific,USA)；IMS-50制冰机（常熟雪科）；JY3002电子天平（上海精密科学仪器有限公司，中国）；ZF1-Ⅱ紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司，中国）；DYY-6B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂，中国）；电泳槽（北京六一仪器厂，中国）；鼓风干燥箱（广州鹏鑫科学仪器有限公司，中国）；Anke低速冷冻多管离心机（上海安亭科学仪器厂，中国）；移液器(20μL,200μL,1000μL）（Eppendorf，德国）；pH计(METTLERTOLEDO，中国）；85－2恒温磁力搅拌器（常州国化电器有限公司，中国）；IKAVORTEGenius3圆周振荡器（IKA，德国）；-20°低温冰柜、低温保存箱、-80°超低温保存箱（海尔集团，中国）；微波炉（美的公司，中国）；PURELABClassic超纯水仪(ELGA，英国）；D-37520小型高速离心机(Thermo，德国）TMABI9700PCR扩增仪(ABappliedbiosystems,USA)；Takara－TP600梯度PCR仪(Takara，日本）；18 华中科技大学硕士学位论文2.3.4实验软件引物设计：GeneTool1.0(Biotools,USA）；测序结果分析：SeqA5.1.1(ABappliedbiosystemsTM,USA)；TMTaqMan分型结果分析：QuantStudio™12KFlex(ABappliedbiosystems,USA)；遗传统计分析：Plinkv1.05(Broadinstitute,USA)；SPSS21.0(SASInstitute,USA)；2.3.5相关网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://asia.ensembl.org/index.htmlhttp://genome.ucsc.edu/2.4实验方法2.4.1血液全基因组DNA的提取2.4.1.1血液基因组柱式提取—试剂盒法由于各地医院提供的样本质量不一，对于新鲜血液，本课题采用北京康为世纪生物科技有限公司生产的BloodGenMiniKit血液基因组柱式中量提取试剂盒（1-5mL）进行全基因组DNA提取，产品目录号CW0541S，具体组分见下表。表2-2康为世纪血液基因组提取试剂盒组分ComponentCW0541S50prepsBufferRCL3×260mlBufferGR25mlBufferGL25mlBufferGW1（concentrate）13mlBufferGW2（concentrate）15mlBufferGE15mlProteinaseK50mgProteinaseKStorageBuffer5mlSpinColumnsDL50CollectionTubes5019 华中科技大学硕士学位论文具体提取步骤如下：（1）实验前准备及重要注意事项①向ProteinaseK中加入5mlProteinaseKStorageBuffer使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K不要长时间放置在室温下，同时也要避免反复冻融，使其活性降低或消失。②血液样品不要反复冻融，反复冻融会使提取的DNA片段较小，而且会严重影响提取量。③最大样品提积：1-5ml。④在BufferGW1和BufferGW2中加入适量无水乙醇。⑤使用前检查BufferGL，如有结晶或者沉淀，56℃水浴重新溶解。图2-3血液基因组提取流程（样本预处理、吸附柱提取）20 华中科技大学硕士学位论文洗脱完成的DNA溶液用NanoDrop2000c超微量紫外-可见分光光度计测定DNA浓度，并将其稀释为30ng/ul的工作液备用。2.4.1.2SDS碱裂解法提取血液基因组DNA本实验的部分DNA由于血量较多、血液质量不高、成本限制等采原因用SDS碱裂解法提取血液基因组DNA。此法需要配制红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白质沉淀液（ProteinPrecipitationSolution，PPS）、TE缓冲液等。具体配制方法如下：①红细胞裂解液，即为20mM的Tris-HCl溶液，以配制1L为例。用天平称取Trisbase2.422g溶于80mL的蒸馏水中，使用pH计，缓慢滴加浓盐酸，直至pH等于7.6，加蒸馏水定容至1L。②白细胞裂解液配制所需的组分及其工作液浓度如下，以1L为例。表2-3白细胞裂解液成分母液名称工作液浓度加入量mL10%SDS0.50%505MNaCl0.1M200.5MEDTA(pH=8.0)1mM21MTris-HCl0.05mM50配制时先加入大约600mL蒸馏水，然后按照NaCl→EDTA→Tris-HCl→SDS的顺序加入，最后定容至1L。[1]10%SDS（配制量100mL）：天平称取SDS10g置于烧杯中，加入80mL蒸馏水，68℃下加热溶解，借助磁力搅拌器，完全溶解后加浓盐酸调pH至7.2，添加蒸馏水定容至100mL，室温保存。[2]5MNaCl（配制量1L）：天平称取NaCl292.2g置于烧杯中，加入800mL蒸馏水后置于磁力搅拌器上完全溶解，加蒸馏水定容至1L，灭菌后室温保存。[3]0.5MEDTA（配制量1L）：天平称Na2EDTA·2H2O186.1g放置在烧杯中，加800mL蒸馏水，边搅拌边加入NaOH，调pH至8.0，EDTA会完全溶解，用蒸馏水定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。[4]1MTris-HCl（配制量1L）：天平称取Trisbase121.1g置于烧杯中，加800mL21 华中科技大学硕士学位论文蒸馏水，搅拌至充分溶解后将溶液冷却至室温，滴加浓盐酸调节pH至7.6，定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。③PPS(ProteinPrecipitationSolution)（配制量100mL）：蛋白沉淀液，即醋酸钾缓冲液，用以除去血液中的蛋白，提纯DNA。称取醋酸钾29.4g置于烧杯中，加入11.5mL醋酸，加入蒸馏水60mL，完全溶解后定容至100mL。④BufferTE（配制量1L）：用以溶解DNA的缓冲液。将1M的Tris-HCl母液(pH=8.0)1mL、0.5MEDTA母液(pH=8.0)200μL加入到600mL的蒸馏水中，搅拌均匀，定容至1L，灭菌后4℃保存。碱裂解法提取人血DNA具体操作步骤如下：①编号，将GeneID号直接写在采血管上。②弃上层血清，向采血管中加入2倍血液体积的红细胞裂解液，在圆周振荡器上剧烈震荡5min，静置10min，3600rpm离心10min，弃上清，将采血管倒扣在干净的滤纸上静置1min；重复此步骤一次，直至沉淀完全变白。③加入2mL白细胞裂解液，用移液器反复吹打直至沉淀散开，置于56℃恒温干燥箱中孵育大约30min，再置于振荡器上剧烈震荡直至沉淀完全溶解，继续孵育30min以上，直到溶液变得澄清透明。④将上面得到的溶液置于4℃冰箱预冷10min，向内加入667μL的PPS，混匀后4℃离心，3600rpm,30min。离心后若发现还有一些蛋白沉淀漂浮在上清中，可再次离心。⑤加入2.5mL异丙醇，上下颠倒多次，直至看到絮状的DNA沉淀。⑥3600rpm离心15min，弃上清，将离心管倒扣在滤纸至沉淀干燥。⑦加入500μL现配70%的乙醇，用移液器反复吹打至沉淀散开，将此溶液转入相应编号的新1.5mLEP管中，5000rpm，离心5min，弃上清。倒扣在滤纸上至沉淀干燥。⑧用150BufferTE溶解DNA，用NanoDrop2000c超微量紫外-可见分光度计测定DNA浓度，将其稀释成30ng/μL的工作液备用。22 华中科技大学硕士学位论文2.4.2血液基因组DNA的放大由于GENEID样本库中的DNA样本收集过程会耗费大量的物力财力，且实验过程会多次使用，为保证我们GENEID样本库的可持续发展，我们在使用之前会对部分稀少的DNA样本进行全基因组水平上的扩增，实现了DNA样本的由少变多。本文使用美国GEHealthcare公司提供的IllustraGenomiPhiV2DNAAmplificationKit(25-6600-32)进行全基因组放大，此试剂盒的主要成分见表。表2-4IllustraGenomiPhiV2DNAAmplification成分表组分名称总量SampleBuffer（绿盖）4.5mLReactionBuffer（蓝盖）4.5mLEnzymeMix（黄盖）500uLControlDNA（10ng/uL）20uLDNA放大步骤如下：①变性：将9μLSampleBuffer与1μL基因组DNA(≥10ng)混匀后，置于PCR扩增仪上，95℃变性3min后，冰上放置5-10min，直到混合物温度降为4℃。②放大：在上述混合物中加入9μLReactionBuffer，再加入1μLEnzymeMix，混匀。在PCR仪30℃孵育3小时，之后65℃10min使酶灭活，此时会得到4-7μg基因组DNA。③稀释：本反应总体系为20μL，放大完成后，加入180μL灭菌水，将其稀释10倍成为DNA工作液，终体积为200μL。流程如图所示。23 华中科技大学硕士学位论文图2-4血液基因组DNA放大流程图2.4.3Taqman探针法基因分型本课题采用病例－对照的研究思路，对冠心病期群体中(3066case-2422control)的全部个体进行特定位点SNP分型，分型使用TaqMan探针法。本文中PCR反应体系TM中所使用的buffer来自于中国Takara公司提供的PremixExTaq(ProbeqPCR)，Taq-Man探针(40xProbe)由美国ABappliedbiosystems公司设计合成的TaqMan®SNPGenotypingAssays，PCR反应和荧光检测都在ABI9700PCR扩增仪上完成。TMTakara公司的PremixExTaq(ProbeqPCR)是用于TaqMan®探针法进行Real-TimePCR（qPCR）反应的专用试剂，可用于快速PCR。PremixExTaq中添加了TliRNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。制品中使用了添加了抗体的HotStartPCR酶TaKaRaExTaqHS，与Takara精心研制的Real-TimePCRBuffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，能够进行高灵敏度的Real-TimePCR扩增反应。试剂盒组分见下表。24 华中科技大学硕士学位论文TM表2-5PremixExTaq(ProbeqPCR)试剂盒组分表试剂总量PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×Conc.）1.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）200μl×1支上述试剂盒中包含了PCR反应所需的DNA聚合酶、dNTP、Buffer，美国AB®appliedbiosystems公司设计合成的TaqManSNPGenotypingAssays试剂盒中包含了我们所需的荧光探针和引物，所以只需再加入DNA模板、荧光探针、灭菌水即可配制成为完整的PCR体系。本课题中针对位点rs13155212设计的探针和引物信息如表所示。表2-6TaqmanSNP分型试剂盒组分信息报报猝浓告告灭名称序列度基基基团团团VICFAMNFQrs1315521TTTCCTTGGCAGATGAAGACAAAAT[C/T]TGGCCCCC40x2ATGTATTAGAGTAATTG按照表2-8配制PCR反应体系，在PCR仪上进行扩增，PCR反应程序如下图2-4。表2-7PCR反应体系试剂体积（uL）TMPremixExTaq2.5ROXReference0.1DyeII40xProbe0.125ddH2O0.775DNA1.5总体积525 华中科技大学硕士学位论文图2-5PCR反应程序PCR反应完成后就可得到如下图所示的结果，坐标图中的一个点就代表一个样本，从图上我们可以看出样本分成了清晰的三群，分别代表了三种不同的基因型。图中横坐标(AlleleX)代表荧光VIC的值，纵坐标(AlleleY)代表荧光FAM的值，根据Taq-Man探针发荧光的原理，我们知道发出VIC荧光的红色群体就是等位基因之一的纯合基因型个体(CC)，同理只发出FAM荧光的蓝色群体是另一种等位基因的纯合基因型个体(TT)，两种荧光值兼而有之的绿色群体即为两种等位基因的杂合子(CT)，这样就成功的实现了基因分型的目的。图中的结果可以用ExcelL图表导出，方便后期计算。2.4.4一代测序验证分型结果本文使用Taq-Man探针法进行基因分型，方便快捷，但由于此技术出现时间较短，技术尚未完全成熟，仍有一定的局限性。为了避免分型结果的误读误判，我们从图中清晰可见的三种基因型群体中各自挑选10-20样本进行一代测序（即Sanger测序）验证。另外Taq-Man探针法中未识别出的样本，即图中的“X”，以及一些分群不是很明显的点，我们都将进行验证。具体方法参见以下步骤：（1）设计测序引物引物是一小段单链DNA或RNA，它是DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点。在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH必须是游离的。引物本质上是两段单链的核苷酸序列，一段能够与我们目标序列的5‟端互补配对，称为正向引物；另一段可以与目标序列的26 华中科技大学硕士学位论文3‟端互补配对，称为反向引物。设计测序引物首先要得到SNP位点前后的碱基序列，进入NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，点击网页右侧的SNP选项，然后输入SNP的rs号，查找，即可找到此位点附近的序列。使用软件GeneTool1.0进行引物设计，把目标序列复制入其中，按照指令操作，选择其中得分较高的引物。利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中的电子PCR和Blat选项对引物的扩增能力和特异性进行检测，若电子PCR能够显示出最终产物，Blat只显示单一匹配结果，则证明此引物符合要求。设计测序引物的注意事项如下：①长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38。②G十C含量：应在40%一60%之间，G十C含量大会使复性温度过高。③碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其在其3‟端不能出现连续的相同碱基。④引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹结构。无法与目的片段结合，从而无法扩增出DNA.⑤引物之间：两个引物之间不能有多于4个的互补或同源碱基，会形成引物二聚体。⑥下游引物的互补性：一个引物的3„末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。⑦3‟末端：尽量让每个引物的3„末端碱基为G或C。⑧引物应当在限制性内切酶识别位点前加入4个保护碱基。基于上述原则，对rs13155212设计的引物如下表2-9所示表2-8引物序列引物名称引物序列产物大小(bp)rs13155212-Factcacttctttccttggcag125rs13155212-Rtgtagcagggtttacagcagt（2）PCR反应条件的确定在扩增样本DNA之前，需要优化PCR反应条件，确定出最适宜的退火温度。27 华中科技大学硕士学位论文本课题温度梯度的范围设定在44-68℃，在TakaraPCR扩增仪进行DNA的扩增，此PCR仪从左至右温度逐渐升高，呈现温度梯度，每一孔的温度见下表。PCR反应体系参照表，PCR反应程序参照图。表2-9梯度PCR反应的温度梯度孔号123456789101112温度4445.246.448.851.654.557.460.363.265.666.868表2-10普通PCR反应体系试剂体积（uL）10xPCRReactionbuffer2.5dNTP（10mM）0.5TaqDNAPolymerase（5U/uL）0.5ForwardPrimer0.5ReversePrimer0.5混合DNA1.5Syto90.7ddH2O18.3总体积2540循环94℃94℃5min15sec72℃72℃44-68℃15sec10min15℃15sec保持图2-6普通PCR反应程序28 华中科技大学硕士学位论文PCR反应结束后，将不同温度条件下扩增出的产物进行HRM检测，观察溶解曲线，选择那些荧光值高且不同基因型曲线分得较开的PCR产物，扩增出这种产物的退火温度是最适宜的。选择编号为19这一孔的温度，即第7孔的57.4℃为最佳退火温度。如下图2-6所示。图2-7HRM检测温度梯度29 华中科技大学硕士学位论文（3）普通PCR扩增DNA样本并测序按照优化好的PCR条件扩增需要测序验证的DNA样本，选择扩增良好的样本送往武汉擎科生物有限公司进行测序。测序完成后，测序结果用SeqA5.1.1软件分析。将测序得出的基因型与TaqMan探针法得出的基因型结合汇总，整理出最终的结果，进入统计分析阶段。2.4.5遗传学统计对于本课题研究的SNP位点，采用Plink与SPSS两个软件共同进行统计分析。对照组的群体要用遗传学软件Plinkv1.05进行哈迪-温伯格平衡检验（Hardy-Weinbergdisequilibriumtest）。关联分析用统计分析软件SPSS21.0来完成，冠心病与等位基因的关联用Pearson2×2列联表分析，冠心病与基因型的关联用Pearson2×2列联表、Pearson2×3列联表分析。显著程度（P值）、相对优势比（Oddsratio，OR值）以及95%的置信区间（ConfidenceInterval，CI）都由卡方检验得来。多因素的线性回归分析可以将性别、年龄等多重因素纳入其中，对关联分析的结果进行矫正，得到矫正P值。30 华中科技大学硕士学位论文3实验结果与讨论3.1研究群体临床信息统计本课题对rs13155212这个SNP位点进行了“病例-对照”的关联分析，采用了实验室提供的冠心病样本，样本量为5488，包含2422例非冠心病正常人样本和3066例冠心病患者样本。冠心病患者的确诊年龄为66±12，正常对照的年龄为57±12；冠心病患者中男性患者占64.2%，女性患者占35.8%，正常对照样本中男性占56.8%，男性患者占43.2%；另外，在冠心病患者中，有534名患有心肌梗塞，占22%，有496名患有脑卒中，占16.2%，有311名患有高血脂，占10.1%，有572名患有二型糖尿病，占18.7%。在正常对照群体中也有少数患有高血脂和二型糖尿病，具体数值见表3-1。表3-1冠心病群体的临床特征临床特征病例对照样本数量30662422年龄66±1257±12性别（男/女）1968/10651376/996心肌梗塞（%）534（22%）0二型糖尿病（%）572（18.7%）103（4.3%）脑卒中（%）496（16.2%）35（1.4%）高血脂（%）311（10.1%）72（3%）3.2基因分型结果基因分型采用Taqman探针法和测序法相结合，具体结果见下图3-1图中一板可以检测384个样本，荧光探针的信息如前面所述，rs13155212（C/T）的体系中所添加的荧光探针，荧光报告基团VIC（X轴）报告等位基因C，荧光报告基团FAM（Y轴）报告等位基因T，图3-1即为rs6842486荧光检测的结果图，如前实验方法部分31 华中科技大学硕士学位论文所述，我们可以知道，只发VIC荧光的红色群体基因型为CC，同理只发FAM荧光的蓝色群体基因型为TT，两种荧光都有的绿色群体基因型为CT。图3-1Taqman分型结果32 华中科技大学硕士学位论文实验过程中由于DNA样本质量有好有坏，出现了某一些样本无法进行分型，如图3-2所示，同时为了避免TaqMan分型结果的误读误判，我们从中挑选了一部分进行一代测序验证。另外TaqMan探针法中未识别出的样本，即图3-2中的“X”，以及一些分群不是很明显的点，我们也用一代测序的方式进行验证。图3-3所展示的A、B、C三幅图是三种不同基因型的测序结果图，使用的反向引物进行测序，图中红色圆圈选定的即为rs13155212位点，从图中可以看出，A、B、C依次为基因型CC、CT、TT。图3-2Taqman分型结果（二）33 华中科技大学硕士学位论文AB34 华中科技大学硕士学位论文C图3-3rs13155212的测序结果（A）目标位点基因型为CC；（B）目标基因型为CT；（C）目标基因型为TT。基因分型结束后，将一代测序的结果与Taqman探针分型结果整合，再与每一个样本的临床资料一一对应，用以进行关联分析。3.3关联分析结果本课题对3066个高血压病例以及2242个正常对照在SNPrs13155212完成了基因分型，整合了病例资料后，我们运用遗传学软件Plinkv1.05对研究群体进行哈迪-温伯格平衡检验。若对照群体的P值大于0.01，则认为群体符合自由婚配规律，符合关联分析的要求。对照群体P值为0.018，故此群体符合要求。具体数值见表3-3-1。表3-3-1rs13155212研究群体的哈迪-温伯格检验基因型分类特征HWE-PCCCTTT病例6563120830.044对照6254217220.018运用Pearson2×2列联表，经卡方检验计算，发现rs13155212与中国人群冠心病35 华中科技大学硕士学位论文并无显著关联（P=0.365），考虑性别年龄因素做回归分析后，依然无显著关联（矫正P值=0.395）；按照性别分类后，做相同计算，发现无论男性群体还是女性群体，均无显著关联，关联分析结果如表3-3-2。表3-3-2rs13155212与冠心病的等位基因关联分析观测值矫正值群体数量小等位基因频率（case/control）（case/control）PobsOR(95%CI)PadjOR(95%CI)全部群体0.137/0.1430.3651.053（0.941-1.178）0.3951.054（0.934-1.188）（2779/2326）男性群体0.138/0.1270.2541.087（0.940-1.257）0.2790.920（0.792-1.070）（1968/1376）女性群体0.140/0.1290.8751.015（0.847-1.215）0.8830.985（0.801-1.120）（1065/996）对该群体的实验结果运用Pearson2×2列联表,发现在显性、加性、隐性三种遗传模式下，rs13155212与中国人群冠心病的发生不存在关联性，经性别、年龄等因素矫正分析后，结果依然如此，如表3-3-3。表3-3-3rs13155212与冠心病的基因关联分析观测值矫正值群体数量病例（n）对照（n）（case/control）PobsOR(95%CI)PadjOR(95%CI)加性模式1722/542/622083/631/650.6431.051（0.942-1.173）0.3881.053（0.936-1.185）TT/TC/CC显性模式2264/622714/650.4561.143（0.804-1.626）0.2691.234（0.849-1.794）（TT,CT）/CC隐性模式1722/6042083/6960.4511.050（0.925-1.191）0.5511.042（0.910-1.194）TT/(CT,CC)为避免计算错误，再次将所有数据按性别分为两类，分别计算男性群体和女性36 华中科技大学硕士学位论文群体在加性、显性、隐性三种模式下的关联性，结果依旧不存在关联，具体数值见下表3-3-4、3-3-5。表3-3-4rs13155212与冠心病的基因关联分析（男性群体）观测值矫正值群体数量病例（n）对照（n）（case/control）PobsOR(95%CI)PadjOR(95%CI)加性模式1349/409/35974/313/330.2641.085（0.940-1.253）0.2851.085（0.935-1.258）TT/TC/CC显性模式1758/351287/330.3031.288（0.796-2.083）0.1641.425（0.865-2.346）（TT,CT）/CC隐性模式1349/444974/3460.3591.079（0.917-1.270）0.4561.066（0.901-1.262）TT/(CT,CC)表3-3-5rs13155212与冠心病的基因关联分析（女性群体）观测值矫正值群体数量病例（n）对照（n）（case/control）PobsOR(95%CI)PadjOR(95%CI)加性模式710/215/30707/221/290.8801.013（0.852-1.205）0.8881.014（0.833-1.235）TT/TC/CC显性模式925/30928/290.8880.964（0.574-1.618）0.9401.022（0.574-1.821）（TT,CT）/CC隐性模式710/245707/2500.8151.025（0.835-1.191）0.8911.017（0.804-1.286）TT/(CT,CC)3.4讨论本课题利用中国人冠心病群体，进行大规模的病例-对照分析，对rs13155212进行基因分型，并做遗传学分析，最终发现，AGGF1与冠心病的显著关联没有出现。经过分析可能有以下几个方面的原因：37 华中科技大学硕士学位论文①AGGF1基因的rs13155212位于6号外显子,其核苷酸改变后所编码的氨基酸不变,仍为异亮氨酸,可能未影响AGGF1结构和功能的改变。②种族人群差异,影响冠心病发病的遗传因素有明显的种族差异性,不同种族的人群由于地理位置上的长期隔离，受环境因素以及生活方式等多种因素的影响，造成了遗传背景、基因修饰的不同，产生了遗传异质性。遗传异质性的产生，又可能引发遗传方式、患病风险以及病情发展状况的不同。本研究中所有CAD患者均为中国汉族人群,可能与其他人群存在差异。③本实验样本量相对偏小,可能因此对结果产生偏倚,增大样本量可能会更好的反映rs13155212多态性与中国人群冠心病发生的相关性。由于中国幅员辽阔，人口分布较分散，而本课题中的群体只包含5000多人，且大多来自于武汉地区，故而不能全面的代表整个中国人群。④SNP的差异：本课题是验证已发表文献中相同的基因，但是基因区域内有很多SNP，本课题选用的SNP与文献中的没能保持一致，才导致结果的变化。因此，后续的工作可以围绕扩大样本量展开。扩大样本量，扩大样本的地域范围，在更多、更广泛、更有代表性的中国人群中做进一步的验证。也可利用实验室特有的基因库资源，开展更多SNP与冠心病的关联分析。38 华中科技大学硕士学位论文致谢随着论文的逐渐成形，等待了许久的一天终于到来。几年的研究生生活是一个漫长的旅程，从踏上征途时的信心满怀，到中期的乏味厌烦，再到最后的圆满结束。我成长了许多，获得了许多。我笑过，哭过，生气过，无奈过，最后还是划下了幸福的句号。一句话，感谢在这几年帮助过我所有人，没有你们的帮忙，我的课题不会如此顺利的完成，我会永远铭记。首当其冲要感谢的，便是生我养我的父母。他们刚开始并不同意我念研究生，但是考上之后的这几年，没有父母的支持，我是断然没有机会顺利完成学业的。你们为子女的未来四处奔波，吃尽了苦头，我已经长大了，马上就可以出去工作了，以后就换我来孝顺你们，你们辛苦了。其次，我要感谢我的导师王擎教授，是他给了我学习的机会。师者，传道授业解惑矣，他不仅是一位良师，更是一位温和的长者，指导研究的方向同时还能处处为学生排忧解难。当然，我还要感谢谭成城，她全程参与了我论文的所有工作，从最初的查阅文献到最后的数据分析，在我需要帮助的时候毫不犹豫的伸出援手，在我迷茫的时候指引我走上正轨。我要感谢姚雨峰师兄、吕秋仑师兄，他们在我刚进入实验室时，带领我走上科研的道路，教会了我很多实验技能和人生道理。我有过埋怨但是绝不后悔。感谢胡振坤，因为我的缘故，你没少被我拖累，耽误了你很多事，对不起。还要感谢周颖超、陈晶、刘俊男、吴曼曼、熊洪波、周梦晨、刘忆南，一个年级的小伙伴们，感谢你们，我们是一个集体，我们一起共同度过了这几年，你们对我的好我不会忘记。最后，我要感谢人类基因组研究中心的所有老师和同学，我们在一起的记忆我会永远珍藏。时光一去不复回，愿我终有一天长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。青春不悔，生命无憾。39 华中科技大学硕士学位论文参考文献[1]MarenbergME,RischN,BerkmanLF,etal.Geneticsusceptibilitytodeathfromcoronaryheartdiseaseinastudyoftwins[J],NEnglJMed,1994,330(15);1041-6.[2]AWayeeH,Gbazalpour,LusisAJ.Usingmicetodissectgeneticfactorsinatherosclerosis[J].ArteriosclerThrombVaseBiol,2003,23(9);1501-9.[3]LopezAD,MathersCD,EzzatiM,etal.Globalandregionalburdenofdiseaseandriskfactors,2001;systematicanalysisofpopulationhealthdata[J].Lancet;2006,367(9524):1747-57.[4]GoAS,MozaffarianD,RogerVL,etal.Heartdiseaseandstrokestatistics—2013update;areportfromtheAmericanHeartAssociation[J].Circulation;2013,127(1);e6-e245.[5]ScheffelH,StolzmannP,PlassA,etal.Coronaryarterydiseaseinpatientswithcardiactumors:preoperativeassessmentbycomputedtomographycoronaryangiography[J].InteractCardiovascThoracSurg,2010,10(4);513-518.[6]DanadI,RaijmakersPG,KnaapenP.DiagnosingcoronaryarterydiseasewithhybridPET/CT:Ittakestwototango[J].JNucICardiol;2013.20(5):874-890[7]vanDamRM,WillettWC.UnetpotentionforcardiovasculardiseasepreventionintheUnitedStates[J].Circulation,2009,120(13):1171-1173.[8]VogiatzisI,TsikrikaE,SachpekidisV,etal.Factorsaffectingsmokingresumptionafteracutecoronarysyndromes[J].HellenicJcardiol,2010,51(4):294-300.[9]陆再英,钟南山.内科学［M］.7版.北京:人民卫生出版社,2008:267-268.[10]GrinspoonS.Diabetesmellitus,cardiovascularriskandhivdisease[J].Circulation,2009,119(6):770-772．[11]MitchellBD,KammererCM,BlangeroJ,etal.GeneticandenvironmentalcontributionstocardiovascularriskfactorsinMexicanAmericans.TheSanAntonioFamilyHeartStudy[J].Circulation.1996,94(9):2159-70.[12]FallahS,SeifiM,FiroozraiM,etal.EffectofapolipoproteinEgenotypesonincidenceanddevelopmentofcoronarystenosisinIranianpatientswithcoronary40 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华中科技大学硕士学位论文附录主要缩略语英文缩写英文全称汉语全称CADcoronaryatheroscleroticdisease冠心病MImyocardialinfarction心肌梗塞SNPsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性GWASGenome-wideassociationstudy全基因组关联分析CAGCoronaryangiography冠脉造影术ORoddsratio相对优势比DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应HRMhigh-resolutionmeltinganalysis高分辨熔解曲线分析dNTPdeoxy-ribonucleotidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EBEthidiumbromide溴化乙锭HWEHardy-Weinbergequilibrium哈迪温伯格平衡CIConfidenceinterval置信区间AGGF1AngiogenicfactorwithG-patchandFHAdomain1血管生成因子TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子45 华中科技大学硕士学位论文iNOSNitricOxideSynthase一氧化氮合成酶NF-κBnuclearfactorkappa-light-chain-enhancer核转录因子kappaBofactivatedBcellsKTSKlippel-Trenaunaysyndrome克-特综合征VEGFVascularEndothelialGrowthFactor血管内皮生长因子PorphyromonasgingivalisPorphyromonasgingivalis牙龈卟啉单胞菌46