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广函医科大＃学号：２０１４２０２３２ＧｕａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖ广西医科大ｇ学硕士学位论文重组９型腺相关病毒载体通过不同方法转染ＳＤ大鼠心肌转染效率及安全性研究陆元喜导师姓名：李浪专业名称：心血管内科申请学位类型：学科学学位答辩委员会主席：李醒三答辩委员会委员：王琦武邝日禹桂春巫相宏二〇一＾ｂ年五月 原创牲声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工怍及取得的研究成果．据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发忐或撰写过的研究成果，也不包含获得广西医枓太学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一．与我同工作的同志对本研究所做的任何宠献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．学位论Ｘ作者黎名签字日期：年ｉ月和曰———■■＂■■■■■■－－ＭＩ１，！ｍｍ■＾■—＾ｔ－学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留．使用学倥论文的规：定，印在校期间论文的知识产枳属广西医科大学。学校有杈保存论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可以■采用影印、复申或其它手段保存１［编本论文，学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查闽和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同煤体上发表，俜播学位论文的全部或部分内容．保密论文在解密后遵守此规定，学位论文作者签名：／导师签字：１＾４；签字曰期：年／月曰签字曰财＜月＾曰＾？７＞？ 个人简历基本情况姓名：陆元喜性别：男民族：壮族出生年月：1986年11月籍贯：广西马山政治面貌：群众学习工作经历起止时间所在院校或单位学历学位职称2004.09-2009.06广西医科大学本科/学士2009.07-2014.08广西民族医院本科/学士医师2014.09至今广西医科大学研究生院研究生/硕士学生研究生期间科研经历项目起止时间项目名称项目来源本人承担职务2016年1月TLR4/NF-kB/TNF-α信号通路广西医疗模型制作至今在ox-LDL致心肌细胞凋亡中卫生技术的作用机制研究研究项目 目录中英文缩略语........................................................................................................1中文摘要.................................................................................................................3英文摘要.................................................................................................................5前言.........................................................................................................................81材料与方法......................................................................................................101.1实验动物、实验主要材料试剂和设备.................................................101.1.1实验动物.......................................................................................101.1.2实验主要材料及试剂...................................................................101.1.3主要实验仪器设备.......................................................................111.2实验方法.................................................................................................121.2.1实验分组.......................................................................................121.2.2病毒液及相关材料的准备...........................................................131.2.3各组转染rAAV9-eGFP方法.........................................................131.2.4心电图检测...................................................................................141.2.5心功能检测...................................................................................151.2.6血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及心肌肌钙蛋白T（cTnT）检测..........................................................................................................151.2.7心肌组织取材及心脏大体解剖的观察......................................15 1.2.8荧光显微镜观察荧光表达...........................................................161.2.9WesternBlot法检测蛋白表达.................................................161.2.10统计学分析.................................................................................202结果....................................................................................................................202.1实验动物的一般情况.............................................................................202.2荧光显微镜观察各组荧光表达并计算转染率....................................202.3蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达.................................................................................................................242.4.酶联免疫吸附测定法检测血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及心肌肌钙蛋白T（cTnT）.....................................................................................292.5转染后12h心功能变化.........................................................................312.6大鼠心电图变化.....................................................................................342.7四种不同方法转染后大鼠心脏大体解剖.............................................353讨论....................................................................................................................364结论....................................................................................................................41参考文献...............................................................................................................42综述.......................................................................................................................47致谢.......................................................................................................................62攻读学位期间发表的学术论文..........................................................................63 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究中英文缩略语英文缩写英文全称中文全称CK-MBCreatineKinase-MB肌酸激酶同工酶MBcTnTCardiactroponinT心肌肌钙蛋白TPMSFPhenylmethanesulfonate苯甲基磺酰氟GAPDHGlyceral-dehyde-3-phosphate3-磷酸甘油醛脱氢酶dehydrogenaseSDSSodiumdodecylsulfonate十二烷基磺酰酸钠PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液TBSTTrisbufferedsalinetween洗膜缓冲液rpmRevolutionsperminute每分钟转数COCardiacoutput心排血量LVESDLeftventricularend-左室收缩末期内径systolicdiameterLVEDDLeftventricularend-左室舒张末期内径DiastolicdiameterFSFractionalshortening短轴缩短率LVEFLeftventricularejection左室射血分数ELISAEnzymelinkedimmunosorbent酶联免疫吸附试验assay1 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究eGFPenhancedgreenfluorescent增强型绿色荧光蛋白proteinTEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺rAAV9recombinantadeno-associated重组9型腺相关病毒virusserotype92 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究摘要目的：重组9型腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirusserotype9，rAAV9）是一种可持续高水平表达目的基因的新型病毒性载体，对心肌转染效率高于其他血清型AAV。rAAV9有多种方法转染心肌组织，本实验旨在探讨尾静脉注射法（Tailveininjection,TVI）、尾静脉泵入法（Tailveinpumping,TVP）、心肌多点注射法（multi-pointintramyocardiuminjection,IMI）、冠脉注射法（intracoronaryinjection,ICI）四种不同转染方法在SD大鼠心肌的转染效率及其安全性。方法：将100只SD雄性大鼠随机分为TVI组、TVP组、IMI组、ICI组，每组25只,转染携带增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescenceprotein，eGFP）报告基因的rAAV9，按转染时间分为7d、14d、21d、28d四个亚组，每组5只。TVI组、TVP组、IMI组、ICI组各设阴性对照亚组11（NC组）5只。转染rAAV9-eGFP各亚组每只SD大鼠注射病毒量为1×10vg，NC组为经相应途径注入等量生理盐水（normalsaline,NS）。通过荧光显微镜观察各组心肌组织的绿色荧光及Westernblotting检测心肌组织eGFP表达确定各组转染最佳时间并比较各组转染效率。转染操作时记录心电图，转染后12小时检测大鼠血清CK-MB、cTnT表达及心功能变化，采集心脏标本时肉眼观察大鼠心脏大体解剖病变，评价四种转染方法的安全性。结果：重组9型腺相关病毒可通过尾静脉注射、尾静脉泵入、心肌多3 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究点注射、冠脉注射四种方法有效转染到心肌组织，各组转染高峰均见于转染14d时。转染效率从高到低依次为ICI组，TVP组，IMI组及TVI组（各组间比较，均P＜0.05）。同一转染方法，转染rAAV9-eGFP亚组与NC亚组比较，大鼠CK-MB、cTnT表达及心功能无明显变化，差异无统计学意义（均P＞0.05）。不同方法转染rAAV9-eGFP或NS：与TVI组比较，TVP组CK-MB、cTnT表达及心功能无明显变化，差异无统计学意义（均P＞0.05）；IMI组及ICI组CK-MB、cTnT表达水平升高，心功能显著降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。实施转染操作时，TVI组及TVP组大鼠未发生心律失常，而IMI组及ICI组大鼠可见严重心律失常（包括室性心动过速、心室颤动、心脏停搏）。采集心脏标本时TVI组及TVP组大鼠心脏大体解剖未见异常，而IMI组及ICI组大鼠心脏可见瘢痕形成或心肺/胸壁粘连。结论：重组9型腺相关病毒（rAAV9）可安全、高效转染至心肌组织，转染高峰期出现于转染14d时，冠脉注射法可实现较高的转染效率，但安全性较低，尾静脉泵入法兼具较高的转染效率和较高的安全性或可作为一种更好的转染方法。关键词：9型腺相关病毒，转染，心肌组织，增强型绿色荧光蛋白,心功能4 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究THEEFFICIENCYANDSAFETYOFRECOMBINANTADENO-ASSOCIATEDVIRUSSEROTYPE9TRANSFECTEDBYDIFFERENTMETHODSINRATMYOCARDIUMABSTRACTObjectiveRecombinantadeno-associatedvirusserotype9(rAAV9)canexpressthetargetgenecontinuouslyandhighlyasanewvirusvector.ThereareseveralapproachestotransferrAAV9intoratmyocardium.Amongtheseapproaches,thetransfectionefficiencyandsafetyaredifferent.ThisstudywasaimedtoexplorethetransfectionefficiencyandsafetyusingrAAV9bymultiways.MethodsOnehundredmaleSprague-Dawleyratswererandomlyandequallydividedintofourgroups：Tailveininjection(TVI)group,Tailveinpumping(TVP)group,multi-pointintramyocardialinjection(IMI)groupandintracoronaryinjection(ICI)group.Theneachgroupwassub-divivedfivegroups:negativecontrol(NC)group(n=5),transfectedgroupsthatdurationfor75 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究days,14days,21daysand28daysrespectively.Theratsinalltransfectedgroupswereinjectedwith1×1011vectorgenomeofAAV9carryinglabeledenhancedgreenfluorescenceprotein(eGFP)gene,whiletheratsofalltheNCsubgroupswereinjectedwiththesamevolumeofnormalsaline.TheoptimaltimefortransfectionandthetransfectionefficiencyweredeterminedbyassessingtheeGFPexpressioninratmyocardium,andthesafetywasdecidedbybothmeasurementsofthelevelsofcreatinekinaseMBisoenzyme(CK-MB)andcardiactroponinT(cTnT)andevaluationsofcardiacfunctionbyechocardiogramandbyelectrocardiogram.ResultsrAAV9canbeeffectivelytransferredtoratmyocardiumwiththesemethodsmentionedabove.TheexpressionsofeGFPinalltranfectiongroupsreachedhighest14daysaftertransfectionandthendeclinedslightly.Inthesegroups,transfectionefficiencyfromhightolowwas:ICIgroup,TVPgroup,IMgroup,TVIinturns.Ineachgroup,thereisnosignificantdifferencebothinthelevelsofCK-MBandcTnTandincardiacfunctionbetweentransfectedsubgroupsandNCsubgroups.Foralltransfactedsubgroups,thelevelsofCK-MBandcTnTinthetwogroupswhichweretransferredwithrAAV9bytailveinwerelowerthanIMIandICIgroups.ComparedtoTVIandTVPgroups,thecardiacfunctionofIMIandICIgroupsdecreasedmarkly.Severecardiacarrhythmia(includeventriculartachycardia,ventricularfibrillation,cardiacarrest)didnotoccurredintheTVIandTVPgroups,whileit6 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究occurredinIMIandICIgroups.TherewerenothingabnormaldetectedinheartsamplesfromTVIandTVPgroups,butscarformationandadhesionbetweenchestwallandheart-lunginIMIandICIgroupsweredetected.ConclusionrAAV9canbetransfectedintoratmyocardiumsafelyandefficiently.Comparedtointracoronaryinjection,transferringintoratmyocardiumbytailveinpumpinghasaslightlylowertranfectionefficiencyandahighersafety.KEYWORDSadeno-associatedvirusserotype9,transfection,myocardium，enhancedgreenfluorescenceprotein,cardiacfunction7 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究前言[1,2]心血管疾病的发病率和死亡率在全世界范围一直保持领先水平，尤其是各种心脏疾病导致的慢性心力衰竭发病率和死亡率不断攀升给临床工[2,3]作带来严峻挑战。各种心脏疾病具有很高的发生率和死亡率，传统的药物及手术治疗效果有限。基因治疗是心脏疾病治疗发展中的一种很有潜力的治疗手段，心血管系统常见的疾病如心肌梗死、冠状动脉粥样硬化和扩[4]张型心肌病等都有可能通过基因治疗得到改善。基因工程技术在心血管领域的应用日渐广泛和深入，包括心脏疾病病理生理机制的研究及心脏疾病[5]的治疗等多方面，如何使外源性目的基因在心肌组织更高效、安全的表达成为当前亟待解决的问题。选择有效而且安全的载体是基因治疗能够成功的关键环节之一。腺相[6]关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）具有无致病性，能够点特异性整合，使外源目的基因长期表达，宿主范围广，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞也较敏感，免疫原性低等优点而备受瞩目。目前，腺相关病毒经不断改进和完善，已成为许多遗传性疾病及慢性病最有希望的载体之[7]一。9型腺相关病毒（adeno-associatedvirusserotype9,AAV9）除具有一般腺相关病毒的优势，还具有嗜心肌细胞特性，可在心肌组织持续高[8,9]水平表达目的基因，对心肌转染效率高于其他血清型AAV。研究发现AAV1及AAV8能够携带目的基因高效转染至心肌组织，而AAV9对心肌组织的亲和力是AAV1的200倍，是AAV8的5-10倍，AAV9对心肌表现出更强的靶向[10][11]亲和力并可使外源性基因在体内长期稳定表达。2006年Inagaki等通过比较AAV8及AAV9转染猴的心肌发现AAV9具有高度心脏特异性。2008年[8]Bish等研究发现，在心脏基因转染上AAV9明显优于AAV1、AAV6、AAV7及AAV8，AAV9在心脏转染1周可检测到基因表达，转染2周可达表达高峰，6周出现稳定表达，转染1年仍可见到大量表达阳性心肌细胞。8 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究重组9型腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirusserotype9，rAAV9）是去除AAV9的结构基因（cap和rep基因），保留AAV9基因组中的倒置末端重复序列（invertedterminalrepeat,ITR），将外源基因和启动子插在ITR之间，即形成重组体rAAV9。目前rAAV9病毒载体广泛应用于心血管疾病动物模型转基因表达，为rAAV9作为心血管疾病基因治疗载体提供实验依据。转染是基因治疗的重要步骤，一种好的转染方法不仅可以提高转染效率，实现更好的治疗效果，而且可以减少载体的使用量及非特异性转染。研究表明，rAAV9可通过尾静脉注射法、心肌多点注射法、冠脉注射法转染至大鼠心肌组织。尾静脉泵入法是在尾静脉注射法基础上的一种改进，转染效率如何尚无研究报道。这四种方法的转染效率及安全性如何尚缺乏系统的研究，本研究以携带增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP）报告基因的rAAV9通过上述四种方法转染至SD雄性大鼠心肌组织，探索最佳转染时间并比较各种方法的转染效率及评估其安全性，为心血管疾病基因治疗选择更好的转染方法提供实验参考依据。9 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1材料与方法1.1实验动物、实验主要材料试剂和设备1.1.1实验动物清洁级SD雄性大鼠100只，8周龄，体质量250-300g，由广西实验动物中心提供（许可证编号：SCXK桂2014-0002），所有程序通过动物伦理委员会批准。1.1.2实验主要材料及试剂表1实验主要材料及试剂材料及试剂名称生产厂家或供应商rAAV9-eGFP上海吉凯基因化学技术有限公司100μl微量进样器上海高鸽工贸有限公司1ml,5ml,10,20ml注射器广西北仑河医科工业集团有限公司一次性静脉采血针山东省成武县华博医疗器械有限公司丙泊酚注射液意大利cordenpharmas.p.a大鼠心肌肌钙蛋白T(cTnT)酶联免疫武汉华美生物工程有限公司试剂盒大鼠肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)酶联武汉华美生物工程有限公司免疫试剂盒兔抗鼠eGFP一抗美国CellSignalingTechnology公司羊抗兔二抗美国licor公司一抗、二抗稀释液上海碧云天生物技术研究所PVDF膜美国Millipore公司脱脂奶粉美国BD公司20xTBS缓冲液北京索莱宝科技有限公司TEMED上海碧云天生物技术研究所10%过硫酸铵北京索莱宝科技有限公司10%SDS北京索莱宝科技有限公司30%丙烯酰胺北京索莱宝科技有限公司10 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1.0MTris-HCl(pH6.8)北京索莱宝科技有限公司1.5MTris-HCl(8.8)北京索莱宝科技有限公司预染marker美国Thermoscientific公司BCA蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术研究所5x上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司PMSF北京索莱宝科技有限公司RIPA裂解液上海碧云天生物技术研究所甲醇北京索莱宝科技有限公司PBS北京索莱宝科技有限公司苦味酸北京索莱宝科技有限公司无水乙醇成都市科龙化工试剂厂O.C.T冷冻切片包埋剂广州济恒医药科技有限公司粘附载玻片江苏世泰实验器材有限公司其他试剂如生理盐水，75%酒精，PBS缓冲液，甲醇等。1.1.3主要实验仪器设备表2主要实验仪器设备仪器设备生产厂商动物呼吸机上海奥尔科特生物科技有限公司MPA心功能分析系统上海奥尔科特生物科技有限公司注射泵保定申辰泵业有限公司超声机心动图机SONOS7500荷兰飞利浦公司倒置荧光显微镜日本olympus公司连续冰冻切片机德国Leica公司组织匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司电泳仪、转膜仪美国Bio-Rad公司Odyssey红外荧光扫描成像系统美国licor公司Elx-808光吸收酶标仪美国bio-tek公司高速冷冻离心机美国Sigma公司-20℃、-80℃电冰箱青岛海尔公司压力蒸汽灭菌器上海医用核子仪器LS-B501调速多用振动器国华电器有限公司旋涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司11 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1.2实验方法1.2.1实验分组SD雄性大鼠100只TVI组25只TVP组25只IMI组25只ICI组25只NC组NC组NC组NC组rAAV9-eGFP7d组rAAV9-eGFP7d组rAAV9-eGFP7d组rAAV9-eGFP7d组rAAV9-eGFP14d组rAAV9-eGFP14d组rAAV9-eGFP14d组rAAV9-eGFP14d组rAAV9-eGFP21d组rAAV9-eGFP21d组rAAV9-eGFP21d组rAAV9-eGFP21d组rAAV9-eGFP28d组rAAV9-eGFP28d组rAAV9-eGFP28d组rAAV9-eGFP28d组转染操作时记录心电转染后12h采集尾静脉转染后12hB超检测CO、图血LVESD、LVEDD、FS、LVEF检测血清CK-MB，cTnT处死动物，观察心脏大体解剖外观，留取心肌组织倒置荧光显微镜检测绿WesternBlot检测eGFP色荧光表达率蛋白表达图1实验分组流程图Figure1Flowchartoftheexperimentalgroups12 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究清洁级SD雄性大鼠100只，8周龄，体质量250-300g。100只大鼠随机分为尾静脉注射组（TVI组），尾静脉泵入组（TVP组），心肌多点注射组（IMI组），冠脉注射组（ICI组）4组，每组25只。各组按转染rAAV9-eGFP时间分7d，14d，21d及28d四个亚组，每组5只，TVI组、TVP组、IMI组、ICI组各设阴性对照亚组（NC组）5只。rAAV9-eGFP组每只大鼠注射11rAAV9-eGFP1×10vg，NC组以同样方法注射同等剂量生理盐水（normalsaline，NS）。1.2.2病毒液及相关材料的准备rAAV9-eGFP由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。转染前将病毒原液从-80℃冰箱取出放入冰盒冰浴融化，将病毒液分装入无菌EP管中，每11管病毒量均为rAAV9-eGFP1×10vg，按不同转染方法需要加入适量生理盐水稀释，放置于冰盒备用。所有使用的玻璃器皿、手术器材均清洁后120℃高压蒸汽灭菌，然后烘干备用。SD大鼠分组后用苦味酸染色标记。1.2.3各组转染rAAV9-eGFP方法1.2.3.1尾静脉注射法将大鼠放入大鼠固定器，于尾静脉注入500µl生理盐水或rAAV9-eGFP溶液，注射完成后压住进针口直至无渗血，防止注射液外漏，大鼠放回鼠笼继续饲养。1.2.3.2尾静脉泵入法将大鼠放入大鼠固定器，微泵于尾静脉泵入500µl生理盐水或rAAV9-eGFP溶液，15min泵完。完成后压住进针口直至无渗血，防止注射液外漏，大鼠放回鼠笼继续饲养。1.2.3.3心肌多点注射法用生理盐水将丙泊酚注射液稀释成2.5mg/ml丙泊酚溶液，以稀释好的13 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究丙泊酚溶液1ml经大鼠尾静脉缓慢注射诱导麻醉，再以6ml/h的速度持续泵入维持麻醉。大鼠胸前毛发剃干净后平躺于小动物手术台，将灯光照射于大鼠颈部气管处，向上提拉大鼠舌头暴露声门，将自制气管插管插入气管，连接小型动物呼吸机通气，潮气量20ml/kg，呼吸频率70次/分，吸呼比1:1。75%酒精消毒大鼠胸前皮肤，铺盖无菌孔巾，胸骨左缘心前区剪开皮肤，钝性分离肌层，于第三、四肋间钝性分离肋间肌肉，置入小型动物开胸器，撑开肋骨暴露术野，向两侧拨开肺脏，轻柔剥离心包，微量进样器于心脏前壁分5个点将250µl生理盐水或rAAV9-eGFP溶液注入心肌内，每个点注射50µl，注射时斜向进针以避免注入心室，注射时可见注射点心肌轻微鼓起发白表明注入心肌内。出针后用纱布轻压进针口防止注射液外漏。观察心跳平稳且心肌无渗血后逐层缝合关胸，消毒切口周围皮肤，贴好无菌方巾，放回鼠笼继续饲养。术后连续三天给予青霉素10万单位/只预防感染。1.2.3.4冠脉注射方法前面操作同心肌多点注射法，剥离心包后，血管钳夹闭升主动脉，同时于心尖部将100µl生理盐水或rAAV9-eGFP溶液注入左心室，升主动脉持续夹闭10s后松开。观察心跳平稳且心肌无渗血后逐层缝合关胸，消毒手术切口周围皮肤，贴好无菌方纱保护手术切口，放回鼠笼继续饲养。术后连续三天给予青霉素10万单位/只预防感染。1.2.4心电图检测大鼠麻醉好后平卧于小型动物手术台，将MPA心功能分析系统的心电图导联连接到大鼠肢体，检查接触良好后进行心电监测，调整导联与肢体接触良好无干扰后开始进行转染，于转染即刻记录采集肢体导联心电图。所有心电图采集由同一位助手操作完成。14 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1.2.5心功能检测各组动物于转染12h时进行超声心动图检查，腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g）麻醉，观察动物无翻正反应后，仰卧位固定，剃掉胸前毛发，超声心动图（PhilipsMedicalSystemsSONOS7500，超声探头S12，频率5.0MHZ）测量心排血量（CO）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、短轴缩短率（FS）、左心室射血分数（LVEF）。所有超声心动图采集均由同一位经验丰富的超声诊断科医生操作完成。1.2.6血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及心肌肌钙蛋白T（cTnT）检测大鼠转染后12h采集尾静脉血1ml，静止于室温待血液完全凝固后，4000rpm离心15分钟，分离血清，分装后做好标记保存于-80℃冰箱待检测。使用美国Bio-Tek公司Elx-808吸收光酶标仪和武汉华美生物工程有限公司生产的大鼠肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）酶联免疫试剂盒、心肌肌钙蛋白T（cTnT）酶联免疫试剂盒检测血清CK-MB及cTnT水平。按试剂盒操作说明书操作，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，使用专业制作曲线软件CurveExpert1.3制作标准曲线。用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的OD值代入方程式，计算出样本浓度。1.2.7心肌组织取材及心脏大体解剖的观察转染时间到达后处死大鼠，打开胸腔，大致观察心脏瘢痕形成情况、与周围组织粘连情况及胸腔积液情况，然后迅速取出心脏，冰面上取材，沿心脏长轴于前壁中间将心脏切成两块，冰生理盐水清洗干净，一块用O.C.T冷冻切片包埋剂包埋于自制容器内，做好标记并迅速冻存于-80℃冰箱。另一块装入离心管并做好标记后直接冻存于-80℃冰箱。15 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1.2.8荧光显微镜观察荧光表达从-80℃冰箱取出包埋好的心脏标本放入冰冻切片机复温，冰冻切片机连续切片（厚度10μm），倒置荧光显微镜下观察心肌细胞荧光表达情况，计算转染率。每组每个时间点5个心脏标本，每个标本随机选择5张切片，每张切片随机选择5个200倍镜下视野，转染率=绿色荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%，结果取5个视野平均值。操作过程注意避光。1.2.9WesternBlot法检测蛋白表达（1）心肌组织总蛋白提取称取0.25g大鼠心肌组织置入玻璃研磨器皿中研磨，用10倍体积的、预冷的PBS清洗两次（包括冲洗器材），将匀浆物转移至离心管中，1500xg、4℃离心5min后弃掉上清。加入1ml预冷含PMSF的RIPA蛋白抽提剂，吹打均匀，放置于冰上。每隔5min振荡器轻柔震荡一次，共震荡4次（反复震荡可以充分裂解组织）。4℃15000xg离心10min，将上清分装至EP管中待用。（2）BCA法测定蛋白浓度取800μl蛋白标准品配置液置入到一管蛋白标准（20mgBSA）中，待溶解充分后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制好的蛋白标准溶液可以立即使用或放置于-20℃长期储存。取适量25mg/ml的蛋白标准溶液，稀释成终浓度0.5mg/ml。根据样品数量，按体积比（50:1）以BCA试剂A和BCA试剂B配制适量BCA工作液并充分混匀。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加至96孔板标准孔中，再加入标准品稀释液补足20μl。加入适当体积样本至96孔板的样品孔中，补充标准品稀释液至20μl。各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30min。全自动酶标仪设置570波长测定吸光度，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。16 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究（3）SDS-PAGE凝胶电泳清洗厚、薄玻璃板：先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗后垂直放置于篮子内，待玻璃板自然晾干。制备10%分离胶：按下表配方制两块分离胶（单位：ml）。试剂名称剂量蒸馏水4.030%丙烯酰胺3.31.5MTris-HCl（Ph8.8）2.510%SDS0.110%过硫酸铵0.1TEMED0.004将厚、薄两块玻璃板对齐后放入已经准备好的制胶架上垂直卡紧，开始灌胶。使用1ml枪头灌胶。各吸取5ml分离胶灌入两块玻璃板之间，并留出适当体积灌注浓缩胶。左右轻微晃动架子以使分离胶面水平。再于分离胶面上缓慢灌入无水乙醇至平玻璃板上缘进行封闭与空气隔绝，防止空气进入分离胶。制胶架垂直静置于室温中通风位置约30min，观察到分离胶与无水乙醇之间出现明显分隔线，表明分离胶已经凝固，将无水乙醇倒掉。再缓慢灌入少量蒸馏水冲洗，用干净的滤纸轻轻吸干，勿碰到分离胶胶面。平稳放置制胶架准备下一步灌注浓缩胶。制备5%浓缩胶：按下表配方制两块浓缩胶（单位:ml）。试剂名称剂量蒸馏水2.730%丙烯酰胺0.671.0MTris-HCl（pH6.8）0.510%SDS0.0410%过硫酸铵0.04TEMED0.004严格按照剂量大小配好浓缩胶后快速摇动，使浓缩胶立即混匀，将浓缩胶注入厚、薄两片玻璃预留的空间填满，先将梳子清洗干净，用干净的滤纸擦干后插入（注意不要引起梳子歪斜或产生气泡以免影响后面上样），17 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究轻微抖动制胶架以赶出气泡或预防产生气泡。将制胶架垂直静置于室温通风处，待浓缩胶自然凝固（约30min）后，将凝胶玻璃板从制胶架轻轻取出（动作轻柔），将凝胶玻璃板放到电泳架上，固定在电泳槽中，按胶的数量加入足量的电泳液（电泳液配方见表3），内侧液面至少漫过薄玻璃板。往内槽加电泳液时不要对着胶面的梳子上加，应将电泳液靠着电泳槽的内板缓慢倒入，当内槽加满并完全浸没浓缩胶，轻轻垂直快速拔出梳子，尽量避免拔梳子时有角度拔出以免损坏上样孔影响后面的上样。样品的准备和上样：取适量蛋白样品按体积比1:4（1份蛋白样品：4份上样缓冲液）加入适量5×上样缓冲液后充分混匀，沸水浴5min使蛋白充分变性，室温自然冷却。每孔加入变性后的蛋白样品10μl，预留一孔加入3μl预染蛋白Marker（上样的时候需将移液枪头放入相应的孔内，须缓慢注入，保持移液枪头的平衡，避免损坏上样孔）。电泳：将整个电泳槽垂直放置于冰上保持低温，恒压电泳，浓缩胶70V，待Marker进入分离胶后将电压上调至100V，电泳至溴酚蓝指示剂到达距离玻璃板下缘约1cm位置时终止电泳。轻柔取下玻璃板，平放于白色泡沫板上准备切胶。表3电泳液和转膜液配方（1L）试剂电泳液（1L，pH8.3）转膜液Tris碱3.03g5.8g甘氨酸18.8g2.9gSDS1g0.37g蒸馏水1000ml800ml甲醇0200ml（4）转膜（半干法）以刮子轻轻撬开薄玻璃板，根据目的蛋白分子量的大小切胶，目的蛋白分子量所在大概位置由Marker指示带估计，将准备好的凝胶片选择目的蛋白和内参的位置后进行切胶。切胶时必须在电泳转膜液中浸泡完成，避18 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究免胶体干燥，切胶时视角应垂直于胶面，避免视角带来的误差导致切不到目的蛋白和内参。切好的胶置于转膜液中平衡10min。按胶的大小裁剪比凝胶稍大的PVDF膜。将PVDF膜置于甲醇溶液中浸泡20s后放入转膜液（转膜液配方如表3）浸泡5min。滤纸直接浸泡于转膜液中。将转膜仪电极板清洁擦干，于电极板正极中央叠放3张浸泡后的滤纸，然后依次铺上浸泡好的PVDF膜、目的条带凝胶及三张浸泡好的滤纸，操作过程注意避免胶、膜之间产生气泡。目的蛋白eGFP用70mA的电流15min转膜，内参用80mA的电流20min转膜。（5）封闭、抗体孵育转膜结束后取出PVDF膜，注意蛋白面朝上，以TBST洗膜3次，每次10min。将PVDF膜浸泡于5%脱脂奶粉封闭液中，摇床室温封闭1小时。用TBST洗膜3次，每次10min。按抗体说明书以一抗稀释液稀释一抗，终体积4ml。将PVDF膜浸没于一抗中，摇床4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10min。按抗体说明书以二抗稀释液稀释二抗，终体积为4ml。将PVDF膜浸没于二抗中，室温摇床避光孵育2小时。用TBST洗膜3次，每次10min。（6）扫膜使用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫膜，按仪器说明书进行相关设置和操作。扫膜结束后用QuantityOne软件分析条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。19 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究1.2.10统计学分析应用SPSS19.0统计分析软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。对计量资料进行正态性和方差齐性检验，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），然后以Student-Newman-Keuls法进行两两比较。率的比较用χ²检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1实验动物的一般情况IMI组NC亚组1只大鼠在注射过程中因出血过多死亡；ICI组rAAV9-eGFP7d亚组1只大鼠在夹闭主动脉时心跳骤停致死。其余各组存活大鼠状态良好，体重差异无统计学意义（均P＞0.05）。2.2荧光显微镜观察各组荧光表达并计算转染率倒置荧光显微镜观察eGFP荧光表达：各NC亚组只见到微弱的自发荧光。转染rAAV9-eGFP各亚组均可见到明显绿色荧光表达，各组转染7d时，可见心肌组织有少量荧光表达，转染14d荧光最强，转染21d、28d荧光表达呈减弱趋势。TVI组、TVP组、ICI组转染rAAV9-eGFP各亚组均可见较多绿色荧光均匀表达,IMI组于心脏前壁注射点位置心肌组织可见到较强绿色荧光表达，心脏侧壁、后壁及室间隔只可见到少量散在荧光表达。转染rAAV9-eGFP14d时，ICI组转染率最高；TVP组次之，TVI组及IMI组转染率较前两组低。20 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究注：NC组（A），转染rAAV9-eGFP7d组（B）、14d组（C）、21d组（D）、28d组（E）大鼠心肌组织绿色荧光表达。Bar=200μm。图2TVI组大鼠心肌绿色荧光表达（×200）Figure2TheexpressionofgreenfluorescenceinTVIgroupratsmyocardium（×200）注：NC组（A），转染rAAV9-eGFP7d组（B）、14d组（C）、21d组（D）、28d组（E）大鼠心肌组织绿色荧光表达。Bar=200μm。图3TVP组大鼠心肌绿色荧光表达（×200）Figure3TheexpressionofgreenfluorescenceinTVPgroupratsmyocardium（×200）21 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究注：NC组（A），转染rAAV9-eGFP7d组（B）、14d组（C）、21d组（D）、28d组（E）大鼠心肌组织绿色荧光表达。Bar=200μm。图4IMI组大鼠心肌绿色荧光表达（×200）Figure4TheexpressionofgreenfluorescenceinIMIgroupratsmyocardium（×200）注：NC组（A），转染rAAV9-eGFP7d组（B）、14d组（C）、21d组（D）、28d组（E）大鼠心肌组织绿色荧光表达。Bar=200μm。图5ICI组大鼠心肌绿色荧光表达（×200）Figure5TheexpressionofgreenfluorescenceinICIgroupratsmyocardium（×200）22 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究表4四种转染方法NC亚组及rAAV9-eGFP不同时间亚组大鼠心肌转染效率（%,x±s）rAAV9-eGFPrAAV9-eGFPrAAV9-eGFPrAAV9-eGFPGroupsNC7d14d21d28daaaaTVI1.20±0.787.25±3.1022.97±3.7815.48±2.5014.05±1.11bbbbTVP1.11±1.1812.64±4.3838.36±3.5729.57±3.8824.38±3.83ccccIMI1.37±0.189.27±3.7330.16±4.3325.15±3.0022.70±2.79ddddICI1.34±0.8517.14±2.4148.86±5.8938.15±1.4732.04±3.11a注：TVI组，与NC亚组比较，P＜0.05，转染rAAV9-eGFP四个不同时间亚组比较，均P＜0.05；bTVP组，与NC亚组比较，P＜0.05，转染rAAV9-eGFP四个不同时间亚组比较，均P＜0.05；cIMI组，与NC亚组比较，P＜0.05，转染rAAV9-eGFP四个不同时间亚组比较，均P＜0.05；dICI组，与NC亚组比较，P＜0.05，转染rAAV9-eGFP四个不同时间亚组比较，均P＜0.05。注：NC组与转染rAAV9-eGFP各亚组比较，均P＜0.001；与TVI、TVP、IMI、ICI转染rAAV9-eGFPa7d、21d、28d亚组比较，均P＜0.05；TVI、TVP、IMI、ICI四组转染rAAV9-eGFP14d亚组比较，均P＜0.05。图6四种不同方法转染NS及rAAV9-eGFP荧光表达率Figure6TheexpressionofgreenfluorescencetransfectedwithNSandrAAV9-eGFPbyfourdifferentmethods23 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究2.3蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达2.3.1尾静脉注射组eGFP表达如图7所示，与NC组比较，转染rAAV9-eGFP各亚组eGFP相对表达水平均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），与转染rAAV9-eGFP7d、21d、28d比较，转染rAAV9-eGFP14d时eGFP表达水平最高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。24 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究a注：与NC亚组比较，P＜0.05。转染rAAV9-eGFP不同时间亚组比较，均P＜0.05。图7TVI组各亚组eGFP表达水平Figure7TheexpressionofeGFPinTVIgroup2.3.2尾静脉泵入组eGFP表达如图8所示，与NC组比较，转染rAAV9-eGFP各亚组eGFP相对表达水平均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），与转染rAAV9-eGFP7d、21d、28d比较，转染rAAV9-eGFP14d时eGFP表达水平最高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。25 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究a注：与NC亚组比较，P＜0.05。转染rAAV9-eGFP不同时间亚组比较，均P＜0.05。图8TVP组各亚组eGFP表达水平Figure8TheexpressionofeGFPinTVPgroup2.3.3心肌多点注射组eGFP表达如图9所示，与NC组比较，转染rAAV9-eGFP各亚组eGFP相对表达水平均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），与转染rAAV9-eGFP7d、21d、28d比较，转染rAAV9-eGFP14d时eGFP表达水平最高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。26 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究a注：与NC亚组比较，P＜0.05。转染rAAV9-eGFP不同时间亚组比较，均P＜0.05。图9IMI组各亚组eGFP表达水平Figure9TheexpressionofeGFPinIMIgroup2.3.4冠脉注射组eGFP表达如图10所示，与NC组比较，转染rAAV9-eGFP各亚组eGFP相对表达水平均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），与转染rAAV9-eGFP7d、21d、28d比较，转染rAAV9-eGFP14d时eGFP表达水平最高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。27 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究a注：与NC亚组比较，P＜0.05。转染rAAV9-eGFP不同时间亚组比较，均P＜0.05。图10ICI组各亚组eGFP表达水平Figure10TheexpressionofeGFPinICIgroup2.3.5四种不同转染方法转染rAAV9-eGFP14deGFP表达水平如图11所示，与TVI、TVP、IMI三组比较，ICI组eGFP相对表达水平最高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。与TVI、IMI组比较，TVP组eGFP相对表达水平明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。28 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究注：TVI、TVP、IMI、ICI四种方法转染rAAV9-eGFP14d比较，均P＜0.05图11四种不同方法转染rAAV9-eGFP14deGFP表达水平Figure11TheexpressionofeGFPtransfectedwithrAAV9-eGFPbyfourdifferentmethods2.4.酶联免疫吸附测定法检测血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及心肌肌钙蛋白T（cTnT）2.4.1血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）表达水平如表5和图12所示，同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，29 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究CK-MB表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。与TVI组比较，TVP组CK-MB表达差异无统计学意义（P＞0.05）,IMI组与ICI组CK-MB表达显著增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）。表5各组血清CK-MB含量测定（单位：ng/ml）GroupsNCrAAV9-eGFPTVI0.452±0.0490.440±0.041aaTVP0.434±0.0260.444±0.036bbIMI1.898±0.1151.978±0.239bbICI1.130±0.1941.085±0.236注：同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，CK-MB表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；ab与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。注：同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，CK-MB表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；ab与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。图12转染NS及rAAV9-eGFP12h后CK-MB水平Figure12TheexpressionofCK-MBaftertransfectedwithNSandrAAV9-eGFPtwelvehours2.4.2心肌肌钙蛋白T（cTnT）表达水平如表6和图13所示，同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，30 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究cTnT表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。与TVI组比较，TVP组cTnT表达差异无统计学意义（P＞0.05）,IMI组与ICI组cTnT表达显著增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）。表6各组cTnT含量测定（单位：pg/ml）GroupsNCrAAV9-eGFPTVI31.22±6.4829.03±4.39aaTVP31.25±4.4729.10±4.48bbIMI85.66±15.6482.87±11.62bbICI46.96±4.7549.94±6.16注：同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，cTnT表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；ab与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。注：同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，cTnT表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；ab与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。图13转染NS及rAAV9-eGFP12h后cTnT水平Figure13TheexpressionofcTnTaftertransfectedwithNSandrAAV9-eGFPtwelvehours2.5转染后12h心功能变化如表7和图14、15所示，同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，31 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究大鼠心功能差异无统计学意义（均P＞0.05）。与TVI组比较，TVP组心功能变化差异无统计学意义（P＞0.05）；与TVI组比较，IMI组及ICI组心功能明显下降，表现为LVEDD及LVESD升高，LVEF、FS、CO降低（均P＜0.05）。ABCD注：TVI组（A）、TVP组（B）、IMI组（C）、ICI组（D）图14四种不同转染方法大鼠超声心动图Figure14Theechocardiographicofratswithfourdifferenttransfectmethods表7四种不同方法转染NS与rAAV9-eGFP大鼠心功能变化GroupsLVEF(%)FS(%)CO(l/min)LVEDD(mm)LVESD(mm)TVINC88.28±53.08±0.236±5.34±2.55±2.093.030.0680.690.54rAAV9-eGFP91.14±52.28±0.234±5.70±2.82±4.101.220.0330.270.22TVPNC90.02±55.16±0.214±5.63±2.35±aaaaa0.951.540.0430.180.13rAAV9-eGFP89.68±55.28±0.202±5.85±2.62±aaaaa3.505.570.0120.370.52IMINC73.68±37.82±0.131±7.25±4.42±bbbbb3.272.660.0180.810.66rAAV9-eGFP74.60±38.56±0.154±7.00±4.11±bbbbb2.411.950.0160.610.41ICINC75.04±39.22±0.157±6.63±3.98±bbbbb4.163.720.0470.340.19rAAV9-eGFP78.02±41.6±0.160±6.68±3.88±bbbbb3.583.360.0230.570.39注：同一转染方法，NC亚组与rAAV9-eGFP亚组比较，心功能变化差异无统计学意义（均P＞0.05）；32 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究ab与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。LVEF:左室射血分数；FS：短轴缩短率；CO：心排血量；LVEDD:左室舒张末期内径；LVESD:左室收缩末期内径。ab注：与TVI组比较，P＞0.05,P＜0.05。LVEF:左室射血分数；FS：短轴缩短率；CO：心排血量；LVEDD:左室舒张末期内径；LVESD:左室收缩末期内径。图15四种不同方法转染rAAV9-eGFP大鼠心功能变化Figure15CardiacfunctionindicesofratstransfectedwithrAAV9-eGFPbyfourdefferentmethods33 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究2.6大鼠心电图变化如图16和表8所示，TVI组及TVP组大鼠心电图正常，转染操作过程中未发生心律失常，IMI组及ICI组大鼠发生较多室性早搏，呈单发或连发，部分大鼠甚至发生室性心动过速、心室颤动、心脏停搏等严重心律失常，其中ICI组rAAV9-eGFP7d亚组1只大鼠在夹闭主动脉时发生心脏停搏致死。各组大鼠严重心律失常的发生率经卡方检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。注：TVI组（A）及TVP组（B）均未见到心律失常；IMI组（C）及ICI组（D）可见室性心动过速及心脏停搏图16各组大鼠肢体导联心电图Figure16Thelimbleadelectrocardiogramofratsineachgroup34 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究表8四种不同方法转染时出现严重心律失常大鼠数量（只）分组室性心动过速心室颤动心脏停搏尾静脉注射组000尾静脉泵入组000心肌多点注射组1942冠脉注射组16542.7四种不同方法转染后大鼠心脏大体解剖如图17和表9所示，TVI组及TVP组未发现大鼠心脏外观有明显异常。IMI组及ICI组部分大鼠可见到心脏瘢痕形成，心脏与肺脏或胸壁粘连，胸腔积液等病理改变，提示IMI组及ICI组所采用的转染方法对大鼠心脏造成较大创伤。注：TVI组（A）及TVP组（B）心脏表面光滑、完整，血管走行清晰可见，色泽红润，IMI组（C）可见心脏表面多个点状白色瘢痕，ICI组（D）可见心脏与肺脏或胸壁粘连。图17各组大鼠心脏大体解剖Figure17Cardiacgeneralmorphologyofratsineachgroup表9四种不同方法转染后大鼠心脏大体解剖表现分组瘢痕形成心、肺/胸壁粘连胸腔积液TVI000TVP000IMI1675ICI74335 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究3讨论本实验研究发现：（1）重组9型腺相关病毒（rAAV9）可通过不同转染途径有效转染至心肌组织，转染高峰出现于转染14d。（2）冠脉注射法可以使rAAV9病毒高效均匀转染至心肌组织；心肌多点注射法转染心肌组织主要集中于心脏前壁注射点周围，其余部位心肌组织转染效果较差；尾静脉注射法及尾静脉泵入法可使心肌均匀转染，尾静脉泵入法转染效率明显高于尾静脉注射法。（3）冠脉注射法及心肌多点注射法可造成大鼠心肌损伤，表现为CK-MB、cTnT相对表达水平升高及心功能下降；尾静脉注射法及尾静脉泵入法对大鼠心肌组织及心功能均无明显影响。（4）心肌多点注射法及冠脉注射法可致大鼠严重心律失常、心肌瘢痕形成及心肺/胸壁粘连的概率显著升高，尾静脉注射法及尾静脉泵入法均未造成上述不良后果。心血管疾病发病率及死亡率逐年增高，药物、介入及手术等传统的治疗措施效果有限。基因治疗是新兴的一种治疗手段，近年来在心血管领域[12]的研究得到了迅速发展，被认为是一种心脏疾病新的替代治疗手段。基因技术不仅应用于心血管疾病病理生理机制的研究，也应用于心血管疾病[13,14][15][16,17]的治疗，例如裸DNA，脂质体，病毒载体等已经应用于这方面疾病的治疗研究。基因转染是实施基因治疗的主要环节之一，起着至关重要的作用。基因在体转染过程中，选择理想的载体是基因治疗成功的关键因素。理想的载体不但可以实现靶器官高效转染，还可以减少靶器官之外其他器官的暴露量，减少载体的使用量，减少毒副作用。基因治疗的载体可分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体具有不受表达盒大小的限制、生物安全性较高的优点，但转染效率较低，在细胞内易于被降解使转染时间缩短。对此出现了很多提高非病毒载体系统转染效率和靶向性的研究如：脂质体/多聚物DNA复合物、脂质体的多聚物、结合电脉冲以及超声[18,19]等新技术的研究等，提示了今后非病毒载体的发展和研究方向。然而，36 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究在某些心血管疾病如慢性心力衰竭中，为达到理想的治疗效果需要持久的基因表达。对于这类疾病，理想的基因治疗载体应该能够持续、稳定表达目的基因，病毒性载体正符合这种需要。目前研究比较深入的应用于基因治疗领域的三大类病毒载体系统包括：反转录病毒载体（Retrovirus,RV）、腺病毒载体（Adenovirus,AdV）、腺相关病毒载体[20]（Adeno-assoeiatedvirus,AAV）。其中逆转录病毒介导基因转移具有能整合、高效及拷贝数恒定等优点，但其对高度分化，不分裂的细胞不能实施基因转移，而只能感染分裂复制的细胞，且逆转录病毒载体致机体肿瘤[21]的发病率比较高，具有一定的致瘤危险性。腺病毒具有易于制备，病毒滴度高、感染效果理想等优点，但其介导的基因在细胞内只能暂时表达，转基因持续表达时间仅为一周左右，且腺病毒载体进入机体后稳定性差，[22]可引起机体较强的免疫反应和致机体疾病等缺点，所以不能在临床使用，目前主要用于临床前小动物模型研究。腺相关病毒属于非致病性的微小病毒科家族的成员，是一种单链DNA病毒，外被衣壳蛋白，是动物病毒中最小的一种，直径20nm。基因组长4675bp，两侧是145bp长的反向末端重复序列（invertedterminalrepeats，ITRs），其中外侧的125个核苷酸呈发卡结构，在复制时有弱启动子作用。基因组中有三个启动子（P5、P19、P40）和两个开放读框，分别编码rep和cap蛋白，rep蛋白在病毒整合、复制包装起重要作用，cap蛋白是包装[23]完成病毒所需的衣壳蛋白。腺相关病毒安全性高，免疫原性低，Wright等研究发现，在心肌注射AAV引起的免疫反应轻微，没有显著超过以生理盐水或裸质粒治疗引起的基线反应水平。这与其他病毒性载体如腺病毒、疱[23-24]疹病毒、慢病毒等引起的严重免疫反应相对比，具有显著的优势。此外，腺相关病毒稳定性好，感染体内可长期表达，不仅可感染分裂期细胞，也[25]可感染非分裂期细胞，而且腺相关病毒对人体没有致病性，能够长期稳[26]定表达目的基因。因此，AAV载体在当前研究的动物模型中能够向骨骼肌、37 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究[27-29]肝脏、心脏等器官安全、长期进行基因转移。根据壳蛋白的不同，目前[30]找到了十多种不同的血清型，超过100种病毒变异体。AAV2是人类发现[31,32]最早、研究最早的血清型，虽然没有致病性和低免疫性，但是AAV2有一定的局限性，它对很多组织和细胞的感染效率不高。科学家们通过对不同的血清型AAV进行了改造，通常所采用的方法是杂合子改造，获得重组[30]腺相关病毒。重组腺相关病毒去除了病毒结构基因（cap和rep基因），感染宿主细胞后，外源基因表达，不存在野生型病毒的表达。国内外大量研究表明，不同血清类型的AAV对不同细胞、不同组织器官有不同的感染[33,34]效率。9型腺相关病毒对心肌的组织嗜性和亲和力可以达到AAV1的200[34,10]倍，是AAV8的5-10倍，对心肌组织的靶向亲和力非常高。由于9型腺相关病毒载体具有安全性好、转染效率高、免疫原性低、表达稳定、可携带外源基因在体内长期表达以及对心肌高度敏感等优点，被认为是目前治[35]疗心血管系统疾病最有希望的病毒性载体之一。因此本研究选择携带eGFP报告基因的rAAV9作为载体，研究其通过不同方法转染心肌的转染效率及其安全性。既往有大量关于病毒转染体内心肌的研究，涉及到多种不同的转染方[8]法。Bish等通过心肌多点注射法对比9型腺相关病毒与1,6,7,8型腺相关病毒在大小鼠心肌的转染效率，发现9型腺相关病毒转染效果明显优于[9]另外四型病毒。Zincarelli等在小鼠使用冠脉注射法对比1-9型腺相关病毒在心肌的基因转染发现9型腺相关病毒具有较高的转染效率。[36]Kumarswamy等通过尾静脉注射法给心衰大鼠实施基因治疗，目的基因在大鼠心肌稳定表达使大鼠心功能得到显著提高。经外周静脉途径转染是转染研究比较常用的方法之一。本研究在大鼠尾静脉注射法转染的基础上增加了尾静脉泵入法，对比尾静脉注射、尾静脉泵入、心肌多点注射、冠脉注射四种不同转染方法的转染效率及安全性。结果发现各组转染rAAV9-eGFP高峰均出现于转染14d时，之后呈缓慢下降的趋势。冠脉注射38 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究组转染效率最高，主要原因是冠脉注射可以实现目标器官靶向传染，提高[37]靶器官的载体量，减少载体的流失。Cittadini等通过夹闭主动脉，以表达野生型Akt基因的腺病毒载体注射到SD大鼠心脏，10d后治疗组的左室收缩性比对照组增加了41%。对心肌多点注射法大鼠心肌组织的观察发现，病毒转染主要集中于注射点周围心肌组织，而在远离注射点周围的心肌组织如心脏侧壁、后壁、室间隔等部位则转染比较少或无转染，平均转染效率不高。对于心力衰竭及心肌病等有广泛心肌细胞病变的疾病，往往需要目的基因在心脏广泛地表达才能达到预期的实验目的或实现理想的治疗效果，因此这个转染方法在使用中显示出其明显的局限性。尾静脉泵入法转染效率虽不如冠脉注射法，但却显著高于传统的尾静脉注射法（P＜0.05）。可能的原因是尾静脉泵入可进一步减轻一次性大剂量高浓度病毒液对机体的刺激引起的免疫反应，减少免疫系统对病毒的破坏。而且尾静脉泵入法可以延长rAAV9通过心肌组织的时间，延长rAAV9与心肌组织的接触时间，增加rAAV9对心肌组织的吸附，提高rAAV9对心肌的感染量，实现较高的转染效率。在安全性方面，四种不同方法分别转染rAAV9-eGFP与转染生理盐水对比发现：同一种方法转染rAAV9-eGFP与转染生理盐水所检测心肌损伤标志物CK-MB、cTnT表达水平及心功能变化差异无统计学意义（均P＞0.05）,提示rAAV9可作为一种安全的基因转移载体，这与既往的研究相一致。不同方法转染rAAV9-eGFP，与尾静脉注射组比较，尾静脉泵入组所检测心肌损伤标志物CK-MB、cTnT表达水平及心功能无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；与尾静脉注射组比较，心肌多点注射组与冠脉注射组心肌损伤标志物CK-MB、cTnT表达水平明显升高，心功能明显下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。在实验中发现，心肌多点注射法在心肌组织注入病毒液时，可见注射点心肌微微鼓起发白，注射点会有少许渗血。心肌多点注射对心肌损伤比较大，除了穿刺对心肌组织的直接物理伤害，还包括39 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究注入病毒液时，注射部位肿胀压迫造成局部心肌血运障碍导致心肌细胞损[38]伤，导致心肌损伤标志物CK-MB、cTnT升高及心功能下降。Aoki等发现注射针头对心肌有损伤作用，可导致注射点周围心肌明显的损伤和纤维化，如果注射剂量超过一定范围，还可能引起心脏骤停。冠脉注射在夹闭主动脉时，左室流出道急性梗阻，造成心腔压力瞬间急剧升高，可能导致高灌注压对内皮损伤或心肌应激性损害导致心肌损伤标志物CK-MB、cTnT升高[39]及心功能下降。Emani等研究发现，重组病毒溶液的流动速度过快与心肌损伤相关。此外，转染过程中，由于心肌多点注射法对心肌组织创伤大，冠脉注射法夹闭主动脉时间长，均存在较高的严重心律失常发生率与猝死风险。由于心肌多点注射法及冠脉注射法需要开胸手术操作，存在大出血等严重并发症。术后心肌瘢痕形成、心脏与肺脏或胸壁粘连、胸腔积液等发生率高，会造成实验动物远期心肺功能下降。此外，心肌多点注射法及冠脉注射法操作难度大，对研究者技术要求高。冠脉注射法在夹闭主动脉时如果夹闭不完全，会造成大量载体进入体循环，造成心肌组织载体量减少，在注射病毒液时，进针方向不正确或注射位置太深容易将病毒液注入右心室，不能发挥冠脉注射法的优势；心肌多点注射容易损伤冠状动脉，导致出血量增大及影响冠脉心肌供血，操作不熟练者容易将病毒液注入心室腔，或者注射时病毒液外渗，造成靶向组织转染失败。心脏疾病基因治疗最理想的转染途径应符合转染效率高、创伤小、操作简便、心肌转染靶向性高等要求，但目前还没有全部满足这些要求的转[40]染途径。以导管为基础的冠脉内给药系统对心肌创伤小，更有希望应用于临床，但在动物实验研究中往往不具备这样的条件，而通过开胸心肌多点注射和冠脉注射转染安全性较低，由于转染方式带来的损伤会影响研究者对一些实验指标的观察，而且技术操作水平对研究结果的稳定性影响较大，甚至有造成实验动物死亡的危险，对于一些珍贵动物模型，将会大大增加研究成本。尾静脉注射及尾静脉泵入有效避免开胸对动物造成的伤害40 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究及操作对心肌组织的损伤，安全性高。针对尾静脉途径转染效率较低的缺点，在不增加其他组织器官副作用的情况下，可以通过适当增加载体量解决。相比之下，尾静脉泵入法兼具与尾静脉注射法同样的安全性及较高转染效率，或可为更理想的转染方法。4结论重组9型腺相关病毒（rAAV9）可安全、高效转染至心肌组织，转染高峰期出现于转染14d时；冠脉注射法可实现较高的转染效率，但安全性相对较低；心肌多点注射法心肌转染不均匀，安全性不高；尾静脉注射法转染安全性高，但转染效率较低；尾静脉泵入法兼具较高的转染效率和较高的安全性或可成为心血管疾病基因治疗研究更理想的转染方法。41 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究参考文献［1］HeartDiseaseandStrokeStatistic.Dallas,Tex:AmericanHeartAssociation,2005.［2］CohnJN,BristowMR,ChienKR,etal.ReportoftheNationalHeart,Lung,andBloodInstituteSpecialEmphasisPanelonHeartFailureResearch.Circulation,1997,95:766–770.［3］RichMW.Epidemiology,pathophysiology,andetiologyofcongestiveheartfailureinolderadults.JAmGeriatrSoc,1997,45:968–974.［4］PacakCA,MahCS,ThattaliyathBD,etal.Recombinantadeno-associatedvirusserotype9leadstopreferentialcardiactransductioninvivo.CircRes,2006,99:e3-e9.［5］HedmanM,HartikainenJ,Yla-HerttualaS.Progressandprospects:hurdlestocardiovasculargenetherapyclinicaltrials.GeneTher,2011,18:743-749.［6］PhillipsMI.Antisenseinhibitionandadeno-associatedviralvectordeliveryforreducinghypertension.Hypertension,1997,29:177-187.［7］Smith-AricaJR,BatlettJS.Genetherapy:recombinantadeno-assoeiatedvirusvectors.CurrCardiolRep,2001,3:43-49.［8］BishLT,MorineK,SleeperMM,etal.Adeno-AssociatedVirus(AAV)Serotype9ProvidesGlobalCardiacGeneTransferSuperiortoAAV1,AAV6,AAV7,andAAV8intheMouseandRat.HumGeneTher,2008,19:1359-1368.［9］ZincarelliC,SoltysS,RengoG,etal.AnalysisofAAVserotypes1-942 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2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究综述腺相关病毒及其在心血管疾病基因治疗的研究进展流行病学调查表明，心血管疾病是当今威胁人类健康最主要的疾病，具有高发病率、致残率、死亡率的特点。常见的心血管疾病如冠心病、高血压、心力衰竭等发病率逐年增高，药物、介入及手术等传统的治疗效果有限。如何提高心血管疾病的治疗水平是目前全世界面临的重大医疗问题。基因治疗技术作为一种潜在的替代治疗方法，具有广大的应用前景，有望成为心血管疾病治疗的新手段。基因治疗的载体选择是基因治疗能否成功的关键因素。腺相关病毒（Adeno-assoeiatedvirus,AAV）是一种用于基因治疗有效的载体，因为其非致病性而且能够在各种组织（如心肌组织[1]等）中长期稳定表达目的基因而备受关注。近年来，其在基础研究及临床应用方面的研究取得很大发展，已成为心血管疾病治疗中很有前景的载体之一。腺相关病毒是细小病毒家庭的成员，具有相似的大小、结构，其增殖复制和表达均需要辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒等）的作用才能完成[2,3]。腺相关病毒不仅可以感染分裂细胞，也能够感染非分裂细胞，以定向整合的方式在宿主体内存在。因其较低的免疫原性及较高的安全性，并且对心肌细胞敏感等特点，成为心血管系统疾病基因治疗的研究热点。目前，腺相关病毒在心力衰竭、高血压、心肌梗死等心血管病的基因治疗研究取得显著进展。1AAV的生物学特性1.1AAV的结构及特点AAV是一种无包膜，直径20nm，正二十面体，基因大小为4.7kb的缺47 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究[4]陷型单链DNA病毒，外被衣壳蛋白，是动物病毒中最小的一种。基因组4675bp，两端是长145bp的反向末端序列（invertedterminalrepeats，ITRs），外侧125个核苷酸呈发卡样结构，复制时有弱启动子的作用。其基因组有三个启动子（P5、P19、P40），两个开放读框，分别编码cap和rep蛋白，cap蛋白是包装完成所需的衣壳蛋白，rep蛋白对整合及复制起重要作用，rep蛋白包含4个不同的重叠序列，分别为Rep40，[5]Rep52,Rep68,Rep78。以AAV构建的载体具有如下优点：宿主范围广，既能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞；低免疫原性和细胞毒性；非致病性，能够特异整合至人19号染色体q13.3-qter区，避免随机整合引起癌基因的激活和抑癌基因的失活而导致肿瘤；转导的外源性基因能长期稳定表达；性质稳定，能够耐受外界环境变化，便于存储。缺点是：滴度不高，制备纯化工艺比较复杂，费用昂贵；外源基因容量小（＜4.9kb）；需要辅助病毒参与复制。1.2AAV的生活周期及定点整合AAV感染宿主后，其生活周期分为裂解期及溶原期两个阶段。在辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）作用下然后发生裂解。这个时期的特点是AAV在体内进行基因复制、表达及病毒体生产。E1a，E2b，E2a，E4和VARNA是已[6]经被鉴定的辅助腺病毒。疱疹病毒提供DNA聚合酶和解螺旋酶来帮助AAV基因表达。尽管腺病毒及疱疹病毒两者的作用机制不同，但都是通过调节细胞的基因表达来帮助AAV的增殖感染。当没有腺病毒及疱疹病毒辅助时，AAV只能进行有限复制，在一定程度上病毒基因表达受抑制，此时，病毒基因组可以整合至19号染色体（q13.4）上的一个AAVS1区域潜伏，这个区[7]域临近TNNT1及TNNI3两个特殊的肌肉基因。组织研究实验表明AAVS1是个安全的基因整合位点，但是否适用于人类转基因治疗尚缺乏证据。1.3AAV的血清型根据壳蛋白的不同，目前除外人类的灵长类动物中找到的AAV血清型48 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究[8]及其变异体超过100种，来自人类的AAV血清型也有12种。不同的血清型具有不同的组织嗜向性，对不同组织器官的转染效率也存在很大差异。研究表明：AAV1,AAV4,AAV5能够高效感染眼睛，AAV5，AAV6，AAV9能够高效感染肺脏，AAV6，AAV7，AAV8能够高效感染肝脏，AAV7，AAV8，[9]AAV9能够高效感染骨骼肌，AAV9能够高效感染心肌。AAV2是发现和研究[10]最早的血清型，也是目前研究的最清楚的血清型。虽然AAV2具有非致病性及低免疫原性等优点，但其对很多组织转染效率并不高。为了提高AAV的转染率，科学家对其进行改造和重组以达到提高转染效率的目的。通常是采用杂合子改造获得重组腺相关病毒。重组腺相关病毒因除掉了病毒的结构基因（cap和rep基因），因而在感染宿主细胞后不存在野生型病毒表达，只有外源性基因表达。9型腺相关病毒（adeno-associatedvirusserotype9,AAV9）是新近发现的病毒，是腺相关病毒家族中的一员。AAV9最初从人体分离获得，在肌肉、肝脏和肺脏等组织中均可以观察到AAV9的存在。目前AAV9的结构尚未完全清楚，国内外对AAV9的研究也非常有限。现有的研究表明，AAV9相对于其他血清型AAV表现出更高的组织和细胞嗜向性。AAV1、AAV8能够高效感染心肌，而AAV9感染心肌组织的能力是AAV1的200倍，是AAV8的[11]5～10倍，对心肌的靶向亲和力非常之高，能够长期稳定表达目的基因。AAV9因此被认为是心血管疾病基因治疗最有希望的病毒性载体。2AAV转染心肌组织的方法国内外有大量关于病毒载体转染心肌组织的研究，涉及到多种不同的[12]转染方法。Bish等通过心肌多点注射法对比9型腺相关病毒与1,6,7,8型腺相关病毒在大小鼠心肌的转染效率，发现9型腺相关病毒转染效果明显优于另外四型病毒。心肌多点注射可精确定位到目标组织器官，减少载体的使用量和非特异转染，避免肝脾的首过消除效应、T细胞免疫应答及血管内皮的屏障作用。但是多点注射一般转染局限于注射点周围，而远离注49 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究射点的心肌组织转染效率低或无转染，很难实现靶器官的均匀广泛转染，而且由于直接在心肌内注射，对心肌组织创伤比较大，目前主要应用于一[13]些动物实验研究。Zincarelli等使用冠脉注射法观察1-9型腺相关病毒在小鼠心肌的基因转染效率均能发现不同水平的转染结果。冠脉注射法可以靶向转染到心肌组织，可以实现较高的转染效率，使整个心脏均匀表达目的基因，且减少非特异转染。尾静脉注射法可以实现心肌的均匀表达，在选择具有心肌组织嗜性的病毒载体基础上，其所实现的转染效率可以达[14]到基因治疗的要求，特别适用于血管疾病的治疗研究。Kumarswamy等通过尾静脉注射法给心衰大鼠实施基因治疗，目的基因在大鼠心肌稳定表达[15]使大鼠心功能得到改善。班努•库肯等经心包腔内注射携带SERCA2a基因2+的腺相关病毒溶液研究心肌肌浆网Ca-ATP酶基因过表达对快速起搏右心房新西兰大白兔SERCA2a活性和蛋白的影响，结果显示心包注射法可转染SERCA基因至心肌细胞，增加SERCA蛋白数量，增强肌浆网内SERCA蛋白表达，延长心房有效不应期，减少心房颤动的发生。经心包注射转染，载体主要集中于临近心包的部位转染，如何优化心包转染使整个心脏广泛表达目标基因仍需更多探索研究。针对不同的心血管系统疾病可以考虑选择不同的转染方法，AAV能通过多种方法灵活转染至靶组织及器官，体现其在应用方面的优异性。3AAV在心血管疾病的治疗研究3.1AAV在心力衰竭的应用大量动物模型证实基因治疗能够增强心肌收缩力，改善心功能，甚至[16]可以改善心室重构。大部分慢性病不仅仅是一种基因突变导致的，应该考虑到治疗的多样性和复杂性。针对不同的基础心脏疾病导致的心衰，基因治疗选择不同的靶基因。迄今为止发现的心力衰竭靶基因包括SERCA2a、[17]PLN、S100A1、β2-AR、GRK2、AC-V1等。KawaseY等在猪冠脉内注射rAAV1-SERCA2a使SERCA2a表达水平恢复正常，dp/dtmax明显增加，心功50 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究[18]能及左心室重构得到明显改善。SakataS等经静脉注射AAV9-PLN至SD大鼠体内，发现SD大鼠左心室舒张期末压力、dp/dtmin、缩短分数都能恢复到正常水平，心肌纤维化及左心室扩大得到一定程度的改善。RaakePW[19]等通过给猪冠状静脉逆向注射AAV6-GRK2，使猪左心室收缩功能及血流动[20]力学得到显著改善，血液中的去甲肾上腺素水平下降。PlegerST等经逆向冠状静脉注射AAV9-S100A1到猪心脏，使S100A1表达增高，逆转了左心室重构，LVEF明显升高，且室性心律失常风险未增加。第一项心力衰竭转2+基因治疗临床试验是由美国发起的多中心CUPID研究。总所周知，Ca是肌2+肉收缩的关键离子，肌浆网ATP酶（SERCA）是参与Ca调节的主要蛋白。而SERCA2a主要存在心肌和骨骼肌中，其功能是ATP依赖性逆浓度梯度将2+Ca由胞浆排入到肌浆网中。大量研究表明，在心力衰竭的心肌细胞中，SERCA2a活性及其mRNA水平明显下降，心力衰竭部位心肌SERCA2a的表达量比正常心肌下降约30%。CUPID研究旨在评价晚期心力衰竭患者AAV1-SERCA2a基因治疗的安全性及其疗效。第一期试验纳入12名患者，经冠脉内注射给药，结果显示安全性尚可，大部分患者症状、心功能和心室[21]重构得到改善。随后，该团队开展了CUPID试验的Ⅱ期临床试验，共纳入39名心力衰竭晚期的患者，经过6个月的观察，多项临床指标得到一致性的改善，证明其在治疗晚期心力衰竭患者具有安全性和有效性。但由于纳入的病例数较少，尚需更多大规模临床研究证实。3.2AAV在动脉粥样硬化的应用动脉粥样硬化是以脂质代谢紊乱为基础，血管内皮细胞损伤，炎性细胞浸润，粥样斑块破裂伴随血栓形成为特征的病理过程。因此，动脉粥样硬化的基因治疗基于这四个方面寻找靶点。高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein,HDL）的减少及低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein,LDL）[22]的升高是动脉粥样硬化的主要危险因素。Rader等发现家族性高胆固醇血症患者LDL升高的基因位点，通过将LDL脂蛋白受体基因定向肝脏转染，，51 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究使LDL在肝脏的摄取得到恢复，降低血中的胆固醇含量，从而阻止动脉粥[23]样硬化的发展。apoAI可逆向转运胆固醇，促进HDL摄取胆固醇，对降低胆固醇含量发挥重要作用。最近研究发现，重组腺相关病毒（rAAV）将B族I型清夫道受体基因及apoAI同时应用治疗动脉粥样硬化大鼠模型，双[24][25]基因联合治疗比单基因治疗效果好。谢佳等将rAAV9-eGFP转染至动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管，可在主动脉斑块中观察到明显的增强型绿色荧光蛋白表达，表明rAAV9可作为动脉粥样硬化的最佳治疗载体之一。有研究发现，rAAV介导生长因子β1（TGFβ1）基因可通过抗氧化、抗炎等[26]机制抑制动脉粥样斑块的形成。实现AAV介导基因治疗动脉粥样硬化进入临床治疗阶段，尚需更多动物研究提供实验依据。3.3AAV在高血压的应用高血压的基因治疗主要从诱导基因表达（over-expression，又称正义基因疗法）和降低基因表达（又称反义基因疗法）从而提高体内抗氧化剂和抗炎物质含量，抑制或封闭高血压相关基因表达和复制，以达到降低血[27]压的目的。Nonaka等将AAV携带的IL10基因通过肌肉注射到高钠饮食的大鼠模型，使大鼠收缩压降低26%，左心室肥厚程度降低22%，心房利钠肽水平降低，心功能改善，盐敏感大鼠的生存率显著提高。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、组织激肽释放酶（HK）、血管紧张素转换酶2（ACE2）等扩张血管物质在基因治疗高血压模型中可引起血压下降，有效预防靶器官损害。[28]Wang等给SHR肌肉注射rAAV携带的HK（Raav-HK）基因，使血压在整个实验期都出现显著下降，且心脏、肾脏等靶器官损害明显改善。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）过度活动是原发性高血压主要发病机制。RASS反义基因治疗的靶点主要有肾素、血管紧张素原（AGT）、ACE及AngⅡ1型[29]受体（AT1R）。Li等研究发现AAV介导反义AT1R基因治疗可明显降低高盐诱导的高血压，作用时间长达12W，且各组织器官的AT1R表达下降，靶[30]器官损害得到明显改善。Wang等研究AAV介导盐皮质激素受体shRNA预52 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究防寒冷诱发高血压及减轻肾损害，发现AAV介导MR-shRNA可有效沉默体内MR基因，RNA干扰抑制MR可长期控制高血压和肾损害。大量动物实验为将来进一步临床研究提供更多理论支持。3.4AAV在心肌梗死的应用心肌梗死（myocardialinfarction,MI）是缺血性心脏病导致人类死[31]亡的主要原因之一。血运重建是目前临床治疗MI的主要方法，包括冠状动脉旁路移植术（CABG）及经皮冠状动脉介入（PCI）治疗。这两种方法为MI患者开通血管，恢复血流发挥了重要作用，但是对于改善微循环血流、抗心肌细胞凋亡及挽救濒死心肌作用不大，而且不能避免再灌注损伤带来[32]的巨大风险。冠状动脉微栓塞（CME）是PCI术中常见棘手并发症，一旦发生CME，冠脉内应用溶栓剂尿激酶、钙离子拮抗剂、硝酸甘油、血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂或直接机械血栓清除术等均不能改善患者临床远期[33]预后。基因治疗等分子生物学技术在保护MI患者心肌细胞中带来新的研究方向，研究比较多的目的基因主要包括改善梗死区血供的基因、抗梗死[34]区纤维化的基因和调节各种细胞因子间相互作用的基因。Tao等以AAV介导血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang1）至猪急性心梗模型缺血缺氧心肌特异性共表达，诱导血管生成，刺激心肌细胞增殖，减少心[35]肌细胞凋亡，显著提高心功能。Su等以心肌内注射的方法转染AAV1介导VEGF促进新生血管的形成，增加心肌血供。由于VEGF可以促进血管生成，改善心肌血供，这将为不适合进行血管重建手术的患者提供另外一种可行的治疗方案。研究发现，rAAV2介导人血管内皮生长因子165基因可有效地[36]转染到家兔的缺血心肌并诱导该部位新血管的生成，呈剂量依赖关系。有研究表明，AAV9对心脏基因具有高效转导作用，AAV9介导的过表达心脏[37]选择性肌钙蛋白过氧化物歧化酶能够使小鼠的心梗面积明显缩小。多项研究表明，AAV介导的基因治疗能够改善心肌梗死的预后，为以后的进一步临床试验提供更多参考。53 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究4展望AAV不同的血清型有不同的组织嗜性，这对研究不同的组织器官疾病带[38]来极大便利。但AAV载体应用于基因治疗仍有一些潜在问题，如表型毒性[39][40]及免疫毒性遗传给后代、插入突变导致肿瘤、基因沉默致治疗失败等。出于安全考虑，各国对AAV的临床使用都比较小心谨慎，当前，其在心血管疾病基因治疗的研究主要还在动物实验阶段，进入到临床试验的项目不多，远期效果和不良影响尚需进一步观察。如何对病毒载体进行改造、包装、纯化、扩大基因容量、进一步降低免疫原性等问题仍有待解决；AAV血清型及转染途径的选择、最佳载体量的确定及如何进一步提高转染率等问题有待深入研究，以期更好的靶向转染和更少的毒副作用。随着AAV不断的改造优化，其作为一种重要的基因治疗载体在心血管疾病的应用将更加成熟更加安全，将会大大改善心血管疾病患者的预后，提高患者生活质量。随着进一步的动物实验研究及更多临床研究的开展，AAV将会在心血管疾病基因治疗领域发挥更大作用。54 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2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究致谢再次回到母校继续研究生阶段的学习，感触颇多。研究生阶段的学习紧张而忙碌，也让自己在这三年的学习当中收获了很多。时光飞逝，转眼间三年的学习很快就要结束了，回首这一路走来，从开始入学的理论课学习，到后来的实验室研究及临床实习，每一步都离不开老师们的悉心指导和同学们的帮助，才使我在学习过程中碰到的许多困难都一一得到解决。在我读研期间给予我帮助的每一个人都让我心怀感激。首先，我要衷心感谢我的恩师李浪教授，感谢李老师在我读研三年期间从学习到生活各个方面无微不至的关怀和悉心培养。李老师学识渊博、在科研和临床都有很深的造诣，能成为李老师的学生我感到荣幸之至。在导管室跟随李老师学习冠脉介入技术将近一年的时间，李老师缜密的思维，精湛的冠脉介入技术，忘我的工作精神，高尚的医德深深影响了我，使我更加深刻认识到如何才能成为一位优秀的临床医生，也时刻鞭策着我不断学习、探索，争取更大的进步。由于李老师的辛勤培养，才使我顺利完成了学业，谢谢李老师！其次，衷心感谢广西心血管病研究所李醒三教授、巫相宏教授、桂春教授、徐戈教授、文伟明副教授、曾晓聪副教授、韦恒主治医师以及导管室的各位老师在我临床实习及导管室学习期间对我的指导和帮助，感谢你们倾囊相授，教会我许多的专业知识和技术，让我受益匪浅。衷心感谢我的师兄苏强、孙羽涵、王现涛、杨华锋，师弟贺文慨、梁家宝、戴玮然、郭文钦、叶自亮等对我科研、临床实习及生活上的帮助，是你们无私的帮助和支持，才使我顺利度过研究生阶段的学习，谢谢你们。衷心感谢读研三年在我学习和生活上帮助过我的所有老师、同学们。最后，特别感谢我的家人对我辞职读研的理解和支持，没有你们，我无法实现我的理想。62 2017届硕士学位论文重组9型腺相关病毒载体通过不同方法转染SD大鼠心肌转染效率及安全性研究攻读学位期间发表的学术论文陆元喜，李浪.支架内再狭窄的治疗进展.中国循环杂志，2016，31：515-517.（北大中文核心）63 ■＝＝￣＝”ｗｗ—？＾４＾Ｃ．１肩＼．％
