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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文猪血清淀粉样蛋白３对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响ＥｆｆｅｃｔｏｆＰｏｒｃｉｎｅＳｅｒｕｍＡｍｙｌｏｉｄＡ３ｏｎＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓｙ硕士研究生：郇贝丽指导教师：马志永研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：人畜共患病及兽医公共卫生学培养单位：上海兽医研究所研究生院２０１７年５月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。７：研宄生签名：咐只叫时间＞１７年艾月曰关于论文使用授权的声明：本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名：时间：年夕月日：间导师签名＾：年玄月＞日＾＾ 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目猪血清淀粉样蛋白３对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响论文作者郇贝丽专业预防兽医学研宄方向：指导教师马志永研宄员培养单位（研宄所、中心）姓名职称￥“、。评、￥刘光清研宄员上海兽医研宄所灘兽医学＾周斌教授南京农业大学预防兽医学／：人－彭大新教授扬州学预防医学｜大兽＆奶范南红结教授京农业大学防兽医学预勇南农学生学周继教授京业大微物．兽学韩干研宄员上海兽医研宂所预防医先上海郑浩副研宄员兽医研究所预防兽医学员记）会录（秘书惠明议顾地２０１７５２论文答辩时间点月４日，上医研年海兽宄所 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪血清淀粉样蛋白3对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响EffectofPorcineSerumAmyloidA3onReplicationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus硕士研究生：郇贝丽指导教师：马志永研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：人畜共患病及兽医公共卫生学培养单位：上海兽医研究所研究生院2017年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationEffectofPorcineSerumAmyloidA3onReplicationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusM.S.Candidate：BeiliHuanSupervisor：Prof.ZhiyongMaMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:ZoonosesandVeterinaryPublicHealthMay2017 摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是一种严重危及养猪业的传染病，病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)。该病自20世纪80年代末爆发以来，给我国乃至全球养猪业的发展造成了重大损失。血清淀粉样蛋白3（SerumamyloidA3，SAA3）是干扰素诱导蛋白,也是机体感染的指标分子之一。但是，PRRSV感染过程中猪SAA3的变化及其对PRRSV复制的影响尚不清楚。为此，本研究分析了PRRSV感染中SAA3的变化以及对PRRSV复制的影响，以期为研究PRRSV感染机制提供帮助。根据猪SAA3的全基因序列设计特异性扩增引物，扩增猪SAA3的开放阅读框区域。将扩增的基因的片段连接到Flag7.1空载体构建真核表达载体。将猪SAA3的氨基酸序列分别与人和小鼠的SAA家族序列进行比对，阐明猪SAA3蛋白的分子生物学特性和系统进化关系，并以此为依据合成猪SAA3抗原小肽，用于制备SAA3多克隆抗体。将合成的猪SAA3抗原小肽免疫兔制备多抗血清，并用ELISA方法检测多抗血清效价，利用Western-blot以及间接免疫荧光技术检测多抗血清的特异性和灵敏性。结果显示，制备的多抗血清可以特异性识别猪源的SAA3蛋白。为了检测PRRSV感染过程中，PAM细胞以及猪各个组织中SAA3的RNA水平和蛋白水平的变化。将PRRSV感染PAM细胞，在不同时间点提取RNA，用相对荧光定量PCR的方法检测SAA3mRNA的动态变化。将PRRSV感染30日龄SPF猪，收取各个组织，分别在RNA和蛋白水平检测SAA3的变化。结果显示，在PAM细胞中，接毒组在12小时以后，SAA3mRNA水平明显高于对照组。在猪各个组织中，接毒组各组织SAA3mRNA水平都有不同程度的升高，其中肺脏升高最为明显，约是对照组的200倍。Western-blot结果发现，接毒组的肺脏、肾脏等的SAA3蛋白水平明显高于对照组，说明PRRSV感染时SAA3在机体各组织的表达会产生明显差异。为了研究猪SAA3蛋白对PRRSV感染的影响，利用过表达猪SAA3以及外源加入SAA蛋白的方法来检测SAA3对PRRSV复制的影响。荧光定量PCR结果显示，过表达猪SAA3能够显著提高PRRSVmRNA复制水平。TCID50的结果表明，猪SAA3表达组的PRRSV滴度显著高于空载体对照组。分析SAA对病毒感染阶段的影响发现，外源加入SAA蛋白能够促进病毒对宿主细胞的吸附作用。综上所述，本研究对猪SAA3进行了克隆、表达和抗体制备，分析了PRRSV感染对猪SAA3表达的影响及其生物学意义，发现了PRRSV可上调猪SAA3表达，SAA3能够促进PRRSV病毒复制和宿主细胞的吸附。关键词：猪呼吸与繁殖综合征病毒，猪血清淀粉样蛋白3，病毒复制I AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)causedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isaviralinfectiondiseasethathasimportantimpactonpigindustry.PRRSisemergedinthelate1980sandcauseshugeeconomiclossesinChinaaswellasworldwide.Serumamyloidprotein3(SAA3)isaninterferon-inducibleproteinandservesasabiomarkerofinfection.ThedynamicsofporcineSAA3duringPRRSVinfectionandtheeffectofporcineSAA3onPRRSVreplicationwereunknown.Therefore,thecurrentstudiesanalyzedthechangesofporcineSAA3atmRNAandproteinlevelsduringPRRSVinfectionandfurtherdeterminedtheeffectofporcineSAA3onPRRSVreplication.ThecodingregionofporcineSAA3wasclonedbyPCRbasedonthegenomesequenceofporcineSAA3andinsertedintoFlag7.1vectortogeneratearecombinantplasmidexpressingporcineSAA3.ThesequenceoftheclonedporcineSAA3wasalignedwithhumanandmousecounterpartstoanalyzetheantigenicepitopes.RabbitswereimmunizedwiththepeptidessynthesizedbasedontheantigenicepitopesofporcineSAA3togenerateantiserumspecifictoporcineSAA3.ThegeneratedantiserumwascharacterizedbyELISA,western-botandimmunofluorescenceassay,andshowedaspecificityandsensitivitytoporcineSAA3.ThechangesofporcineSAA3inPRRSV-infectedPAMsaswellasintissuesofPRRSV-infectedpigsweredeterminedatbothmRNAandproteinlevels.Porcinealveolarmacrophages(PAMs)infectedwithPRRSVwereharvestedatdifferenttimepointsandsubjectedtoreal-timePCRanalysis.Thetissuescollectedfrom30days-oldspecific-pathogen-freepigsinfectedwithPRRSVweresubjectedtoreal-timePCRandwesternblotforanalysisofthelevelsofporcineSAA3mRNAandprotein,respectively.ThelevelofporcineSAA3mRNAinPRRSV-infectedPAMswassignificantlyhigherthanthatinmock-infectedcellsfrom12hpost-infection.PorcineSAA3mRNAinthetissuesofPRRSV-infectedpigswasup-regulatedatdifferentlevelswiththetopoflung,inwhichthemRNAlevelwas200timeshigherthanthatinmock-infectedpig.ThelevelsofporcineSAA3proteininPRRSV-infectedtissues,suchaslungandkidney,wereremarkablyhigherthanthatinmock-infectedpigs,asdetectedbywesternblotanalysis.ThesedataindicatedthatPRRSVinfectionup-regulatedporcineSAA3expressionatdifferentlevels.TheeffectofporcineSAA3onPRRSVinfectionwasdeterminedbyexogenouslyexpressingporcineSAA3inPRRSV-infectedcellsorbytreatingPRRSV-infectedcellswithSAAprotein.ThelevelofPRRSVmRNAincellsexpressingporcineSAA3wassignificantlyincreasedcomparedwithcontrolcells,asdetectedbyreal-timePCR.PRRSVtitersincellsexpressingporcineSAA3werehigherthancontrolcells,suggestingthatporcineSAA3facilitatedPRRSVreplication.FurtherstudiesdemonstratedthatSAAassistedinPRRSVadsorptiontohostcells.Inconclusion,porcineSAA3genewasclonedandexpressed,andtheantiserumspecifictoporcineSAA3wasgeneratedinthecurrentstudies.PRRSVinfectionup-regulatedporcineSAA3expressionatbothmRNAandproteinlevels.PorcineSAA3wasabletofacilitatePRRSVreplicationandtoassistinII PRRSVadsorptiontohostcells.Keywords:porcinerespiratoryandreproductivesyndromevirus,porcineserumamyloidprotein3,viralreplication.III 目录第一章引言..........................................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征...............................................................................................11.1.1概述.................................................................................................................11.1.2流行病学.........................................................................................................11.1.3临床症状.........................................................................................................11.1.4PRRS的防制..................................................................................................21.2猪繁殖与呼吸综合征病毒.......................................................................................21.2.1概述.................................................................................................................21.2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特性.....................................................21.2.3猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学特征.............................................31.3猪血清淀粉样蛋白概论...........................................................................................41.3.1概述.................................................................................................................41.3.2SAA的结构....................................................................................................41.3.3SAA的功能....................................................................................................61.4研究现状.................................................................................................................101.5研究目的和意义.....................................................................................................11第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析................................................122.1材料与方法.............................................................................................................122.1.1材料...............................................................................................................122.1.2方法...............................................................................................................122.2结果.........................................................................................................................142.2.1猪SAA3基因克隆.......................................................................................142.2.2测序结果.......................................................................................................142.3讨论.........................................................................................................................16第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证....................................................................18IV 3.1材料与方法.............................................................................................................183.1.1材料...............................................................................................................183.1.2方法...............................................................................................................183.2结果.........................................................................................................................213.2.1抗原小肽的合成...........................................................................................213.2.2真核表达载体的构建...................................................................................213.2.3多抗血清的ELISA效价检测......................................................................223.2.4Western-blot验证抗体.................................................................................233.2.5间接免疫荧光实验验证抗体.......................................................................243.3讨论.........................................................................................................................24第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立................264.1材料与方法.............................................................................................................264.1.1材料...............................................................................................................264.1.2方法...............................................................................................................264.2结果........................................................................................................................284.2.1SYBRGreenI实时荧光定量PCR标准曲线的建立................................284.2.2SYBRGreenI实时荧光定量PCR的熔解曲线的建立.............................294.2.3敏感性实验..................................................................................................304.2.4重复性实验..................................................................................................304.3讨论.........................................................................................................................31第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究.................................................................335.1材料和方法.............................................................................................................335.1.1材料...............................................................................................................335.1.2方法...............................................................................................................335.2结果.........................................................................................................................365.2.1猪SAA3的组织分布..................................................................................36V 5.2.2PRRSV感染中SAA3在PAM细胞上RNA水平的动态变化.................375.2.3SAA3在组织中RNA水平以及蛋白水平的比较......................................375.2.4过表达SAA3蛋白对PRRSV复制的影响...............................................385.2.5SAA蛋白对病毒吸附的影响......................................................................395.3讨论.........................................................................................................................40第六章全文结论................................................................................................................42参考文献..............................................................................................................................43致谢....................................................................................................................................53作者简历..............................................................................................................................54VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称ApoAApolipoproteinA载脂蛋白AA-SAAAcuteserumamyloidA急性型血清淀粉样蛋白ACCLC-Cmotifchemokine趋化因子CXCLC-X-Cmotifchemokine趋化因子C-SAAConstituteserumamyloidA组成型血清淀粉样蛋白AELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒FPR2Formylpeptidereceptor甲酰肽受体2HDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白HP-PRRSVHighlypathogenicporcinereproductiveand高致病性猪繁殖与呼吸综合respiratorysyndromevirus征病毒IFN-ɑInterferon-ɑ干扰素-ɑIL-1βInterleukin-1β白细胞介素-1βIL-6Interleukin-6白细胞介素-6LPSLipopolysaccharide脂多糖LDVLactatedehydrogenasevirus小鼠乳酸脱氢酶病毒Marc145Monkeykindneyepithelialcells非洲绿猴胚胎肾上皮细胞MOIMultipleofinfection感染复数NF-ĸBNuclearfactorkappaB核转录因子ORFOpenreadingframe开放阅读框PAMsPorcinealveolarmacrophages猪肺泡巨噬细胞PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PRRSPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征SAASerumamyloidA血清淀粉样蛋白ASHFVSimianhemorrhagicfevervirus猴出血热病毒TNF-ɑTumornecrosisfactor-ɑ肿瘤坏死因子-ɑTLR2TolllikereceptorToll样受体2VII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1猪繁殖与呼吸综合征1.1.1概述猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），本病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合症”、“猪繁殖与呼吸综合症”等。其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的病毒性疾病（AlbinaE,1997）。并且此病也是一种免疫抑制性疾病（MurtaughM.P.,1995）。20世纪80年代末，该病首先发现于美国，当时的临床兽医发现猪群中有不同程度的母猪繁殖障碍，产生死胎，木乃伊胎，弱仔数量明显增加的现象，而仔猪与育肥猪有不同程度的呼吸系统疾病发生。随后这种现象也相继在欧洲一些国家包括德国，荷兰等出现该病的相关报道。1990年，荷兰的相关人员发现该病的病原体为一种有囊膜的RNA病毒，命名为Lelystad毒株，与此同时，北美的研究人员也分离到类似的病毒毒株，命名为VR-2332毒株。Lelystad毒株和VR-2332毒株则被认为是欧洲型和美洲型的原型毒株。该病于二十世纪八十年代开始流行于亚洲（AlbinaE.,1997;Bilodeauetal.,1991；Doneetal.,1996）。1995年，在中国大陆首次发现PRRS阳性猪，1996年我国成功分离到第一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(郭宝清等，1996)，自此之后，该病在我国多个地区全面蔓延和爆发（蔡雪晖等，2000）。尤其是2006年，爆发了由高致病性毒株引起的多个省市的蔓延和流行，给养猪业造成了非常重大的经济损失，也引起了相关政府部分的高度重视。1.1.2流行病学易感动物。目前猪是PRRSV唯一的自然宿主（王俊东，2008）。目前还没有PRRSV感染其他物种的情况发生。由于感染猪在临床症状消失后8周仍然可以排毒，并且病毒可以在猪的上呼吸道和扁桃体中长期存在，所以带毒猪就成了重要的病毒来源。其次感染猪的分泌物或是排泄物，以及感染母猪所产的木乃伊胎，死胎，子宫分泌物等也可污染环境，成为传染源。猪繁殖与呼吸综合征的主要的传播方式是呼吸道传播、接触传播等。和成猪相比，此病更容易在仔猪中传播。易感猪可以通过多种方式而感染PRRSV病毒，包括口腔，鼻腔，腹腔等。猪感染PRRSV十周之后仍可通过接触使得其他易感猪感染PRRSV。感染猪在不同地区之间的流动也是该病非常重要传播方式。本病是一种高度接触性的传染病，无明显的季节性，一年四季都可发生，以夏秋季最为多发。该病的初发地区呈爆发式，地方流行。发生过的地区多为散发，流行缓和。1.1.3临床症状该病的潜伏期不定，人工感染的孕猪为4-7天左右，其他情况下的潜伏期在2-37天之间不1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言等。被感染的妊娠母猪，尤其是在妊娠期100天之后的母猪，通常表现为突然发病，精神不振，食欲废绝，体温升高，部分母猪可能出现打喷嚏，咳嗽等呼吸道症状，或是出现大批流产，早产，死胎，木乃伊胎等症状。被感染的仔猪通常表现为呼吸加快，厌食等症状。而育肥猪和较大的仔猪感染后往往只呈现一过性反应，症状相对较为缓和。1.1.4PRRS的防制近年来对PRRS的防制越来越引起相关部门的重视。目前的研究已知PRRSV主要通过免疫逃避，抗体依赖性增强以及免疫抑制等方式来促进感染。临床上用来防控PRRSV的疫苗主要有弱毒苗与灭活苗、基因工程苗、亚单位疫苗等。其中弱毒苗与灭活苗由于免疫原性差以及存在一定的安全隐患，已经不能给猪提供绝对的保护作用。基因工程疫苗：目前已有相关研究人员研发了腺病毒表达GP3-5、M、N蛋白的活载体疫苗，猪伪狂犬病毒作为载体的表达GP5蛋白的载体疫苗。亚单位疫苗：PRRSV的多个蛋白都可诱导机体产生中和抗体，目前主要以GP3、GP5的亚单位疫苗研究较为深入（BastosR.G.et.al.,2002;chiaM.Y.,2010）。1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒1.2.1概述猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为单股正链有囊膜的RNA病毒（Conzelmannetal.,1993;Gorbalenyaetal.,2006;Meulenbergetal.,1993），属于套式病毒目，动脉炎病毒科，其亚基因组由独特的不连续转录机制形成。1990年，荷兰科学家通过“科赫法则”实验报道PRRS的病原为有囊膜的RNA病毒，从而第一次分离出PRRSV，并命名为Lelystad毒株，与此同时，北美的研究人员也分离到类似的病毒毒株，命名为VR-2332毒株。Lelystad毒株和VR-2332毒株即后来人们所说的欧洲型和美洲型毒株(Wensvoortetal.,1991;Collinsetal.,1992;Wensvoortetal.,1992）。1.2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特性PRRSV病毒粒子呈卵圆形，直径约50-65nm(图1.2)。该病毒属于套式病毒目，动脉炎病毒属，此种类型的病毒还有马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（Lactatedehydrogenasevirus，LDV）以及猴出血热病毒（Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV）。它们所具有的共同特点是都能引起病毒血症，持续性感染和在巨噬细胞中复制增殖。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.1PRRSV的基因结构模式图Fig.1.1ThegenestructureofPRRSVPRRSV受温度和PH的影响比较大，一般情况下，在pH<5或是pH>7的情况下，病毒的活力将会下降95%以上，其最适的pH范围是6.5-7.5之间（BloemraadM,1994）。该病毒对热较敏感，病毒在-70℃可保存18个月，在4℃保存一周活力将会下降90%，在56℃，45min即可完全失去感染力。其次，PRRSV对一些有机溶剂非常敏感，经氯仿处理后，其感染性基本完全丧失（DeaS,2000）。1.2.3猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学特征，，PRRSV基因组全长大约在15KB左右，在5端有甲基化的帽子结构，在3端具有多聚腺苷酸尾巴（PolyA）尾巴（Meulenbergetal.,1993）。该病毒基因组包括多个开放阅读框（FirthA.E.,2011;denBoonJ.A.,1995;DeaS.,2000）。其中ORF1占整个基因组的大部分区域，包括ORF1a和ORF1b两个部分（FangY.,2010;vanAkenD.,2006;ZiebuhrJ.,2000），其主要功能是编码病毒的非结构蛋白。ORF2-4分别编码GP2，GP3，GP4蛋白，ORF5编码GP5蛋白，GP5是PRRSV主要的结构蛋白，包括胞外区，跨膜区和胞内区。ORF6编码M蛋白，属于非糖基化蛋白。ORF7编码N蛋白，是碱性磷酸蛋白，占病毒总蛋白的40%（LoembaH.D.et.al.,1996;NelsonE.A.,1993）。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.2PRRSV病毒粒子结构模式图Fig.1.2ThevirionstructureofPRRSV1.3猪血清淀粉样蛋白概论1.3.1概述血清淀粉样蛋白A(serumamyloidA，SAA)是一种多形态蛋白家族，其具有多种功能，尤其作为一种急性时相反应蛋白，在炎性反应和感染后的48-72小时之内，血清中的SAA可以显著的提高至1000倍之多（Kushner,1982;UhlarC.Metal.,1999）。在很多疾病中，都能检测到血清中SAA的升高，尤其在炎症反应和移植排斥反应中SAA的敏感性要远高于C反应蛋白（AHartmann,1997;LannergardAetal.,2003），这也预示着SAA作为一种新的检测指标越来越受到人们的关注。1.3.2SAA的结构SAA的发现是由于研究者在继发性淀粉样病变患者的血清中观察到与淀粉样蛋白A的交叉反应物，从而确定此反应物为血清淀粉样蛋白（MalleE,1993;Rosenthaletal.,1976)，此后SAA作为血清中淀粉样物质A的前体而被确定（Levinetal.,1973;HusbyandNatvig,1974;RosenthalandFranklin,1975）。SAA是一种高度异质性蛋白，其代表一个相对分子量约为12kD的蛋白家族。研究人员已经获得人类SAA完整的氨基酸序列，SAA在进化过程中非常保守，表明它可能具有极其重要的生物学功能。SAA主要由肝细胞产生，但肝外也有SAA的体质性表达。SAA是一种非常敏感的急性时相反应物（UhlarC.Metal.,1999）。近年来，SAA作为一种急性时相反应蛋白已被应用于临床(JovanovicD.B,2004)。人类的SAA基因位于11号染色体短臂，大小为150KB左右（Bettsetal.,1991;Sellaretal.,1994），其基因簇是由四个外显子和三个内含子排列而成(UhlarC.Metal.,1999)，其中包含四个基因：SAA1、SAA2、SAA3、SAA4（TaylorB.Aetal.,1984）。根据体内的表达情况，SAA家4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言族可被划分为两种类型，即急性型SAA（acuteSAA，A-SAA）和组成型SAA（consititutiveSAA,C-SAA)(陈长强，2012;WhiteheadA.Setal.,1992)。由于在急性反应过程或是促炎因子刺激下，SAA1和SAA2的表达量会迅速提高（XuYetal.,2006;GabayandKushner,1999），所以把SAA1和SAA2归为A-SAA(GabayandKushner,1999;UhlarandWhitehead,1999)，而SAA4基本不受促炎因子的影响，故把其归为C-SAA(DeBeerM.Cetal.,1995)。在人类中SAA3被认为是一种假基因（Kluve-Beckermanetal.,1991）。和人类SAA基因一样，鼠的SAA基因家族也是由SAA1,SA2,SAA3,SAA4组成，位于7号染色体上，鼠的SAA基因家族也含有四个外显子和三个内含子。然而人类的SAA基因彼此之间的相关性要比和它们对应的鼠的基因的相关性大（UhlarC.Metal.,1994），这表明在进化过程中，SAA基因的物种均质化（UhlarC.Metal.,1994;LiaoD,1999）。在每种物种之间，SAA1，SAA2是高度同源的，SAA3的同源性要低一些（LowellC.Aetal.,1986;Kluve-BeckermanBetal.,1991）。SAA4是SAA家族中最相异的，所有的SAA基因共同分享相同的四个外显子和三个内含子的结构（SteelD.Metal.,1994）。在鼠上，主要的急性期SAA蛋白是由SAA1和SAA2编码的，作为一种成熟的蛋白质，鼠的SAA1含有103个氨基酸，和人类的SAA1有70%的同源性。从目前的研究成果来看，鼠的SAA1和SAA2蛋白和人类的急性期SAA蛋白有很多相似的功能，因此常被用来生物研究中。目前敲除鼠的SAA1和SAA2的实验动物模型已经建立，并被应用于最近的新的研究中。人类的SAA3是一种假基因，与人类不同的是，鼠的SAA3可以编码有功能的基因产物（(MeekandBenditt,1986;BendittandMeek,1989），并且主要表达在除了肝脏的组织和细胞中，包括脂肪细胞和巨噬细胞。在炎性组织和肥胖的小鼠中，SAA3的表达可以被高度诱导。有趣的是在很多其他物种中SAA3的转录本可以被检测到，除了一些例外，比如人。对鼠的SAA3的研究有可能帮助理解SAA蛋白在生理和病理条件下的潜在功能。尽管在炎性反应组织中，鼠的SAA3的表达量是充足的，但是它不引起淀粉样变，在急性反应时期，也不会导致血浆中SAA水平的提高。在脂肪细胞中，在缺氧的条件下，SAA3的表达可以被诱导。在免疫细胞，SAA3可以结合MD-2，然后通过TLR4激活NF-ĸB通路。更有研究表明，鼠的SAA3在肿瘤转移的过程中发挥了重要的作用。SAA4可以在人类的肝脏组织以及除肝脏之外的其他组织中表达(UpragarinNetal.,2005)，然而鼠的SAA4只在肝脏组织中被发现有表达（deBeerM.Cetal.,1994）。在炎性反应期间，SAA4被影响的程度没有SAA1大，因此SAA4在人类和鼠中不被认为是一种急性时相的基因（WhiteheadA.Setal.,1992;YamadaTetal.,1994;YamadaTetal.,1997）。现在的SAA就是是根据人类和鼠中的SAA基因进行命名的（SipeJetal.,1999）。猪的SAA基因家族的四个基因已经被确认，其位于2号染色体，基因长度大约60kb，猪SAA的命名是根据人和鼠的命名方式来进行的。研究者命名猪SAA基因簇上四个猪的基因位点从左到右为SAA1，SAA2，SAA4，SAA3(图1.3)。但是这些基因产物的功能仍不是特别的明确。目前的研究发现，猪的主要SAA蛋白有一些SAA3蛋白的特性，但是在其他哺乳动物中，主要的SAA蛋白为SAA1和SAA2蛋白。猪的SAA不同于相应的人和鼠的SAA，猪的SAA在预测的第四个螺旋结构处有一个8个氨基酸的插入序列。尽管缺乏区分SAA基因型的免疫实验，但是基于SAA3特有的碱性等电点的分析方法表明，在一些比如狗，马，牛的乳房中，SAA3是正常以及发炎组织中的主要的基因类型（JacobsenSetal.,2006;Kjelgaard-HansenMetal.,2007）。在急性反应应答时期，在肝脏以及非肝脏组织中可以发现SAA3，而SAA1、SAA2优先的在5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言肝脏中表达。在急性反应时期，和其他急性蛋白相比，这种基因型的组织特异性差异调节是SAA蛋白特有的特征。在很多组织中能够检测到SAA3蛋白，包括肝脏（SkovgaardKetal.,2009;ChangW.Cetal.,2007;SolerLetal.,2011）乳腺组织（RodriguezBdJetal.,2009），唾腺，膈肌，肺脏（SolerLetal.,2011），淋巴结，脾脏，扁桃体，血白细胞（SkovgaardKetal.,2009）。由于缺乏其他SAA基因型和循环SAA蛋白的证据，这导致SAA3是目前猪血液循环中SAA的主要形式（SolerLetal.,2011;SolerLetal.,2013）。图1.3猪SAA家族基因结构(OlsenH.Get.al.,2013)Fig.1.3TheporcinegenestructureofSAA(OlsenH.Get.al.,2013)1.3.3SAA的功能首先SAA蛋白是一种重要的载脂蛋白（(BendittandEriksen,1977;Bendittetal.,1982），并在胆固醇的逆向转运中起了非常重要的作用（HuaS.,2009）。肝脏或是小肠合成的高密度脂蛋白可与蓄积于末梢组织的游离胆固醇结合而使胆固醇运送到各组织细胞，主要是肝脏，这一过程称为胆固醇逆转。载脂蛋白Apoa-I是血浆高密度脂蛋白（Highdensitylipoprotein，HDL）中最主要的载脂蛋白。一些体外研究表明SAA和Apoa-I的结构非常相似。血液中SAA能替代Apoa-I作为主要的HDL载脂蛋白(CoetzeeG.A.,1986)，SAA进入血浆后与HDL结合(BendittE.Petal.,1977)，通过置换HDL上的Apoa-I(BendittandEriksen,1977;Urieli-ShovalSetal.,200;Coetzeeetal.,1986)和抑制卵磷脂胆固醇酞基转移酶活性,影响HDL清除胆固醇,从而造成胆固醇无法正常代谢，引起心血管疾病和动脉粥样硬化疾病（DongZetal.，2011）。当SAA在HDL上富集达到一定程度后，将会导致HDL对胆固醇的运转能力下降，并且SAA还会增加巨噬细胞对胆固醇酯的摄取(MiidaTetal.,2006;ArtlAetal.,2000)。当HDL上有SAA存在时,前者对巨噬细胞的亲和力将会增加2～3倍（KisilevskyRetal.,1992）。在炎性反应和急性反应时相过程中，胆固醇的流出能力会下降（McgillicuddyF.Cetal.,2009）。研究表明，当SAA在实验老鼠体内高表达时，巨噬细胞内胆固醇的分泌也会相应的降低（AnnemaWetal.,2010）。更有一些研究分析了2型糖尿病患者SAA与细胞胆固醇分泌之间的相互关系，研究表明此类患者体内清道夫受体B1介导的胆固醇流出过程显著受损，但是SAA水平有显著上升(TsunJetal.,2013)。其次，SAA在炎性反应应答中起了非常重要的作用（YangR.Zetal.,2006）。其中它的促炎6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言性反应的作用是通过诱导细胞因子和趋化因子的产生，以及通过TLR2，FPR2受体来发挥趋化作用来实现的。反之，一些细胞因子和受体也能够促进SAA的表达产生(DeBuckMetal.,2016)。趋化因子是具有趋化性质的小蛋白，目前已经大约有50种趋化因子被确认(BromleyS.K.etal.,2008)。这些趋化因子可以为免疫细胞提供趋化信号(Weber,S.Netal.,2010)。在组织损伤的区域，趋化因子的表达将会被上调，他们的上调表达将会导致免疫细胞的浸润，包括淋巴细胞，中性粒细胞，单核细胞。在一些诸如肝炎的肝脏疾病中，趋化因子以及趋化因子受体发挥了至关重要的功能(SimpsonK.J.etal.,2003;Moreno,Cetal.,2005;AjueborM.Netal.,2004)。趋化因子可以从一些免疫细胞和普通细胞中分泌，包括肝细胞，枯否氏细胞以及内皮细胞。在炎症反应时期，编码SAA1和SAA2的基因可以被促炎症因子，包括IL-6、TNF-α所诱导(ItoAetal.,1999;GanapathiM.Ketal.,1991)。作为促炎症反应的中介者，SAA可以通过诱导噬中性粒细胞，单核细胞以及T细胞的趋化性来行使功能，也可以促进白细胞浸润，促进噬中性粒细胞粘附到内皮细胞(XuLetal.,1995;Badolato,Retal.,1994)，也可以刺激噬中性粒细胞和单核细胞释放细胞因子(HeRetal.,2003;FurlanetoC.Jetal.,2000)，趋化因子(LeowK.Yetal.,2012)以及基质金属蛋白酶(LeeH.Yetal.,2005;VallonRetal.,2001)来行使功能。这些发现都表明SAA在炎症反应建立以及维持过程中发挥的重要作用。7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.4细胞因子-SAA-趋化因子网络(M.DeBucketal.,2016)Fig.1.4Thecytokine-SAA-chemokinenetwork(M.DeBucketal.,2016)一些细胞因子对SAA的诱导起了非常重要的作用(KumonYetal.,2001;Pate1Hetal.,1998)。在炎性反应条件下，巨噬细胞，其他白细胞能够产生大量的IL-1，IL-6，TNF-α来诱导SAA的产生（JiangS.Letal.,1995）。这些细胞因子能够结合到合适的受体上，然后激活不同的细胞内信号转导通路，最终引起一些转录因子的激活，这些转录因子的激活大多通过磷酸化作用。在人类中细胞因子对A-SAA的诱导有四个转录因子是非常重要的：NF-ĸB，可以被IL-1、TNF所激活(PoitouCetal.,2009;Urieli-Shovaletal.,1994;RayB.Ketal.,1997)；NF-IL6，可以被IL-1、IL-6(BettsJ.Cetal.,1993;EdbrookeM.Retal.,1989;KogaTetal.,2008)、NF-IL6β所激活；NF-IL6β可以被磷酸化的NF-IL6所激活(MalleEetal.,2009)；SAA激活序列激活因子（SAAactivingfactor,SAF），可以被IL-6、LPS所激活（JensenL.Eetal.,1998）。通过结合这些转录因子来调节A-SAA的启动子，最终引起A-SAAmRNA的转录。同样的，SAA也能够结合TLR2、FPR2等受体（图1.4）从而诱导产生不同的细胞因子和趋化因子，在炎症发生过程中起了非常重要的作用。IL-1β、IL-6、TNF-α是比较常见的可以被SAA诱导的细胞因子。IL-1β在SAA刺激后的18-24小时可以达到最大值(FurlanetoC.Jetal.,2000;HatanakaEetal.,2007;NiemiKetal.,2011)，但是最大值也不会超过1ng/mL(SongCetal.,2009;YuNetal.,2015)。在单核细胞，巨噬细胞，滑膜细胞，角质细胞中，相对于LPS(MigitaKetal.,2010MigitaKetal.,2014)，通常需要较高浓度的SAA（1-10μg/mL）来诱导细胞因子的产生（EdbrookeM.Retal.,1991;JiangS.Letal.,1995;LiYetal.,2011）。在中性粒细胞和HNC-1柱状细胞中，需要更高浓度的SAA才能诱导IL-1β的产生（NiemiKetal.,2006）。研究人员已经证明了SAA能够通过结合巨噬细胞以及角质细胞表面的TLR、TLR4来刺激IL-1β的产生，如果用抗TLR2，TLR4的抗体培养这些细胞，那么由SAA刺激的IL-1β的mRNA的表达水平将会下降。更加重要的是，8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言如果同时用这两种抗体处理细胞，IL-1β的mRNA的表达将会继续下降。图1.5在单核细胞以及中性粒细胞中SAA1α趋化性的机制(M.DeBucketal.,2016)Fig.1.5MechanismofchemotacticactivityofSAA1aonmonocytesandneutrophils(M.DeBucketal.,2016)相对于细胞因子，急性时期的蛋白SAA能够诱导更高水平的趋化因子（图1.5）。其他一些为人所熟知的趋化因子诱导者是LPS以及SAA诱导产生的细胞因子IL-1β。事实上，SAA同脂多糖以及IL-1β一样，也能最大量的诱导趋化因子的产生。根据细胞类型的不同，SAA、LPS,、IL-1β能够在24小时后分别诱导2–400ng/mL（WestermarkG.Tetal.,1990），3–400ng/mL（SunLetal.,2014）或者7–400ng/mL（S.O’Reillyetal.,2014;LakotaKetal.,2013;MullanR.Hetal.,2010）的CXCL8，CCL2，CCL3的产生。更加重要的是，诱导趋化因子产生所需的SAA的量和LPS差不多。SAA诱导趋化因子产生所需的浓度已经达到ng/mL的范围，刺激单核细胞3小时后，10ng/mL的SAA的浓度已经足够诱导产生CXCL8（(8ng/mL）（CaiHetal.,2007）。相比于SAA和LPS,IL-1β在更低的浓度就能诱导产生足够量的趋化因子。最后，有研究表明，SAA在病毒感染过程中起了非常重要的作用。研究发现,在病毒感染的急性期，甲型乙型肝炎、巨细胞病毒感染、副流感病毒、传染性单核细胞增多症、腺病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等病毒感染中，SAA水平都有轻到中度的升高，在恢复期降低到正常。更9 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言有研究推测SAA可抑制病毒入侵，最近的研究发现病毒感染的病人有更高水平的血清SAA（LannergårdAetal.，2003）。在一例女性酒精性肝硬化病例中，用免疫组织化学检测肝脏结节呈SAA1阳性（KimS.Retal.,2014）。这些研究表明肝炎可能导致SAA表达的提高，SAA能够加剧肝炎的发展。然而，其他研究有报道，在培养的细胞中，SAA具有抗丙型肝炎病毒的抗病毒活性。SAA能够通过结合丙型肝炎病毒粒子进而特异性阻止病毒进入细胞而发挥作用（CaiZetal.,2007;LavieMetal.,2006）。因此需要进一步的研究来确定SAA1表达和各种形式的肝炎，例如病毒性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，自身免疫性肝炎之间的联系，进而进一步确定SAA1在肝炎中的作用。因为丙型肝炎病毒感染是通过病毒包膜上的糖蛋白与靶细胞表面受体、B族型清道夫受体结合后侵入细胞形成感染。SAA可作为天然配体,通过竞争性地结合受体而阻止病毒侵入靶细胞。随着对SAA功能的不断深入，SAA在病毒感染中的作用也越来越受到关注。1.4研究现状目前，人的SAA蛋白功能已经越来越明确，并且已经在多种疾病诊断中得到广泛应用，其中包括一些细菌、真菌、病毒相关的感染性疾病(ArnonSetal.,2002)、急慢性炎症性疾病(刘钢等，2002)、肿瘤、癌症（RosenthalC.Jetal.,1979;ChanD.Cetal.,2007;GlojnaricLetal.,2001）、异地移植排斥反应、冠心病（FyfeA.Ietal.,1997;JohnsonB.Detal.,2004）以及一些少见病中。研究发现，在一些病毒、细菌性的感染疾病中，都能够观察到SAA的升高(HuttunenTetal.,2003)。而病毒感染中，C-反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）几乎不升高或是升高不明显(LannergardAetal.,2003)。这也预示着在某些病毒细菌感染中，SAA的敏感性要远高于CRP。其次在淀粉样变性病中，SAA是组织淀粉样蛋白A(amyloidA，AA)的前体物质，SAA在淀粉样性疾病中起到了关键性的作用(VanderHilstJ.C,2011)，在淀粉样性疾病患者的血清中，可以检测到SAA明显的升高(GillmoreJ.Detal.,2001)。另外在肾脏移植排斥反应中也可以检测到A-SAA的升高，研究发现，血清中A-SAA是排斥反应中最早升高的指标之一(MüllerTetal.,1992)。再如在一些冠心病、动脉粥样硬化、心血管疾病等疾病中，SAA释放到血液之后能够与HDL结合，从而影响胆固醇的代谢（DelangheJ.Retal.,2002）。因此SAA可作为心血管疾病中的危险因素(KarakasSetal.,2011;ZakynthinosEetal.,2009)。目前对猪SAA的研究还比较少，但是已有研究表明在自然爆发的猪繁殖与呼吸综合征条件下猪血清和唾液中SAA的基本水平已经被确定，并且在发病猪和健康猪中，SAA的含量表现出明显的差异，其中血清中SAA平均值大约是60mg/L，唾液中SAA的平均值大约是5mg/L。在血清中SAA的切点值为66.4mg/L，表现出68.9%的敏感性，68.09%的特异性。然而在唾液中的SAA切点值为5.59mg/L表现出的敏感性和特异性在69–66%之间。因此唾液和血清中的SAA含量需要被进一步确定从而一致的区分健康组和PRRS感染猪。在猪产业中，一些健康生物指标应用的植入面临很多需要，例如在经济项目中合理的测量，在产业链的任何环节都能很容易的实行，最重要的是，能够回答畜群管理的结果。急性期蛋白是被公认的猪健康和福利的生物指标，SAA被认为是猪主要的急性期蛋白，并且在这个物种中，它已经在不同的疾病中得到临床的确认。然而在很多文献中也提到很多关于测量技术的缺点。由于缺乏有力的敏感的允许检测健康猪的基本SAA含量的方法，所以不能对SAA进行定量，并且有效的切点值也不能被确定。目前通过测定10 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言唾液中SAA的含量来进行疾病的判断已经变得越来越流行，此方法便利简单，已开始被广泛应用。虽然SAA在众多疾病的诊断当中发挥了重要的作用，但是其发挥作用的机制和原理仍不明确，所以对SAA的深入研究可以为相关疾病的诊断与检测提供有利的信息和帮助。随着对SAA研究的不断深入，猪的SAA的结构和功能也在不断研究中(OlsenH.Getal.,2013)。研究发现，在被猪繁殖与呼吸综合征影响的育成猪的唾液和血清中，SAA的含量都有不同程度的升高(SolerLetal.,2012)。更有研究发现，只能在肝脏中检测到猪的SAA2，SAA4，但是在肝脏以外的脾脏和肺脏都能够检测到SAA3，这表明SAA3是猪上主要的肝脏外可诱导的SAA基因型。并且在被胸膜肺炎放线杆菌和金黄色葡萄球菌感染的猪体内，相对于对照组，在肝脏、脾脏、肺脏中都能检测到SAA3具有不同程度的升高(OlsenH.Getal.,2013)。这些结果表明，猪的SAA可能和人的SAA不同，猪的SAA3可能是血液循环中主要的SAA类型。尽管对猪SAA的研究已经越来越深入，但是猪SAA在某些疾病中是否也会有不同程度的升高以及其作用机制是什么仍不明确，需要进一步的探讨和研究。1.5研究目的和意义作为人类疾病中高敏感的检测指标，SAA已经被运用到各类疾病的诊断检测中(YamadaTetal.,1999)。但是在猪的体内，SAA是否具有和人的SAA相似的特征仍不明确。在猪的相关疾病中，尤其是病毒感染性疾病中，SAA的组织分布以及SAA与病毒感染之间的关系有待进一步研究。研究已经发现，PRRSV感染猪后能够引起严重的间质性肺炎，能够刺激相关的巨噬细胞、单核细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-ɑ等促炎性细胞因子。而人的A-SAA已被证明是主要的急性时相蛋白，与炎症反应息息相关，而对猪SAA研究甚少。所以本研究主要围绕PRRSV感染后，SAA的表达变化以及SAA与PRRSV之间的相互关系进行展开，从而进一步探讨猪SAA的与病毒感染的相互关系，为进一步阐明猪SAA在PRRSV感染中的作用以及相关的作用机制奠定基础。11 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析血清淀粉样蛋白A（serumamyloidA,SAA）是一种急性时相反应蛋白，在炎症反应或是感染后的5-6小时，即可大量表达，因此SAA已经被广泛的用于人类疾病的早期监测当中。虽然人类SAA的分类、结构和功能已经日渐清晰，但是对猪的SAA的研究还处在初级阶段。已有研究发现，猪的SAA可能不同于人类和鼠的SAA，人类的SAA3是一种假基因，而猪的SAA3分布于各种组织中，并表现出一些人类SAA1和SAA2的特性，所以对猪的SAA3基因结构进行深入研究就显得尤为重要。本章利用生物信息学技术对猪SAA3分子进行分析，并将猪SAA3分子序列与人和鼠的SAA1、SAA2、SAA3、SAA4进行序列比对，旨在进一步明确猪SAA3的结构与功能。其次利用基因克隆技术克隆猪SAA3分子，为阐明猪SAA3分子的功能奠定基础。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1细胞、猪IFN-α干扰素细胞：本实验PAMs分离自无PRRSV感染及免疫的猪。IFN-α干扰素：购自SinoBiological公司。2.1.1.2主要仪器与试剂主要仪器：PCR仪；电泳仪；水平电泳槽；凝胶成像仪；分光光度计；制冰机；高速冷冻离心机（Eppendorf）；超纯净水仪；FA/JA系列电子天平；迷你离心机LX-200型。主要试剂：培养细胞所用到的胎牛血清、0.25%-EDTA胰酶、RPMI-1640培养基等均购自Gibco公司。RNA提取所用到的Trizol试剂、RNA酶抑制剂、反转录酶MLV、快速反转录试剂盒等均购自宝生物工程有限公司。PCR相关试剂购自上海英潍捷基生物工程有限公司。实验所用到的引物均有Invitrogen公司合成。2.1.2方法2.1.2.1猪SAA3扩增引物的设计根据GenBank中猪SAA3基因序列（NM_001044552.1），应用prime5.0设计引物，扩增猪SAA3分子的开放阅读框（openreadingframe,ORF）区域。引物序列见表2.1。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析表2.1引物序列Table2.1Primersequences引物序列SAA3-FGCGTCGACATGAAGCTTTCCACGGGCATCATTTTCTGCTTCCTSAA3-RCGGGATCCGTACTTGTCAGGCAGGCCACGAGGTCTGAAGTGGT2.1.2.2猪SAA3基因克隆（1）猪肺泡巨噬细胞的获取：将40日龄左右的猪颈部放血，无菌摘取其肺脏，用灭菌后的PBS冲洗肺的表面，然后用30mLPBS从气管进入肺脏，轻轻的揉搓肺脏，用移液器轻轻吹打，吸取PBS灌洗液。如此反复进行，直到灌洗液变的清亮(Wensvoortetal.,1991)。然后将灌洗液在4摄氏度预冷的离心机中，1000r/min，离心10min，弃上清，然后再用PBS悬浮细胞，如此进行两次，最后弃上清，用含有5%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，过滤后勇细胞计数板进行细胞计数后置于24孔培养板中进行培养。（2）PAMs细胞的处理：将200ng/mL的IFN-α处理PAM细胞(马改妮，2016)，待24小时后，收取细胞，提取细胞的RNA，用于后续的基因扩增。（3）RNA的提取：将上述用IFN-α处理过的PAM细胞用Trizol裂解法抽提细胞中的总RNA。首先弃去细胞板中培养液，用PBS洗两遍，目的在于清洗掉细胞板中粘附的死细胞，然后每孔加入500μLTrizol液，用移液器反复吹打以充分裂解细胞。将上述裂解液转移至无RNA酶的1.5mLEP管中，再加入1/5体积的氯仿，在振荡器上充分震荡一分钟，在4℃条件下，转速12000rpm离心15分钟。取上清后加入等体积的异丙醇以充分沉淀RNA，然后离心10分钟后弃上清。加入75%的乙醇洗涤离心管后将EP管放在通风橱中使得乙醇自然蒸发。最后加入20μLRNAfreeH2O混匀，瞬时离心。并对RNA的浓度进行测定。（4）反转录：在PCR反应管中加入RNA4μL，加入1μL10mmol的dNTPs和1μLRandomprimer6引物以及0.2μLSAA3-R引物，加入6.3μL的RNase-free水，混匀后于65℃，5min；-20℃；2min，再加入适量的5×M-MLV反应缓冲液、还原剂DTT、M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用RNase-free水补充到20μL。混合液于37℃，45min；75℃，15min后得到cDNA序列。（5）PCR扩增：以特异性引物扩增猪SAA3基因。向PCR管中加入5×Q5缓冲液5μL，上下游引物各0.25μL（100pmol/μL），cDNA0.5μL，10mmol的dNTPs0.5μL,Q5酶0.3μL，加RNase-free水补充到25μL。反应条件如下：95℃预变性30s；95℃变性15s；54℃退火30s；72℃延伸1min，共35个循环；PCR结束之后进行凝胶电泳分析。2.1.2.3猪SAA3分子序列及序列的生物信息学分析用DNAStar中的EditSeq模块初步进行SAA3的序列分析，采用DNAStar中的Protean模块对SAA3分子的抗原性，亲水性以及表面可及性等进行分析，为后续合成抗原小肽打下基础。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析2.2结果2.2.1猪SAA3基因克隆成功克隆了猪SAA3开放阅读框区域，大小为393bp，详见图2.1。图2.1猪SAA3的PCR扩增结果Fig.2.1PCR-amplifiedresultofporcineSAA3M:DNA分子质量标准(DL2000);1:SAA3基因的PCR产物;M:DNAMarker(DL2000);1:PCRproductsofSAA3gene;2.2.2测序结果2.2.2.1核苷酸序列扩增的猪SAA3分子共393bp，编码130个氨基酸。序列如下：ATGAAGCTTTCCACGGGCATCATTTTCTGCTTCCTGATCCTGGGTGTCAGCAGCCAGAGATGGGCATCATTCCTCAAGGAAGCTGGTCAAGGGGCTAAAGACATGTGGAGAGCCTACTCGGACATGAGAGAAGCCAATTACAAAAATTCGGACAAGTACTTCCATGCCCGGGGCAACTATGATGCTGCCCAAAGGGGACCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTGATCAGCGATGCCAGAGAGAATGTCCAGAGAGTCACAGACTTGTTTAAGCATGGAGACAGTGGCCACGGAGTGGAGGACTCAAGGGCTGACCAGGCTGCCAATGCATGGGGCCGGAGTGGCAAGGACCCCAACCACTTCAGACCTCGTGGCCTGCCTGACAAGTACTGA2.2.2.2氨基酸序列氨基酸序列如下：MKLSTGIIFCFLILGVSSQRWASFLKEAGQGAKDMWRAYSDMREANYKNSDKYFHARGNYDAAQRGPGGAWAAKVISDARENVQRVTDLFKHGDSGHGVEDSRADQAANAWGRSGKDPNHFRPRGLPDKY.14 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析2.2.2.3序列的遗传差异性分析利用DNASTAR中MegAlign模块，将猪的SAA3氨基酸序列分别与猪的SAA1、SAA2、SAA4氨基酸序列进行相似性分析。将猪的SAA3氨基酸序列与小鼠的SAA1、SAA2、SAA3、SAA4氨基酸序列进行比对。由于人的SAA3分子已被证明为假基因，故只将猪的SAA3氨基酸序列与人的SAA1、SAA2、SAA4氨基酸序列进行比对。结果显示：猪的SAA3氨基酸序列与猪的SAA1、SAA2、SAA4的相似性分别为82.5%，87%，59.1%。猪的SAA3氨基酸序列与人的SAA1、SAA2、SAA4的相似性分别为72.7%，71.8%，56.9%。有趣的是，相对于人的SAA1、SAA2，猪在第86位氨基酸到第93位氨基酸之间有一个八个肽的插入。猪的SAA3氨基酸序列与鼠的SAA1、SAA2、SAA3、SAA4的相似性分别为64.4%，62.1%，74.2%，56.2%。同样地，相对于鼠的SAA1、SAA2、SAA3，猪的SAA3氨基酸序列也有八个肽的插入。由以上结果可以看出，猪的SAA3与人的SAA1，SAA2的相似性更高，但与鼠的SAA3相似性更高。2.2.2.4序列的生物信息学分析抗原域的预测：利用DNASTAR软件中的Protean模块预测猪SAA3分子的抗原指数，由预测结果可以看出，猪SAA3编码的氨基酸的抗原域主要集中在16aa-70aa,75aa-130aa，详见图2.2。图2.2猪SAA3基因编码的主要抗原域预测Fig.2.2ThemajorantigenicdomainsencodedbytheporcineSAA3geneprediction二级结构预测：利用DNASTAR软件中的Protean模块对猪SAA3分子的二级结构进行预测，Carnier-Robson方法和Chou-Fasmon方法预测的结果有所差异。图2.3猪SAA3基因编码的氨基酸的二级结构预测Fig.2.3SecondarystructurepredictionporcineSAA3geneencodedaminoacids通过对猪SAA3分子的表面可及性预测，我们可以看出猪SAA3分子表面可及性预测区域有：15 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析Arg67-Pro67,Asp78-Val83,Val99-Ala108,Gly112-Ter131。图2.4SAA3基因编码的氨基酸表面可及性预测Fig.2.4AminoacidsencodedbytheSAA3genesurfaceprediction2.3讨论已有文献报道，猪SAA3可能是主要的SAA蛋白，因为SAA3蛋白含有一些人类SAA1的特性，因此本章主要对猪SAA3的结构进行分析。本实验成功克隆了猪SAA3的开放阅读框序列，大小为393bp，编码130个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽。人的SAA1、SAA2编码122个氨基酸，前18位氨基酸为信号肽，相比于猪的SAA3，有8个肽的缺失。人的SAA4编码130个氨基酸，有一个插入的八肽序列并可形成N末端连接的糖基化位点（UhlarC.Metal.,1999;陈长强等，2012）。但是即便如此，猪的SAA3与人的SAA1、SAA2有更高的同源性，约为70%左右。已有研究发现，猪SAA3的功能和人的SAA1、SAA2更相似，表现为猪SAA3的广泛组织的分布以及在应激或是感染中SAA3蛋白表达的上调等。对猪SAA3基因结构的比对和解析对进一步研究SAA3的功能提供帮助。通过将猪SAA3与猪SAA1、SAA2、SAA4比对，发现SAA3与SAA1、SAA2有更高的同源性，约为85%，与SAA4的同源性仅为60%左右。已有文献报道，在细菌感染的情况下，SAA3的表达会显著上调，而SAA1、SAA2几乎不受影响（OlsenH.Getal.,2013），在人类中,SAA1和SAA2被成为急性型反应蛋白，在炎症反应以及一些感染性疾病中，SAA1和SAA2的表达量会迅速升高。因此人类SAA1常作为某些疾病的监测指标而被广泛运用。这也说明猪的SAA结构和功能是完全不同于人类和鼠的，猪SAA的功能仍需要进一步的研究。通过对猪SAA3蛋白抗原域、二级结构的预测以及表面可及性预测，预测出SAA3抗原性较强的区域，为进一步合成抗原小肽提供结构基础。目前对于猪SAA的研究仍处于初级阶段，对猪SAA基因家族的基因结构以及功能仍有很多不明确的地方。通过克隆猪SAA3基因以及与其他物种的SAA序列比对，有助于进一步解析猪SAA3的结构，研究猪SAA蛋白之间以及猪SAA蛋白与其他物种之间的联系和区别，从而鉴定出猪SAA各个蛋白的主要功能；因为目前人和鼠SAA分子的结构和功能已经越来越明确，通过16 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪SAA3分子基因克隆及序列生物信息学分析借鉴其他物种SAA与猪源SAA的相似性和相异性有助于更深一层的解析猪SAA的结构，为进一步研究猪SAA功能提供理论基础。17 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证作为一种重要的某些疾病的指示因子，在人类疾病中，SAA已被广泛应用于疾病的诊断监测中。但是由于目前对猪SAA的研究只处于初级阶段，SAA的结构和相应的功能仍在探索当中，所以为了进一步在分子层面探究猪SAA的功能，制备多克隆抗体是必需的。已有研究表明，猪SAA3可能是血液循环中主要的SAA类型，这也说明SAA3可能在SAA家族中有着不可替代的功能，本章通过制备猪SAA3多克隆抗体，为进一步研究猪SAA3的功能奠定基础。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1细胞，菌株，动物，载体293T细胞由本实验室保存。载体p3xFlag-CMV-7.1由本实验室保存。菌株DH-5α购自上海天根生物有限公司。新西兰兔购自某兔场。3.1.1.2主要试剂与仪器主要仪器：高速冷冻离心机（5417R型）、全温双层摇床（SKY-2102C型）、低温冷冻离心机、超声破碎仪（Uibracellsonics）、三孔加热恒温水浴锅（DK-8D型）、超净工作台、美国BIOTek的酶标仪、SartoriuspH计（PB-10型）、恒温培养箱（MJX-160B-Z型）、恒温培养箱（Thermo）。主要试剂：构建质粒所用到的核酸内切酶、T4DNA连接酶以及相应的buffer购自Takara有限公司；核酸电泳所用到的DNAMarker、6xloadingbuffer、TAE缓冲液购自天根生物有限公司；蛋白电泳所用到的蛋白质预染Marker购自Thermoscientific公司；培养细胞所用到的DMEM培养液、PBS、RP1640培养液购自Gibco公司；转染所用到的脂质体2000购于Invitrogen公司。HRP标记的羊抗鼠的荧光二抗以及羊抗兔荧光二抗购于lifetechnologies公司。3.1.2方法3.1.2.1抗原小肽的合成根据上述对SAA3分子抗原性，亲水性以及表面可接触性等的分析，选择SAA3第69位-126位氨基酸合成抗原小肽。我们选择在合成的抗原小肽C端加入一个半胱氨酸进而与载体蛋白以钥孔虫斤血蓝蛋白（keyholelimpethemacyanin，KLH）进行偶联以增强抗原小肽的抗原性。然后将偶联的蛋白作为抗原免疫兔子，进而获得多抗血清。3.1.2.2多克隆抗体的制备兔子的免疫程序：将合成的抗原小肽用生理盐水进行稀释，然后与完全或是不完全弗氏佐剂1:1混合。然后将稀释好的抗原分别在颈部进行皮下注射，在大腿后侧进行肌肉注射，每个部位注射免疫总量的1/4，目的在于增强免疫应答。具体的免疫程序见表3.1。18 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证表3.1免疫程序Table3.1Immuneprocedure接种次数抗原接种量注射部位一免（第1天）弗氏完全佐剂+蛋白500μg/只颈部皮下+大腿肌肉二免（第15天）弗氏完全佐剂+蛋白500μg/只颈部皮下+大腿肌肉三免（第29天）弗氏不完全佐剂+蛋白250μg/只颈部皮下+大腿肌肉四免（第36天）弗氏不完全佐剂+蛋白250μg/只颈部皮下+大腿肌肉五免（第43天）弗氏不完全佐剂+蛋白250μg/只颈部皮下+大腿肌肉兔子多抗血清的ELISA效价检测，将收集的多抗血清用ELISA检测效价，具体步骤如下：1.首先将抗原小肽用碳酸盐缓冲液稀释成5μg/mL，然后在ELISA板中每孔加入100μL，4摄氏度孵育过夜。2.用清洗缓冲液洗掉未结合的抗原，清洗两次。然后每孔加入200μL的封闭液，室温孵育两个小时。弃去封闭缓冲液，并用清洗缓冲液清洗三次。3.分别将多抗血清按照1:3125,1:6250,1:12500,1:25000,1:50000的比例用封闭缓冲液进行稀释，对照组用未进行免疫的兔血清，1:3000稀释。然后将稀释的血清每孔加100μL，室温孵育一个小时。4.用清洗缓冲液洗三次，然后每孔加入HRP标记的羊抗兔的IgG(1:5000稀释)，37摄氏度孵育45分钟。5.用清洗缓冲液清洗三次，每孔加入100μL的底物，室温孵育十分钟，然后加入终止液。6.进行读数。3.1.2.3真核表达质粒的构建真核表达载体的构建：将上述克隆的猪SAA3基因进行胶回收，并将胶回收产物以及p3×Flag-CMV-7.1进行双酶切，酶切条件为：37℃，5小时，酶切体系见表3.2，表3.3。然后进行连接、转化，步骤如下：1.将感受态细胞迅速拿出，置于冰上自然解冻融化。2.然后将全部连接产物迅速加到感受态细胞中，冰上孵育30min。3.迅速拿到水浴锅中，42℃，热击90s，再置于冰上2min。4.向感受态细胞中加入800μLLB培养基，轻轻吹打混匀，置于37℃摇床瑶60min，转速为180r/min。5.将菌液6000r/min，离5min，弃掉培养液，剩下的菌液用移液枪在超净工作台中吹打混匀，并涂布于100μg/mL的AmpLB培养板上。6.在37℃恒温培养箱中正置培养半个小时，然后倒置培养。7.挑取培养基中的单个菌落，接种于100μg/mLAmp的LB液体培养基中，置摇床培养过夜，取1mL菌液，用质粒小提试剂盒进行质粒的提取，并送公司测序。19 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证表3.2P3×Flag-CMV-7.1酶切体系Table3.2P3×Flag-CMV-7.1Digestionsystem体系成分用量（μL）p3×Flag-CMV-7.11SaII2BamHI210×Buffer5Total50表3.3胶回收产物酶切体系Table3.3Plasticrecyclingproductdigestionsystem体系成分用量（μL）胶回收产物20SaII2BamHI210×Buffer5Total50表3.4连接体系Table3.4Connectionsystem体系成分用量（μL）T4DNALigase0.52×LigationBuffer6p3×Flag-CMV-7.11酶切产物4.5Total123.1.2.4多克隆抗体的验证Western-blot验证抗体:（1）293T细胞的培养1.将冻存的293T细胞从液氮灌中拿出，放到42℃水浴锅中迅速旋转融化然后转移到T25细胞培养瓶中进行培养。2.待细胞贴壁长满后，进行细胞传代：首先将细胞用PBS清洗两遍，然后加入0.25%EDTA的胰酶，放在含有5%CO2，37℃恒温培养箱中消化30s，弃掉消化液，然后用10%的RPMI-1640培养基吹打计数后制成细胞悬液后进行培养。3.待细胞长到良好的状态和数量，再次将细胞消化，铺于6孔板中，每孔细胞为105个。（2）293T细胞的转染20 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证待6孔板中的细胞长到大约70%-80%。进行细胞转染：1.分别将4μg上述构建的SAA3阳性质粒、p3×Flag-CMV-7.1空质粒与250μLOpti-MEM培养基混合，轻轻混匀后，静置5min。2.将8μL脂质体与250μLOpti-MEM培养基混合，轻轻混匀后，静置5min。3.将步骤1+2充分混匀，室温静置15min。4.期间将293T细胞用PBS轻轻洗一遍以彻底去除血清和抗生素，然后补加2mLOpti-MEM培养基。5.将步骤3中的混合液加到6孔板中，每孔加500μL。6.4-6h后，更换2%的DMEM培养液。（3）293T细胞中蛋白的提取转染24小时之后，提取293T细胞中的蛋白：1.将6孔板中的培养液弃掉，用PBS清洗三遍。2.每孔加入1mLPBS，用细胞刮刮取细胞，将刮取的细胞2000r/min，离心10min,弃上清。用适量的加了蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液重悬细胞，并进行超声至不再粘稠。离心后取上清。3.向上清中加入适量的5×SDSloadingbuffer，煮沸10min进行蛋白变性。间接免疫荧光实验验证抗体:将SAA阳性质粒与FLAG空质粒转染293T细胞，24h后用间接免疫荧光实验急性检测验证，具体步骤如下：1.将细胞用PBS轻轻清洗三遍，加入适量的4%多聚甲醛放在4℃进行固定半个小时。2.弃掉4%多聚甲醛，用PBS清洗，然后加入适量的1%NP40进行细胞打孔，室温放置15min。3.弃掉1%NP40，用PBS清洗，加入适量的封闭液，室温放置30min。4.弃掉封闭液，用PBS清洗，加入一定稀释度的一抗，室温放置1h。5.弃掉一抗，用PBS清洗三遍，加入一定稀释度的荧光二抗，室温避光孵育1h。6.弃掉荧光二抗，PBS清洗三遍，加入细胞核染液DAPI，室温避光放置10min。7.用PBS清洗三遍后，用封固剂将片子固定在载玻片上，放置4℃过夜后进行荧光观察。3.2结果3.2.1抗原小肽的合成根据猪SAA3氨基酸序列，预测其抗原性，进而合成抗原小肽，合成的抗原小肽序列如下：GAWAAKVISDARENVQRVTDLFKHGDSGHGVEDSRADQAANAWGRSGKDPNHFRPRGL3.2.2真核表达载体的构建真核表达重组质粒构建成功,其大小与预期一致，详见图3.1。21 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证图3.1真核重组质粒的双酶切结果Fig.3.1ResultsdigestedeukaryoticrecombinantplasmidM1:DL2000标准分子质量；M2:DL15000标准分子质量1：重组质粒的单酶切；2：SAA3基因；3：重组质粒的双酶切3.2.3多抗血清的ELISA效价检测制备的多抗血清进行ELISA效价的检测，分别将两只兔子的血清进行倍比稀释，稀释比例以及对应的OD值见表4。结果显示：两只兔子的血清进行1:50000稀释时，仍然具有较好的ELISA检测效价，而阴性血清在1:3000稀释时，OD值就已经小于0.2。22 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证图3.2多抗血清的ELISA效价检测Fig.3.2ThetiterdetectionofpolyclonalantibodyassayedbyELISA表3.5ELISA检测结果Table3.5ThedetectionresultofELISADilutionAntibodyAntigenBlankNegative1:31251:62501:125001:250001:50000Rabbit1GC-59GC-590.0960.1033.2522.581.8151.3670.994Rabbit2GC-59GC-590.0910.0993.1672.5941.8531.4111.0323.2.4Western-blot验证抗体结果显示，经转染之后，293T细胞可以成功的表达p3×Flag-CMV-7.1-SAA3重组蛋白。此重组蛋白不仅可以和Flag抗体反应，还可以和制备的SAA3多克隆抗体反应，与预期大小位置一致。此结果充分说明了制备的多克隆抗体的可用性。23 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证图3.3多克隆抗体的Western-blot验证Fig.3.3TheverificationofpolyclonalantibodyassayedbyWestern-blot1,3:转染FLAG7.1空质粒2,4：转染SAA3阳性质粒1,3:thetransfectionofemptyplasmid2,4:thetransfectionofpositiveplasmid3.2.5间接免疫荧光实验验证抗体分别将SAA3阳性质粒以及FLAG7.1空质粒转染293T细胞，然后间接免疫荧光验证抗体。结果如图所示：绿色荧光代表SAA3蛋白。图3.4间接免疫荧光验证抗体Fig.3.4Theantibodyverificationbyindirectimmunofluorescenceassay3.3讨论本实验成功制备了猪SAA3多克隆抗体，并用Western-blot以及间接免疫荧光技术验证了此抗体的敏感性和特异性。根据前述的SAA3的基因结构的抗原性以及表面可及性的预测合成抗原小肽，免疫兔子后，收集血清测定多抗效价，表明SAA3多抗效价明显高于对照组。其次我们构24 中国农业科学院硕士学位论文第三章猪SAA3多克隆抗体的制备及验证建了SAA3真核表达载体，转染细胞后能够成功表达，为进一步在细胞水平研究SAA3的功能奠定基础。25 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立血清淀粉样蛋白是一种重要的急性期蛋白和载脂蛋白，目前已被应用于多种疾病的诊断和检测中。但对猪血清淀粉样蛋白的研究目前还比较局限，为进一步研究猪SAA的功能以及发挥功能的机制，建立一种高效检测SAA3的方法非常必要。目前，还没有针对检测猪SAA3表达的荧光定量RT-PCR方法建立的研究报道。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1菌株，载体pMD18T载体购自Takara公司。大肠杆菌DH5α购自天根公司。4.1.1.2试剂与仪器主要仪器：PCR仪；ABi7500荧光定量PCR仪；电泳仪；水平电泳槽；凝胶成像仪；分光光度计；制冰机；高速冷冻离心机（Eppendorf）；超纯净水仪；FA/JA系列电子天平；迷你离心机（LX-200型）。主要试剂：RNA提取所用到的Trizol试剂、RNA酶抑制剂、反转录酶MLV、快速反转录试剂盒以及荧光定量相关试剂均购自宝生物工程有限公司。PCR相关试剂购自上海英潍捷基生物工程有限公司。实验所用到的引物均有Invirtrogen公司合成。4.1.2方法4.1.2.1引物的合成利用BeaconDesigner7，根据GenBank数据库中的猪GAPDH,SAA3基因序列，针对其保守区设计特异性荧光定量引物，分别命名为GAPDH-1r，GAPDH-2r，SAA3-1r，SAA3-2r。利用primer5.0引物设计软件设计猪GAPDH,SAA3扩增引物为GAPDH-1R，GAPDH-2R，SAA3-1R，SAA3-2R。具体序列见表4.1。26 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立表4.1引物序列Table4.1Primersequences引物序列GAPDH-1rTCTGGCAAAGTGGACGAPDH-2rGGTGGAATCATACTGGAACASAA3-1rATGGGCATCATTCCTCAASAA3-2rTTTGTAATTGGCTTCTCTCATGAPDH-1RTATAAATTCCGGCTGCAGCCTTCCCCTGCGCTCTCTGCTCCTGAPDH-2RGGGTACAGTGTACTTTATTGATGGTACATGACGAGGCAGGTCTCCCTSAA3-1RGCGTCGACATGAAGCTTTCCACGGGCATCATTTTCTGCTTCCTSAA3-2RCGGGATCCGTACTTGTCAGGCAGGCCACGAGGTCTGAAGTGGT4.1.2.2标准品的制备猪GAPDH真核表达质粒质粒的制备：(1)RNA的提取及反转录：具体步骤见2.1.2.2。(2)猪GAPDH基因扩增体系：cDNA模板2μL，上下游引物各0.25μL（50pmol/μL，dNTPMixture(2.5mmol/μL)4μL，ExTaq酶0.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，加水至25μL.反应程序：98℃预变性5min；98℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分并进行胶回收，将胶回收产物与与pMD18T载体连接，转化至DH5α大肠埃希氏菌种，提取质粒进行PCR鉴定和序列测定，挑选结果正确的质粒并测定其浓度。猪SAA3真核表达质粒制备:具体过程见3.1.2.3。4.1.2.3SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立反应体系的建立及优化：模板为猪SAA3、GAPDH质粒标准品,反应体系为20μL，向反应体系体系中分别加入不同终浓度的引物和模板，对检测结果的重复性和扩增效率进行分析和优化，最终筛选出20μL反应体系：2×SYBRGreenPremixExTaqII10μL、ROXReferenceDye(50×)0.4μL、模板（质粒或cDNA）1μL、上下游引物各0.4μL（25pmol/L）、DEPC水7.8μL。反应条件的建立及优化：分别选取浓度为1.94×105拷贝/μLSAA3重组质粒模板、9.44×105拷贝/μLGAPDH重组质粒模板进行Real-timePCR反应条件的优化，改变退火延伸温度等各个条件，并分别重复4次，最终筛选出最佳反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火及延伸34s，扩增40个循环。结果表明用此参数进行扩增重复性较好并且扩增效率较高。标准曲线的建立：经过浓度测定，SAA3重组质粒的质量浓度为419ng/μL，转化为拷贝数为1.94×1010/μL，然后将此SAA3质粒按1:10倍比稀释，使得最终拷贝数为1.94×107-1.94×103拷贝/μL，并以此作为标准曲线制作的模板。同样的，将GAPDH重组质粒按1:10倍比稀释成9.44×107-9.44×103拷贝/μL，并以此作为标准曲线制作的模板。分别将这些稀释度的标准品质粒作27 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立为模板进行荧光定量PCR,按照前面所筛选的反应条件和反应体系进行检测，每个稀释度3个重复。标准曲线由ABi7500荧光定量PCR仪自动生成,横坐标代表拷贝数，纵坐标代表ct值。敏感性试验：分别选取1.9×107，1.9×106，1.9×105，1.9×104，1.9×103拷贝/μLSAA重组质粒，选取9.4×107，9.4×106，9.4×105，9.4×104，9.4×103拷贝/μLGAPDH重组质粒进行荧光定量PCR，同时将荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以观察实验的敏感性。4.2结果4.2.1SYBRGreenI实时荧光定量PCR标准曲线的建立对SAA3阳性重组质粒进行10倍倍比稀释，获得1.9×107，1.9×106，1.9×105，1.9×104，1.9×103拷贝/μL5个浓度梯度，同时对GAPDH阳性重组质粒进行10倍倍比稀释，获得9.4×107，9.4×106，9.4×105，9.4×104，9.4×103拷贝/μL5个浓度梯度，作为标准品进行实时荧光定量PCR反应。扩增曲线见图4.1A（横坐标为循环数，纵坐标为荧光值），根据扩增结果分别绘制了SAA3，GAPDH的标准曲线见图4.1B（横坐标为拷贝数，纵坐标为ct值）。由SAA3标准曲线可知：斜率为-3.418，相关系数为0.985，扩增效率为96.145%，标准曲线方程为：y=-3.418x+33.969。由GAPDH标准曲线可知:斜率为-3.442，相关系数为0.984，扩增效率为95.23%，标准曲线方程为y=-3.442x+34.887。28 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立图4.1实时荧光定量RT-PCR检测猪SAA3，GAPDH的扩增曲线和(A)标准曲线（B）Fig.4.1Amplificationplots(A)andstandardcurve(B)ofrealtimefluorescentquantitativeRT-PCR4.2.2SYBRGreenI实时荧光定量PCR的熔解曲线的建立根据参数95℃15s、60℃1min、95℃10s绘制熔解曲线。结果显示，标准样品均出现了窄且尖的单峰，无杂峰出现（图4.2），表明该SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR反应为特异性扩增。29 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立图4.2SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪GAPDH,SAA3标准品的熔解曲线Fig.4.2ThemeltingcurveofrealtimeSYBRGreenIfluorescencequantitativeRT-PCRofporcineGAPDH,SAA3standard4.2.3敏感性实验实时荧光定量PCR检测梯度稀释的标准样品，在35个循环内的ct值>0,且相邻稀释梯度定拷贝数呈10倍关系。将稀释5个梯度的标准样品用普通PCR进行检测，并进行琼脂糖凝胶电泳（图4.3），结果与实时荧光定量PCR结果相符。图4.3猪GAPDH,SAA3标准品PCR检测结果Fig.4.3DetectionresultsforPCRofporcineGAPDH.SAA3standardM:DNA分子量标准（DL2000）;100,101,102,103,104为PCR产物的稀释倍数M:DNAMarker(DL2000);100,101,102,103,104werethedilutionmultipliesofPCRProducts4.2.4重复性实验如表4.2、表4.3所示，无论是SAA重复性实验还是GAPDH重复性实验，重复性良好，变异系数均在5%以下，进一步证实该方法检测猪GAPDH，SAA3基因高效、可信。30 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立表4.2猪SAA3实时定量PCR重复性实验（n=3）Table4.2ReproducibilityassayofrealtimefluorescentquantitativeRT-PCRforporcineSAA3标准品（copies.μL-1）组内差异（Intraassay）组间差异（Interassay）Standard平均数标准差变异系数/%平均数标准差变异系数/%MeanCTSDCV/%MeanCTSDCV/%1.91076.350.121.96.420.182.81.91069.740.0180.199.800.0210.21.910514.290.211.514.320.241.71.910417.740.050.2917.790.080.41.910322.130.060.2722.160.080.36表4.3猪GAPDH的实时定量PCR重复性实验（n=3）Table4.3ReproducibilityassayofrealtimefluorescentquantitativeRT-PCRforporcineGAPDH标准品（copies.μL-1）组内差异（Intraassay）组间差异（Interassay）Standard平均数标准差变异系数/%平均数标准差变异系数/%MeanCTSDCV/%MeanCTSDCV/%9.41075.190.244.55.200.254.89.41068.900.030.379.220.111.29.410511.650.131.111.770.151.39.410416.490.110.6916.520.140.89.410320.150.241.220.210.261.34.3讨论目前SAA作为一种重要的指示因子已经被用在各种疾病的监测与诊断中，为了进一步研究SAA发挥功能的具体机制，建立一种迅速定量SAA的方法显得尤为重要。本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高，特异性强，重复性好，对3份不同批次的标准品分别进行3个批内重复和批间重复,变异系数均小于5%。并且本研究同时建立了GAPDH的相对荧光定量的方法，其目的在于作为定量SAA3的基础，其作为对照组可更准确的检测出SAA3的相对含量。综上所述，本研究建立的基于SYBRGreenI染料法的猪SAA3绝对荧光定量PCR检测方法可以定性和定量检测猪SAA3的表达，实时分析样品中SAA3基因的表达含量，也可以应用于其31 中国农业科学院硕士学位论文第四章猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立它猪病相关研究，为深入研究猪SAA3的功能和机制打下基础。32 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究PRRSV能够引起严重的间质性肺炎，尤其是PRRSV能够引起某些促炎细胞因子的表达释放。研究表明，PRRSV感染后，能够激活IL-1β、IL-6、IL-8等细胞因子以及CXCL10等趋化因子的上调（XiaoSetal.,2010），进一步引起肺部严重的病理变化。在人类疾病中，A-SAA也能够引起诸如IL-1β、IL-6、IL-8等促炎细胞因子的表达分泌，反过来这些细胞因子也能够刺激SAA表达的上调。所以SAA已经作为一种重要的炎症指示因子广泛应用于各种急慢性炎症中。研究发现，巨细胞病毒感染、副流感病毒、腺病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等病毒感染人体后，都会引起人体内SAA表达上调，但是PRRSV感染猪后是否也会引起SAA的变化至今未有报道。猪SAA3能够在肺脏，肝脏，脾脏等组织中有分布。但是SAA3的组织分布情况以及在PRRSV感染之后是否会对SAA3的表达量有影响至今未有报道。人类SAA蛋白作为组织淀粉样蛋白的前体物质而被发现。人类SAA是一种急性时相反应蛋白，在炎症或是感染中，其表达量可以迅速升高。其次，SAA是一种重要的载脂蛋白，SAA释放到血液之后，可以替代Apoa-I称为主要的载脂蛋白，进而在胆固醇代谢中发挥了重要的作用。有研究发现，SAA蛋白能够直接与丙型肝炎病毒（hepatitiscvirus，HCV）相互作用从而影响HCV的入胞过程（MurielLavieetal.,2006）。本实验旨在初步探讨SAA蛋白是否对PRRSV的复制有影响，以及将PRRSV感染实验猪以及PAM细胞后检测SAA3的组织分布以及细胞中的动态变化，从而探讨在猪体内SAA与PRRSV感染之间的关系，进而为进一步探究作用机制奠定基础。5.1材料和方法5.1.1材料5.1.1.1细胞，病毒，动物本实验PAMs分离自无PRRSV感染及免疫的猪。实验所用猪购自某猪场。本实验所用的高致病性PRRSV毒株SH-PRRS01株由本实验室保存。5.1.1.2试剂与仪器主要试剂：HRP标记羊抗鼠以及羊抗兔IgG购自美国SigmaAldrich公司；抗FLAG单克隆抗体购自Sigma公司；抗ACTIN单克隆抗体购自proteintech公司；细胞培养用的PBS、DMEM、1640培养液、Opti-MEM培养基，血清均购自Gibco；主要仪器：高速冷冻离心机（5417R型）、全温双层摇床（SKY-2102C型）、低温冷冻离心机、超声破碎仪（Uibracellsonics）、三孔加热恒温水浴锅（DK-8D型）、超净工作台、美国BIOTek的酶标仪、SartoriuspH计（PB-10型）、恒温培养箱（MJX-160B-Z型）、恒温培养箱（Thermo）。5.1.2方法5.1.2.1HP-PRRSV感染后SAA3在细胞中的表达研究33 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究（一）SAA3在PAM细胞中RNA水平的动态变化PAM细胞的复苏：将本实验室栋存的PAM细胞从液氮罐中取出，在40℃迅速旋转至融化。然后以转速为800r/min的方式离心10min后弃去上清，1mL培养液重悬细胞,再补加适量的培养液，铺到24孔板中。放在37℃，含有5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后进行后续实验。病毒感染：用预热的PBS清洗细胞，以去除培养液中的血清，再每孔加入适量的1640培养液。病毒迅速拿出在冰上融化，每孔接0.1moi，然后放在培养箱中进行病毒吸附。两个小时用PBS清洗细胞后更换2%1640培养液。分别在病毒吸附后0h，6h，12h，24h，36h，48h收取细胞样品，用去提取RNA或是蛋白样品。接毒细胞RNA的提取以及荧光定量PCR：利用软件BeaconDesigner7设计荧光定量PCR的引物，引物列表见表5.1：表5.1荧光定量PCR引物序列Table5.1Real-timePCRPrimersequences引物名称引物序列SAA3-FATGGGCATCATTCCTCAASAA3-RTTTGTAATTGGCTTCTCTCATPRRSVORF7-FAGTGGGTCGGCACCAGTTPRRSVORF7-RGCAGACAAATCCAGAGGCTCATSussrofaGAPDH-FTCTGGCAAAGTGGACATTSussrofaGAPDH-RGGTGGAATCATACTGGAACARNA提取、反转录以及荧光定量PCR的具体步骤见2.1.2.2。5.1.2.2HP-PRRSV感染后SAA3在组织中的表达研究SAA3在组织中RNA水平的比较：（1）动物模型的建立选择6头健康、PRRSV抗原抗体均为阴性的4周龄仔猪作为本实验的用猪。将其随机分为两组，即PRRSV感染组与空白对照组。感染后17天，实验猪的临床症状明显，剖杀3头感染组和3头对照组的仔猪。取每头猪的各个组织，并切成小块迅速放入液氮灌中，然后于-80℃保存。（2）组织RNA的提取、反转录以及荧光定量组织RNA的提取：将上述取得的实验组和对照组的各个组织从液氮灌中取出，并迅速放入液氮预冷的研钵中，加入适量的裂解液后迅速充分的研磨。研磨充分后，加入适量的的RNase-free水和蛋白酶K，混匀后，56℃处理10-20min，直至其裂解消化成透明。之后按照说明书进行操作。反转录与荧光定量PCR具体步骤见2.1.2.2。（二）SAA3在组织中蛋白水平的比较组织中蛋白的提取：取豆粒大小的组织加入500μLPBS，用匀浆机打碎。4℃条件下，5000r/min，离心8min，弃上清。每管用适量的裂解液吹起，冰上超声至澄清透明。4℃条件下，12000r/min，离心10分钟。取上清，加入适量的5SDS，煮沸10min。34 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究Western-blot分析：分别将实验组和接毒组的不同组织上样，上样量为30μg。5.1.2.3转染质粒检测SAA3蛋白对PRRSV复制的影响Marc145细胞的培养：将Marc145细胞从液氮灌中拿出，迅速放在42℃水中快速旋转至融化，1000r/min离心10分钟，弃上清，再用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬后转移到细胞培养瓶中，放在37℃，含有5%CO2培养箱中培养。待细胞稳定贴壁长至80-90%作用，用PBS清洗细胞，再加入相应的胰酶放在37℃，含有5%CO2培养箱中进行消化两分钟。再用适量的含有10%胎牛血清的DMEM培养基吹打，最后转移至24孔细胞培养板中进行培养，待培养板中的细胞长至70-80%左右进行转染。Marc145细胞的转染：1.分别将0.5μg上述构建的SAA3阳性质粒、p3×Flag-CMV-7.1空质粒与50μLOpti-MEM培养基混合，轻轻混匀后，静置5min。每孔三个重复。2.将2μL脂质体与50μLOpti-MEM培养基混合，轻轻混匀后，静置5min。3.将步骤1+2充分混匀，室温静置15min。4.期间将Marc145细胞用PBS轻轻洗一遍以彻底去除血清和抗生素，然后补加500μLOpti-MEM培养基。5.将步骤3中的混合液加到24孔板中，每孔加100μL。6.4-6h后，更换2%的DMEM培养液。PRRSV感染Marc145细胞：转染24h之后，将0.1moiPRRSV感染Marc145细胞，感染24h之后收取细胞样品提RNA，收取细胞上清进行TCID50的检测。RNA的提取，反转录以及荧光定量PCR具体步骤见2.1.2.2提取蛋白，Western-blot验证蛋白表达：将SAA3阳性质粒转染Marc145细胞，24小时后，提取蛋白，Western-blot验证转染的SAA3阳性质粒成功表达了蛋白。TCID50的检测：收集接毒细胞上清，进行病毒滴度的测定。具体步骤为：提前12-24h将Marc145细胞铺至96孔细胞培养板中，用含有10%胎牛血清的DMEM，放在37℃，含有5%CO2培养箱中培养。待细胞长至80-90%，弃掉上清，并用PBS清洗三遍。然后用无血清的DMEM将病毒液倍比稀释至浓度为10-1-10-11，另设一组阴性对照，每组八个重复，每孔加入稀释好的病毒液或者无血清的DMEM培养液100μL。吸附1.5h后更换含有2%胎牛血清的DMEM。然后继续放在37℃，含有5%CO2培养箱中培养，每日观察噬斑形成情况，直至连续三天噬斑情况不再发生变化。记录有无噬斑的细胞孔数，Reed-Muench氏算法计算病毒的TCID50。5.1.2.4SAA蛋白对病毒吸附的影响PAMs细胞的复苏与培养：将本实验室栋存的PAM细胞从液氮罐中取出，在40℃水浴锅中旋转至融化。转速为800r/min，离心10min后弃去上清，1mL培养液重悬细胞,再补加适量的培养液，铺到24孔板中。35 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究放在37℃，含有5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后进行后续实验。用预热的PBS清洗细胞，以去除培养液中的血清，再每孔加入适量的1640培养液。病毒迅速拿出在冰上融化，每孔接0.1moi，同时加入适量的SAA蛋白，使的终浓度为30μg/mL、50μg/mL,然后放在培养箱中进行病毒吸附。两个小时用PBS清洗细胞后收取细胞样品进行RNA的提取。RNA提取、反转录与荧光定量PCR：具体步骤参照2.1.2.2。5.2结果5.2.1猪SAA3的组织分布提取正常猪各个组织中的RNA以及蛋白，检测猪SAA3在各组织中RNA水平（图5.1）以及蛋白水平（图5.2）的组织分布。结果显示：猪SAA3主要分布在肝脏中，在肺脏、脾脏、肺门淋巴结中表达量也相对较高。图5.1猪SAA3mRNA水平的组织分布Fig.5.1PorcineSAA3organizationdistributionofmRNAlevel图5.2猪SAA3蛋白水平的组织分布Fig.5.2PorcineSAA3organizationdistributionofproteinlevel36 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究5.2.2PRRSV感染中SAA3在PAM细胞上RNA水平的动态变化分别在PRRSV感染后的不同时间点收取PAM细胞样品，用荧光定量PCR的方法检测SAA3的动态变化，结果显示：在0-6h内，接毒组和对照组的SAA3RNA水平没有明显的差异。在12h，接毒组的SAA3RNA水平开始明显高于对照组。图5.3SAA3在PAM细胞上的动态变化Fig.5.3DynamicsofSAA3inPAMs5.2.3SAA3在组织中RNA水平以及蛋白水平的比较将PRRSV感染猪出现明显的临床症状时进行剖杀，分别取对照组和接毒组的不同组织提取RNA，然后用荧光定量分析SAA3在RNA水平的相对变化以及组织分布情况。由图5.4可以看出，首先在正常组织中，可以看出SAA3主要分布在肝脏，胸腺，肺脏等组织，这与报道的不谋而合。相对于对照组，接毒组组织中SAA3RNA的相对表达水平不尽相同。其中肺脏最为明显，接毒组中SAA3RNA的相对表达大约是对照组的200倍，其次在下颌淋巴结，肺门淋巴结，肠系膜淋巴结以及肝脏，脾脏等组织中，接毒组SAA3RNA的相对表达都具有显著的提高。但是这种提高在肌肉以及心脏中不明显。在蛋白水平方面，首先在正常组织中，从图5.5可以看出，SAA3蛋白主要表达在脾脏，肝脏，肺脏以及肠系膜淋巴结中，尤其在肝脏中表达量较高。而在下颌淋巴结，肾脏，肺门淋巴结中表达量相对较少。当PRRSV感染组织与健康组织相互比较时，我们可以看出，PRRSV感染的肺脏，肾脏，下颌淋巴结，肺门淋巴结中SAA3蛋白都有不同程度的提高，尤其在肺脏和肺门淋巴结中。37 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究图5.4在感染猪和健康猪组织中，SAA3mRNA水平的相对表达Fig.5.4TherelativeexpressionofSAA3mRNAinvarioustissuesofhealthyandvirusinfectedpigs图5.5在感染猪和健康猪组织中，SAA3蛋白水平的表达Fig.5.5TheexpressionofSAA3proteininvarioustissuesofhealthyandvirusinfectedpigs5.2.4过表达SAA3蛋白对PRRSV复制的影响分别将0.5μgSAA3阳性质粒和FLAG7.1空质粒转到Marc145细胞中，24h后收取细胞样品，38 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究提取RNA，反转录，荧光定量PCR检测SAA3蛋白对PRRSV复制的影响。图5.6A结果显示，转染SAA3阳性质粒的细胞能够成功表达SAA3蛋白，而转染Flag7.1空质粒组和未处理组检测不到SAA3蛋白，其次相对于转染的FLAG7.1空质粒，转染SAA3阳性质粒的实验组PRRSV在RNA水平大约是对照组的5倍。TCID50结果也显示，转染SAA3阳性质粒的实验组表现出较高的病毒滴度。图5.6过表达SAA3蛋白对PRRSV复制的影响Fig.5.6TheinfluenceofSAA3proteinforPRRSVreplicationA.SAA3蛋白在MARC45细胞中表达B.SAA3蛋白上调PRRSVmRNA水平C.SAA3蛋白上调PRRSV滴度A.theexpressionofSAA3proteininMarc145cells,B.SAA3proteinup-regulatedmRNAlevelofPRRSV,C.SAA3proteinincreasetheTCID50ofPRRSV5.2.5SAA蛋白对病毒吸附的影响感染病毒的同时，加入SAA蛋白，使得蛋白终浓度为30μg/mL，50μg/mL。对照组加入等量的蛋白稀释液。结果显示：相对于MOCK组，无论是30μg/mL，50μg/mL都表现出一定的促吸附作用。但是具体机制还有待进一步研究。39 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究图5.7SAA蛋白对PRRSV吸附的影响Fig.5.7TheinfluenceofSAAforPRRSVadsorption5.3讨论人类的SAA3被证明是一种假基因，但是我们的结果表明猪的SAA3在诸如肺脏，肝脏，脾脏，下颌淋巴结等组织等都有表达，并且PRRSV病毒感染能够影响SAA3的表达。在RNA水平，PRRSV感染的肺脏组织中,SAA3的表达约是未感染组织的200倍之多。在蛋白水平，PRRSV感染的肺脏中SAA3的表达也高于对照组。由于PRRSV感染主要病变部位在肺脏，引起严重的间质性肺炎，而在人类中，SAA已被证明是急性炎性反应的标志，即在急性炎性反应时期，SAA的表达会在48小时之内升高甚至1000倍之多。所以在PRRSV感染之后，SAA3表达量的升高可能与炎症有关，其功能与人类的SAA1、SAA2的相同，是一种重要的急性时相反应物。也可能有其他的机制有待进一步研究。PRRSV感染PAM细胞后，在12小时时PRRSV感染组SAA3的RNA水平要明显高于对照组。从以上结果可以看出猪SAA3有一些人类A-SAA的特性。与人类A-SAA不同的是，人类A-SAA主要由肝脏产生，而猪SAA3可以由不同的组织产生，由上述结果可以看出，肝脏仍是产生SAA3的主要部位，但像脾脏，肺门淋巴结等免疫器官也能产生大量的SAA3。在大多数脊椎动物中，SAA是一种小的载脂蛋白和一种主要的急性期蛋白。在人类中，它是被发现的可以最快和最高的被诱导的急性期蛋白，可达到一千倍。在炎性反应期间，SAA变成HDL的主要的载脂蛋白。SAA的生物学功能是备受争议的。然而在急性炎性反应的早期，肝脏中SAA的合成以及转录的水平，和它在物种之间高度的进化保守性，表明SAA的功能是尤其重要的。已有研究表明，猪SAA3不仅产生于肝脏，在其他组织中也有分布。如前所述，SAA3分布在猪不同的组织，并且其表达量受PRRSV感染的影响。本实验中，转染SAA3阳性质粒的PAM40 中国农业科学院硕士学位论文第五章猪SAA3与PRRSV相互关系的研究细胞中，PRRSV的增殖量明显高于对照组。在病毒吸附试验中，加入SAA蛋白有利于病毒的吸附，说明SAA蛋白对病毒增殖有一定的促进作用，但具体机制有待进一步研究。41 中国农业科学院硕士学位论文第六章全文结论第六章全文结论1.成功构建了猪SAA3真核表达质粒，制备了猪SAA3多克隆抗体。2.成功建立了猪SAA3分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。3.HP-PRRSV感染可以影响猪SAA3分子的表达，反之，在一定程度上，SAA蛋白也能够影响HP-PRRSV的复制，表现出一定的促病毒作用。42 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢岁月如梭，转眼间，三年的硕士求学生活即将结束。回首往昔，无论是这三年中的泪水、苦恼、辛劳还是感动、收获、付出都变成了最美好的记忆。值此毕业即将来临之际，我谨向所有关心、帮助、爱护我的人们表示最诚挚的感谢和最美好的祝愿。感谢我的导师马志永研究员对我的悉心指导，从本论文的实验设计，实验开展以及论文的写作、修改都是在马老师的用心指导下完成的。马老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，平易近人的人格魅力对我影响深远。感谢我的实验指导老师刘珂老师，感谢他总能在我实验迷茫的时候给我指引正确的方向，感谢他在我三年硕士学习中给予的所有帮助与教导。在此，由衷的向马老师和刘老师表示最衷心的感谢！感谢童光志研究员、丁铲研究员、于圣青研究员以及所有相关领导对我的教导，感谢科研处顾惠明老师和牛牧笛老师在学习生活中给予的关怀与帮助，感谢中心实验室的各位老师在我使用仪器上的帮助。感谢本实验室邱亚峰老师、魏建超老师、李蓓蓓老师、石元元师姐对我实验过程中所提出的良好建议与帮助，感谢邵东华老师对我生活以及实验上给予的关怀与帮助。衷心感谢本研究室齐鹏飞博士、李玉明博士、许金鹏博士、马改妮师姐，徐晓伟、张彦兵、陆美林同学，肖长广、相笑、王飞飞、刘茜倩、陆艳等师弟师妹，卢亚平、石坤、张克龙、杜翔、刘浩等实验室助理三年来对我在学习和生活上的帮助，给实验室带来了轻松、愉快、积极向上的学习氛围。感谢我的的室友吴小卡同学、张耀丹同学、于之清同学三年来对我的陪伴与关心，感谢我的同窗好友刘晓敏同学以及其他同学对我的帮助与支持。最后，我要感谢我的父母、妹妹、弟弟等亲人，他们的支持与鼓励，是我完成学业最大的动力。53 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历郇贝丽，女，1991年9月24日出生于山东省临沭县，硕士研究生。教育经历：2010年9月-2014年6月，就读于山东农业大学，动植物检验检疫专业（动检方向）；2014年9月至今，就读于中国农业科学院上海兽医研究所，预防兽医学专业。54
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