eEF1α影响传染性法氏囊病强弱毒复制差异的研究

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分类号：密级：硕士研究生学位论文eEF1α影响传染性法氏囊病强弱毒复制差异的研究专业领域：养殖研究方向：动物疾病防控研究生：杨搏指导教师：杨玉莹教授王笑梅研究员论文起止日期：2015年9月至2018年4月 分类号：密级：硕士研究生学位论文eEF1α影响传染性法氏囊病强弱毒复制差异的研究专业领域：养殖研究方向：动物疾病防控研究生：杨搏指导教师：杨玉莹教授王笑梅研究员论文起止日期：2015年9月至2018年4月 eEF1αAffectsReplicationDifferencebetweenVeryVirulentInfectiousBursalDiseaseVirusandAttenuatedStrainField：AquacultureDirectionofStudy：AnimaldiseasepreventionandcontrolGraduateStudent：BoYangSupervisor：Prof.YuyingYang、Prof.XiaomeiWangSchoolofAnimalScienceYangtzeUniversitySeptember,2015toApril,2018 摘要传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease,IBD）的病原是传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV），其主要侵害3-6周龄家禽法氏囊未成熟的B淋巴细胞，是一种高度接触性、急性、致死性传染病。IBDV的血清型可分为I和II型，然而只有血清I型会导致雏鸡发病。血清I型病毒发生过两次比较大的变异，产生了三种毒株：经典毒、变异株和超强毒株。超强毒可以导致雏鸡死亡而弱毒则不能导致雏鸡死亡，故超强毒株与弱毒株在致病机制上的差异值得深入研究。法氏囊B淋巴细胞可以被传染性法氏囊病强弱毒感染，所以是研究强弱毒差异最理想的细胞模型。有研究报道，鸡的原代法氏囊B淋巴细胞在体外培养易于凋亡。72小时的凋亡率可达到80%以上，但鸡源CD40L能维持并增加B淋巴细胞的存活时间达到数周以上。本研究构建了CD40L功能域的真核表达载体并进行人源密码子优化，用293T细胞进行表达。结果表明CD40L成功表达，并将纯化的CD40L直接添加到法氏囊B淋巴细胞的培养基中，选择不同的时间点分别进行B淋巴细胞形态的观察、活性的检测、细胞调亡的检测以及细胞数量的统计。结果显示添加CD40L以后可以小量地增加细胞数、增强细胞活性、减缓法氏囊B淋巴细胞的凋亡速度，但目前还不能使其在体外长时间培养。为了更好地研究并认识传染性法氏囊病病毒复制的机制，本研究开展了病毒与宿主相互作用的研究。首先利用IBDV多聚蛋白进行免疫沉淀试验，并将疑似条带进行质谱分析，发现其中一个宿主蛋白eEF1α与IBDV多聚蛋白存在相互作用。为了进一步研究eEF1α在IBDV复制以及IBDV强弱毒复制差异中的作用，分别从转录水平和蛋白表达水平检测了等量的IBDV强弱毒感染原代法氏囊B细胞后eEF1α的变化，发现IBDV强弱毒感染促进eEF1α的转录，并且强毒的促进程度高于弱毒，但蛋白的表达水平并没有发生明显的变化。为了研究eEF1α的变化对IBDV复制的影响，筛选获得了针对鸡源eEF1α的有效siRNA，干扰下调DF-1细胞内源的eEF1α后，能够减少IBDV弱毒Gt在DF-1内的病毒蛋白表达，也能降低病毒的TCID50滴度；而干扰下调DT40细胞内源的eEF1α后，能够十分明显地减少IBDV强毒Gx在DT40内的病毒蛋白的表达，也能降低病毒的ELD50滴度。反过来，在DT40细胞中过表达外源eEF1α，能小量增加IBDV强毒VP3蛋白的量。说明IBDV强弱毒的复制均需要宿主蛋白eEF1α的参与。然后利用免疫共沉淀试验发现eEF1α与IBDV强毒的VP3蛋白存在相互作用，但与IBDV弱毒的VP3蛋白不存在相互作用，即eEF1α与强弱毒的相互作用存在差异。激光共聚焦试验进一步证实eEF1α与强毒VP3能够部分共定位。基于序列分析发现强弱毒VP3之间有4个氨基酸的差异（28、226、235、250位）。为了进一步确定eEF1α与Gx-VP3作用的关键位点，将强弱毒VP3进行相互的点突变，再进行免疫共沉淀试验，发1 现eEF1α与Gx-VP3的作用位点不只一个，因为Gt-VP3向Gx-VP3单一位点的突变均没能被eEF1α沉淀下来，而Gx-VP3的28、235、250突变成相应位点的弱毒氨基酸后被沉淀的条带明显减弱，证明这些位点均与eEF1α的相互作用有关。综上所述，本研究发现传染性法氏囊病强弱毒在与宿主蛋白eEF1α的相互作用上存在差异，并且证明eEF1α能够影响传染性法氏囊病强弱毒的复制。由于eEF1α是翻译延伸因子，故推测eEF1α可能是在病毒蛋白翻译的过程中发挥作用，具体的作用机制还需后续继续探究。关键词：传染性法氏囊病病毒，eEF1α蛋白，复制2 AbstractTheinfectiousbursaldisease(IBD)isahighlycontact,acute,lethalinfectiousaviandisease.Theagentofdiseaseisinfectiousbursaldiseasevirus(IBDV),whichmainlyinfectsimmatureB-lymphocytesofbursaof3-6weeksoldpoultry.IBDVserotypescanbedividedintotypeIandtypeII,however,onlyserotypeIcausesdiseaseinchicks.TwomajormutationshaveoccurredintheserotypeIvirus,resultinginthreetypestrains:classic,variant,andveryvirulentstrains.VeryvirulentIBDV(vvIBDV)canresultinthedeathofchicks,whileattenuatedstraincannotcausethedeathofchicks.Therefore,thedifferenceinpathogenicmechanismbetweenvvIBDVandattenuatedstrainsdeservesfurtherstudy.B-lymphocyteofbursaistheidealcellmodeltoinvestigatethedifferencebetweenvvIBDVandattenuatedstrains,sinceitcanbeinfectedbyvvIBDVorattenuatedstrainsinvitro.IthasbeenreportedthatprimaryB-lymphocytesfromchickensaresusceptibletoapoptosisinvitro.Theapoptosisratecanreachmorethan80%at72hours,butchickenCD40LcanextendthesurvivalofBlymphocytesformorethanafewweeks.Inthisstudy,theeukaryoticexpressionvectoroftheCD40Lfunctionaldomainwasconstructedandoptimizedbyhumancodonsforexpressionin293Tcells.TheresultsshowedthatCD40LwassuccessfullyexpressedandthepurifiedCD40LwasdirectlyaddedtothemediumofbursalBcells.ThemorphologyofBcells,thecellactivity,theapoptosisrate,andthequantityofcellswereobservedanddetectedatdifferenttimepoints.TheresultsshowedthattheadditionofCD40Lcanslightlyincreasethenumberofcells,enhancetheactivityofcells,andreducetherateofapoptosisofBcells,butitcannotbeculturedforalongtimeinvitro.Inordertostudyandunderstandthemechanismofinfectiousbursaldiseasevirusreplication,thisstudycarriedoutresearchontheinteractionbetweenIBDVandhost.First,IBDVpolyproteinwasusedforimmunoprecipitationexperiments,andthesuspectedbandswereanalyzedbymassspectrometry.Itwasfoundthatoneofthehostproteins,eEF1α,interactswiththeIBDVpolyprotein.InordertofurtherstudytheroleofeEF1αinthereplicationofIBDVandthedifferentialreplicationofvvIBDVandattenuatedstrains,wedetectedthechangesofeEF1αinBcellsinfectedwiththesameloadofvvIBDVandattenuatedstrainsattheleveloftranscriptionandproteinexpression.BothvvIBDVandattenuatedstraininfectionspromotethetranscriptionofeEF1α,andthepromotionofvvIBDVishigherthanthatofattenuated,buttheexpressionlevelhasnotchangedsignificantly.InordertoinvestigatetheeffectofeEF1αonthereplicationofIBDV,effectivesiRNAtargetonchickeneEF1αwasscreened.SincethedownregulationofendogenouseEF1αinDF-1cells,theexpressionofviralproteinofattenuatedGtinDF-1cellswasreduced.AndtheTCID50titeroftheviruscanalsobereduced.Besides,whenknockingdownoftheendogenouseEF1αoftheDT40cells,boththeamountofviralproteinandthetiterofELD50ofthevvIBDV3 canbeobviouslyreduced.Incontrast,overexpressingexogenouseEF1αinDT40cellscanslightlyincreasetheamountofvvIBDVVP3protein.ItindicatesthatthereplicationofIBDVrequirestheparticipationofhostproteineEF1α.Basedonco-immunoprecipitationexperiments,theresultsshowedthateEF1αinteractswithvvIBDVVP3protein,butthereisnointeractionwithIBDVattenuatedVP3.ItmeanshostproteineEF1αpossessesdifferentproperityininteractionwithdifferentIBDVVP3proteins.TheconfocalmicroscopyobservedthateEF1αandvvIBDVVP3couldpartiallyco-localize.Basedonthesequenceanalysis,thereare4aminoacidsdifferencesbetweenvvIBDVVP3andattenuatedVP3(28,226,235,250).InordertofurtherexplorethedeterminantaminoacidsfortheinteractionbetweeneEF1αandGx-VP3,theVP3proteinwassubjectedtopointmutations,andtheco-immunoprecipitationexperimentswereperformed.ItwasfoundthattherewasmorethanonedeterminantsiteofaminoacidsbetweeneEF1αandGx-VP3interactionbecausenoneoftheGt-VP3withanysinglemutationtocorrespondingofGx-VP3aminoacidscouldbeco-immunoprecipitatedbyeEF1α.Moreover,theGx-VP3amountofco-immunoprecipitatedbyeEF1αwassignificantlyreducedwithpointmutationin28,235,or250ofGx-VP3,demonstratingthattheseaminoacidsareimportanttointeractionbetweeneEF1αandIBDVVP3.Insummary,thepresentstudyfoundthattherewasadifferenceintheinteractionofeEF1αwithvvIBDVorattenuatedIBDV,andthateEF1αcouldaffectthereplicationofIBDV.BecauseeEF1αisatranslationelongationfactor,itisspeculatedthateEF1αmayplayaroleinthetranslationofIBDVproteins.Theunderlyingmechanismforthesefunctionsneedsfurtherinvestigation.Keywords:infectiousbursadiseasevirus,eEF1α,replication4 目录第1章绪论...............................................11.1引言..........................................................11.2鸡传染性法氏囊病..............................................11.3鸡传染性法氏囊病病毒..........................................61.4CD40L相关的研究进展..........................................91.5eEF1α相关的研究进展.........................................141.6目的与意义...................................................17第2章CD40L对法氏囊B淋巴细胞的作用.....................182.1方法与材料...................................................182.2实验结果.....................................................23第3章eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒复制的影响.............263.1材料与方法...................................................263.2实验结果.....................................................31第4章讨论..............................................38第5章结论..............................................39致谢...................................................40参考文献..............................................41个人简介..............................................475 第1章绪论1.1引言传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease,IBD）的病原是传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV），其主要侵害3-6周龄家禽法氏囊未成熟的B淋巴细胞，是一种高度接触性、急性、致死性传染性疾病。由于在美国南部的甘保罗第一次发现此病，故该病被称为甘保罗病。IBD主要的病理变化是鸡的法氏囊发生病变，不仅引发死亡率，还能引发免疫抑制，从而导致发生继发感染。目前IBDV在世界上一共存在三种毒株：经典毒、变异株和超强毒株。超强毒可以导致动物死亡而弱毒则不能导致动物死亡，故超强毒株与弱毒株在致病机制上的差异值得深入研究。从上世纪的80年代开始，在我国广东、北京、上海等地区[1]先后出现IBD的报道。1999年，我国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所经分离获得了第一株vvIBDV，感染vvIBDV的SPF鸡100%死亡，感染vvIBDV的商品鸡85%死亡[2]。之后的30年来，本国境内均存在vvIBDV的报道，使得养禽业受到非常巨大的影响。目前，在我国IBDV的三种毒株共存，并且新的基因重组与变异随之出现。使得本国在IBDV的防控方面即将遇到十分艰难的挑战。自三十多年来，IBD凭借着高死亡率和巨大的经济损失的一直在世界各地占据着主导地位。在大多数国家，vvIBDV毒株已经扩散开来，目前在全世界范围内都已从急性病例中分离IBDV出来。由于需要采取新的适当的控制措施，这种突然而戏剧化的出现刺激了IBDV的研究[3]。在分子病毒学、疾病流行病学、新疫苗的发病和发展等方面取得了重要进展。特别是，T淋巴细胞最近被证明有助于急性疾病的发作。虽然它们在清除病毒和从疾病中恢复的作用是至关重要的，但在感染vvIBDVs后，它们的作用更严重。希望目前和未来在禽类免疫学领域的研究能够更好地了解疾病所涉及的免疫机制，同时也提供了测量免疫抑制的工具，从而更好地鉴定保护标准。这将允许早期识别问题群，并将促进进一步的研究，以确定这种情况的原因。最近对免疫调节的认识的增加和重组产品的快速发展对免疫反应的操纵可能提供一种治疗这些条件的方法。若想要准确的诊断，然而还需要进一步的研究来克服目前的一些障碍。在这方面，反向遗传系统，提供了构建嵌合病毒的工具，将决定病毒标记的识别和菌株的遗传衰减。同样，未来的研究需要关注病毒蛋白和宿主细胞之间的分子机制，尤其是细胞因子调控[4]。这应该允许发展更适当的控制措施，以便为携带母源抗体的幼鸟提供更高程度的保护。1.2鸡传染性法氏囊病1.2.1IBD的背景情况IBD出现在1962年，当时在鸡身上发现此病。由于IBDV引起的感染可能会1 加剧其他病因的感染并减少鸡对疫苗接种的反应能力，故自从第一次有关报道以来IBD已引起世界各地家禽行业的关注。IBD的病毒株、易感性、病原体以及环境管理等因素能够给经济发展带来影响。近年来，在IBDV结构和形态等分子生物学方面取得重大进展，为IBD的有效防止提供了坚定的基础，做出了伟大的贡献。法氏囊的淋巴样细胞是IBDV血清1型的靶细胞[5]。孵化后3-6周，当法氏囊达到最大发育的时候。鸡极易受IBDV感染，感染导致淋巴衰竭最终法氏囊被破坏。在IBD爆发时，死亡率可能从百分之1到50不等。肉鸡中感染可能导致高达50%的发病率，但死亡率很少超过3%。对于蛋鸡会导致鸡蛋产量下降，蛋壳变质。并且由于IBD病毒性呼吸道感染的流行率会提高。自1986年以来，欧洲出现了“剧毒”菌株。IBDV，可以导致70%的鸡群死亡率。这些菌株会引起典型的病变。然而，值得注意的是，在母体内产生的抗体，以前对“经典”菌株有保护作用，但vvIBDV也可以感染[6]。与此同时vvIBDV感染也在非洲、亚洲以及最近发生在南美洲。在过去的几十年里，由于价格的优势和消费者的健康理论，鸡肉在食品中的比例增加了。消费者在食品安全领域的需求似乎已经是一种没有“化学物质”的产品即没有病原体。在未来的鸡肉行业，微生物污染可能成为一个主要问题。消费者也希望鸡肉是从那些动物卫生和福利达到要求的鸡群中生产出来的。接种疫苗可以显著的阻止鸡传染病的感染。虽然第一次观察到大约40年前，IBDV仍然是一个重要的威胁对于养禽业来说[7]。已经开发出了具体和敏感的诊断工具，并提供了有效的疫苗。尽管如此，作为RNA病毒的成员，IBDV基因组的突变导致了免疫接种群中的抗原变异株并不完全出乎意料。IBDV基因组的性质可能允许出现新的菌株，对于vvIBDV基因组分段的性质可能允许出现新的菌株。然而,可以预期的是，持续努力的研究分子生物技术的应用，可能提供廉价、有效和安全的疫苗。IBDV血清型1或2的重组嵌合体都能够有效控制vvIBDV，已经迈出了非常有效的第一步。此外IBDV毒力的测定已经被阐明，但致病性的机制许多年来都一直特别值得关注。1.2.2IBD的发病机理在口腔感染后，病毒在与内脏相关的巨噬细胞和淋巴细胞中复制，进入门脉循环，导致原发性病毒血症。病毒抗原可在盲肠的巨噬和淋巴细胞中检测到，早在4h后感染，在5h到达肝脏，并在原发性病毒血症后，11h后病毒到达法氏囊。在法氏囊的IBDV复制后，病毒进入血液流，导致继发性病毒血症，导致病毒扩散到其他组织。细胞凋亡是一种个体和活性类型的细胞死亡，其特征是细胞核分裂和分解为凋亡的囊泡，细胞内没有细胞的释放，因此没有引起炎症反应[8]。在感染血清1型IBDV的鸡外周血淋巴细胞中，细胞凋亡水平较高，外周血淋巴细胞表现为高凋亡指数(核和细胞分裂为凋亡小泡)。2 最严重的临床表现为3-6周的雏鸡，此时法氏囊接近其最大发展阶段。1至14d的鸟类不易受感染，它们通常受到母体抗体的保护。6周多的感染禽类很少会出现疾病的临床症状。然而，它们会对病毒产生抗体。潜伏期通常为2至3天，在此之后，鸟类表现出痛苦、抑郁、羽毛、厌食、腹泻、颤抖和脱水。临床症状持续3-4天，幸存的鸟类迅速恢复。从宏观上看，受感染的鸟类是脱水的，在大腿和胸肌中经常出现出血,肠黏液含量增加[9]。法氏囊的大小和重量在3dpi开始增加。4dpi它的重量达到正常重量的两倍，然后开始减小，并恢复到正常重量在5dpi。当其恢复到正常大小时，渗出物消失，8dpi法氏囊开始萎缩。显微镜下，早在1dpi淋巴细胞的变性和坏死在囊泡的髓质区开始。在第3d或第4d感染后，所有的淋巴滤泡都受到影响。严重的水肿、充血和明显的嗜异细胞的积累是明显的，这导致了体重增加[10]。这些囊性空洞是由嗜异细胞和浆细胞的坏死和吞噬引起的。在囊性萎缩的过程中，囊组织的纤维增生变得明显。此外，囊状上皮变得增生，形成腺状结构，包括囊状柱状上皮内含有黏液的球状物。在晚期，分散的淋巴细胞病灶没有形成功能卵泡的能力。1.2.3IBD的诊断在鸡群中，临床表现和病程通常预示着IBDV感染。IBD有两种不同的临床表现形式。第一种是在新孵出的雏鸡在3周大的时候发生的亚临床的囊性疾病，导致严重的长时间的免疫缺陷。这是由于粘液囊泡的淋巴细胞衰竭和随后的免疫抑制引起的囊性坏死。在最初感染的时候，没有明显的这种疾病的迹象，而且常常被忽视，直到生命后期的糟糕表现导致了对病因的更仔细的检查。这些免疫缺陷的鸟类不能产生抗体。结果，他们对疫苗的反应很差，很容易被细菌、球虫、支原体和呼吸道病毒所引起的其他疾病感染[11]。在新孵出的小鸡中，与IBD有关的一个悖论是，尽管对许多抗原有免疫抑制作用，但对IBDV本身的反应是正常的。似乎有IBDV抗体的产生能刺激B细胞的增殖。这种疾病的第二种形式，即临床的囊性疾病，发生在3-8周大的雏鸡身上，这些感染后的鸡会啄自己的肛门。其他的特征是污浊的羽毛，白色或水样的腹泻，厌食，抑郁，皱褶的羽毛，颤抖，脱水和严重的虚脱。出血经常出现在大腿和胸肌。受感染的鸡的血凝血次数增加，表明这种凝血作用导致了这种疾病的出血热[12]。由于水肿，在感染后的第4天，法氏囊的体积和重量都翻了一倍，接着是萎缩，一直持续到达到原来体重的三分之一。在这种情况下，囊性b淋巴细胞前体再次被破坏。然而，由于3周大的时候有大量的成熟的B淋巴细胞从粘液囊释放到血液中，免疫抑制没有发展。IBD的组织学病变，表现为淋巴细胞的变性和坏死，主要发生在淋巴结构中。IBDV诊断主要以法氏囊的病理变化为特征，但组织病理学检查也要与病毒抗原检查相结合。通过接种无抗体胚胎的鸡蛋，可以隔离IBDV。病毒抗体可以通过3 AC-ELISA实验证明（AC-ELISA可以识别vvIBDV），并且ELISA系统在商业上可用[13]。病毒中和试验只有血清学检测，能可靠地将IBDV分离成抗原血清型和亚型。目前，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是一种分子工具，经常用于IBDV诊断。RT-PCR结合限制性酶分析，可以快速鉴定vvIBDV。RT-PCR产物的核苷酸测序已被广泛应用。研制了一种原位RT-PCR技术，用于IBDV感染的早期阶段[14]。1.2.4IBD的流行病学特点IBD是一种经济上重要的禽类疾病，其特征是在法氏囊内的淋巴细胞(主要是B淋巴细胞及其前体)被破坏。法氏囊是年轻鸟类免疫系统的重要组成部分，因为它是产生抗体的B淋巴细胞发育成熟的地方。小于3周的易感雏鸡不显示临床症状，但有亚临床症状。对临床疾病最敏感的时期是3-8周，死亡率高达20-30%。受感染的鸡会在粪便中排泄病毒，而健康的鸟类对粪便污染物质的口服吸收会导致感染的传播。通过鸡蛋垂直传播IBDV没有被报道[15]。该病毒已在鸡以外的家禽中检测到，如火鸡和鸭子，导致亚临床感染而无免疫抑制。在完全易感动物群中，发病率接近100%，通常在感染后5-7天达到高峰。1.2.5IBD的预防因此,尽管严格卫生措施，疫苗接种是能完全保证在高感染的压力下，孵化后的头几周内保护鸡不受感染。为了在整个产卵期持续的诱导产生高滴度的母源抗体，于是接种了没活的乳化疫苗。孵化后鸡成功的被免疫。被免疫的群体的滴定度可能存在较大的差异，需要重新接种疫苗。同时也需要考虑到vvIBDV。将通过高度稀释的疫苗株提供免疫。另一方面，众所周知，较弱的毒株(“热疫苗”)可能会导致病灶。因此，免疫抑制甚至会发生在接种疫苗的鸟类。已经研制出一种“免疫复合体”疫苗，在这种疫苗中，疫苗病毒在体外完成，具有最佳的抗体数量并被使用[16,17]。在蛋接种疫苗，“免疫复合体”疫苗的确切工作机制目前还不清楚。许多实验重组的IBD疫苗都有，已开发利用ARV、HVT、ADV、MDV和SFV。体外表达的VP2或体外产生的IBDV的病毒样颗粒(VLP)已被发现具有免疫原性。然而目前，这些疫苗都没有被商业化。越来越多的人担心，对IBDV的大量使用减毒活疫苗可能会导致这种病原体由于潜在突变而增加毒性。已经通过使用毒性更强的(热)疫苗进行免疫抑制病原体，这样的热疫苗可能会对易受感染的基因型或不受母体抗体保护的小鸡有害。因此，这些问题引起了人们越来越多的兴趣。亚单位疫苗的发展，其中一个或多个重组DNA疫苗编码特定病原体抗原的基因被表达。DNA疫苗接种为提供保护性抗原提供了优势，DNA疫苗模仿自然病毒感染，它们编码的抗原在它们的原生结构中产生，并唤起了一个平衡的免疫。最后，新生儿可以在母体抗体的最小干扰下免疫，然而，DNA是4 否存在仍有待确定。疫苗总能克服母体抗体。DNA疫苗在高环境温度下是稳定的，可以去除。新的免疫方法已经从对DNA的理解和构建表达质粒、重组病毒和重组细菌的能力中产生。最近，同体液免疫一样细胞介导的基因工程疫苗已经被开发出来。DNA疫苗表达VP2或vp4-2-3多聚A由此产生的疫苗产生了不同程度的保护，从局部到完全保护。完全保护，对抗临床疾病，死亡率和对BF的损害只有当DNA疫苗被应用于加强免疫时才会被观察到。在几条经过测试的管理路线中(肌肉、腹腔、口腔和眼线)，肌内路线是唯一提供保护和抗病毒抗体反应的途径[18]。相反，据报道，DNA疫苗的局部管理可以诱导IgA和IgM抗病毒抗体。相比之下，含有多蛋白基因的DNA疫苗通常比含有单一VP2基因的DNA疫苗更具有保护作用。然而据报道，含有vp2的DNA质粒能够诱导完全保护。在卵细胞内注射40μgDNA疫苗(pCI-VP2)，以质粒载体pCI-neo为载体，从vIBDV株F52/70中携带VP2的编码序列，在18天的孵育过程中伴随着fpIBD1后孵化产生了完全的保护，以对抗IBDV诱导的死亡率和法氏囊病理。这种保护并不明显，因为它本身就使用了两种疫苗。在加强免疫疫苗接种后，即使在雏鸡受到IBDV感染，对IBDV的Ab反应也未被发现。当质粒被DNase消化并与胞嘧啶甲基化后，这种免疫刺激作用被抑制，证实了CpG在质粒DNA中的免疫调节作用，并提示CpG在质粒DNA疫苗中作为疫苗佐剂的潜在作用[19,20]。在T细胞疫苗中，尤其强大的是DNA和活载体的组合，其中使用活的载体疫苗来促进对DNA素体的反应，或者在其中一个重组病毒载体用于启动，第二个病毒载体用于促进。这些异质性的朊病毒增强免疫反应比通过启动和促进相同的载体获得更强的免疫反应。第一次免疫接种启动记忆细胞;第二种疫苗扩大了记忆反应。在对普通疫苗的免疫反应之外，这两种药物的作用是巨大的，它们不会对彼此产生反应，因此不会干扰彼此的活动[21]。仅使用DNA疫苗就能在动物体内诱发T细胞反应，许多佐剂的抗原也是如此。人们已经考虑了各种各样的方法来改进DNA疫苗，例如细胞因子扩增。在预防性免疫后成功地消除病原体，很大程度上取决于宿主免疫系统在必要时识别何时需要激活，以及如何最有效地做出反应，最好是对健康组织的伤害最小。在有效的、非复制的疫苗的设计中，免疫佐剂作为重要的组成部分，指导和控制适当类型的抗原特异性免疫反应的选择性诱导。因此，疫苗佐剂对于激发宿主对缺乏免疫原性的抗原的免疫反应至关重要。从理论上讲，佐剂可分为信号1的助推器(增强整个抗原的持续时间或大小，或由MHC分子在淋巴器官APC上呈现的肽片段)和/或内源性信号2分子(细胞因子、膜结合的共刺激分子或其他宿主自然佐剂)的诱导物。有效的疫苗佐剂，如Freund的佐剂，由于其潜在的毒性，临床使用有限，因为它们通过非特异性诱导的几种细胞因子介导其作用;Freund的佐5 剂诱导T细胞增殖并产生IL-2和IFN-c。因此，使用特定的细胞因子作为疫苗佐剂应增强免疫原性，而不需要非特异性细胞因子诱导的副作用[22,23]。许多这样的宿主衍生免疫刺激因子被描述为疫苗的免疫增强剂，当它被作为一种外源表达产品或通过病毒载体进行传递时。它们的作用可能是直接向适应性效应T或B细胞提供第二个信号，或者间接调控其他重要信号2分子的生成。基于它们的生物活性，哺乳动物和鸟细胞因子作为辅助剂，用于增强抗原表达(粒细胞巨噬细胞-群体刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞-csf,IL-1a/b,IFN-c)，增强T细胞免疫应答(IL-2,IL-12,IL-6,IFN-c)，增强b细胞体液免疫应答。当表达鸡IL-2的DNA质粒与编码VP2的DNA疫苗联合使用时，可以增强抗毒IBDV的保护作用。Sun等人采用了携带鸡IL-6和IBDVVP2-4-3的质粒载体，使鸡对vvIBDV菌株SH95免疫，混合了两种基因的免疫接种可以保护90%的鸡[24]。此外，当与VP2单独使用时，使用VP2作为疫苗佐剂时，也观察到部分保护和提高抗原滴度。各种病毒已经被用作IBDV的载体，利用鸡痘病毒(FPV)作为重组载体，在80年代开始使用。重组的FPV载体已经成功地预防了多种疾病，如NDV、IBV、AIV等。此外，重组FPV疫苗已用于非鸟类物种。FP9是用于重组疫苗的FPV菌株的最佳特征。FP9在20世纪80年代末在英国霍顿家禽研究站被隔离。FPV基因组长度为288kb，包含260个ORFs。基因组由一个中央编码区域组成，由两个相同的反向末端重复(ITR)区域，每个区域约为9.5kb。ITRs与中心编码区之间的边界以ORFFPV010和FPV251的30148个密码子标记。Eldaghayes证明FPV-IL-18结合蛋白是由orf214编码的。Bayliss等人构建了一种重组FPV疫苗，fpIBD1(FPV株FP9，一种由父FPV株HP-1的组织培养适应菌株，从vIBDV株F52/70编码VP2，作为b-半乳糖苷酶融合蛋白，插入到FPV基因组的ITR中)[25,26]。fpIBD1(在一种原始的疫苗接种方案中)保护了罗得岛红鸡，由vIBDV株F52/70或高毒菌株CS89引起的死亡，虽然不是vIBDV引起的法氏囊损伤。fpIBD1的保护是在缺乏可检测的血清抗体的情况下被诱导的，这表明细胞介导的免疫对IBDV的保护具有重要的作用。与此相反，在接种了表达VP2和流感病毒血凝素的重组FPV的鸡中发现了对流感病毒和FPV的反应。针对IBD，已对各种疫苗接种策略进行了实验测试。与传统的减毒活疫苗和灭活疫苗相比,重组疫苗被证明是成功的在保护动物机体免受IBDV感染。1.3鸡传染性法氏囊病病毒1.3.1鸡传染性法氏囊病的病毒粒子IBDV粒子无囊膜结构，仅由核酸及衣壳组成。病毒粒子由32个壳粒组成，按5:3:2对称排列,成熟的病毒粒子直径约为65-70nm[27,28]。其结构由结构蛋白VP1，VP2，VP3，VP4非结构蛋白VP5以及RNPs复合体组成。6 1.3.2鸡传染性法氏囊病病毒的基因组鸡传染性囊病病毒(IBDV)属于双股RNA病毒科[29]，基因组包括A和B两个，，RNA节段，这两个节段均包括5UTR和3UTR，A节段长约3.17kDa，编码IBDV病毒的主要成分[30]，并且含有两个ORF，B节段长约2.8kDa，编码IBDV病毒RNA依赖的RNA聚合酶。1.3.3鸡传染性法氏囊病病毒编码的蛋白IBDV总共编码5种蛋白分别是VP1、VP2、VP3、VP4、VP5，其中A节段编码VP2、VP3、VP4、VP5，B节段编码VP1。VP1又称做VPg[31]起到连接蛋白的作用，将基因组A和（或）B节段连接起来。VP1在IBDV病毒粒子中分子量最大，其大小约为95kDa，占IBDV粒子总蛋白的3%，不但具有RNA依赖的RNA聚合酶活性使病毒复制，而且具有甲基转移酶等多种酶活性[32]。VP1与dsRNA的两个末端共价偶联，存在于病毒粒子的内部，多数以游离形式存在，负责IBDV的复制和转录，VP1包含三个结构域：N端（1-167位氨基酸），中心聚合酶结构域（168-658位氨基酸），C端（659-878位氨基酸）；其中中心聚合酶又分为手指，手掌和拇指结构域。其中有八个氨基酸位点是关键位点能够影响IBDVRdRp的生物学活性，包括N端结构域中VP1鸟苷酰化位点，其余的七个位点位于中心聚合酶结构域。VP2大小在40-42kDa左右，占IBDV总蛋白的51%，是IBDV中非常重要的蛋白之一。有且只有VP2能够使机体生成中和抗体，也是IBDV的保护性宿主抗原[33]。VP2是鸡传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白，包含基底、壳体和突起结构域。突起结构域在病毒衣壳表面突出出来，并垂直于壳体结构域，基底结构域与VP3相连位于病毒衣壳的内部。通过目前的科学技术已知VP2中至少包含3个位于高变区的中和表位并且存在高度构想依赖性[34]。VP2与IBDV的毒力十分相关，VP2表面的丝氨酸残基起到了至关重要的作用。此外，VP2还可以决定IBDV的细胞嗜性。已证明，VP2可以让鸡B淋巴细胞、CEF以及多数哺乳动物细胞发生凋亡。VP3是IBDV另一个重要蛋白，大小约为32kDa,占IBDV总蛋白的43%。VP3参与VP2的折叠并在IBDV衣壳蛋白的形成中发挥重要作用[35]。VP3有群特异性，并且在其C端存在特异性血清型可用于血清型的鉴定。VP3又称为“脚手架”蛋白，因为其在IBDV衣壳蛋白内层，并且IBDV衣壳蛋白形成过程中与VP1、pVP2、VP3和dsRNA存在相互作用[36]。其中VP3与VP1的相互作用与IBDV的复制有关。进一步的研究成功将VP3与VP1互作位点定在VP3C端的16个氨基酸上并且发现VP1与VP3形成的复合物是IBDV形成过程中步骤之一。VP3还可以起到诱导pVP2（VP2的前体）成熟的作用。VP3与IBDV基因组A、B节段都能够发生互作，但目前为止，具体的相互作用位置并没有确定，还有待更进深入的进一7 步研究[37]。VP3的C端979-1002位氨基酸存在一个结构域被称作寡聚结构域，并且已经证明如果这一寡聚结构域被破坏会阻断IBDV病毒粒子的生成[38]。VP4蛋白大小约为28kDa,其含量占病毒总蛋白的6%，具有蛋白水解酶的活性可以水解多聚前体蛋白，其中VP4蛋白可以剪切多聚蛋白pVP2-VP4-VP3从而释放pVP2、VP3和VP4自身，但对其机制的进一步研究目前还不十分清楚。VP4蛋白在帮助IBDV躲避固有免疫起到重要作用，其可以与糖皮质激素结合并通过诱导亮氨酸拉链蛋白表达从而达到抑制调控转录的因子NF-kB的激活，进一步抑制干扰素表达[39,40]。此外，VP4对VP1的表达起到激活作用，故而能够起到影响病毒粒子复制的作用。VP5是IBDV编码大小约为17kDa的一种非结构蛋白，1995在感染IBDV的细胞中被鉴定出来，具有高度保守性，并且其中含有丰富的半胱氨酸残基，PH大于7呈碱性[41]。对于IBDV病毒粒子的复制来说VP5蛋白并非是必须的蛋白，实验表明若缺失VP5蛋白IBDV病毒粒子的致病性会大大降低，并且其细胞毒性和引起细胞凋亡的程度也会大幅度降低，IBDV的靶器官法氏囊不出现损伤，失去了对鸡原本的致病性。VP5在子代IBDV粒子的释放中非常重要，拓扑学蛋白结构预测显示VP5的N端存在于细胞内部，其C端则暴露在细胞外，属于跨膜蛋白。免疫荧光实验可以证明VP5能够聚集在细胞膜的内侧，这种聚集提高了细胞膜的通透性，使得大分子能够通过[42]。VP1，VP3和dsRNA形成的复合体叫做RNPs复合体，是构成IBDV病毒粒子的最基本的单元。此复合体不仅能够维持病毒衣壳的完整性，调控宿主抗病毒反应，还能够调控IBDV聚合酶活性，并且新的研究表明，其在IBDV的复制中促进IBDV转录。病毒蛋白VP2，特别是VP5，被怀疑在IBDV复制中起关键作用，诱导细胞死亡。体外实验表明，IBDV感染激活效应caspase3，启动caspase9和核因子κB(NFκB)，可能通过活性氧自由基的积累，导致在感染周期晚期凋亡。最近，VP5通过与线粒体中的电压依赖性阴离子通道2(VDAC2)相互作用而被证实是一种主要的凋亡诱导因子。此外，rRNA结合VP3多肽可能通过抑制PKR介导的细胞凋亡来保证IBDV复制周期的连续性。另一方面，在病毒抗原阴性的囊细胞中也观察到细胞凋亡，增强了免疫介质在此过程中的作用。1.3.4传染性法氏囊病病毒的感染特性IBDV主要侵害3-6周龄家禽法氏囊中未成熟的B淋巴细胞，对除法氏囊以外的器官中的淋巴细胞的感染性大大降低。IBDV不仅在不同组织中感染性不同，强弱毒对不同细胞易感性也大不相同。Gx能够在原代的法氏囊B细胞和DT40内繁殖，Gt则是在原代的法氏囊B细胞、DF1、CEF以及Vero细胞内繁殖。多年来，IBDV与宿主细胞之间的相互作用变得更加清晰。首先指出病毒的先8 决条件是细胞分化的某一阶段的复制。旧的假设是，这一事实可能是由于特殊的受体或潜在的合成装置存在于这些细胞中。然后证明IBDV主要是由一种由n-糖基化蛋白组成的病毒受体在承载细胞表面所控制。观察IBDV感染发现两个IgMB细胞亚群。最近，也有人提出，IBDV可能使用a4b1整合蛋白作为禽类细胞的特异性结合受体。虽然膜穿孔被认为是由IBDV介导的渗透方式，但被劫持的细胞机制仍在很大程度上是未知的。最近的研究结果表明，完整的IBDV颗粒被转移到V-ATPase阳性的囊泡中，并在病毒进入过程中发挥了网格蛋白独立内吞作用的重要作用。单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞也可以以持久和有效的方式感染，并在病毒的传播和疾病的发病中发挥关键作用。在法氏囊巨噬细胞中，RT-PCR检测病毒RNA，在1-7dpi之间进行免疫化学检测。共焦显微镜检查发现，细胞对KUL01(巨噬细胞表面标记物)和R63(IBDV-VP2标记)均呈阳性，从而证实了病毒在巨噬细胞中的存在。因此，巨噬细胞的功能，尤其是吞噬活性，被IBDV的感染所改变，细胞因子基因表达上调，从而影响受影响鸟类的正常免疫应答。最后，虽然T细胞和IFNc不容易感染，但在IBD的发病机制中起着重要的间接作用。事实上，在1到10dpi之间，CD4+和CD8+细胞的大量涌入和浸润，最可能增强细胞损伤。1.4CD40L相关的研究进展1.4.1CD40LCD40L又叫做CD40配体或者CD154，是一种主要在激活T细胞上表达的一种蛋白，也是肿瘤坏死因子超家族中一员。它跟抗原呈递细胞的CD40有相互捆绑作用，会根据靶细胞的种类不同产生很多效应。CD40L一共有三个受体：CD40，αIIbβ3，α5β1整合蛋白[43]。CD40L作为一种辅助刺激分子也是一种尤其重要的T细胞的一个子集叫T卵泡辅助细胞(TFHcells)。在T卵泡辅助细胞上的CD154通过同B细胞表面CD40接通使得B细胞能够维持并行使功能，同时加强了细胞之间的交流。缺少CD154会阻止次级淋巴小结（生发中心）的形成，同时禁止与抗体的亲和，这是一种重要的后天免疫。鸡CD40L基因序列在4号染色体上，其中包括6个外显子，1个转录体，转录长度约892bp,编码272个氨基酸（详见图1）。CD40L一共有3种存在形式：分别是14kD、31kD和18kD。CD40L形成三聚体并且与TRAF联合转导信号[44]。图2为CD40L的立体结构。9 图1鸡CD40L基因组区域、转录及翻译产物Fig.1Genomicregions,transcriptsandproductsofChicken-CD40L图2ACD40L立体结构图2BCD40L三聚体结构Fig.2ACD40LProtein3Dstructure；Fig.2BCD40LTrimerProtein3Dstructure1.4.2CD40L的生物学功能早期的实验表现出，CD40与CD40L互相作用于调控B细胞的增殖过程中有着十分重要作用，与此同时可以使NF-γB/Rel蛋白活化，从而介导Ig同型转化、促使抗体进行分泌，且能够促使具有记忆功能的B细胞，挽救发生细胞凋亡的B淋巴细胞。经实验证明，把CD40L基因去除后，可以致使机体患有HIGH-X[45]。在有IL-4、IL-10和IL-2存在条件下，CD40L能够促使B细胞生出IgG、IgE、IgA和IgM..经研究发现具有水溶性的CD40L可以当作治疗方法或者佐剂去提升疫苗在机体里免疫的效果。APC（抗原呈递细胞）外CD40和CD40L结合，导致一氧化氮分泌，提高脾脏内淋巴细胞存活率，同时能够调控细胞免疫过程中不同时期产生的免疫应答。CD40/CD40L互作可以促使抗原呈递细胞分泌出一系列重要的细胞因子与趋化因子，例如：IL-28、TNF2α等。同时CD40和CD40L的相互结合能够诱使巨噬细胞中其它前炎症因子的表达与分泌，也可以调节趋化因子的受体表达量，进而调控相关细胞往具有炎症的部位迁移。CD40/CD40L互相的结合起到了重要的作用在T细胞的激活和效应功能。10 CD40信号对B细胞分化的影响：生发中心内的B细胞被抗原刺激之后一般形成记忆B细胞或者浆细胞这两种成熟型的B细胞。CD40L/CD40系统上调了浆细胞中的蛋白1的表达量从而加快了B细胞转化成浆细胞的速度，这是由于CD40L/CD40加强了IL-21对STAT3和信号转录因子通路的作用导致的。在它培养系统内加CD40L，Blimp1的表达水平明显提高，此时，B淋巴细胞分泌的IgM、IgG水平明显提高，说明CD40信号会增强IL-21介导B淋巴细胞往浆细胞方向分化。在一些情况中，CD40的信号并不可以促使B淋巴细胞向浆细胞转化。有些实验证明CD40信号能够抑制B淋巴细胞往浆细胞转化，CD40信号可以降低因受到LPS（脂多糖）刺激而上涨的Blimp1表达，这类抑制作用并不是经过当前知道的Blimp1调控因子Pax5（配对盒基因5）、人类的Bcl-6因子（B细胞淋巴瘤）起作用，证明CD40还能够通过某些还未发现的方式调整B淋巴细胞转化。CD40L/CD40系统对B淋巴细胞免疫球蛋白类别转换的作用：XHIM（X高免疫球蛋白M血症）患者是因为CD40L缺陷，致使体内B淋巴细胞不能够正常的发生免疫球蛋白的类别之间的转换从而身体里过量的积累IgM,缺少IgE、IgG、IgA。Zelm等人发现CD40L缺陷性病患免疫球蛋白重链的突变率比正常人低，而且体液内抗体和相应的抗原结合的程度比健康人低。从机制角度讲，因为CD40L的缺陷致使CD(胞苷脱氨酶)与UDG2的活性能够阻碍体细胞产生高频的突变[46]。Kim等人在小老鼠身上所做的实验中发现，SphK1缺陷类型的小老鼠体内抗原特异性的IgE的转化明显下降，在CD40下游JNK、NF-KB的通路中SphK1起到了至关重要的作用，但是SphK1对于CD40通路的调整和IgE类型转化间有着什么样的关系，以及SphK1与UDG2和CD间有无关系直到现在还不十分清楚。CD40L/CD40系统抑制B淋巴细胞凋亡：早些时候人们通过实验证明CD40配基化的作用对生发中心功能B淋巴细胞的选取非常重要。B细胞成熟需要初始的B细胞与CD4+T相结合，这类结合让抗原亲和力高的非自身免疫B淋巴细胞生存并且增加其转化为记忆B细胞，进到血液循环中并具有防御功能[47]。没有与T细胞结合并进行配基化的自身免疫细胞或者恶性细胞则被除去。BTK（Bruton酪氨酸激酶）与CD40缺陷类的小鼠的外周血B淋巴细胞的数量少于两者有单独缺陷类的小白鼠，这说明在没有足够的BCR的时候，CD40可以促使B淋巴细胞存活。基质细胞信号与CD40L共同诱导白血病的患者体内的淋巴结的B淋巴细胞产生许多小RNA，当中miR-155、miR-125b，在RNA水平经过抑制致使死亡蛋白Bcl-2DE转录，抑制B淋巴细胞凋亡并且促使它增殖。CD40/CD40L系统与疾病：对于具有系统性红斑狼疮（SLE）的患者来说，是患病者自身免疫产生抗体过程中一个相当重要的过程。由于CD40L长时间的发生表达会产生对机体自身组织器官的抗体。在老鼠的上皮组织细胞中进行CD40L的过量表达能够导致小鼠自身的免疫疾病以及慢性炎症。若用CD40L抗体进行11 CD40/CD40L系统的阻断,结果显示会抑制抗核抗体的产生，由此进一步证实了机体的自身免疫性应答启动过程被阻断。用CD40L抗体进行CD40/CD40L系统的阻断能够阻断CIA并且抑制APC产生Th1和IL-12的各自转化，同时使机体自身产生的IgG，关节局部的一氧化氮产生减少，炎性细胞也随之减少。用酶联免疫吸附试验（ELSE）检测的结果发现，病人体内CD40的抗体3A8对TNF-α的产生起到抑制作用。患有血管炎症的RA病人相对于没有患血管炎症的RA病人的血液中sCD40L存在显著的提高，据此推测CD40/CD40L系统很有可能与RF相关[48]。最新研究显示，RA病人体内滑膜细胞内的IL-12的表达可以由于IFN-γ通过CD40L系统这一途径来实现。CD40配体抗体能够有效阻止EAE的发生，若早期患者体内有CD40L的产生则能够减轻EAE的发展情况。使用人鼠嵌合的CD40L抗体在效果上能够明著阻止EAE发病的进程。最近还有研究显示，来自于单核细胞的CD40L在参与MS复发过程中起到关键作用。CD40L-CD40和AS关系是密切的，阻隔这个共刺激方式能够让粥样斑块破裂，经实验证明，在患病的部位里的平滑肌、血管内皮和巨噬细胞的表面上能够表达CD40L和CD40，但是正常组织内这三种细胞不能进行表达[49]。所以推测CD40L-CD40间互相作用能够和AS有关系。在临床上，女性患有冠心病的患者的血液内sCD40L、CRP和心肌内钙蛋白Ⅰ的水平升高，某种程度中预示了病人有可能复发心梗。CD40L-CD40共同刺激途径会在移植免疫内也有着重要的作用，所以，封闭阻挡这个途径能够延长移植物体的存活时间。用CTLA4-Ig和抗CD40L抗体治疗，对于阻隔CD4OL-CD40的互相作用十分明显，经实验证明，抗CD40L抗体Hu5c8与CTLA4-Ig能够同时逆转或者阻挡极性的移植物发生排斥。一般常用的传统免疫抑制剂能够影响mAbHu5c8治疗效果，但是整体的实验上看，mAbHu5c8在器官移植方面有着很好的应用前景[50]。CD40L-CD40互作对于肿瘤疫苗有保护性免疫。使T细胞的数量增加，并且使DC成熟加快；由于CD40表达量的提高，DC上CD80/CD86的表达量也增多了，对于T细胞的激活有益处。所以在DNA方面疫苗的研发中怎样提高抗原表达量是疫苗成功关键所在。如上所述，CD40/CD40L系统在机体的特异性免疫中（其中包括体液和细胞两种免疫）均扮演者至关重要的角色。因此会导致机体发生异常的病理反应，有效切断刺激途径是一种有效的治疗方法。1.4.3鸡源CD40L的研究进展CD40与CD40L之间的作用即免疫应答之中心环节所在，特异性的免疫在刚开始的阶段。CD40L机体内主要为膜蛋白形式，由于是种Ⅱ型的跨膜蛋白，那么跨膜区周围的精氨酸十分可能是蛋白酶的作用位点，所以分泌细胞外部的CD40L112 段肽链能让特定蛋白酶发生酶切，在血液中形态为可溶性。体外实验验证，细胞膜外表面的CD40L和血液中可溶性的CD40L有着同样生物活性。现在已经有很多有关CD40L和CD40间互相作用方面的研究，这让人们对细胞免疫和体液免疫在调节作用方面有着不小的帮助，因为CD40L与CD40间的互相作用，让很多病的治疗变为可能。CD40L适应性的免疫应答的过程中有着至关重要的作用，这作用在哺乳动物和禽类的免疫系统逗得到了证实。最近研究表现，小老鼠的CD40L能够当作分子学佐剂去提高机体免疫应答的水平与对疾病抵抗力[51,52]。AutenMW等人用腺病毒来构建CD40L的表达载体，发现了CD40L能够十分明显的增强DNA疫苗去激活CD4+T有缺陷型小鼠的免疫应答，并且CD40L对于有些终究有着很好的疗效。综合以上能够的到小老鼠的CD40L不管是当作融合蛋白还是单独使用，都能够当作分子佐剂去提高机体对于疾病防御能力和加强机体免疫反应。JunCao等在2010年，分别将PRRSV基因组内GP5和GP3基因与猪的CD40L蛋白来构建新的重组得腺病毒衣壳蛋白：rAd-CD40L-GP3-GP5,rAd-CD40L,rAd-GP3-GP5,结果说明猪CD40L能够有效的增强由PRRSV-GP5和GP3介导引发的细胞免疫和体液免疫[53]。正因如此猪的CD40L能够用来当作一种免疫导向或佐剂去提高PRRSV亚单位类型疫苗的免疫应答反应。CD40L免疫刺激的能力在鸭和鸡上取得了观察。Ramosai等于2011年，把H5型的禽流感病毒细胞外部的红细胞凝素部分（HA）与鸡CD40L蛋白相互融合。并且在Ad（腺病毒）所表达的载体内成功的表达收获啦新蛋白AdHACD，经实验验证AdHACD相比较HA来说，能够明显增强机体抗体的滴度水平。GaresSL等人将鸭CD40L细胞外部结构域和病毒的抗原共同表达，或作为融合蛋白，和APC上的靶向病毒的抗原相互结合。相同的，已通过被乙型肝炎病毒感染的鸭子的模型证明了CD40L免疫调节的能力，这能够间接说明早在哺乳动物与鸟类发生分化之前，CD40L负责调节适应免疫应答功能发生进化。尤其是鸡这个物种，CD40L编码序列已被克隆并且测序，以及它在B细胞的生长与分化的过程中功能作用同样得到研究。除此之外有实验证明，M2e抗原和CD40L相互结合能够导致机体对禽流感产生免疫保护。SharmilaM等人把可以进行真核表达载CSFV载体与表达CD40L的载体给小老鼠进行皮下注射，从结果上看，免疫后的毒性T细胞增殖活化获得了相当程度的提升，并且促使CD8+细胞的产生，这能够证明CD40L能够当作一类有效免疫佐剂。MastenBJ等人通过实验证实SRV病毒DNA疫苗和CD40L共同免疫BALB/c小老鼠后，小老鼠身体内部病毒的清除率有着明显的增高，并且加强了机体免疫，证明CD40L能够增加免疫时间。从而增加免疫效果[54,55]。相同的，CD40L自己也是可以参加抗病毒的反应。前两次免疫的过程中表达HIV抗原重组NYVAC和13 MVA的DNA疫苗，在同一时间注射能够表达CD40L的质粒，相对于只用病毒载体基因疫苗，动物机体在免疫应答方面的广度和强度有着明显提高，增加了IL-2和干扰素的分泌。CD40L有着关键的作用在加强B和T细胞的应答反应中能够把它看成一类“信号弹”，作用在为B细胞发出CD40信号。因为CD40主要是由B细胞来表达分泌，所以这类佐剂效应发挥十分有可能是因为袭击了大量抗原特异性的B细胞而引发剧烈的应答反应。CD40/CD40L系统对B细胞的作用：对于保持免疫系统平衡，淋巴细胞数量增加与存活有非常重要的作用。B细胞数量增加的生理机制很是复杂，这是要不同功能的基因群都处在适宜的水平。在B淋巴细胞的培养基里添加CD40L，使用通路抑制类药物隔断ERK、P13K、p38，细胞数量的增加被明显抑制。然而细胞是否存活对CD40信号通路的倚赖性很低，在相同的CD40L体系内，用药物分别阻隔CD40通路下的PI3K、p38、ERK通路，B细胞的存活没有收到太大影响[56,57]。CD40对于B细胞数量增加的调整和ROS有关系，CD40可以经过ROS调整B细胞无APE/REF-1的细胞核内的重新定位，而APE/REF-1的细胞核内的重新定位从而影响TF(转录因子)的活性与P21细胞核与细胞质的转移，调整细胞周期的进度。Merluzzi等人发现CD40诱导的APE/REF-1的重新定位影响CDK抑制子P21的核质转移，而APE/REF-1影响了P21的细胞核与细胞质的转移的具体的机制到目前位置还不太清楚。1.5eEF1α相关的研究进展1.5.1eEF1α的定义翻译延伸因子（eukaryotictranslationelongationfactor1-alpha,eEF1α）是广泛存在于所有生物许多类型细胞的一类含量丰富且高度保守的蛋白质家族。它属于G蛋白家族，在肽链延伸过程中作为翻译延伸复合物的一部分，促使GTP依赖的氨酰tRNA转移至核糖体[58]。众所周知，蛋白质的表达需要通过转录和翻译两个过程，转录一般即是将遗传物质（DNA）在RNA聚合酶的作用下形成mRNA,若遗传物质是RNA需要在逆转录酶的作用下先形成cDNA然后再形成mRNA,翻译即是以mRNA为模板在转运RNA（tRNA）的帮助下核糖体形成多肽链的过程，其中包括起始、延伸、终止三个阶段。1.5.2eEF1α的形态结构鸡eEF1α的大小约为53kDa,包含三个结构域其空间构想和功能都不相同，分别是结构域1，结构域2和结构域3。结构域1又叫做G结构，其中包含四个基序分别为G1,G2,G3,G4，用来结合GTP/GDP，是G蛋白的共有基础结构。结构域2和3结合起来形成一个功能单位，其位置相对不变[59,60]。结构域1中含有2个可14 变区，可变区1在结构域1与结构域2的接触面之间，起到稳定结构域的作用，可变区2在结构中心，使2和3相互联系。结构域1与GTP相互结合，结构域2与t-RNA相互结合，此外结构域2和结构域3共同参与和细胞肌动蛋白的相互结合。物种不同eEF1α基因数不同，eEF1α是由一个多基因家族编码的。eEF1A1和eEF1A2是eEF1α的异构体，两者有百分之九十二的相似在氨基酸的排列顺序上，在蛋白延伸中作用十分相似。这两种异构体也存在差异，主要表现在不同生长阶段这2种亚型表达不同。eEF1A1在胚胎发育时广泛表达，在重新生长的肌肉中含量降低。有实验表明，21d的小鼠肌肉中无法检测到eEF1A1的表达，但可以检测到eEF1A2的表达。小鼠的神经元中的eEF1A1从胚胎时期开始下降直到出生后第26天完全停止表达。然而，eEF1A2只在神经元，骨骼肌和心脏中表达。1.5.3eEF1α的生物学功能真核翻译延伸因子1（eEF1）由eEF1A和eEF1B这两个不同亚因子组成，是蛋白合成中至关重要的蛋白因子[61]。eEF1A即是之前叫做eEF1α的单个多肽链，eEF1B是多聚体。在蛋白翻译的延伸过程中，eEF1α与tRNA、GTP形成复合物从而正确识别密码子和反密码子将tRNA转运到核糖体的A位上，与此同时核糖体按照mRNA的方向进行移位，然后eEF1α离开核糖体，在eEF1B的催化下完成GDP与GTP之间的转化。如此，新的氨基酸源源不断地加到延伸的肽链上去。过程详见图3。图3蛋白质翻译延伸过程。①eEF1A将氨酰-tRNA转运至核糖体A位。②GTP水解使eEF1A从核糖体释放并结合eEF1B。③eEF1B将eEF1A结合的GDP换为GTP。④eEF1A又将新的氨酰-tRNA转运至核糖体A位。Fig.3Theelongationphaseoftranslation.①eEF1Arecruitsanamino-acylatedtRNAtotheAsiteoftheribosome.②GTPhydrolysis15 allowseEF1AtodissociatefromtheribosomeandbindeEF1B.③eEF1BexchangesGDPforGTPoneEF1A.④eEF1Aisfreetorecruitanewamino-acylatedtRNAtotheribosomalAsite.注释：A：氨基酸受位；P：肽基去位；E：脱氨酰-tRNA去位。eEF1α的致癌效应：eEF1α对细胞生长具有促进作用，已经被公认为是致癌基因，人的eEF1A2有很多致癌基因具有的特点。由于eEF1A1与eEF1A2的序列低分相似所以表明人eEF1A1和eEF1A2功能相似，在前列腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤等中eEF1A1均被发现大量表达，在肺癌以及卵巢癌中发现eEF1A2被大量的表达[62]。降低eEF1α表达量能够促进癌症的治疗，提高存活率。eEF1α调节细胞骨架结构：eEF1α能够切断微管同肌动蛋白微丝相结合，并且同细胞骨架肌动蛋白网存在互作。eEF1α与肌动蛋白的微丝存在相互作用，能够抑制肌动蛋白的解聚，提高微丝多聚体的组成，还可以增加细胞肌动蛋白的微丝长度。与此同时肌动蛋白能够影响eEF1α的功能，细胞肌动蛋白与eEF1α结合后能够减弱eEF1α和氨酰-tRNA之间的相互作用，因此表明eEF1α和细胞骨架之间的相互作用能够抑制翻译。目前为止eEF1α调节细胞骨架同细胞肌动蛋白的互作的生理机制还不清楚[63]。eEF1α与细胞凋亡：据有关报道eEF1α能够在细胞凋亡中起到作用，实验在仓鼠的体内进行，由于其对棕榈酸诱导的凋亡有抵抗，一种功能已经失调的eEF1A1在体内被分离出来，此eEF1A1在相关部位存在碱基突变，用上下游引物不能扩增出其全长。实验研究可以证明心肌细胞里eEF1A1参与细胞凋亡，此细胞凋亡是由棕榈酸所引起的一种高脂质类模型。干扰eEF1A1表达后发现棕榈酸引发的脂毒性降低了，这些结果表明eEF1A1在细胞凋亡尤其是由于脂质含量增高引起的。在过氧化氢诱发凋亡的大鼠的心脏细胞中，eEF1α的表达量连续升高。eEF1A1表达量降低会抑制由于内质网和过氧化氢应激诱发的凋亡，在这类凋亡中，eEF1A1的调节作用与蛋白的合成无关，因为细胞内eEF1A1的表达水平不随蛋白的合成的变化而发生变化[64,65]。有关研究显示eEF1A1因为与细胞肌动蛋白的微网相结合，使细胞骨架结构被破坏从而使细胞凋亡。除此之外，其他研究表明eEF1α具有抵抗细胞凋亡的作用，其中它不可以抑制由于紫外辐射诱发的细胞核损伤类细胞凋亡。最新的研究结果表明，eEF1α还能够参与TNF-α刺激而引起的巨噬细胞凋亡。结果显示，IL-1、LPS、TNF-α等因素刺激IFIT-1的表达量也会提高，在被TNF-α刺激的巨噬细胞里的eEF1A1的表达量也升高。Pull-Down实验、激光共聚焦已经CO-IP都能证明IFIT-1能够与eEF1α产生相互作用从而加快细胞凋亡[66]。eEF1α与心血管系统：最近几年，经研究所发现eEF1α参与了心血管系统。16 人eNOS可以催化L-精氨酸的氧化而生成NO，eNOS活性的正常与否和心血管疾病有着十分密切的关系。经研究发现TNF-α能够通过和eEF1A1互相的作用，调节血管内皮eNOS的基因的稳定性进而充分发挥出它下调血管内皮eNOS的作用[67,68]。经多年研究证实TNF-α可以抑制血管内皮eNOS的表达，并且是经过降低它基因稳定性所实现的。其中血管内eNOS的基因的3’-UTR在转录后基因稳定性的方面发挥出的作用十分重要。eEF1A1与血管内皮一氧化氮合酶基因的3’端非翻译区作用后，可以缩短它的半衰期进而降低它的稳定性。这个实验还证明了过量表达eEF1A1可以显著降低血管内皮eNOS的表达的水平；相反，eEF1A1的表达遭到抑制之后，TNF-α诱导血管内皮eNOS的表达水平也遭到显著抑制。以上所有实验充分说明eEF1A1在血管内皮eNOS表达水平的方面有了重要调节的作用[69,70]。TNF-α经过eEF1A1下调血管内皮eNOS基因的稳定性从而抑制血管内皮eNOS的表达，可以引发血管功能的异常，可以引起心力衰竭，糖尿病，动脉硬化等心严重的血管类疾病。这也引起我们的注意，eEF1A1在系统内有可能有着十分重要的关于调节的作用，在心脏和脑血管方面的疾病的治疗和防御方面，给人们提供了全新的思路和靶点[71,72]。综上，eEF1α在细胞内功能相对复杂并且表达丰富，目前为止对eEF1A1的研究相对广泛，对eEF1A2的研究还没有那么透彻。很多蛋白组学实验证明，eEF1α与细胞里面的很多的分子存在相互作用，调控细胞中很多重要的生理机制。1.6目的与意义从上世纪80年代开始，我国广东、北京等地区先后出现IBD的报道。1999年，我国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所经分离获得了第一株vvIBDV，感染vvIBDV的SPF鸡100%死亡，感染vvIBDV的商品鸡85%死亡。之后的30年来，本国境内均存在vvIBDV的报道，使得养禽业受到非常巨大的影响。目前，在我国IBDV的三种毒株共存，并且新的基因重组与变异随之出现。使得本国在IBDV的防控方面即将遇到十分艰难的挑战。本研究用IBDV感染后的宿主因子eEF1α为诱饵，运用免疫共沉淀技术，筛选与eEF1α有相互作用的病毒蛋白，并找到鸡传染性法氏囊病强弱毒的差异所在，进一步探究该蛋白对IBDV复制的影响及分子机制。17 第2章CD40L对法氏囊B淋巴细胞的作用由于法氏囊B淋巴细胞可以同时感染传染性法氏囊病强弱毒，所以是最理想的细胞模型，但是禽的法氏囊B淋巴细胞目前还不能够进行体外长时间培养，每次都需要从3-6周龄的鸡的法氏囊中分离，并且体外培养时会大量凋亡，据文献报道72小时凋亡率可达到百分之八十以上，但CD40L能维持并增加B淋巴细胞的存活时间达到数周以上，于是构建了CD40L的表达载体并进行优化，选用293T细胞进行表达。CD40L又叫做CD40配体或者CD154，它跟抗原呈递细胞的CD40有相互捆绑作用，会根据靶细胞的种类不同产生很多效应。CD40L作为一种辅助刺激分子也是一种尤其重要的T细胞的一个子集叫T卵泡辅助细胞(TFHcells)。缺少CD154会阻止次级淋巴小结（生发中心）的形成，同时禁止与抗体的亲和，这是一种重要的后天免疫。肿瘤坏死因子家族在哺乳动物B细胞的分化和中和方面起着重要角色，但很多没有在其他物种上被证实。为了研究CD40/CD40L系统，通过表达筛选的方法得到的鸡的CD40cDNA，CD40可以像哺乳动物CD40一样表达在鸡的B细胞和巨噬细胞上。CD40L功能蛋白可以使B细胞增殖一直到培养的第三周，期间它们向浆细胞分化。这些结果都是用脾脏中的和外周血中的B细胞进行实验得出的，展示了CD40L可以使未分化的鸡B细胞维持和分化，本研究探究CD40L对体外培养的鸡法氏囊B淋巴细胞的作用。由于需要用法氏囊中的B淋巴细胞，但不知道CD40L是否起作用，故在体外培养法氏囊B淋巴细胞的时候在培养基中直接添加CD40L，选择不同的时间点分别进行B淋巴细胞形态的观察，活性的检测，细胞调亡的检测以及细胞数量的统计，结果显示添加CD40L以后可以小幅减缓法氏囊B淋巴细胞的凋亡速度，但不能使其在体外进行长时间培养。2.1方法与材料2.1.1CD40L对法氏囊B淋巴细胞的作用的主要材料3-6周龄的SPF鸡若干；IMDM培养液,胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素-链霉素，CEF上清，鸡血清均购自Gibco；从鸡法氏囊中分离的B淋巴细胞于37℃，5%CO2的培养箱中培养；流式细胞仪检测细胞凋亡所用的试剂盒FITCAnnexinVApoptosisDetectionKit购自BDBiosciences公司；流式细胞仪CytomicsFC500购自Beckma公司；CellCountingKit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒购自于Dojindo。PrimeSTARTMHSDNA聚合酶及各种限制性内切酶等购自TaKaRa公司；T418 DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs公司；大肠杆菌由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫创新团队制作；凝胶回收、小提质粒试剂盒购于Axygen公司；中提质粒试剂盒购于QIAGEN公司。293T细胞是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队保存。DMEM细胞培养液,胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素-链霉素，0.05%胰蛋白酶消化液均购自Gibco。WesternBlot细胞裂解液，IP裂解液均购自碧云天生物技术有限公司。人源抗体FC购自Sigma公司。增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自TIANGEN公司。BCA蛋白定量试剂盒购于Thermo公司。质粒的转染试剂X-tremeGENEHPDNAtransfectionreagent购自Sigma公司。19-2载体由张宝山教授馈赠。2.1.2引物的设计与合成为了构建CD40L的表达载体，设计并由库美公司合成带有同源臂的含有目的基因的引物，分别命名为19-2-h-8a154-F-r，19-2-h-8a154-R-r，具体的核苷酸序列见表1。表1引物核苷酸序列Table1Primerssequences，，PrimerSequences（5-3）19-2-h-8a154-F-rCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGGCCACCATGGACTCC19-2-h-8a154-R-rCTAGAAGGCACAGCAGATCTGGATCCTATCACTTGCCAGGA2.1.3构建CD40L表达载体首先需要设计带有同源臂的引物然后以优化后的CD40L的基因序列为模板，进行PCR，程序如下：98℃30s；98℃10s，55℃15s，72℃2min30s，30个循环；72℃延伸10min。作为目的基因，把用XhoI和BamHI在37度水浴中进行双酶切后的19-2作为载体，进行基因重组，具体步骤如下：于冰水浴中配制如下体系：ddH2OUpto20μl，5xCEⅡBuffer4μl，线性化克隆载体50-200ng，插入片段扩增产物20-200ng，ExnaseⅡ2μl，该体系配制完，用移液器上下吹打几次混匀，瞬离切记不能剧烈震荡。置于37度反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰中5min。之后产物可直接加入到感受态（100μl）中，轻弹管壁数下混匀，冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴2min,加无抗LB(890-900μl)，37℃摇床中摇1h,然后离心8000r,4min。弃部分上清，用枪头悬浮沉淀，烧棒，涂板(含有卡那抗性），放37℃的培养箱内培养12h。19 胶回收：1.在紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶2.加入大约3个凝胶体积的BufferDE-A,混合后于75度加热，直至凝胶块完全融化。3.加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。4.将混合液吸取到DNA制备管中，12000g离心1min。5.将制备管置回2ml离心管中，加500μlBufferW1，12000g离心30s,弃滤液。6.将制备管置回2ml离心管中，加700μlBufferW2，12000g离心30s,弃滤液，同样的方法再用700μlBufferW2洗一次，12000g离心1min。7.将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。8.将制备管放入新1.5mlEP管，在制备管膜中央加20μlElunet，室温静置1min,12000g离心1min。小提质粒DNA具体操作：1.取1-4ml菌液，12000g离心1min,弃液体。2.加250μlBufferS1重悬沉淀，不能留有小的细菌沉淀。3.加250μlBufferS2，上下翻转4-6次使细菌充分裂解，能够形成透明的溶液。（此步骤不宜超过5min）。4.加350μlBufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。5.吸上一步的上清到制备管中，12000g离心1min,弃液体。6.将制备管置回离心管，加500μlBufferW1，12000g离心1min,弃滤液。7.放回制备管，加700μlBufferW2，12000g离心1min,反复两次。8.将制备管置回EP管，12000g离心1min。9.将制备管放到新的1.5mlEP管，在制备管膜中央加60-80μlElunet，室温静置1min,12000g离心1min。2.1.4CD40L的表达与验证中提质粒DNA：实验前准备，将P1，P3放在4度预冷或者放在冰中预冷。1.将菌液倒入50ml离心管，6000g，4度离心15min。2.弃上清液，放在纸巾上倒置等水流干，加入4ml的P1旋涡震荡或者用移液枪吹打混匀，确保菌液沉淀被完全溶解。3.加4mlP2，颠倒翻转震荡4-6次将变成蓝色。4.加4ml的P3，快速混合并翻转4-6次，溶液重新变成白色，室温下置放10min，6000g，4度离心5min。5.用4ml的QBT平衡柱子，需要用自然重力使其完全下滴。6.将离心管中的上清倒入针管中（试剂盒里），插入活塞将其压入柱子中。7.用10ml的QC洗两次柱子。8.加入5mlQF将质粒洗脱到10ml的离心管中。9.在10mlEP管中加3.5ml异丙醇上下颠倒充分混匀，用来沉淀洗脱下来的质粒，然后在4度，15000g离心30min。10.在超净台里小心弃上清，然后加2ml的70%乙醇，4度15000g离心15min。11.在超净台打开EP管盖子吸走上清吹干沉淀，风干约10min。用记号笔画出沉淀区域。12.加52μl灭菌水溶解，几分钟后吸出放入1.5ml的EP管中，取出2μl加入到500μlEP管中，用灭水稀释10倍。13.用分光光度计测浓度，将剩下的50μl质粒稀释成1μg/μl,-40℃保存。293T细胞的传代培养：将原来的培养液弃掉，加4mlPBS润洗。弃掉PBS，加2ml胰酶，作用几分钟，弃掉胰酶，加14ml培养液，吹打混匀，每瓶分装2ml。20 每瓶加12ml新的细胞培养液，放入CO2培养箱内。转染：由于293T是贴壁细胞，所以在铺板前用多聚赖氨酸包被10min左右，使细胞贴壁更牢固利于生长，在细胞的密集程度在80％时进行转染。转染前换成1%FBS的DMEM。将Opti1ml+质粒10μg+转染试剂（Roche）300μl混匀，室温静置18min,均匀的滴入平板中，放入37℃CO2培养箱中，36h-48h左右收。收样：用PBS洗三遍，吸500ul裂解液均匀滴入10cm平皿中，在冰上作用30min，在此期间多次晃动平皿使裂解充分，将细胞刮下来放入2mlEP管内。12000g离心3min,取上清。跑蛋白胶:用试剂盒配制12.5%的蛋白胶，分别取上清和沉淀各160μl，加40μl5×Loading混匀,100℃煮8min,取20μl混合液加样，80v20min,110v1h20minWesternBlot：转膜：用转膜仪25v20min。封闭：配制5%的脱脂乳，在摇床上，封闭2h。孵一抗：将一抗融化，把膜放在一抗中在摇床里缓慢放置2h。HRP显色：配制HRP显色剂（1ml1×HRP反应缓冲液+50μl试剂A+50μl试剂B+50μl试剂C）混匀，滴到膜上，避光，反映5-30min。间接免疫荧光：首先转染然后收样，加抗体的时候二抗（1:200稀释）是FITC的荧光抗体，每孔加500ul，37℃孵育1h,再用PBS洗5遍，在荧光显微镜下看结果。2.1.5CD40L的纯化及浓度的测定由于19-2上自带Fc标签的基因序列，插入的目的序列CD40L与Fc形成的融合蛋白，故用Fc标签蛋白进行纯化。具体操作：1.将上清/裂解后的细胞+BindingBuffer10ml左右+1ml树脂，4℃摇过夜，1000g离心2min,弃上清。2.洗树脂，用WashingBuffer12ml,颠倒混匀（在摇床上）5min,1000g离心2min,弃上清。洗3次。3.ElutionBuffer洗脱：加1mlElutionBuffer，1000g离心2min，收上清。4.将上清加到中和Buffer（100ul）中,平衡PH。5.过滤器0.45/0.22um，除细菌。再生树脂：5倍体积的ElutionBuffer，洗两遍；5个柱体积的WashingBuffer,洗三遍；加1体积的20%乙醇。BCA蛋白浓度的测定：按照说明书按试剂A：试剂B：试剂C=25:24:1配制显色液，每个孔150ul。稀释标准品制作标准曲线，1ml的ElutionBuffer+100ul中和Buffer取出1ml混合液用9ml的PBS稀释用于稀释标准品，按说明书稀释成8个梯度，每个取150ul。在96孔板中加150ul显色液+150ul的标准品。加150ul显色液+150ul10倍稀释的未知蛋白样品。放37℃，2h,用多功能酶标仪测浓度，建立标准曲线，测出未知蛋白浓度。标准曲线的建立：用多功能酶标仪读出相应数值后，对应标准品稀释后的浓度，形成散点图，然后建立曲线，R2越接近1越好，在确保标准曲线可用的前提21 下，方可进行读数，测出未知蛋白的浓度。注意其数值在2-40ug/ml是可信的，若超出这个范围，数值不可信。蛋白的分装与保存：蛋白特别容易降解，尤其是反复冻融对其影响特别大，所以最好是对其进行分装保存，根据经验一般100ul/管，存放在-80℃冰箱里即可。由于CD154是要添加到细胞培养液中的，故要对其进行过滤除去细菌，以免污染细胞。2.1.6法氏囊B淋巴细胞体外的制备与培养法氏囊B淋巴细胞体外的制备：首先安乐处死3-6周龄SPF鸡，清洗鸡只后，将鸡只浸泡于75%乙醇中20min。于生物安全柜内，用无菌剪刀剖开鸡只腹部，换用无菌剪刀摘取鸡只法氏囊，将法氏囊转移至含PBS（含二倍青链霉素）的平皿内，视法氏囊大小将其等分为2-4片。将分解的法氏囊转移至含PBS（含二倍青链霉素）的50ml离心管中，拧紧管盖，上下较剧烈晃动1min；如前重复洗一遍；进一步将其转移至下一个含PBS（含二倍青链霉素）的50ml离心管中，拧紧管盖，上下较剧烈晃动1min；如前再重复洗两遍。将法氏囊放至40um孔径的滤网内，被套于50ml离心管中，用注射器的内管对法氏囊进行研磨。研磨后的细胞经过滤网漏于管内的PBS（含二倍青链霉素）中。1100rpm离心细胞10min。用20ml10%FBS的1640悬起细胞，将10ml的11191直接加到离心管最底部。2000rpm离心细胞25min（加速度调成最小）。用长Tip头吸取中间层的细胞于另一含PBS（含二倍青链霉素）的50ml离心管中。1800rpm离心细胞10min。用新的PBS重悬细胞，1400rpm离心细胞10min。重悬细胞，计数，并分装。B淋巴细胞培养液组成：82%IMDM;10%FBS;2%chickenserum;3%CEF上清；1%SP；1%ITS；1%Glutamine；0.1%β-巯基乙醇。培养条件：在37℃或41℃（最佳）、5%CO2的细胞培养箱内培养。其他注意事项：尽量杜绝污染。2.1.7法氏囊B淋巴细胞的数量，活性以及凋亡的检测细胞计数：吸取20μl待测细胞到细胞计数板中，若数量比较多尽量用PBS或不含细胞的细胞培养基稀释10倍再进行细胞读数会比较准确。细胞活性检测：1.在96孔板中加入100微升细胞悬液。放在37度，5%CO2的条件下培养。2.每孔加10微升的CCK-8（为了不影响读数尽量不要生成气泡）。3.在培养箱避光孵育1-4h。4.在450nm处用酶标仪测吸光度。若暂时不测定，可以加10微升StopSolution，在0-5度避光条件下保存7天。细胞凋亡的检测:500g离心5min后弃掉上清，用500μLPBS轻柔悬浮沉淀，500g离心5min后弃掉上清，重复两次以达到清洗目的。加入500μL的FITCAnnexinVApoptosisDetectionKit提供的1×bindingbuffer（用灭菌的蒸馏水将1022 ×AnnexinVbindingbuffer稀释成1×bindingbuffer）轻柔的重悬细胞，计数，将实验组与对照组均调整为1×106，500g离心5min，弃掉上清，加入100μL1×bindingbuffer轻柔的重悬细胞，加入5μLFITC室温避光染色15min，加入5μL的PI室温避光染色10min，加入400μL1×bindingbuffer轻柔混匀，将细胞转移到300目滤网的流式管中，进行检测。注意在第一次检测的时候需要调补偿，即在正常细胞内加入100微升的1×bindingbuffer；正常细胞加入100微升的1×bindingbuffer然后再加入FITC在65度的金属浴上煮5min；正常细胞加入100微升的1×bindingbuffer然后再加入PI在65度的金属浴上煮5min，不能把细胞都煮死需要留部分活细胞，故需要控制时间不能煮太长时间。2.2实验结果2.2.1鸡源CD40L的表达载体利用同源重组的方式成功的构建了CD40L的真核表达载体，并且双酶切鉴定条带大小正确，基因序列的比对结果也正确（如图4,5,6），说明鸡源CD40L的真核表达载体构建成功。图4线性载体图5扩增片段图6双酶切鉴定M1：15000Marker；1.载体19-2；2.PCR产物；3.双酶切产物。Fig.4linearizationFig.5productofPCRFig.6digestedplasmidM1:DL15000Marker;1.linearizationvector;2.CD40L;3.digestedplasmid2.2.2CD40L蛋白的表达与纯化本研究利用间接免疫荧光和WesternBlot进行CD40L蛋白表达以及纯化的验证，间接免疫荧光结果显示CD40L蛋白能够成功表达，并且从荧光强度判断蛋白表达量较高。WesternBlot结果显示条带大小正确的CD40L表达成功，并获得了较好的纯化（如图7,8）。23 图7间接免疫荧光验证CD40L蛋白的表达Fig.7ExpressionoffusionproteinassayedofIFA图8CD40L的表达与纯化Fig.8ExpressionandpurificationofCD40L2.2.3CD40L蛋白浓度的测定本实验将纯化后的CD40L用PBS稀释10倍然后成功利用BCA蛋白定量的方法对其浓度进行了测定，建立的标准曲线如图9。图9CD40L的标准曲线Fig.9StandardcurveofCD40L2.2.4CD40L对法氏囊B淋巴细胞增殖数量的作用利用细胞计数的方法进行未加入与加入CD40L（0.5μg/ml）的法氏囊B淋巴24 细胞在细胞数量差异方面的研究，由于实验组和对照组的初始细胞数、培养液体积和培养条件均完全一致，故可以用细胞浓度代替总的细胞数。从结果来看在培养基内添加CD40L之后比没有添加CD40L的法氏囊B淋巴细胞在细胞总数上略高一些，但没有明显的差异。实验结果如图10。图10A总细胞浓度图10B活细胞浓度Fig.10ATotalcellconcentrationFig.10BLivingcellconcentration2.2.5CD40L对法氏囊B淋巴细胞增强细胞活性的作用本研究用CCK-8试剂盒进行加入与未加入CD40L的法氏囊B细胞的细胞活性检测，结果显示添加CD40L的法氏囊B细胞的活性相对比较高。详见图11。图11不同时间点B淋巴细胞的活性Fig.11TheBcellactivityatdifferenttimepoints2.2.6CD40L对法氏囊B淋巴细胞减缓细胞凋亡的作用本实验通过流式细胞术对加入与未加入CD40L的法氏囊B淋巴细胞在细胞凋亡方面进行检测，结果显示加入CD40L后细胞凋亡率有小幅降低。详见图12。图12B细胞的细胞凋亡Fig.12apoptosisofBcell25 第3章eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒复制的影响翻译延伸因子（eukaryotictranslationelongationfactor1-alpha,eEF1α）是广泛存在于所有生物许多类型细胞的一类含量丰富且高度保守的蛋白质家族。它属于G蛋白家族，在肽链延伸过程中作为翻译延伸复合物的一部分，促使GTP依赖的氨酰tRNA转移至核糖体。本研究首先利用IBDV多聚蛋白进行免疫沉淀试验，并将疑似条带进行质谱分析，发现其中一个宿主蛋白eEF1α与IBDV多聚蛋白存在相互作用。本研究利用免疫共沉淀技术发现eEF1α与传染性法氏囊病强毒的VP3(Gx-VP3)存在相互作用，但与传染性法氏囊病弱毒的VP3(Gt-VP3)不存在相互作用，即eEF1α与Gx-VP3和Gt-VP3的相互作用存在差异，并且对其关键氨基酸位点进行了进一步的研究。激光共聚焦实验进一步证实eEF1α与Gx-VP3能够部分共定位。最后为了探究eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒复制的影响我们通过下调和上调表达eEF1α分别检测传染性法氏囊病强弱毒病毒滴度的变化以及病毒蛋白的表达情况，结果显示下调表达eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒的复制均起到抑制作用，上调表达eEF1α则促进病毒的复制。3.1材料与方法3.1.1eEF1α影响传染性法氏囊病强弱毒复制的主要材料DT40，DF1，293T以及BHK细胞均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队保存。CEF细胞由9日龄SPF鸡胚分离获得，培养于37℃，5%CO2的培养箱，并提供含5%胎牛血清的DMEM培养液。8-9日龄SPF鸡胚。DMEM细胞培养液,1640培养液，胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素-链霉素，CEF上清，0.05%胰蛋白酶消化液均购自Gibco公司。鸡源eEF1α的siRNAs由上海吉玛基因公司设计并合成；siRNA转染试剂RNAiMAX购自Invitrogen公司。电转试剂盒购自BDBiosciences公司。4%多聚甲醛购自Solarbio公司；0.1%TritonX-100购自Roche公司；鼠源Alexa488二抗和兔源Alexa633二抗均购自Invitrogen公司；DAPI购买于碧云天公司；LeicaSP2confocalsystem购自德国。检测双荧光素酶的试剂盒采用Promega公司。质粒pCAGGS-FLAG-eEF1α由本实验室前期克隆；Y-T7-HLJ4A5UTR130，Y-T7-GtA5UTR130均由本实验克隆保存。Y-T7-Dual由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所大动物病研究团队于力研究员馈赠。生物安全柜（Forma-scientific）、CO2培养箱（Forma-scientific）、BeckmanCoulter离心机（Beckman）、W-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）、1026 μl、100μl-200μl移液器（eppendorf）、6孔、96孔细胞培养板。3.1.2引物的设计与合成本实验成功独立构建了Gx-VP3向Gt-VP3突变的表达载体Gx-VP3-28，Gx-VP3-226，Gx-VP3-235，Gx-VP3-250以及Gt-VP3向Gx-VP3突变的表达载体Gt-VP3-783，以及双荧光素涉需要的载体Y-T7-HLJ4A5UTR130，Y-T7-GtA5UTR130。构建时需要的引物的核苷酸序列如表2。表2引物核苷酸序列Table2Primerssequences，，PrimerSequences（5-3）Gx-T-28-FCCACTGTTCCAATCTGCGCTCAGTGGx-T-28-RCACTGAGCGCAGATTGGAACAGTGGGt-X-783-FCCACTATTCCATTCTGCACTCAGTGGt-X-783-RCACTGAGTGCAGAATGGAATAGTGGPcHAvvVP3-226L-FCCAGGCGGGCTCTACCAAAGCCCAAGPcHAvvVP3-226L-RCTTGGGCTTTGGTAGAGCCCGCCTGGPcHAvvVP3-235A-FCAAAACCCAATGCTCCAACACAGAGPcHAvvVP3-235A-RCTCTGTGTTGGAGCATTGGGTTTTGPcHAvvVP3-250T-FGCTGGATCAGGACCGTCTCTGATGPcHAvvVP3-250T-RCATCAGAGACGGTCCTGATCCAGCDual-GxGt1FGAAGATCTGGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGDual-GxGt130RCATGCCATGGCGCTGCGATCGTTTGTCTGATCTCTAC3.1.3eEF1α与传染性法氏囊病毒蛋白的相互作用的验证以及作用域的确定CO-IP（免疫共沉淀）：1.转染后36-48h可收获细胞（6孔板），用PBS（PH7.4）洗三次。每孔加200ul裂解液（碧云天P0013），在冰上静置20min。2.细胞刮收集到EP管里，弃沉淀取上清（上清即含有所用的蛋白）。取40ul作为input对照。（对于293T等易悬浮的细胞，加入1ml预冷的PBS悬起细胞，转入1mlEP管，1500rpm离心3min，吸走上清。同法洗涤2次，最后一次加入200ul裂解液，冰上放置20min）。3.在裂解物上清中加入20ulProteinA/GPLUS-Agarosebeads，4度孵育（缓慢晃动）1-2h进行除杂。（beads通常按1/10量加，具体可以优化）。4.4500rpm4℃离心3min,弃沉淀取上清。5.将Preclearlysate中加入primaryantibody（IBDVVP2单抗2ul）），4度孵育（缓慢晃动）2h或过夜。（抗体的量需要优化，商品化的抗体可以考虑1-2ug）。6.然后加入ProteinA/GPLUS-Agarose27 beads20ul4度孵育（缓慢晃动）4-6h。7.4500rpm4℃离心3min,弃上清。8.用200ul-1mlPBS或裂解液（含1mMPMSF和1mg/mlproteaseinhibitorcocktail）如上，洗beads3-5次，4500rpm4℃离心3min。9.最后一次洗涤后加入40ulPBS+10ul5Xloadingbuffer重悬。10.煮沸10min，做SDS-PAGE（80V30min，120V1h40min）。11.Western-blot：①转膜（15V45-50min）。（PE膜据说效果优于NC膜）②5%脱脂乳（BD）封闭（37℃1h或4℃过夜）。③PBST每次洗涤5min，一共洗三次。④加一抗：（VP2单抗，1:3000）或/和（抗Flag单抗，1:1000），37℃至少1h。⑤PBST洗涤。RT，3X5min。⑥加二抗（HRP-抗鼠二抗，1:4000），37℃至少1h。⑦显色（化学发光或红外）。注意事项：细胞裂解及整个实验过程一定要在低温环境下操作（冰上或4°裂解），以避免蛋白降解，细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂，洗涤beads时要充分，避免非特异反应。共聚焦实验步骤：1.将PBS预热。2.吸走培养液，用PBS洗2—3次。注意，为了避免细胞悬浮，加PBS时一定要温柔缓慢。3.吸取PBS加1ml的4%多聚甲醛，常温放置30min。4.加PBS1ml，洗3次，每次5min。5.弃掉后加0.1%Triton-X1001ml，室温下透膜，静置15min。6.加PBS1ml，洗3次，在摇床上晃每次5min。7.加5%PBS脱脂乳，封闭1h。8.加入一抗1h，可在摇床上轻晃。9.加PBS1ml，洗3次，在摇床上晃每次5min。10.加入二抗1h。避光可在摇床上轻晃。11.加PBS1ml，洗3次，在摇床上晃每次5min。12.DAPI染色15min避光，室温静置。13.加PBS1ml，洗3次，在摇床上晃每次5min。14.激光共聚焦显微镜观察。强弱毒VP3关键氨基酸的点突变:以Gx-VP3和Gt-VP3为模板，用PrimeSTARTMHSDNAPolymerase通过PCR的方法进行点突变。PCR程序是：95℃5min；95℃30s,60℃1min,68℃6min，18个循环；72℃10min。然后对PCR产物进行沉淀，具体操作是：1.向PCR管中加入1/10体积的醋酸钠（NaAc3M）。2.再加2倍体积的无水乙醇。（针对原始PCR反应体系）。3.离心混匀。4.于-20℃下进行沉淀（2h以上）。5.倒干液体。6.再瞬离，吸干。7.加70-75%乙醇洗涤（沿管壁轻吹打），多洗几次。8.12000rpm，5min。9.吸去液体，晾干。接着用DpnⅠ降解母链，具体步骤：1.直接向以上出现过的PCR管中加入。DpnⅠ（0.5μL）、bufrer4（2μL）、ddH2O（17.5μL）。2.于37℃下酶切1h。3.取10ml反应液进行转化（热激），剩10μL，storeat-20℃。取10μL酶切产物转化感受态细胞DH5α，提取质粒并送Invitrogen公司测序。3.1.4荧光定量RNA的提取：准备阶段需要加10μL的（β-ME）到1mlBufferRLT中，现用现配；加4倍体积的无水乙醇到BufferRPE中；70%乙醇现用现配。步骤如下：1、加600μLBufferRLT，移液枪吹打混匀。2、加600μL70%的乙醇，用移液枪28 混匀。3、分两次放入制备管中（放入2ml的EP管中），8000g离心15秒,倒掉滤液。4、加700μLBufferRW1到制备管中，8000g离心30秒，弃滤液。5、加500μLBufferRPE到制备管中，8000g离心30秒，弃滤液。5、加500μLBufferRPE到制备管中，8000g离心2分钟，弃滤液。6、将制备管放入新的2mlEP管，12000g空离1min。7、将制备管放入新的1.5mlEP管中，加35μL的无RNA酶的水到膜上，12000g离心1min。cDNA的合成：将提取的RNA利用SuperscriptⅢ进行反转录。将提取的RNA利用SuperscriptⅢ逆转录酶进行反转录。dNTP(10mM)1μL，Randomprimer1μL，RNA2μg，RNase-freeWaterUpto20μL,65℃5min(1cycle)Placeoniceforoneminute;SuperscriptⅢreversetranscriptase1μL，RNaseinhibitor1μL，5×FirstBuffer4μL，0.1MDTT1C，50℃foronehour(1cycle)70℃for15minutes(1cycle)4℃hold.荧光定量PCR反应：以cDNA为模板，体系是RNA-directTMRealtimePCRMasterMix10μL，50mMMn(OAc)21μL，PrimerandTaqManprobe1μL，TemplateRNA2μL，Nuclease-freewater6μL，Totalvolume20μL.步骤：Pre-denaturation95℃1min，Denaturation95℃15sec.Extension60℃1min(datacollection)45cycles.3.1.5eEF1α对传染性法氏囊病弱毒复制影响干扰RNA的筛选：为了接下来研究降低eEF1α表达对IBDV病毒复制方面的影响，由上海吉玛公司设计了3条siRNA。为了鉴定siRNA对eEF1α干扰的效果，我们用RNAiMAX分别将2μgsiRNA和negativesiRNAcontrol转染到DF1细胞中去，转染后12h可以更换一次培养液，继续养24h后进行第二次干扰，48h后裂解细胞用WesternBlot进行内源性eEF1α的检测，筛选出干扰效果最明显的siRNA用于以后的实验研究。制作CEF过程：1.取9-10日龄SPF鸡胚10个，先将鸡胚消毒，一般用75%酒精擦拭两遍，放在超净台中。在直径为10厘米的平板中倒入约一半的PBS。2.将气室朝上，用无菌小镊子（在火上烧一下）敲碎鸡蛋壳，夹掉蛋壳，换用新无菌小镊子揭开尿囊绒毛膜。然后用弯头镊子夹住鸡胚的颈部或者大腿部分往出拽。3.将鸡胚去头、翅、小腿、内脏，放入小烧杯中，用剪子剪碎，直到呈1平方毫米左右的小块，越碎越好。4.用PBS洗三遍，静置一会儿，加入胰酶（每只胚4ml左右），将剪碎的组织块移入另一个三角杯中，用牛皮纸封口，在37度水浴锅中消化12-15分钟左右。5.弃混合液，加入25ml生长液，用移液管尽量反复吹打。6.用6-8层的灭菌纱布过滤，悬液稀释10倍，一般一个胚做成40ml细胞。7.37度培养24h,长满单层，即可接毒。半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：1、将病毒29 液从10的-1次方到10的-10次方进行稀释。2、将稀释好的病毒接到96孔板（底部铺有CEF）中，每个稀释度接种一排共8孔，每孔100μL。3、每孔加100μL细胞悬液，保证细胞为2-3×105个/ml。4、100μL生长液+100μL细胞悬液为正常组作为空白对照。5、每天都要观察并记录，一般观察7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。3.1.6eEF1α对传染性法氏囊病强毒复制影响电转：1.如果使用新的kit，确保将kit提供的supplement完全加入到solution中。将solution放于室温预热。2.先将细胞培养液加到6孔板中（2.5ml/孔）于37℃中作用。3.通过计数，将适量的细胞100g离心10min。4.弃干净细胞上清，用100μLsolution/样重悬细胞，轻柔重悬，细胞悬液不能放置超过20min。5.将适量转染DNA加到100μL细胞液里。6.将细胞悬液吸至电转小杯中，不要出现气泡，盖上杯盖。7.选择适合的程序进行电击。需根据不同的kit和不同的细胞来筛选。8.加至500μL的细胞培养液，转移至培养箱中预处理的细胞液中，避免吸吹细胞。ELD50：收取48,72hGx接毒细胞的上清用无菌PBS分别10倍倍比稀释，选取10-1~10-8稀释度，接种9日龄SPF鸡胚。每组有6个重复，接种后，在37℃温箱内孵育，连续观察7-9天。接种后24h内死亡的鸡胚不计入计算，按照Reed-Muench法计算ELD50。接种方法为：1、将气室放在上面立在蛋托上，画出气室交接位置尽量避开血管，用铅笔做标记然后消毒。2、用打孔器在划线上方打碎蛋壳，用无菌小镊子剥离蛋壳，大约直径1cm的圆孔。3、用无菌注射器枕头避开尿囊膜。4、移液枪吸取0.1ml病毒液注入小孔中。5、用石蜡将小孔封闭。3.1.7双荧光素酶报告系统的构建准备试剂：1.LuciferaseAssayReagentⅡ(LARⅡ)：用10mlLuciferaseAssayBufferⅡ重悬1管冻干的LuciferaseAssaySubstrate并混匀。标注上日期放-70度冰箱保存。2.现用现配Stop&GloReagent：用Stop&GloBuffer50倍稀释Stop&Glosubstrate.放冰上备用。3.用灭菌的去离子水5陪稀释PassiveLysisBuffer。用预冷的PBS洗两遍细胞，然后用150ul1XPLB裂解,室温裂解10min,每3分钟晃一次。4度8000g离心3min。实验步骤：将100ulLARⅡ加到检测96孔板中。设好机器读数程序，2秒的测定延迟，10秒的读数。拿到机器附近操作,加30ulPLB细胞裂解液到含有100ulLARⅡ的96孔板中,混2-3下直接读数。每孔加之前配好的Stop&GloReagent使用液100ul，用排枪吸吹10下混匀,直接读数。30 3.2实验结果3.2.1干扰RNA的筛选本研究成功的用DF-1细胞进行了内源eEF1α的干扰RNA的筛选（如图13）。其结果显示：在三条针对鸡源eEF1α的小干扰RNA中，2#siRNA比较明显地抑制了内源eEF1α的表达量。图13筛选干扰RNAFig.13RNAiscreen3.2.2传染性法氏囊强弱毒感染B细胞上调表达eEF1α本研究首先利用IBDV多聚蛋白进行免疫沉淀试验，并将疑似条带进行质谱分析，发现其中一个宿主蛋白eEF1α与IBDV多聚蛋白存在相互作用。为了进一步研究IBDV感染对eEF1α表达情况的影响，我们分别从基因转录水平和蛋白表达水平进行验证。我们用等量的IBDV强弱毒株感染体外培养的原代法氏囊B细胞，在感染12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集细胞，一部分提取RNA用于转录水平的检测，另一部分进行WesternBlot试验以检测蛋白表达。结果显示24h、48h、60h这三个时间点传染性法氏囊强弱毒感染B细胞在转录水平上促进eEF1αmRNA上调表达，并且强毒的促进程度高于弱毒。在蛋白水平上IBDV强弱毒感染前后eEF1α的表达并没有发生明显的变化（如图14）。图14AIBDV感染B细胞上调表达eEF1αmRNAFig.14AIBDVinfectionupregulatesthemRNAexpressionofeEF1αinBcells31 图14BIBDV感染B细胞的eEF1α表达情况Fig.14BTheexpressionofeEF1αinBcellsinfectedbyIBDV3.2.3下调表达eEF1α抑制传染性法氏囊病强、弱毒蛋白的表达本研究对DF-1细胞中的eEF1α进行下调表达，在转染siRNA24h之后用IBDV的弱毒Gt对DF-1进行感染，分别在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72h进行收样并进行WesternBlot的检测，结果表明在24h、36h、48h这三个时间点下调eEF1α后有效减少了IBDV弱毒的VP3蛋白量，仅一次的试验结果，后续还需要重复（如图15）。图15下调表达eEF1α抑制Gt蛋白的表达Fig.15KnockdownofeEF1αinhibitstheexpressionofGtVP3本研究对DT40细胞的eEF1α进行下调表达，电转siRNA24h之后用IBDV的强毒Gx对DT40进行感染，分别在感染后的24h、48h、72h进行收样并进行WesternBlot，结果表明在48h、72h这两个时间点下调eEF1α后均能明显地减少IBDV强毒的蛋白量，本试验重复三次，均得到相似的结果，说明下调表达eEF1α抑制传染性法氏囊病强毒蛋白的表达（如图16）。32 图16.下调表达eEF1α抑制Gx蛋白的表达Fig.16KnockdownofeEF1αinhibitstheexpressionofGxviralproteins3.2.4过表达eEF1α促进传染性法氏囊病强毒蛋白的表达在DT40细胞中过表达外源eEF1α，电转pcaggs-flag-eEF1α质粒1μg24h之后用IBDV的Gx对DT40进行感染，分别在感染后的48h、72h进行收样并进行WesternBlot，结果表明在48h、72h这两个时间点上调eEF1α后均能小量增加IBDV强毒的VP3蛋白量，仅一次的试验结果，后续还需要重复（如图17）。图17过表达eEF1α促进Gx蛋白的表达Fig.17OverexpressionofeEF1αenhancestheexpressionofGxVP33.2.5下调表达eEF1α降低传染性法氏囊病强、弱毒的病毒滴度本研究对DF-1细胞中的eEF1α进行下调表达，在转染siRNA24h之后用IBDV的弱毒Gt对DF-1进行感染，在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72h收取细胞上清然后用CEF进行TCID50的滴定，结果表明在48h这个时间点下调eEF1α后有效减少了IBDV弱毒的滴度（如图18）。仅一次的试验结果，后续还需要重复。33 图18下调表达eEF1α抑制弱毒的滴度Fig.18KnockdownofeEF1αinhibitsviraltitersofGt对DT40细胞中的eEF1α进行下调表达，电转siRNA24h之后用IBDV的强毒Gx对DT40进行感染，分别在感染后的48h、72h收取上清然后进行ELD50的滴定，结果表明在48h、72h这两个时间点下调eEF1α后均能有效地降低IBDV强毒的滴度（如图19）。图19下调表达eEF1α抑制Gx的滴度Fig.19KnockdownofeEF1αinhibitsviraltitersofGx3.2.6eEF1α与传染性法氏囊病强毒的VP3存在相互作用本研究利用免疫共沉淀试验，将带Flag标签的宿主蛋白eEF1α与带HA标签的病毒蛋白Gx-VP3从正反两个方向进行共沉淀，结果表明eEF1α能够免疫共沉淀Gx-VP3，Gx-VP3也能够共沉淀eEF1α，即eEF1α与Gx-VP3存在相互作用（详见图20）。34 图20AeEF1α共沉淀Gx-VP3Fig.20AeEF1αco-immunoprecipitatesGx-VP3图20BGx-VP3共沉淀eEF1αFig.20BGx-VP3co-immunoprecipitateseEF1α3.2.7eEF1α与传染性法氏囊病弱毒的VP3不存在相互作用利用免疫共沉淀试验，将带Flag标签的eEF1α分别与带HA标签的Gx-VP3（阳性对照）和带HA标签的Gt-VP3共沉淀，结果表明eEF1α能够免疫共沉淀Gx-VP3，但不能够共沉淀Gt-VP3，即eEF1α与Gt-VP3不存在相互作用（详见图21）。图21eEF1α不与Gt-VP3相互作用Fig.21eEF1αcannotinteractwithGt-VP335 3.2.8eEF1α与传染性法氏囊病强毒VP3作用的关键氨基酸位点根据之前的结果即eEF1α与Gx-VP3有相互作用而与Gt-VP3没有相互作用，而且基于序列分析发现：强弱毒VP3之间有4个氨基酸的差异（28、226、235、250位）。为了进一步确定eEF1α与Gx-VP3作用的关键位点，于是成功构建了Gx-VP3向Gt-VP3突变的表达载体Gx-VP3-28，Gx-VP3-226，Gx-VP3-235，Gx-VP3-250；以及Gt-VP3向Gx-VP3突变（为了避免混淆，以VP3在多聚蛋白中的核苷酸位点为标记）的表达载体Gt-VP3-783，Gt-VP3-981，Gt-VP3-990，Gt-VP3-1005。从结果可以看出eEF1α与Gx-VP3作用的关键位点不只一个，因为Gt-VP3向Gx-VP3单一位点的突变均没能被eEF1α拉下来，而Gx-VP3的28、235、250突变成弱毒后被拉下来的条带明显减弱，证明这些位点均与eEF1α的相互作用有关（如图22）。图22免疫共沉淀鉴定强弱毒VP3与eEF1α作用的关键氨基酸位点Fig.22IdentificationofthedeterminantaminoacidsinIBDVVP3interactswitheEF1αa.Gx-VP3或突变体与eEF1α的相互作用；b.Gt-VP3或突变体与eEF1α的相互作用a.TheinteractionbetweeneEF1αandGx-VP3orGx-VP3withindicatedpointmutation;b.TheinteractionbetweeneEF1αandGt-VP3orGt-VP3withindicatedpointmutation3.2.9eEF1α与传染性法氏囊病强毒的VP3能够共定位本研究利用激光共聚焦的方法对eEF1α与Gx-VP3之间的内源性共定位进行36 观察，将未感染的DT40细胞作为对照，感染强毒Gx48h后的DT40细胞为试验组，结果显示DT40内的eEF1α能与Gx-VP3部分的共定位（如图23）。图23eEF1α与Gx-VP3存在共定位Fig.23eEF1αandGx-VP3displayacolocalization3.2.10eEF1α对IBDV5’-UTR的作用本研究成功构建Y-T7-HLJ4A5UTR130，Y-T7-GtA5UTR130两种表达质粒。，分别以HLJ0504，Gt为模板，对A节段的5-UTR进行PCR扩增回收并用BglⅡ和NcoI进行双酶切。同时将Y-T7-Dual进行双酶切回收作为载体，成功构建质粒。之后我们分别在BHK和293T细胞中进行双荧光素酶试验，遗憾的是结果显示IBDV强弱毒的5'-UTR单独没有IRES的功能（如图24）。需要从另外的角度研究eEF1α对IBDV5’-UTR的作用。图24IBDV强弱毒IRES功能的验证Fig.24FunctionalverificationofIBDV5’-UTRIRES37 第4章讨论CD40L又叫做CD40配体或者CD154，是一种主要表达在激活T细胞上的一种蛋白，也是肿瘤坏死因子超家族中的一员。它跟抗原呈递细胞的CD40有相互捆绑作用，会根据靶细胞的种类不同产生很多效应。肿瘤坏死因子家族在哺乳动物B细胞的分化和中和方面起着重要作用，但很多没有在其他物种上被证实。CD40可以像哺乳动物CD40一样表达在鸡的B细胞，单核细胞和巨噬细胞上。这些结果展示了CD40和它的配体在哺乳动物和禽类有重要的保守性的功能。CD40L可以使未分化的鸡B细胞维持和分化，有文献报道，CD40L成功的在体外能够促进鸡脾脏B淋巴细胞的增殖与分化，但对于鸡的法氏囊中的B淋巴细胞只能起到缓解其凋亡，延长在体外存活时间的作用，并不能使其在体外进行增殖。本研究用293T表达的鸡源CD40L功能域能小幅延长鸡法氏囊B淋巴细胞在体外的培养时间，但还不能够达到使其增殖的目的。我们分析可能是CD40L的纯度不够，或者是其在纯化过程中未能使该蛋白保持较好的空间构象，故而影响其功能的发挥，需要细致的试验进一步探究其原因。翻译延伸因子eEF1α，是广泛存在于所有生物许多类型细胞的一类含量丰富且高度保守的蛋白质家族。它属于G蛋白家族，在肽链延伸过程中作为翻译延伸复合物的一部分，促使GTP依赖的氨酰tRNA转移至核糖体。为了进一步探究eEF1α在传染性法氏囊病强弱毒感染中的差异，以及在IBDV病毒复制中的作用。我们首先利用免疫共沉淀技术发现eEF1α与传染性法氏囊病强毒的VP3(Gx-VP3)存在相互作用，但与传染性法氏囊病弱毒的VP3(Gt-VP3)不存在相互作用，即eEF1α与Gx-VP3和Gt-VP3的相互作用存在差异，并且对其关键氨基酸位点进行了进一步的研究，发现多个氨基酸位点参与病毒VP3与eEF1α的相互作用。激光共聚焦实验进一步证实eEF1α与Gx-VP3能够部分共定位。最后为了探究eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒复制的影响，我们通过下调和上调表达eEF1α分别检测传染性法氏囊病强弱毒病毒滴度的变化以及病毒蛋白的表达情况，结果显示下调表达eEF1α对传染性法氏囊病强弱毒的复制均起到抑制作用，上调表达eEF1α则促进病毒的复制。然而，对于强弱毒复制影响的程度需要在同一类细胞中进行，这需要后续进一步的研究。本研究发现传染性法氏囊病强弱毒在与宿主蛋白eEF1α的相互作用方面存在差异，并且证明eEF1α能够影响传染性法氏囊病强弱毒的复制。那么eEF1α能够影响病毒复制的机制又是什么？需要进一步的深入研究，由于eEF1α是翻译延伸因子故推测eEF1α可能是在翻译延伸的过程中发挥作用，但本研究证明IBDV强弱毒的5'-UTR单独没有IRES的功能，需要从另外的角度研究eEF1α对IBDV病毒蛋白翻译的作用机制。38 第5章结论1.用293T表达的鸡源CD40L功能域能小幅延长鸡法氏囊B淋巴细胞在体外的培养时间。2.IBDV强弱毒体外感染法氏囊B淋巴细胞后上调eEF1α的转录。3.下调表达eEF1α抑制IBDV强弱毒的复制。4.发现强弱毒VP3与宿主蛋白eEF1α的相互作用存在差异，其中eEF1α与强毒的VP3存在相互作用，与弱毒VP3不存在相互作用。多个氨基酸位点参与eEF1α与VP3的相互作用。39 致谢首先要向我的导师王笑梅研究员、杨玉莹教授和王永强老师致谢！王笑梅老师感谢您对我硕士期间锲而不舍的培养与殷切教诲，在您付出了无数心血和汗水后，才能使我的论文从选题、构思到定稿能如此顺利，老师渊博的学识、务实的治学、敏锐的洞察力，以及每次论文及其耐心的指导都能使我对专业有更深入的认识。感谢您深夜里的每一封邮件，您的批评让我成长您的鼓励让我充满力量。王永强老师感谢您在整个试验中倾注了大量心血、在学习和科研上给予我耐心细致的指导，生活上给予我帮助和关心,并对我论文撰写上给予帮助,使我能够克服各种困难顺利完成论文，而老师对科研的执着、对工作的一丝不苟、对生活的乐观态度对我影响深远！感谢高玉龙老师、刘长军老师、祁小乐老师、张艳萍老师、崔红玉老师、李凯老师、高立老师和潘青老师在试验过程中给予的指导与帮助。感谢幺帅师兄、刘永振师兄、王淼师兄、高祥师兄、刘琳琳师兄、韩春燕师姐、刘爱晶师姐、张瑶师姐和钟丽师姐在实验以及生活上予我的极大关心与帮助。同时也要感谢同窗的所有的同学，他们给予的支持，鼓励，使我最终坚持到完成。感谢我身边的所有人，感谢你们给我带来的欢乐与美好回忆。感谢我的父母和家人，是你们的支持让我走到现在。40 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个人简介杨搏，女，1992年4月28日，黑龙江省哈尔滨市人。顺利通过大学英语四级考试，并且获得执业兽医师证。在校期间被评为优秀研究生，学习成绩优异，平均成绩在85分以上。主要学习经历：2010年9月至2015年7月就读于东北农业大学动物医学专业。2015年9月至今就读于长江大学动物科学专业，2016年7月-2018年4月在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所进行实验学习。在校期间的获奖情况：2015年11月获长江大学二等学业奖学金；2016年11月获长江大学二等学业奖学金；2017年10月获长江大学“优秀研究生”荣誉称号；2017年11月获长江大学二等学业奖学金。在校期间发表的主要学术论文（论文题目、刊物名称、时间）：2018年3月以第一作者身份在《预防兽医学报》上发表了题目为“传染性法氏囊病病毒基因组A节段3’-UTR影响病毒的复制”的论文一篇。47 附件３：研究生学位论文原创性声明和版权使用授权书原创性声明我以诚信声明：本人呈交的硕士学位论文是在王笑梅研究员和杨玉莹教授指“导下开展研究工作所取得的研究成果。文中关于ｅＥＦｌａ能够影响传染性法氏囊”“”病强弱毒复制的结论和关于ｅＥＦｌａ能够影响传染性法氏囊病强弱毒复制的结果系本人独立研究得出，不包含他人研究成果、方法、观。所引用他人之思路点、认识均已在参考文献中明确标注，所引用他人之数据、图件、资料均已征得所有者同意，并且也有明确标注，对论文的完成提供过帮助的有关人员也已在文中说明并致以谢意。学位论文作者（签字）：签字日期：年月曰ｊ卜版权使用授权书本人呈交的硕士学位论文是本人在长江大学攻读硕士学位期间在导师指导下。完成的硕士学位论文，本论文的研究成果归长江大学所有本人完全了解长江大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长江大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文，学校也可以公布论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后遵守本授权书）学位论文作者（签字）：签字日期：月ｙ