水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行稱学研究所取得的成果，。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到。《中国学位论文全文数据库》并向社会公众提供信息服务保密论文在解密后应遵守此规定。悼论文作者签名：解导师签名；々、〇＇（？（日期ｙｄ＾； 符号说明英文缩写英文全称中文缩写bpbasepair碱基对DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应ADAleutianMinkDisease水貂阿留申病ADVAleutianMinkDiseaseVirus水貂阿留申病毒APSAmmoniumpersulphate过硫酸铵AAAminoacids氨基酸ADEAntibodydependentenhancement抗体依赖性增强作用dNTPdeoxyribonucleictriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸Taqthermusaquaticu水生热栖酶CRFKCrandellfelinekidney猫肾细胞E.coliEscherichiacoli大肠杆菌ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验IPTGIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白B19HumanparvovirusB19人类微小病毒CIEPCounterimmuneelectrophoresis对流免疫电泳CICCirculatingimmunocomplex循环免疫复合物LAMPloop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增DMEMdulbecco'smodifiedeaglemedium细胞培养基ORFOpenreadingframe开放读码框PBSTPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS-PAGSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶mlMilliliter毫升μlMicroliter微升 rpmratationperminute每分钟转数LBLauriabrothLB肉汤TAETris/Acetate/EDTATAE缓冲液TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸VP2Capsidprotein2衣壳蛋白TEMEDN,N,N,N-tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺ODabsorbance吸光度AmpAmpicillin氨苄青霉素PBSPhosphateBuffer磷酸缓冲液nmnanometre纳米hhour小时mgmilligram毫克EGlutamicacid谷氨酸DAsparticacid天冬氨酸LLeucine亮氨酸VValine缬氨酸KLysine赖氨酸TThreonine苏氨酸SSerine丝氨酸AAlanine丙氨酸YTyrosine酪氨酸FPhenylalanine苯丙氨酸RArginine精氨酸GGlutanine谷氨酰胺IIsoleucine异亮氨酸MMethionine甲硫氨酸NAsparagine天冬酰胺 目录中文摘要...........................................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................................................Ⅲ前言...................................................................................................................................................11综述...............................................................................................................................................21.1ADV的生物学特性..................................................................................................................21.1.1ADV的分类地位...................................................................................................................21.1.2ADV的形态特征...................................................................................................................21.1.3ADV的理化特性...................................................................................................................31.1.4ADV的培养特性...................................................................................................................31.2ADV的分子生物学研究.........................................................................................................41.2.1ADV的基因组特点...............................................................................................................31.2.2ADV基因的复制和转录......................................................................................................41.2.3ADV编码的蛋白...................................................................................................................51.3水貂阿留申病的研究..............................................................................................................71.3.1AD的流行病学......................................................................................................................71.3.2AD的发病机理......................................................................................................................81.3.3AD的临床症状......................................................................................................................81.3.4AD的病理变化......................................................................................................................81.4AD的诊断.................................................................................................................................91.4.1病原学诊断............................................................................................................................91.4.2血清学诊断............................................................................................................................91.4.3分子生物学诊断.................................................................................................................101.5AD的综合防治.......................................................................................................................111.6本研究的目的及意义............................................................................................................122材料与方法................................................................................................................................131材料.............................................................................................................................................132.1.1病料......................................................................................................................................13 2.1.2主要试剂..............................................................................................................................132.1.3主要仪器..............................................................................................................................132.1.4质粒与菌种..........................................................................................................................132.1.5试剂的配制..........................................................................................................................142.2方法.........................................................................................................................................152.2.1水貂阿留申病毒的分离鉴定............................................................................................152.2.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究......................................................182.2.3间接ELISA检测方法的建立...........................................................................................233结果.............................................................................................................................................303.1水貂阿留申病毒的分离鉴定结果........................................................................................303.1.1PCR初步检测结果.............................................................................................................303.1.2ADV的分离结果.................................................................................................................313.1.3ADV分离的PCR鉴定结果..............................................................................................313.1.4序列的核苷酸同源性比较................................................................................................323.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究结果..................................................323.2.1PCR扩增结果......................................................................................................................323.2.2酶切鉴定结果.....................................................................................................................333.2.3同源性分析与系统发育分析结果....................................................................................343.3间接ELISA检测方法的建立结果.......................................................................................353.3.1重组载体pMD18-T-VP2的PCR鉴定结果...................................................................353.3.2重组载体pMD18-T-VP2的酶切鉴定结果.....................................................................383.3.3重组表达载体pET-32a-VP2的PCR鉴定结果.............................................................393.3.4重组表达载体pET-32a-VP2的酶切鉴定结果...............................................................393.3.5重组质粒pET-32a-VP2的序列测定结果.......................................................................403.3.6表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果...................................................................................373.3.7表达蛋白的Westernblot检测结果.................................................................................373.3.8纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果...................................................................................383.3.9抗原包被浓度和一抗稀释度的确定................................................................................38 3.3.10抗原包被条件的确定.......................................................................................................393.3.11封闭液的确定...................................................................................................................393.3.12封闭液作用时间的确定..................................................................................................403.3.13二抗最佳稀释度的确定..................................................................................................403.3.14底物最佳作用时间的确定..............................................................................................403.3.15临界值的确定...................................................................................................................413.3.16特异性检测结果...............................................................................................................413.3.17敏感性检测结果...............................................................................................................413.3.18重复性检测结果...............................................................................................................413.3.19临床样本检测结果...........................................................................................................414讨论.............................................................................................................................................414.1水貂阿留申病毒的分离鉴定................................................................................................424.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究.........................................................434.3间接ELISA检测方法的建立..............................................................................................485结论.............................................................................................................................................46参考文献........................................................................................................................................48攻读学位期间发表论文情况......................................................................................................59致谢.................................................................................................................................................57 山东农业大学硕士学位论文中文摘要近年来，受市场需求的刺激，水貂养殖业迅猛发展。山东也成为了我国水貂的养殖大省。但是，随着水貂养殖规模的不断扩大，一些疫病也成为了制约水貂养殖业发展的重要因素。水貂阿留申病（AleutianMinkDisease,AD）,作为毛皮动物三大疫病之一（阿留申病、病毒性肠炎、犬瘟热）(李艳伍等.,2009)，会造成水貂的毛皮质量的下降，对养殖业造成巨大经济损失。但是，目前，还没有专门的药物或者疫苗来防治此病，只能通过检疫淘汰病貂达到对貂群的净化。因此，研究水貂阿留申病毒（Aleutianminkdiseasevirus,ADV）在山东地区的分子生物学特点，建立一种特异性的检测方法具有重要意义。在2014-2015年间，本实验室对检测到的患水貂阿留申病的水貂脏器进行研磨，将研磨液接种到猫肾细胞（CRFK）中分离培养。当细胞出现稳定的病变后，提取细胞DNA进行PCR检测，结果呈现阿留申阳性。将扩增的序列进行测序，与参考序列ADV-G比对后，核苷酸同源性达到92.6%。但是，随着病毒传代次数的增加，细胞病变逐渐消失，PCR检测呈现阴性。说明该病毒不能在猫肾细胞中稳定传代。同时，我们对从山东省诸城某水貂养殖场采集的134份水貂实质器官进行检测，发现有37株呈现水貂阿留申病阳性，阳性率达到27.6%。对37株水貂阿留申病毒进行VP2基因的扩增并进行序列测定。用生物软件分析后发现，37株测序株间VP2基因核苷酸相似性为88%-99.8%，与GenBank中参考序列的相似性为88.0%-100%。并且，我们观察到：山东地区水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突变位点。将测序株与参考株经进化树分析后，分成5个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。VP2基因进化树显示89%的国内毒株处在进化树的第Ⅰ和第Ⅴ分支，而这两个分支不包含国外毒株。其中，有78.4%的毒株处在第Ⅰ分支。余下的11%的国内毒株则与其他国外毒株有较近的亲缘关系。这说明我国水貂阿留申病毒已经有别于国外毒株，形成了自己的独立进化支。由于大多数分离到的毒株处于第Ⅰ分支，我们暂且认为可能山东地区的毒株在向第Ⅰ分支进化的趋势。这对找出本地区流行的水貂阿留申病毒的标准毒株，以便进行对该病的检测提供科学依据。为了进一步研究分离到的37株病毒VP2基因的分子特征，用DNASTAR软件分别推导出各基因片段的氨基酸序列，并与参考毒株进行比较分析。结果发现：测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%，与参考序列间的相似性87.7%-100%。纵观VP2I 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用的整个氨基酸序列中，突变较多,有超过100多个氨基酸的突变。突变较集中的区域有三个，其中包括免疫反应区VP2:429-524。有14个突变位点只存在于中国毒株。其中，位点204：V-I、305:K-T、308:T-S、419：L-I、436：I-M的突变，突变毒株超过10个。419：L-I、436：N-D两个突变存在于VP2:428-446区域，而该区域可能影响水貂阿留申病毒的宿主范围的选择(McKennaetal.,1999)。对于其它几个频率较高的突变，我们目前还没有确切的研究来表明它突变的意义。其次，本实验室针对VP2序列的高免疫反应区（430-525）进行原核表达，并建立了间接ELISA检测方法。将扩增出的序列与pET-32a原核表达载体连接，在大肠杆菌BL21中进行表达。当诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L，在37℃诱导4h的表达量最高。表达蛋白经Westernblot检测后具有良好的反应原性。将纯化蛋白包被酶标板，通过优化条件，建立了间接ELISA检测方法。用建立好的方法对84份送检的血清样本进行检测，检出率为26.2%。关键词：水貂；阿留申病毒；分离鉴定；VP2基因；分子流行病学调查；间接ELISA检测II 山东农业大学硕士学位论文AbstractAlongwiththemarketdemand,theminkbreedingindustryhasdevelopedrapidlyinrecentyears.ShandongbecametheimportantprovinceoftheminkbreedinginChina.However,asthecontinuousexpansionoftheminkbreedingscale,someepidemicdiseasesbecomethekeyfactorrestrictingminkbreedingdevelopment.AleutianMinkDisease(AD),asoneofthethreeepidemicdiseases(AleutianMinkDisease、virusenteritis、caninedistemper)offur-animals,willcausethedeteriorationoffurquality,whichwillbringaboutthegreateconomiclossoftheminkbreeding.However,therearenotspecificdrugsorvaccinestotreatthisdisease.Theonlywaywecoulduseistoeliminatetheseinfectedanimals.Therefore,itisimportanttoresearchthemoleculargeneticfeaturesofADVinShandongprovinceandestablishaspecificdiagnosticmethod.In2014-2015,wegrindminkvisceralmusclethatinfectedADVandtheninoculatethelappingliquidtoCRFK.WhenthereisstablecytopathyinCRFK，wecollectedgenomeDNAforPCRtest.TheresultisADVpositivetest.ComparingreferencesequenceADV-GanddeterminationofDNAsequencesusingDNASTARsoftware,thenucleotidehomologyis92.6%.But,withincreasingserialpassagesofADVintheCRFK,thecytopathyeffectgraduallydisappeared.WecollectedgenomeDNAforPCRtest.TheresultisADVpositivetest.ItisindicatedthattheADVcan’tsteadilypassageinCRFK.Meanwhile,wecollected134minkparenchymalorgansamplesfromZhuCheng.itisdiscoveredthat37minksampleswerepositive.Thepositiverateis27.6%.AmplifinganddeterminingthesequenceofVP2,wefoundthatthe37nucleotidesequencesshowed88%-99.8%identitywitheachotherand88.0%-100%identitywithreferencesequences.Therearelargeamountsofmutationalsitesinthe37VP2genes.The37sequencesandreferencesequencesisdividedinto5branches(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）,analyzedwithphylogenetictree.89%domesticstrainsispointedinthegroupofⅠandⅤ,inwhichisnotincludedtheforeignstrains.78.4%domesticstrainsispointedinthegroupofⅠ.Theclosegeneticrelationshipexistsintherestofthe11%domesticstrainsandforeignstrains.ItshowedthattheAleutianminkvirusindomesticisformedtheindividualbranch,whichisIII 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用differentfromtheforeignstrains.OwingtothemostoftheisolateslieinthegroupⅠ,itistentativelyconsideredthattheisolatestrainshavetheevolutionarytrendtogroupⅠ.ThisresearchwillhelpustofindthestandardstrainsaboutShandongprovince,whichwillprovideascientificbasisfordetectingthisvirus.InordertoinvestigatemorepreciselythecharacteristicsofthemolecularbiologyinVP2geneof37isolatestrains,weusingDNASTARsoftwareanalyzedandalignedthededucedaminoacidsequencesofeachproteinandanalyzedrelativelywithreferencestrains.Itisdiscoveredthattherehad89.2%-99.7%similaritywithisolatestrainsand87.7%-100%similaritywithreferencesequencesataminoacidlevel.Morethan100aminoacidmutationsliedintheVP2gene.Mostofthemutationsexistedinthethreeareas,includingVP2immuneresponsesequences:429-524.The14mutationsitesexistedmerelyintheChinesestrains,including204：V-I、305:K-T、308:T-S、419：L-I、436：I-M,whichconsistedinmorethan10domesticstrains.Twomutationsites(419：L-I、436：N-D)lieinVP2:428-446.ThisregionwaslikelytoaffectthescopeofhostselectionaboutAleutianminkvirus.Thereisnoexactresearchtoshowthemeaningofitsmutationsfortheothermutationsites.Inthenextplace,weinducedprokaryoticexpressionfortheimmuneresponsesequenceofVP2region(430-525)andestablishedtheindirectELISAdetectionmethod.Connectingtheamplificationsequencewithprokaryoticexpressionvectorandconstructingrecombinantplasmids,weimporttherecombinantplasmidsintoEscherichiacoliBL21.Theexpressionproteinreachedamaximumdeducedat37℃with4hand1mmol/LIPTGandhadahighreactogenicityafterdetectedwithWesternBlot.Coatingwithpurifiedproteinintoplatesandoptimizingthecondition,weestablishedtheindirectELISAdetectionmethod.Detectingof84serumsamples,itisdiscoveredthatthepositiverateofADVis26.2%,whichisconsistentwiththeresultofPCRdetectionmethod.Keyword:Mink;AleutianMinkDiseaseVirus;IsolationandIdentification;geneVP2;MolecularEpidemiologyInvestigation;IndirectedELISAIV 山东农业大学硕士学位论文前言水貂是一种珍贵的毛皮动物，貂心、貂油、内脏、貂粪都具有很高的实用价值和经济价值。其中，主要产品是貂皮。水貂皮与狐狸皮、波斯羔羊皮是世界裘皮市场的三大支柱商品。水貂皮的品质和价值使水貂素有“裘皮之王”的美称。水貂的养殖分布于我国山东、河北、东北地区。较好的发展前景，使我省的水貂养殖业迅速发展，随之而来的是水貂疫病的大量出现，造成了养殖户重大经济损失。其中，水貂阿留申病（Aleutianminkdisease，AD）是危害养貂业的三大疾病之一（阿留申病、犬瘟热、病毒性肠炎）(李艳伍等.,2009)，它是由水貂阿留申病毒(Aleutianminkdiseasevirus,ADV)引起的水貂慢性病毒病，主要侵害水貂的免疫系统，造成该系统的紊乱(Bloometal.,1980;Hadlowetal.,1983)。水貂阿留申病毒属于细小病毒科、阿留申病毒属(忠信,2006)，主要感染水貂，具有基因型“a”的水貂发病率高于其他水貂，也可以感染臭鼬、雪貂、浣熊等(Alexandersenetal.,1985;IngramandCho,1974;Kenyonetal.,1978;Lietal.,2011;Murakamietal.,2001)。最早发现到此病的是由美国学者G.Hartsough，在上世纪四十年代，“阿留申貂”中观察到。此后，上世纪五十年代，Hartsough和Gorham确定了引起该病的病原是水貂阿留申病毒。该病可造成成年貂常年带毒，引起水貂慢性、持续性的感染，以浆细胞增多，持续性的病毒血症为特征。侵害新生水貂的Ⅱ型肺泡细胞，引起严重的感染及急性死亡。这种持续性的感染，与循环性的免疫复合物、高水平的抗病毒抗体有关。尽管在体外，抗体能在猫肾细胞中中和ADV，但是在体内抗体却不能中和病毒，只能与病毒形成免疫复合物，并通过Fc受体介导的抗体依赖性增强作用造成目标细胞的持续性的感染。持续性的慢性感染会影响水貂的繁殖力和毛皮的质量，给貂场造成很大的经济损失(Knuuttilaetal.,2009b;Themudoetal.,2011)。但是目前对阿留申病的治疗没有特异性的药物，只能通过检测淘汰病貂来净化貂群，达到预防的目的。由于管理不完善等原因造成的水貂阿留申病连年居高不下。基于此，我们从山东诸城的水貂养殖场采集水貂实质器官，对该地区水貂阿留申病毒进行分子生物学研究，掌握水貂阿留申病的流行情况，针对VP2基因的高免疫反应区进行原核表达，建立一种适合本地区的间接ELISA检测方法。希望为今后我省水貂阿留申病的研究提供科学依据。1 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用1综述1.1ADV的生物学特性1.1.1ADV的分类地位根据国际病毒分类委员会第八次会议公布的结果显示：将阿留申病毒归类为细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、阿留申病毒属(Amdovirus)的成员(李艳伍等.,2009)。细小病毒科分两个亚科，细小病毒亚科、浓核病毒亚科，细小病毒亚科又分为依赖病毒属、红病毒属、牛与犬病毒属、细小病毒属、阿留申病毒属，其中牛与犬病毒属与阿留申病毒属是本次报告中对细小病毒亚科新增的两种病毒属。由于阿留申病毒与其他细小病毒无论在遗传基因还是在抗原性方面都有很大差别(Huefferetal,2003;Steineletal.,2001)，因此将阿留申病毒单独归类于阿留申病毒属中，目前此病毒属中只有唯一的阿留申病毒。有学者从灰狐体内发现到一株阿留申病毒，将该病毒进行基因组分析和系统进化树分析，发现该病毒与水貂阿留申病毒有很大的差异性，这代表阿留申病毒属中可能出现第二种病毒(Lietal.,2011)。但是，目前对该病毒还没有明确的归类。1.1.2ADV的形态特征6水貂阿留申病毒无囊膜，无脂质和糖蛋白构成的包膜。分子量约3-5×10道尔顿，6中心是单链DNA构成的核酸，DNA分子量约为1.5×10道尔顿，外面包被着一层由蛋白构成的衣壳，衣壳外径为128A，由60个不对称的衣壳粒组成，壳粒呈中空管，外径4.5nm，内径1-2nm，每个衣壳粒中五重轴面上有一个沟槽，呈峡谷样结构，三重轴面上呈土堆样突起结构，二重轴对称面上有一个凹陷，按照衣壳粒的排列方式，该病毒呈现球形二十面体对称的结构，病毒的直径为22-25nm(Bloometal.,2001;McKennaetal.,1999)。用三维结构研究阿留申病毒粒子可见，该病毒衣壳蛋白有些特点类似于猫泛白细胞减少症病毒、人类B19细小病毒、小鼠微小病毒、犬细小病毒，但是与它们不同的是，阿留申病毒在邻近三重对称轴区域形成小丘，并且该病毒有插入环。1.1.3ADV的理化特性3水貂阿留申病毒沉淀系数大约是110s,在氯化铯中的浮密度为1.42-1.44g/cm，抵抗力极强，无论是物理还是化学因素都有抵抗力。耐热、耐酸、耐乙醚。病毒在56℃30min能保持不变的感染力，60℃可将部分灭活，80℃能耐受1h，90℃能耐受10min，2 山东农业大学硕士学位论文100℃作用3min不能全部灭活，所以耐热能力强。将病毒置于低温处长期保存，其感染力没有很大变化。对乙醚、氯仿、DNA酶、RNA酶抵抗力强(郑全等.,2002)，PH值的变化对其的活力不产生影响。连续28天的3%福尔马林处理才能将该病毒灭活，对蛋白酶敏感(徐凤宇等,2006)，能被0.5mol/ml的盐酸、2%的NaOH、0.5%的碘、紫外线灭活(Bloometal.,1988;李长生等,2000)。1.1.4ADV的培养特性对ADV最初的分离是Kenyon用亲和层析的方法进行研究的(Kenyonetal.,1973)，将分离的病毒进行动物实验可见鼠的L细胞和水貂肾脏细胞产生病变(Yoonetal.,1975;Yoonetal.,1973)。此后，Porter等选取39株细胞进行ADV的分离，证实了ADV可在5株水貂细胞株、人细胞株W1-38和一株非洲绿猴肾细胞中能进行增值。但是，感染ADV超过4d很难检测到病毒的存在(Porteretal.,1977)。上世纪70年代，Hahn用免疫荧光的方法在猫肾细胞（CRFK）的细胞核内检测到病毒抗原(Hahnetal.,1977)。上世纪80年代，Bloom等用猫肾细胞在31.8℃的条件下用ADV-Utah强毒株首次分离到没有毒力的毒株ADV-G(Bloometal.,1980)。分离到的ADV-G只能感染猫肾细胞，并且能在该细胞中任意复制(Aastedetal.,1984;vanDawenetal.,1983)。不同的毒株有不同的宿主选择和不同的致病力(Bloometal.,1993;Haasetal.,1990;Oieetal.,1996)。国外已报道的部分ADV毒株包括：ADV-G（美国）、ADV-Utah（美国）、ADV-K（丹麦）、ADV-Pullman（美国）、AMDV-Utah-K（美国）、AMDV-United（丹麦）、ADV-SL3（美国）、ADV-TR（远东）、ADV-Fareast（德国）、ADV-Ontario（加拿大）。水貂阿留申病毒的致病力与在体外培养的能力成反比，如ADV-G没有致病力，但是却能在体外CRFK中进行培养；ADV-Utah有较强的致病性，但是却没有能在体外培养的能力。但是目前只发现了一株，既能在体外培养，又有较强的致病力ADV-SL3(Schuiereretal.,1997)，除此之外，其他强毒株都不能在体外进行分离培养，这造成了对水貂阿留申病毒研究的困难。目前，用于分离和培养病毒的细胞主要是猫肾细胞、貂的肾和睾丸原代细胞和鼠的细胞株。1.2ADV的分子生物学研究1.2.1ADV的基因组特点水貂阿留申病毒属于阿留申病毒属，目前已确定的该属的成员只有阿留申病毒。ADV属于单链、线状DNA病毒，目前已经完成ADV全基因组测序的只有ADV-G毒株(Bloom3 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用etal.,1990)。所以，对ADV基因组特点的描述，主要是针对ADV-G。ADV-G的基因组全长4801bp，主要有两个开放阅读框：LORF（左开放阅读框），RORF（右开放阅读框）。中间还有3个小的阅读框mid-ORFs(中间阅读框)。此外，还包括polyA位点、两个启动子序列P3和P36。由这两个启动子各自启动转录，最终翻译成不同的蛋白质(Alexandersenetal.,1988)。整个基因组的两端5’和3’端有发卡结构，是由100-300bp的末端回文序列组成。ADV-G编码两种蛋白，结构蛋白VP1、VP2，非结构蛋白NS1、NS2，还有可能包含NS3。1.2.2ADV基因的复制和转录ADV不具有能独立进行代谢的酶系统，它的复制和转录是在宿主细胞中，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料，ADV的复制和转录发生在宿主细胞DNA聚合酶活性比较旺盛的有丝分裂S期（90）。对ADV的复制和转录有两种说法，一种是Alexandersen等(Alexandersenetal.,1988;Bloometal.,1997;Christensenetal.,1993;Clemensetal.,1992)的研究，认为ADV包含两个启动子P3、P36，P3启动子负责启动非结构蛋白NS1、NS2的转录，P36启动子负责启动结构蛋白VP1、VP2的转录。该转录方式与MVM等的啮齿类动物的细小病毒相似；另一种说法是QiuJinming等的研究，对上述观点提出质疑，并且认为ADV的转录机制与人类B19病毒的转录机制很相似。他认为P3启动子能启动非结构蛋白和结构蛋白的转录，而对P36启动子的启动功能提出质疑。1.2.3ADV编码的蛋白1.2.2.1非结构蛋白非结构蛋白包括NS1、NS2，还可能包含NS3。这些非结构蛋白的主要作用在于对ADV的感染和复制的调控作用。NS1是最大的非结构蛋白，编码起始于206-208nt处的起始密码子ATG处，翻译到1961nt处停止，后又从2042nt翻译到2208nt，两者拼接，完成NS1蛋白的翻译。分子量为71Ku(Alexandersenetal.,1986)。该蛋白的重要作用在于对病毒的转录、复制、调节病毒与细胞启动子、装配衣壳蛋白(Christensenetal.,1995a;Christensenetal.,1995b)。如在ADV复制中，NS1蛋白有ATP酶、解旋酶的作用，此外还能在特异性位点切断DNA。NS1基因相比于VP2基因有较好的保守性，在此基因上进行引物的合成来进行PCR的检测有很好的特异性(张瑞等.,2009)。有研究发现，4 山东农业大学硕士学位论文NS1蛋白在抗肿瘤方面有重要作用(罗祖玉等.,1999)。CastelruizY等将NS1基因与杆状病毒连接，将重组质粒转化到真核系统中进行表达，发现了该表达蛋白有抑制细胞、细胞毒的作用(Castelruizetal.,2005)。并且发现NS1蛋白对病毒的感染有部分保护作用(Christensenetal.,1993)。基于此，国内学者对NS1也进行了大量研究，马凡舒等(马凡舒等.,2016)利用生物学软件对NS1基因分析后发现有6段可能存在抗原表位，将这6条表位肽包被抗原，进行间接ELISA反应，结果发现302-320段氨基酸的抗体识别特异性高，并且该肽段进行的间接ELISA反应与CIEP的检测符合率高。刘红娜等(刘红娜等.,2014)将NS1基因截成三段进行PCR扩增，将扩增片段分别连接到pGEX-4T-1中进行原核表达，表达蛋白经Westernblot检测后发现所表达的三种蛋白都具有反应原性，此项研究对水貂阿留申病毒的亚单位疫苗研制奠定基础。NS2非结构蛋白翻译起始于206nt，到384nt处停止，后又从2042nt处翻译，直到2204nt处终止，两者拼接，完整NS2蛋白的翻译。与NS1有相同的起始位点，但是有不相同的终止位点。分子量13.4KDa。NS1蛋白细胞毒性的发挥有赖于NS2蛋白对其的协助作用，但是NS2本身是不具有细胞毒性的。该蛋白对个别宿主细胞在病毒的复制中也起到一定作用，但是如果缺少此蛋白，会影响阿留申病毒衣壳蛋白的合成。目前，对NS2基因在病毒复制中的作用的研究还在进行中(张瑞等.,2009)。NS3的分子量可能10KDa(Alexandersenetal.,1988)，对NS3的研究还处于探索阶段，对它的研究很多方面还不是很清楚(Knuuttilaetal.,2009a;张瑞等.,2009)。1.2.2.2结构蛋白水貂阿留申病毒的衣壳蛋白由60个衣壳粒组成。结构蛋白包括VP1、VP2，两者共同构成水貂阿留申病毒的衣壳蛋白，VP1分子量约为85KDa,VP2分子量约为75KDa，但是两者存在的比例却大有不同，VP1：VP2大约是1:9的比例(McKennaetal.,1999)，所以VP2占据了病毒衣壳蛋白的大部分，因此推断出VP2是水貂阿留申病毒的主要免疫原性抗原蛋白，也使人们对阿留申病毒结构蛋白的研究多集中在VP2上(Oieetal.,1996;Qiuetal.,2007)。VP1结构蛋白的翻译起始于2204-2206的ATG处，仅连续翻译3个氨基酸后，于2289nt处开始翻译直到4346nt处终止，负责编码689个氨基酸。虽然VP1蛋白在构成衣壳蛋白的比例较低，但是它对病毒的感染与复制起着重要作用。研究发现，VP1有协助病毒进入细胞并感染的作用，因为VP1能与宿主细胞的特异性受体结合，使之5 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用进入细胞(Tullisetal.,1993)。同时，其3’端富含的碱性碱基也对病毒的复制起到重要作用。VP2结构蛋白的翻译起始于2406-2408nt处的起始密码子ATG，终止于4346nt，中间含有1941bp，编码647个氨基酸，比VP1在N端多出42个氨基酸。与VP1蛋白的终止密码子的位点相同，只是起始位点不同。VP2是主要的抗原蛋白，也是研究最多的结构蛋白。Bloom(Bloometal.,1997)等将ADV-G的结构蛋白分为9个分折叠型片段，分别对这9个片段进行原核表达，并进行各段抗原性的研究。结果发现，430-525肽段与292-430肽段是高免疫反应区。后来，Costello等(Alexandersenetal.,1986)进行研究证实了Bloom等的结论，并且证明429-524间的肽段产生的抗体能中和水貂阿留申病毒对猫肾细胞的感染。顺势作用元件中邻近的聚腺苷酸化位点[（pA）p]在ADV感染性克隆中的特点，揭露了(pA）p位点的聚腺苷酸化受200nt的上游基因（USE）、AAUAAA信号、40nt的下游基因（DSE）控制。AAUAAA信号和DSE的突变会导致(pA）p位点的聚腺苷酸化的下降，这会增加衣壳蛋白VP1、VP2的表达，也会使子代病毒的复制增加2-3倍，而不影响编码氨基酸。这表明内部腺苷酸环化是病毒复制的限速步骤(Huangetal.,2012)。1.3水貂阿留申病的研究1.3.1AD的流行病学二十世纪四十年代，在美国的俄罗岗州的水貂养殖场人们发现了一种基因突变型水貂，该水貂毛皮呈暗蓝色，将该突变型水貂称之为阿留申型貂(Alexandersen,1986),其基因为阿留申基因a。到了二十世纪五十年代，由于具有阿留申基因型的水貂之间的繁殖，形成了大量基因型为aa的纯合子，具有aa基因型的水貂表现出一种逐渐消瘦的疾病，并伴有粘膜出血。后来，Hartsough与Gorhen将该病命名为水貂阿留申病。该病在所有养水貂的国家和地区都能出现，是危害养貂业的三大疫病之一（水貂阿留申病、水貂病毒性肠炎、犬瘟热）。各种年龄、性别、品种的水貂均可感染该病，但以阿留申基因型貂更易感。本病常年都可以发生，但以秋冬季节多发，呈现明显的季节性。病毒主要存在于血清、血液、脾脏、骨髓、唾液、尿、粪便，并由唾液、粪便、尿液排出体外。病貂和潜伏期的貂是主要的传染源(Alexandersen,1986)，可通过伊蚊进行传播。本病的传播方式主要通过水平和垂直的方式进行传播。水平传播主要通过消化道6 山东农业大学硕士学位论文和呼吸道进行传播，如病貂与健康水貂接触，在笼养条件下，主要是通过传递物或传递者间传播，如病貂污染过的饲料、饮水、食具等，公貂的精液带毒，可通过交配，引起母貂的感染。垂直传播主要通过患病的母貂经胎盘将病毒传给子貂。此外，患病的母貂也可通过乳汁，将病毒传给子貂(BrollandAlexandersen,1996)。水貂阿留申病可传播的动物包括：水貂、雪貂、短尾鼬鼠、狐狸、斑纹臭鼬、北美水獭、浣熊、山猫、石貂、麝猫、松貂、貉子、艾鼬等(Farid,2013;秦绪伟等.,2013;张丽华,2011)，对于人类与水貂阿留申病之间的传染性很少有记载，但是最近的研究在两名水貂养殖人员的体内发现了ADV和ADV的特异性抗体，并且具有与水貂阿留申病相同的症状微血管疾病(Jepsenetal.,2009)。这一发现，增加了我们对水貂阿留申病在人类传播的怀疑。1.3.2AD的发病机理水貂阿留申病能引起水貂的持续性的感染，这与循环性的免疫复合物、高γ球蛋白有关。感染ADV能在体内形成较高浓度的抗体，抗体能使ADV感染淋巴结的巨噬细胞，通过Fc受体介导的抗体依赖性增强作用（ADE）会引起目标细胞持续性的感染。ADV在巨噬细胞中进行复制、转录、蛋白的表达。水貂体内产生的较高浓度的抗体不能中和体内的抗原，而是与抗原结合形成免疫复合物。该免疫复合物随着血液循环沉积在组织器官中，沉积在血管周围会造成动脉血管炎，沉积在肾小球周围会造成肾小球肾炎。对AD的发病机理，大多是基于国外对该病的研究。对抗体依赖性增强的产生，国外有学者研究了主要衣壳蛋白VP2不同区域的肽段产生的不同抗体，发现在产生的抗体中VP2:428-446段产生的抗体能与抗原形成免疫复合物，并且能产生抗体依赖性增强效应，这一抗体能在体外中和病毒感染(Bloometal.,2001)。由于MEV(水貂肠炎病毒)与ADV（水貂阿留申病毒）都属于细小病毒，但是MEV已经研制出了较好的免疫保护性疫苗，所以还有一种研究是将ADV与MEV的比较研究(Parketal.,2005)：由于MEV(水貂肠炎病毒)与ADV同属于细小病毒，而且两种病毒都能在CRFK中复制，于是就研究了两种病毒在CRFK中复制时的细胞受体，研究发现MEV的细胞受体是TfR（transferrinreceptor，转铁蛋白受体），而ADV的细胞受体却没能被识别。因此，该研究认为不同的细胞受体可能导致了对水貂的不同发病机制。国外又有研究发现，水貂阿留申病毒的发病机理与B19很相似(BestandBloom,2005)。该研究指出，B19是感染人类的唯一的自主性细小病毒，尽管B19病毒的基因组在其他组织中有所发现，7 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用但病毒复制的主要场所在儿童和成年人的骨髓、血液中的红细胞前体细胞中。B19的感染经常会造成一种免疫自限性疾病。感染B19和ADV的最显著的相似之处就在于，可能是对于发病机理，体液免疫应答在感染中发挥的作用。它既对机体有保护作用，又有致病作用。由于在这两种病毒感染中抗体扮演了重要作用，因此，了解在保护机体方面，抗体产生的具体作用；抗体介入使感染的增强作用；持续性的感染和免疫介导的疾病发生，将帮我们理解该病的发病机理和感染。两种病毒的另一相似之处在于两者都可造成持续性的感染，这种持续性的感染与病毒受到限制性的复制有关。尽管宿主细胞的因素可能导致限制性的病毒复制。但是，主要的非结构蛋白NS1与细胞的相互作用可能是造成这一现象的重要因素。而这两种病毒NS1蛋白的表达和翻译后修饰可能是导致病毒受限性的复制的原因。因此，研究NS1蛋白表达的规律和它与细胞信号传导通路的相互作用，可能会增强我们对这两种病毒的受限制性的复制和持续性感染的认知。对胱门蛋白酶的研究显示，衣壳蛋白的表达激活胱门蛋白酶，而激活的胱门蛋白酶反过来在有机体内促进衣壳蛋白的裂解，而ADV的突变体能抵抗胱门蛋白酶对衣壳蛋白的裂解作用。所以，该学者认为胱门蛋白酶的激活在ADV感染中扮演多个角色(Chengetal.,2010)。1.3.3AD的临床症状幼年貂（2-6周龄）感染水貂阿留申病毒，主要侵害肺部，引起间质性肺炎。潜伏期短，多表现一种急性症状，如咳嗽、呼吸困难、发热，存活率低，2-3天死亡。成年貂感染水貂阿留申病毒，潜伏期长，自然感染潜伏期在60-90d，饲喂在笼舍中的潜伏期稍长，最长可达7-8个月(万雪等.,2007)。主要是一种持续性感染，表现为厌食、逐渐消瘦、排黑色的粪便、被毛粗乱失去光泽、虚弱、嗜睡、渴欲增加、出血和贫血、尿毒症、损害神经系统会表现神经症状。存活率高，病貂长期带毒，最终大多以尿毒症而死亡。母貂感染会造成流产、不孕，产出的子貂成活率低；公貂感染会造成性欲下降，精子活力低，甚至死精，使母貂不易受孕。1.3.4AD的病理变化新生貂感染水貂阿留申病毒表现一种急性症状，会引起肺部的严重感染，该病毒在幼貂肺泡Ⅱ型细胞中大量复制，破坏肺泡表面活性物质，造成细胞病变，幼貂急性死亡(Alexandersenetal.,1994)。而该病毒感染成年水貂会引起一种慢性的感染，这就是我们通常所说的水貂阿留申病。在成年水貂感染ADV后，病毒的复制主要发生在淋巴结的巨噬细胞中，在这里进行病毒的DNA复制，mRNA的转录和蛋白的表达。8 山东农业大学硕士学位论文它会造成成年貂的一种慢性地、持续性的感染(Bestetal,2005)。剖检以肾脏的病变最明显：感染的初期可见肾脏体积增大，表面有出血点，后期肾脏变成灰白色、体积缩小。脾脏肿大，成暗红色，后期萎缩。肝脏肿大，呈红色，后期成暗黄色，有散在的灰白色病灶。1.4AD的诊断1.4.1病原学诊断该诊断方法是通过借助电镜，直接观察病原的方法。将采集的病貂实质器官（肾、脾、肺脏等）用研钵研磨后，离心收集上清，经0.22um的滤器过滤后接种到猫肾细胞（CRFK）中，在33℃温箱中约培养至7-9d，即可看到单层细胞变成网状。此时将病毒负染后即可在电镜中观察。观察到约22-25nm大小，典型的球形正二十面体的阿留申病毒。1994年，常国权等，用DTEM（直接电镜）、IEM-G（胶体金免疫电镜）建立了对ADV的快速检测方法，结果发现胶体金免疫电镜的检测效果优于直接电镜，能对病毒在细胞中定位。但是考虑到该方法的一些现实因素，不能在临床上广泛使用，只能用于实验室的诊断(常国权，杨盛华,1994)。1.4.2血清学诊断1.4.2.1碘凝集试验（IAT）1962年由Henson等将该方法首次用于检测AD(籍玉林,1998)。该方法是最简单，也是最早用于的检测ADV的非特异性诊断方法。此方法的原理是：由于患有AD的水貂血清中的γ球蛋白含量增高，当其与碘反应时，会产生褐色的大块絮状凝集物。IAT操作简单，方便观察，便于在检测大群中使用。到现在为止，此方法仍被我国的许多貂场及科研院所的实验室所使用。但是此法也有它的弊端，就是IAT只能在水貂感染该病的三周后检测到。因为只有此时感染ADV的水貂血清中的γ球蛋白含量才较高。同时，也不是只有患水貂阿留申病的水貂体内γ球蛋白含量高，结核病、其他肝肾疾病也会出现IAT的阳性反应(洪龙,1986)。因此，该法的检测会有许多假阴性、假阳性的出现，也由此导致了IAT不能从根本上达到扑灭该病的效果。只能是作为检测该病的一种辅助检测方法。1.4.2.2对流免疫电泳（CIEP）CIEP对水貂阿留申病的检测是由Cho等，于1972年在加拿大首次将该方法用于诊断AD。在国内，用CIEP检测水貂阿留申病是始于20世纪80年代。到现在为止，9 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用CIEP是国内目前比较常用的一种检测方法，能对水貂感染ADV后7-9天就能检测出。IAT与CIEP的对比试验证明了CIEP的检出率比IAT高24.8%(关中湘等.,1985)。基本原理是：在琼脂板上打两排孔，将抗原加入阴极侧，抗体加入阳极侧。在电场的作用下，抗原、抗体相向而行，最终两者接触并结合，形成一条灰白色沉淀线。由于该方法制备的抗原多是细胞抗原或脏器抗原，这都有可能增加在环境中散毒的危险。因此，在国外学者用重组表达载体对ADV蛋白进行表达来获得抗原，并取得了成功。如Clemens等用重组牛痘病毒进行了表达(Clemensetal.,1992)，Christensen等用腺病毒进行了表达(Christensenetal.,1993)。近年来，国内学者也开展了对重组表达蛋白的研究，如2015年张蕾等，将VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达，有望成为生产AD诊断抗原的替代方法(张蕾等.,2015)。1.4.2.3酶联免疫吸附试验（ELISA）首先使用ELISA方法检测水貂阿留申病的，是由Wright等在1982年开始尝试的。国内对ELISA方法对该病的检测，最初的报道是1993年，由吴威等建立的检测ADV抗体的PPA-ELISA检测方法，该方法高于CIEP敏感性的16倍(吴威等,1993)。2015年，由李晶等建立了一种水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot-ELISA的检测方法，该方法与CIEP比较得出，Dot-ELISA敏感性要高于CIEP，并且适用于基层单位对于水貂阿留申病的快速检测。1.4.2.4免疫复合物检测法（CIC）该方法是基于患有ADV的水貂体内形成自体不能清除的免疫复合物而建立起来的，CIC就是检测水貂体内的免疫复合物。1997年，赵元楷等建立的用PEG沉淀法对种貂进行CIC的检测，将该方法应用到实践中(赵元楷等.,1997)。1.4.3分子生物学诊断1.4.3.1聚合酶链式反应(PCR)PCR是一种对特定DNA片段进行扩增的分子生物学技术，该方法特异性好、灵敏度高，能将微量的DNA进行放大。从1985年由Mullis发明了简易的PCR至今，该技术已经发展到第三代。将配好的体系在专门的PCR仪中，经过变性、退火、延伸三个阶段完成对目的基因的扩增，而后在琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，将电泳后的琼脂糖凝胶放到凝胶成像系统中观察有无目的条带，达到检测的目的。二十世纪九十年代初，就有报道显示该方法在国外被用作检测ADV的方法(Gottschalcketal.,1991)。在国外，已经有学者证实了PCR的检测的灵敏性高于CIEP（Jensenetal,2011）。同时，10 山东农业大学硕士学位论文也有学者提出将该方法同CIEP同时进行对水貂阿留申病的检测将更为有效（Cepicaetal.,2012）。有很多国内学者在检测ADV普通PCR的基础上建立了一些新型的检测方法。张瑞(张瑞,2010)建立了对水貂阿留申病毒的实时定量PCR的检测方法，该方法是基于普通PCR的新型核酸定量技术，要比普通PCR的灵敏性高100倍，同时不与其他病毒发生交叉反应，既能定性检测病毒，也能定量检测病毒。张秀丽等(张秀丽etal.,2014)建立了ADV的荧光定量PCR检测，提高了普通PCR检测水貂阿留申病的灵敏性，为净化该病奠定基础。虽然，现阶段对PCR检测ADV的研究比较多，但是鉴于其对大群检测的一些限制性，如相比与CIEP，PCR的一些成本及操作上的限制，对该方法的使用仅限于在实验室，还没有在实践中广泛应用。CIEP仍是在国内检测ADV的普遍方法。1.4.3.2核酸杂交技术该方法分为DNA印记杂交和RNA印记杂交。基本原理是：将待检的DNA或RNA固定至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后将用生物素、同位素等物质标记的DNA或RNA探针经过碱基互补配对的原则与膜上的DNA或RNA进行杂交，洗去未结合的游离探针，然后通过放射自显影或显色反应检测。该方法的使用在国内还没见报道，但是在国外已有对这方面的研究。1.4.3.3基因检测芯片该方法是通过同时将大量的探针固定到固相载体上，根据核酸分子杂交配对时的特异性结合，对DNA样品的序列进行高效的解读和分析。目前，该方法在国内还没有达到检测ADV的流行。国内学者朱善元等(朱善元等,2006)，利用此原理，制备出了检测ADV的基因芯片。除了以上方法，补体结合试验(McGuireetal.,1971)、酶标斑点纸条法(刘润珍等.,1990)、单克隆抗体检测(华育平and王金生,1990)，徐磊(徐磊,2010)还建立了水貂阿留申胶体金免疫层析诊断方法，2015年，田国宁等(田国宁等.,2015)，建立了ADV的LAMP(环介导等温扩增)检测方法，等等。1.5AD的综合防治目前，对水貂阿留申病的防治还没有有效的药物或疫苗等特异性的治疗方法，只能通过淘汰病貂，达到对该病的控制(刘晓等.,2010)。国外学者研究发现，当ADV病毒感染水貂幼崽时，无论是否是阿留申基因型水貂，都会因感染肺泡Ⅱ型细胞而急性死亡，死亡率达到100%。而当采用抗γ球蛋白和抗ADV11 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用结构蛋白的小鼠单克隆抗体治疗后，死亡率会下降50%-75%，从而减少幼貂的急性症状(Alexandersenetal.,1989)。该研究也发现，所有经治疗后存活的幼貂，都会转成慢性阿留申病，在体内形成不易清除的免疫复合物。并且表明了，避免幼貂急性死亡是由于该抗体将病毒的复制和转录限制在了细胞水平上，这与感染成年水貂体内形成的免疫复合物很像。但是，此方法不能从根本上治愈该病。因为免疫复合物在体内不能清除，而是易在器官沉积，形成慢性进行性疾病。CheemaA等研究发现，通过免疫抑制疗法能在一定程度上能阻止感染ADV后的组织损伤(Cheemaetal.,1972)。在国外，也有学者提到了褪黑素能保护部分水貂免受阿留申病的侵害(Bonillaetal.,2004)。还有对NS1基因的疫苗研究(Castelruizetal.,2005)，一段时间后，注射了疫苗的水貂组相比于对照组体内的CD8+细胞的水平显著增高，这表明记忆性T细胞对疫苗做出了回应。在北欧日德兰半岛(Themudoetal.,2011)，人们采用空间扫描统计方法（spatialscanstatistics）探测传染病一场增多的局部区域，对可能的传染病暴发做出早起预警，对疾病的预防起到一定效果。在国内，黄永凯等，提到了水貂阿留申病的中药疗法，板蓝根配合复合维生素B的治疗(黄永凯等.,2006)。但是这些方法都不能很好的预防、消除本病。现阶段，对水貂阿留申病的防治主要还是通过一些综合性的措施，比如平时做好饲养管理，引种、配种时注意对水貂的检疫，淘汰阳性貂。丹麦，通过扑灭性的措施使阳性农场从1976年的100%下降到1996年的15%(Themudoetal.,2011)，到2001年，大约只有5%的丹麦水貂农场仍感染ADV，这些农场也都是日德兰半岛北部(Christensenetal.,2011)，以此做到逐步对该病的净化。1.6本研究的目的及意义水貂阿留申病是危害养貂业的三大疫病之一，目前，对该病尚没有很好的治疗方法，只能通过检测淘汰病貂，从而净化貂群来控制该病的传播。由于，VP2是水貂阿留申病毒主要的结构蛋白，具有良好的反应原性。目前，主要通过对VP2基因主要抗原位点的表达来建立诊断抗原。而通过分析，VP2基因的核苷酸和氨基酸突变率都很高。所以，本实验主要通过对水貂阿留申病毒的VP2基因进行分子生物学研究，弄清本地区该基因的进化规律。针对本地区的毒株的VP2基因的抗原位点进行原核蛋白的表达，建立一种灵敏度高、特异性好的间接ELISA检测方法，提高该地区对水貂阿留申病的检测率。12 山东农业大学硕士学位论文2材料与方法2.1材料2.1.1病料2014-2015年间从山东潍坊采集的137份水貂的实质器官，-20℃保存。2.1.2主要试剂pMD18-T载体、Taq酶、dNTPs、10×buffer、DMEM、胰蛋白酶购自Takara有限公司；胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清购自四季青生物工程有限公司；感受态DH5ɑ；猫肾细胞（CRFK）由本实验室保存；离心管（1.5ml、5ml）、剪刀、镊子、研钵、枪头(白、蓝、黄)、试管（10ml）、PCR管、电泳仪、水浴锅、4℃离心机、超净工作台、摇床、凝胶成像系统、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、电子天平、脱脂棉、PCR仪、微量移液器、6×loaddingbuffer、核酸染色剂、LB肉汤、Amp、0.1MCaCl2、限制性内切酶、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、琼脂、HRP-DAB底物显色试剂盒、PAGE胶蛋白微量回收试剂盒、RabbitAnti-MinkIgG/HRP、封闭液、电转液、PBST、30%丙烯酰胺、10%SDS、1.5MTris-cl、0.5MTris-cl、10%APS、RunningBuffer、染色液、脱色液、T4DNA连接酶、IPTG、4×SDS上样缓冲液、抗原为本实验室表达纯化、阳性血清一抗为本实验室保存、兔抗貂二抗购自北京博奥森生物技术有限公司、BAC蛋白定量试剂盒、脱脂牛奶、PBST、包被液、TMB底物显色液、终止液、BSA、明胶2.1.3主要仪器细胞培养瓶、吸管、枪头、离心管、PCR仪、摇床、恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酸缸、CO2培养箱、温箱、离心管（1.5ml、5ml）、剪刀、镊子、研钵、枪头(白、蓝、黄)、试管（10ml）、PCR管、电泳仪、水浴锅、4℃离心机、超净工作台、摇床、凝胶成像系统、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、电子天平、脱脂棉、PCR仪、移液枪、试管、培养皿、水平电泳仪、水浴锅、离心机、垂直电泳仪、摇床、恒温箱、微波炉、半干转膜仪、超净工作台、凝胶成像系统、超声波细胞粉碎机、滤纸、PDVF膜、96孔酶标板、CO2培养箱、酶标仪、微量移液器、吸水纸2.1.4质粒与菌种克隆载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司、表达载体pET-32a为本实验室保存、大肠杆菌DH5ɑ和大肠杆菌BL21为本实验是保存。13 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用2.1.5试剂的配制DMEM溶液：DMEM13.5g，Na2CO33.7g,加水定容至1000ml溶解，调PH值至7.2-7.4，将溶液经灭菌滤器（含0.22um滤膜）过滤除菌，置于4℃保存。细胞培养液：在超净工作台中将DMEM溶液中加入10%的胎牛血清。0.25%的胰蛋白酶：NaCl4g，KCl0.1g，Na2HPO412H2O1.68g,KH2PO40.12g，胰蛋白酶1.25g，EDTA二钠0.1g，加水定容至500ml，溶解后将溶液用0.22um的滤器过滤除菌，将溶液分装到无菌的离心管中置于-20℃保存备用。PBS：NaCl4g,KCl0.1g,Na2HPO412H2O1.68g,KH2PO40.12g,加双蒸水定容至500ml,经高压蒸汽灭菌，4℃保存。LB液体培养基：称取2.5gLB肉汤，加去离子水定容至100ml溶解，然后经过高压蒸汽灭菌，4℃保存。LB固体培养基：称取2.5g肉汤LB，3g琼脂，加去离子定容至100ml溶解，然后经过高压蒸汽灭菌，待灭菌后温度降至50℃左右时倒板，4℃保存。0.1MCaCl2:称取1.47gCaCl2·2H2O，加灭菌的去离子水定容至100ml，混匀，然后用0.22um的一次性滤器过滤溶液至灭菌的容器中，—20℃保存。LB液体培养基：称取2.5gLB肉汤，加去离子水定容至100ml溶解，然后经过高压蒸汽灭菌，4℃保存。LB固体培养基：称取2.5g肉汤LB，3g琼脂，加去离子定容至100ml溶解，然后经过高压蒸汽灭菌，待灭菌后温度降至50℃左右时倒板，4℃保存。组织抽提液：NaCl5.85g,Tris-Cl1.211g,EDTA二钠0.093g,SDS5g,加去离子水定容至1L溶解，调PH值至8。10mg/ml蛋白酶K：将0.1g蛋白酶K溶解于10ml去离子水中，于-20℃保存备用。100ug/ul的Amp：在1g氨苄中加去离子水定容至10ml，溶解，然后用0.22um的一次性滤器过滤，分装到1.5ml无菌离心管中，—20℃保存备用。30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺和1gN2N’-亚甲双稀酰胺溶于80ml超纯水中，然后定容至1000ml，用0.45um滤膜过滤后，测PH值。将溶液装于棕色瓶中，4℃保存，保证PH值低于7.0，但是禁止调节PH值。10%SDS：称取10gSDS溶于80ml超纯水中，定容至100ml。室温保存。1.5MTris-cl：称取18.171gTrisBase溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调PH值至8.8，定容至100ml，4℃保存。14 山东农业大学硕士学位论文0.5MTris-cl：称取6.057gTrisBase溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调PH值至6.8，然后定容至100ml，4℃保存。10%APS：称取2.282g过硫酸铵溶于8ml超纯水中，定容至10ml。-20℃保存RunningBuffer：称取3.03gTrisBase，18.8g甘氨酸，1gSDS溶解定容至1000ml，室温保存。染色液：称取0.5g考马斯亮蓝R-250，125ml甘油，50ml冰醋酸溶于30ml超纯水中，定容至50ml，用化学滤纸过滤出去杂质，室温保存。脱色液：量取100ml醋酸，50ml无水乙醇溶于800ml超纯水中，定容至1000ml，室温保存。电转液：称取甘氨酸14.4g，TrisBase3.03g，甲醇200ml，加双蒸水定容至1000ml。洗脱液（PBST）：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.36g，KH2PO40.24g，加双蒸水定容至1000ml，加0.5mlTween-20。封闭液：称取2.5g脱脂奶粉溶于100ml的PBST中。0.5mMIPTG：称取1.1915gIPTG加双蒸水定容至10ml溶解，-20℃保存。8M尿素：称取NaH2PO4.2H2O1.5601g，Tris-Cl0.1576g，尿素48.08g，加双蒸水定容至100ml，用NaOH调PH值至8。包被液：称取NaCO20.159g，NaHCO30.293g，加双蒸水定容至100ml，调PH值至9.6,4℃保存。2.5%脱脂牛奶：称取0.25g脱脂牛奶，加PBST10ml，溶解。5%脱脂牛奶：称取0.5g脱脂牛奶，加PBST10ml，溶解。0.5%BSA：称取0.05gBSA，加PBST10ml，溶解。1%BSA：称取0.1gBSA，加PBST10ml，溶解。1%明胶：称取0.1g明胶，加PBST10ml，加热至55℃水浴，溶解。终止液：量取22.2ml98%的浓硫酸缓慢的加入177.8ml的双蒸水中，边加边搅拌。2.2方法2.2.1水貂阿留申病毒的分离鉴定2.2.1.1引物设计根据GenBank上发布的ADV-G标准毒株的核苷酸序列，用引物设计软件PrimerPermier5.0设计了一对特异性检测引物，P1：5’-AACCAAGCAAGGTGGAAAG-3’15 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用（1459-1477）,P2：5’-ATTCTTCGTGGCAGTTGTG-3’（2067-2085），预期的扩增片断为627bp。该引物由上海生工生物工程有限公司合成。2.2.1.2病毒基因组DNA的提取采用饱和苯酚—氯仿提取DNA的方法。具体步骤如下：（1）将组织用灭菌的去离子水冲洗。（2）取0.1g组织于研钵中剪碎，放入500ul的组织抽提液，用研钵研磨制成单个细胞匀浆。（3）将处理后的样品转移到离心管中，加入5ul的10mg/ml蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度为100ug/ml。置于55℃水浴锅中温浴3-4h。（4）消化完全后，加入等体积的饱和酚，温和的上下颠倒混合，将管内的溶液混合成乳状液，1000rpm离心10min。（5）将上层水溶液转移到另一个干净的离心管中，加入1/2体积的酚和1/2体积的氯仿，均匀，1000rpm离心10min。（6）将上层水溶液转移至另一个干净的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，1000rpm离心10min。（7）将上层水溶液转移至另一个干净的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，置于—20℃保存2h，沉淀DNA。1000rpm离心10min。（8）将上清弃掉，加入1ml75%乙醇，混匀，洗涤DNA,1000rpm离心10min，弃掉上清。（9）重复上述步骤三次。（10）将沉淀置于室温晾干。（11）加25ul的TE缓冲液溶解DNA，于—20℃保存。2.2.1.3PCR检测将提取到的病毒基因组DNA进行PCR检测，反应体系如下:16 山东农业大学硕士学位论文表1PCR反应体系Table.1reactionsystemofPCR成分反应体系10×Buffer2.5μldNTP2μl上游引物1μl下游引物1μlTaq酶0.2μlddH20Upto20μl反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。2.2.1.4细胞的复苏（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入到37℃-38℃的水浴锅中，不时摇动使其融化，大约为1min。（2）在超净台中用吸管将细胞悬液无菌转移到离心管中，用预热的含有25%胎牛血清的培养液将冻存的细胞稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心，1500rpm，5-10min。（4）弃掉上清，加入含25%胎牛血清的培养液混匀，接种到培养瓶中，置于37℃温箱中进行培养。2.2.1.5病毒的分离将检测到的阳性水貂实质器官在预冷的研钵中加入PBS剪碎研磨，研磨过程中需要保持低温环境，同时要保证研磨的充分。将研磨后的组织悬液置于-20℃冻融三次，保证病毒能充分地从细胞中释放出来。然后1000rpm离心5min，取上清，将上清用0.22um的滤器过滤除菌，取过滤后的液体1ml接种到含有10ml培养液的猫肾细胞中，同时设置没有接毒的猫肾细胞空白对照组。将细胞置于37℃，含有5%二氧化碳的培养箱中。每天观察细胞，并将细胞进行盲传，直至细胞稳定出现明显的病变为止。2.2.1.6分离病毒的PCR鉴定将细胞冻融三次，取500ul冻融的细胞到1.5ml离心管中；1000rpm离心5min取上清；加入蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度在100ug/ml，置于55℃水浴锅中作用2h；加入500ul饱和酚抽提，10000rpm离心10min取上清；将上清加入500ul苯酚：氯仿（1：1）抽提，10000rpm离心10min取上清；将上清加入500ul氯仿抽提一次10000rpm17 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用离心10min取上清，共抽提三次。将上清加入二倍体积的无水乙醇置于-20℃2h后10000rpm离心10min，弃掉上清；用75%乙醇洗涤后，彻底晾干，加入30ulddH20混匀，-20℃保存备用。将提取的病毒基因组DNA进行PCR检测，按照2.2.3建立的方法操作。2.2.1.7基因序列克隆测定将2.2.6中的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中将目的基因切胶回收，将目的基因与pMD18-T载体于16℃连接30min后，转化到感受态DH5ɑ中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴3min后，加入500ulLB液体培养基，置于37℃水浴锅中水浴45min，10000rpm离心3min后弃部分上清，重悬沉淀，涂布到含有Amp的LB固体培养基中，37℃温箱过夜培养后，挑取单克隆菌落培养，经PCR检测，将呈阳性的单克隆菌落送上海生工生物公司有限公司进行测序。将测序结果用DNAStar编辑后与GenBank中已发表的AMDV国际参考毒株进行核苷酸、氨基酸序列的同源性比较。2.2.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究2.2.2.1引物设计根据GenBank中保存的标准毒株AMDV-G的核苷酸序列,利用引物设计软件PrimerPremier5.0，针对VP2基因设计1对特异性引物，扩增VP2基因的其中一对引物VP2-1参考Qie等（QieKLet.,1996）的研究报告。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下表：表2扩增VP2基因的引物Table2PrimersusedforamplificationofVP2genes扩增片段引物引物序列(5’-3’)扩增位置扩增片段长度上游cttgtcacgctactagaatggtVP2-12587-3276693bp下游agcttaaggttagtttacatggtttact上游gaacgggagataactttcatacagVP2-23211-44781268bp下游gtaggtttattttaatccgccac2.2.2.2病毒基因组DNA的提取方法按照2.2.1.2操作2.2.2.3PCR检测18 山东农业大学硕士学位论文将提取到的基因组DNA进行PCR检测，测得有37份病料呈现阿留申阳性。对这37份病料的VP2基因进行扩增。扩增条件：VP2-1：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；VP2-2：96℃预变性5min，95℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸2min30s，31个循环，72℃延伸10min，4℃保存。2.2.2.4PCR产物的鉴定称取0.25g琼脂糖溶解于25ml1xTAE中，混匀；在微波炉中加热3min左右直至完全融化，待温度降至55℃左右时加入2.5ul核酸染色剂，混匀；将溶液倒入胶床，插上梳子，待胶凝固后上样。2.2.2.5琼脂糖凝胶DNA回收根据BIOMIGA的琼脂糖凝胶／PCR产物纯化试剂盒（Gel/PCRExtractionKit）(DC3511/DC3514)中的说明书操作，步骤如下：（1）从凝胶上割下带有目的片段的凝胶块到一个1.5ml的离心管中，加入1倍体积的BufferGC(称量或者估算凝胶的重量，确保加入不少于1倍体积的BufferGC)，置于55℃-60℃水浴中8-10分钟，期间颠倒混匀几次，直至凝胶块完全溶化。冷却离心管至室温。（2）转移以上混合液（每次不超过700ul）至一个带有收集管的吸附住中，室温下，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。重复此步骤，直至剩余的混合液全部通过吸附柱。（3）加入650ulDNAWashBuffer至吸附柱中，室温下，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复次步骤。（4）室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇。（5）转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入40ul60℃预热的ElutionBuffer或ddH2O到吸附柱膜的中央，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟，如果想提高收获量，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次。2.2.2.6重组载体的构建按照TaKaRa的pMD18-TVectorCloningKit的使用说明书操作，具体反应体系如下：19 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用表3重组载体连接体系Table3Theconnectionsystemofrecombinantvector成分反应体系pMD18-TVector0.5μl目的DNA片段4.5μlSolutionI5μlRNase-FreeWaterUpto10μl在16℃连接30min，反应结束后置于4℃保存。2.2.2.7感受态的制备（1）从培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取单个菌落，接于2ml的灭菌的LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。（2）取0.5ml菌液转接到50ml灭菌的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，使OD600在0.4-0.6之间。（3）在无菌条件下，将菌液转移到一个无菌的—20℃保存的50ml离心管中，并于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，目的是使培养物停止生长。（4）在4℃离心机中以4000rpm离心10min，回收细菌细胞。（5）弃掉上清液，将管倒置1min，使残存的培养液流尽。（6）用10ml经过冰预冷的0.1MCaCl2重悬沉淀，冰浴30min。（7）重复步骤（4）。（8）重复步骤（5）。（9）将原始培养物与0.1MCaCl2按照5：1的比例重悬沉淀，并分装到无菌的1.5ml的离心管中（150ul／管），4℃保存备用，若长期保存需加30%的甘油于—80℃保存。2.2.2.8连接产物的转化（1）将重组载体连接产物10ul加入到150ul感受态中，混匀，冰浴30min。（2）然后放入42℃水浴锅中热激90s。（3）迅速冰浴3-5min，中间不要剧烈晃动。（4）加入500ul无菌LB液体培养基，混匀。（5）置于37℃水浴锅中，水浴45min。（6）离心，待离心机转速达到10000rpm，即停。（7）弃部分上清，留约200ul上清，重悬沉淀。20 山东农业大学硕士学位论文（8）均匀地涂到含有氨苄的LB固体培养基中，置于37℃温箱中培养12-16h。（9）待长出白色菌落，挑取单个菌落到含有Amp的LB液体培养基中（Amp终浓度为100ug/ml），每个平板约挑取3个单克隆菌落，过夜培养。2.2.2.9质粒的提取按照BIOMIGA质粒小提试剂盒（PlasmidMiniprepKit）(PD1211)中的说明书操作，对质粒进行提取。分别将含不同毒株VP2-1基因片段的重组子命名为pVP2-1-SD-1至pVP2-1-SD-37，含不同毒株VP2-2基因片段的重组子命名为pVP2-2-SD-1至pVP2-2-SD-37。具体操作如下：（1）将1.5ml菌液加到离心管中，室温下1000rpm离心1min，收集菌液，并尽可能吸去上清。（2）加入250ulBufferA1(确保已加入RNaseA)，用移液枪或漩涡震荡充分悬浮细菌细胞。（3）加入250ulBufferB1，轻轻地反复转10次以混合混匀，然后静置5min至溶液粘稠而澄清。注意静置时间不要超过5min。（4）加入350ulBufferN1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。注意：使用前将BufferN1预冷或在加入到裂解液后在冰上放置1min利于减少白色漂浮。（5）将离心管转至高速离心机，在室温下13000rpm离心10min（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。（6）小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中（避免吸起沉淀），室温下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。（7）向DNA柱中加入500ulBufferKB，室温下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。（8）向离心柱中加入500ul的DNAWashBuffer（确保已加入无水乙醇），室温下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回道收集管中，重复此步骤。（9）将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下开盖离心5-10min，以彻底去除残留的乙醇。21 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用（10）将离心柱转至一个新的1.5ml离心管中，向DNA柱的正中间加入50ul的ElutionBuffer，室温放置2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。将洗脱液再加入到柱中，在13000rpm离心1min，收集洗脱液。2.2.2.10酶切鉴定选取限制性内切酶，EcoRⅠ、SalⅠ，对重组质粒进行酶切鉴定，于37℃反应2h。反应体系如下：表4酶切反应体系Table4Enzymereactionsystem成分反应体系重组质粒DNA5ul10×Buffer2ulSalⅠ1ulEcoRⅠ1μlddH2OUpto20μl2.2.2.11序列测定及系统发育分析经过酶切鉴定为阳性的质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果用DNAStar进行编辑。将编辑后的37株阿留申病毒VP2基因与GenBank中的12株国际参考毒株进行比对，建立进化树。表5主要的参考毒株Table5Themainreferencestrains毒株分离时间来源地序列号ADV-GLate1970sUSAM20036ADV-FarEast2006RussiaDQ371395ADV-FIN2009FinlandGQ336866ADV-LN12009ChinaGU183264ADV-LN22009ChinaGU183265ADV-LN32009ChinaGU269892ADV-Beijing2015ChinaKT329428ADV-UtahLate1970sUSAZ18276ADV-Utah1-Kit1995USAU39015ADV-TR1995USAU39013ADV-SL3Early1980sGermanyX97629ADV-Pullman1995USAU3901422 山东农业大学硕士学位论文2.2.3间接ELISA检测方法的建立2.2.3.1引物的设计利用引物设计软件PrimerPremier5.0参考国际标准毒株ADV-G，针对水貂阿留申病毒VP2基因的抗原表位区，设计一对特异性引物。引物上游引入SalI酶切位点，下游引入EcoRI酶切位点，扩增长度为522bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：上游5’-gCgTCgACTAAATggAgCgTTgTTgTTC-3’(3525-3541)下游5’-CCggAATTCATgTACTTTgCTggAggACC-3’(4028-4046)2.2.3.2病毒DNA的提取方法同2.2.1.2。2.2.3.3目的片段的克隆(1)PCR扩增将提取到的病毒DNA按照2.2.1.3的反应体系进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸10min，4℃保存。(2)PCR产物的回收将PCR扩增的目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，具体操作同2.2.2.5。(3)感受态的制备方法同2.2.2.7。(4)目的片段的连接与转化胶回收产物与pMD18-T载体进行连接构建重组载体，反应体系参考2.2.2.6。将构建好的重组载体进行转化，具体步骤参考2.2.2.8。2.2.3.4阳性重组子的鉴定(1)PCR鉴定对摇取的单克隆菌液经过质粒提取后，对重组质粒进行PCR鉴定，反应体系和反应条件参考2.2.3.3。(2)双酶切鉴定用限制性核酸内切酶EcoRI、SalI对重组质粒进行酶切鉴定，反应体系参考2.2.2.10。23 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用(3)阳性重组子的序列测定将经过PCR鉴定和酶切鉴定都为的阳性重组质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。2.2.3.5表达载体的构建与鉴定(1)表达载体的构建将阳性重组子pMD18-T-VP2与表达载体pET-32a同时进行双酶切，酶切之后的产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪中观察后，将含有目的片段的胶切下，用胶回收试剂盒回收。将酶切后的表达载体与目的片段在16℃过夜连接。连接体系见表6：表6VP2基因与表达载体pET-32a连接体系Table6MixtureforligationofpET-32avectorandVP2gene成分体系表达载体pET-32a2ul目的片段6ulT4DNAligase1ul10×T4DNAligaseBuffer1ul总体系10ul重组表达载体pET-32a-VP2的转化：将重组后的原核表达载体转化到感受态BL21中，步骤参考3.2.8。(2)表达载体的鉴定①PCR鉴定对摇取的单克隆菌液经过质粒提取后，对重组质粒进行PCR鉴定，反应体系和反应条件参考4.2.3.1。②酶切鉴定用限制性核酸内切酶EcoRI、SalI对重组质粒进行酶切鉴定，反应体系参考3.2.10。③重组质粒pET-32a-VP2的序列测定将经过PCR鉴定和酶切鉴定都为的阳性重组质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。重组质粒于-20℃保存。24 山东农业大学硕士学位论文2.2.3.6VP2蛋白的诱导表达将测序成功的重组质粒重新转化入感受态BL21中，同时设置对照组，将空载体pET-32a转化到感受态BL21中,均匀的涂布到含有Amp的LB固体培养基，在37℃温箱中过夜培养。次日，在长满菌落的培养基上挑取单菌落接种到含有Amp的5mlLB液体培养基中于37℃的摇床中进行单克隆培养，摇床的转速为200rpm，Amp的终浓度为100ug/ml。12-16h后，取500ul菌液接种到50ml含有Amp的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养。大约培养2-3h时，用紫外分光光度计测OD600的值。当OD600在0.6-0.8时，加入100ul的诱导剂IPTG继续摇菌，此时进行蛋白的诱导表达。分别取诱导前1h，诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h的菌液各5ml。在4℃离心机中5000rpm离心10min，弃上清，留沉淀。沉淀用PBS重悬洗涤，5000rpm离心10min后弃上清，留沉淀。沉淀再次用PBS重悬。将菌体在超声破碎仪中进行超声破碎，设置工作时间1s，间隙3s，90次，两个回合。超声破碎后，在4℃离心机中12000rpm离心10min，收集包涵体沉淀，弃上清。用8M尿素溶解包涵体，加4×SDS上样缓冲液后，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳检测。2.2.3.7表达蛋白的SDS-PAGE分析(1)制胶：进行浓缩胶与分离胶的制备，见表7，表8：表1721%2分%离分胶离的胶制的备制备TTaabb7PPrereppaarereooff1122%%seseppaararatitoionnggeell成分加入量（ml）ddH2O2.3130%丙烯酰胺2.81.5MTris-cl（PH8.8）1.7510%SDS0.0710%APS0.07TEMED0.0028凝胶体积725 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用表8浓缩胶的制备Tab.8Prepareofconcentratedgel成分加入量（ml）ddH2O2.730%丙烯酰胺0.670.5MTris-cl（PH6.8）0.510%SDS0.0410%APS0.04TEMED0.004凝胶体积4（2）灌胶：将混合好的分离胶用枪吸取，沿着玻璃板的一角缓缓地加到玻璃板的中央，注意不要有气泡产生，大约加到玻璃板的3/4的位置停止，保持液面平整。最后用枪吸取双蒸水均匀地加慢玻璃板，封顶。待30min分离胶凝固后，将水弃掉，多余的水用枪吸净。加入制备好的浓缩胶，方法同加分离胶，将浓缩胶加满剩余的胶板，轻轻地插上梳子，室温静置30min直至胶凝固。（3）加样：待胶凝固后，轻轻拔下梳子。沿着点样孔缓缓的加入样品，每个点样孔加15ul，注意不要加到其他孔中。（4）电泳：加好样品后，插入电源。样品在浓缩胶电泳时先设定80V的电压，待看到溴酚蓝的样品成一条线，即将要到分离胶时，更换电压120V电泳。待溴酚蓝到达胶板的底部时，停止电泳。（5）染色：电泳结束后，将胶板取出，用切胶板切下有样品的分离胶，轻轻放入染色液中，在摇床中缓慢摇动3h。（6）脱色：染色结束后，将胶移入脱色液中，在摇床中摇动脱色，每30min更换一次染色液，直至出现清晰条带为止。2.2.3.8表达蛋白的Westernblot检测(1)电泳结束后将分离胶割至合适的大小，进入转膜缓冲液中。(2)膜处理：裁剪与胶条大小相同的滤纸和PDVF膜，将膜先浸入甲醇中，然后在转入到电转液中，滤纸和海绵垫直接进入到电转液中。(3)转膜：采用转膜装置，由负极到正极依次放置：海绵垫、3层滤纸、胶片、PVDF26 山东农业大学硕士学位论文膜、三层滤纸、海绵垫，放置时注意每一层不能有气泡。接通电源，120V约30-40min。(4)转膜完毕后，将膜取出，此时看到预染Makery已经转移到膜上，放入封闭液中4℃封闭过夜。(5)弃封闭液，用PBST洗脱，在摇床上缓慢摇动，洗三次，每次约10min。(6)一抗用封闭液1：4000稀释，将膜放入一抗中，室温孵育2h。(7)弃掉一抗，用PBST洗脱，同步骤（5）(8)二抗用封闭液1：8000稀释，将膜放入二抗中，室温孵育2h。(9)弃掉二抗，用PBST洗脱，同步骤（5）。(10)最后加入显色液，避光显色直至出现目的条带为止，然后将膜放入双蒸水中终止反应，观察，然后将膜晾干。2.2.3.9表达蛋白的纯化本试验采用切胶回收纯化表达的蛋白，方法参考PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，步骤如下：（1）对于考马斯亮蓝的方法染色的胶块，直接将脱色液脱色的胶块中含有目的条带部分切下，放入1.5ml的离心管中，用双蒸水洗两遍，每次5min。（2）用研磨杆将离心管中的胶体研磨成细小的碎片，加入400ul的溶液A，在室温条件下，脱色摇床上震荡过夜（16-18小时），期间取出，偶尔震荡几下。（3）室温12000rpm，离心15min，转移上清到另外一个2ml的离心管中，加入2ml的预冷的溶液B，混匀，4℃放置30min。（4）室温12000rpm，离心15min，去除上清，再将离心管放置在通风厨中，待残留的液体挥发干净。也可以再次加入0.5ml的溶液B，震荡洗涤沉淀，4℃放置15min，再重复步骤（4）1-2次，这样得到的蛋白质更纯净。（5）选用磷酸盐缓冲液溶解沉淀的蛋白质，以方便进行后续的电泳试验。注意：在保证完全切取到目的蛋白质后，尽量去除多余的胶片；研磨杆淹没碎片时，越充分越好，这样有利于蛋白质扩散到溶液A中；所加溶液A和溶液B的体积需要保持一定的比例关系，溶液B的体积必须是溶液A体积的5倍或5倍以上，以避免在步骤（3）的过程中产生不必要的杂质沉淀。2.2.3.10纯化蛋白的SDS-PAGE检测将纯化后的蛋白加4×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5min后，按照4.2.7的步骤再进行一次SDS-PAGE检测。27 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用2.2.3.11纯化蛋白的含量测定采用BCA蛋白定量试剂盒的方法操作：（1）稀释BSA标准品：使BCA标准品最终浓度（ug/ul）分别为0、0.062、0.125、0.25、0.5、1、2。（2）配置BCA工作液：BCA工作液总量=（BSA标准品样品个数+未知样品个数）×复孔数×每个样本BCA工作液体积，可以多配制1-2个孔的量。（3）将稀释好的BSA标准品和待测蛋白样品各25ul分别加到做好标记的96孔板微孔中。每个样本做3个平行反应。（4）每孔加200ul的BCA工作液，37℃孵育30min。（5）室温冷却。（6）用酶标仪测定在560nm时的样品吸光值。（7）以蛋白标准品的浓度为纵坐标，去除背景值后的吸光值为横坐标，绘制标准曲线。（8）根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。（9）测得的纯化蛋白的浓度为500ug/ml。2.2.3.12抗原包被浓度和一抗稀释度的选择（1）用事先备好的包被液将纯化好的AMDV-VP2蛋白按照1：10、1：50、1：100、1：200、1：400稀释后每个稀释度一行，此时蛋白的浓度分别为50ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml。加入到酶标板中（100ul/孔），4℃过夜。（2）次日，将包被液弃掉，在吸水纸上拍干液体。用PBST洗涤3次，每孔加200ulPBST洗涤，洗涤5min，弃掉PBST，拍干。（3）每孔加200ul5%的脱脂牛奶置于37℃温箱中，封闭2h。（4）弃掉封闭液，拍干液体。用PBST洗涤3次，每孔加200ulPBST洗涤，洗涤5min，弃掉PBST，拍干。（5）将一抗用封闭液按照1：50、1：100、1：200、1：400、1：800的比例稀释，每个稀释度两列，加入酶标板中（100ul/孔）。置于37℃温箱中，作用1h。（6）弃掉一抗，拍干液体。用PBST洗涤3次，每孔加200ulPBST洗涤，洗涤5min，弃掉PBST，拍干。（7）按照1：2000的比例稀释二抗，每孔100ul，加入酶标板。37℃温箱作用1h。（8）将二抗弃掉，拍干液体。用PBST洗涤3次，每孔加200ulPBST洗涤，洗28 山东农业大学硕士学位论文涤5min，弃掉PBST，拍干。（9）加TMB底物缓冲液，100ul/孔，置于37℃温箱中避光15min。（10）最终每孔加50ul2MH2SO4终止反应。（11）酶标仪测定OD450的值。2.2.3.13抗原最佳包被条件的选择根据5.2.2中确定的抗原稀释倍数包被3块酶标板，将这三块板分别采用37℃过夜包被、37℃1h后4℃过夜包被、4℃过夜包被。次日，将包被液弃掉，用PBST洗脱三次，每次5min，弃掉液体，拍干；用5%脱脂牛奶37℃封闭2h后用PBST洗涤三次，拍干；加确定好稀释倍数的一抗，37℃作用1h，弃掉，拍干，用PBST洗涤三次，拍干；按照1：2000的比例稀释二抗，加到酶标板中，37℃作用1h；PBST洗涤三次后，拍干；加TMB底物缓冲液，置于37℃作用15min后加50ul2MH2SO4终止反应；用酶标仪测OD450的值。2.2.3.14最佳封闭液的选择抗原、一抗的稀释倍数、抗原包被条件都采用上述确定好的最佳条件，封闭液选用2.5%脱脂牛奶、5%脱脂牛奶、1%BSA、1%明胶封闭，进行检测。最后用酶标仪测定OD450的值。2.2.3.15封闭时间的选择确定好封闭液后，用5%脱脂牛奶分别封闭1h、2h、3h进行检测，最终测定OD450的值。2.2.3.16二抗最佳稀释度的选择将上述确定好的最佳条件包被酶标板，二抗的浓度按照1：1000、1：2000、1：4000、1：8000本别进行ELISA的检测，结果测定OD450的值。2.2.3.17底物最佳作用时间的选择将上述确定好的最佳包被三块酶标板，加TMB底物缓冲液时，在37℃的作用时间分别采用10min、15min、20min，最终测定OD450的值。2.2.3.18临界值的确定将35份阴性血清按照上述确定好的方法进行ELISA的检测，测定OD450的值。根据公式计算临界值。2.2.3.19特异性试验将实验室保存的水貂肠炎病毒、水貂细小病毒的阳性血清进行ELISA检测，测29 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用OD450的值。检测建立方法的特异性。注意要设置水貂阿留申病毒的阳性血清、阴性血清的对照。2.2.3.20感性试验将一抗的稀释度从1：50、1：100倍比稀释，一直稀释到1：1600，检测OD450的值。2.2.3.21重复性试验对同一时间与不同时间表达纯化的蛋白，同时包被酶标板，检测13份血清，测定OD450值，计算变异系数。2.2.3.22床样本检测按照上述已经建立好的ELISA方法，将实验室采集的84份水貂血清进行检测，测定OD450的值。3结果3.1水貂阿留申病毒的分离鉴定结果3.1.1PCR初步检测结果对采集病料提取的DNA进行水貂阿留申病的PCR初步检测，结果呈现AMDV阳性，扩增大小为627bp，结果与预期相符，见图1：M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图1VP2基因片段PCR扩增结果(M.DL50001.PCR扩增结果)Fig.1TheresultsofVP2geneforPCRamplification(M.DL50001.ProductbyPCR)30 山东农业大学硕士学位论文3.1.2AMDV的分离结果AB图2ADV感染猫肾细胞后第13代96h感染情况(A.正常细胞B.感染ADV后的细胞)Fig.2TheinfectionofADVinfectedCRFKinthethirteenthof96hA.thenormalcellsB.thecellsinfectedADV3.1.3AMDV分离的PCR鉴定结果对细胞培养物提取的DNA进行PCR扩增，扩增大小为627bp，结果得到与预期相符的基因片段。见图3：M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3VP2基因片段PCR扩增结果(M.DL50001.PCR扩增结果)Fig.3TheresultsofVP2geneforPCRamplification(M.DL50001.ProductbyPCR)31 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用3.1.4序列的核苷酸同源性比较将分离到的毒株命名为ADV-ZC，将此毒株进行序列测定，将测序结果与Genbank中12株参考序列进行核苷酸同源性比较，结果同源性在91.3%-100%，与ADV-G的同源性在92.6%，与ADV-FIN的核苷酸同源性最低为91.3%，与ADV-LN3的同源性最高为95.7%。进一步证实所分离到的毒株为阿留申病毒。图4ADV-ZC的VP2基因核苷酸同源性比较Fig.4ThehomologycomparisionofthenucleotidesequenceforVP2geneofADV-ZC3.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究结果3.2.1PCR扩增结果将134份采集的水貂实质器官进行PCR扩增，结果有37份呈现阿留申病阳性，阳性率达到27.6%。将这37株病料VP2基因的两个片段VP2-1、VP2-2分别进行PCR扩增，结果见图5、图6，扩增大小分别是693bp、1268bp，与预期相符。32 山东农业大学硕士学位论文M1M15000bp5000bp3000bp3000bp2000bp2000bp1500bp1500bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图5VP2-1片段扩增结果图6VP2-2片段扩增结果(M.DL50001.PCR扩增结果)(M.DL50001.PCR扩增结果)Fig.5TheresultsofVP2geneforPCRFig.6TheresultsofVP2geneforPCRamplificationamplification(M.DL50001.ProductbyPCR)(M.DL50001.ProductbyPCR)3.2.2酶切鉴定结果将提取的质粒进行酶切鉴定，结果与预期相符，见图7、图8：M1M15000bp5000bp3000bp3000bp2000bp2000bp1500bp1500bp1000bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp250bp100bp100bp图7pVP2-1-SD-1重组载体酶切结果图8pVP2-1-SD-1重组载体酶切结果(MDL5000Maker；1VP2-1片段酶切结果)(MDL5000Maker；1VP2-2片段酶切结果)Fig.7TheresultsofrecombinantvectorpVP2-1-SD-1byFig.8TheresultsofrecombinantvectorpVP2-1-SD-1enzymedigestionbyenzymedigestion(M.DL50001.VP2-1byrecombinantvector)(M.DL50001.VP2-2byrecombinantvector)33 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用3.2.3同源性分析与系统发育分析结果结果显示：37株测序株间VP2基因核苷酸相似性为88%-99.8%，与GenBank中参考序列的相似性为88.0%-100%，测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%，与参考序列的相似性87.7%-100%。用MEGA5.1软件建立进化树，将所有毒株划分为5个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。结果显示，国内毒株分布在除了第Ⅳ分支的其他组中，其中第Ⅱ和第Ⅲ分支的AMDV是由国外引入的，第Ⅰ和第Ⅴ分支全部由国内毒株组成，78.4%的国内毒株分布在第Ⅰ分支。图937株VP2基因的系统发生树Fig.9PhylogenetictreeoftheVP2genesequencesof37strain34 山东农业大学硕士学位论文3.3间接ELISA检测方法的建立结果3.3.1重组载体pMD18-T-VP2的PCR鉴定结果以构建的重组载体pMD18-T-VP2为模板，进行PCR扩增之后，经琼脂糖凝胶电泳，得到了与预期大小相符的目的片段，522bp。结果见图10：M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图10重组载体pMD18-T-VP2的PCR鉴定结果(M.DL50001.PCR扩增结果)Fig.10TheidentificationproductPCRproductsofpMD18-T-vp2(M.DL50001.ProductbyPCR)3.3.2重组载体pMD18-T-VP2的酶切鉴定结果重组载体pMD18-T-VP2经限制性内切酶SalI、EcoRI酶切，并经琼脂糖凝胶电泳后，得到了与预期相符的载体片段与目的片段。结果见图11：M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图11重组载体pMD18-T-VP2的酶切鉴定结果(M.DL50001.酶切鉴定结果)Fig.11TheidentificationofpMD18-T-vp2withrestrictionenzymedigestion(M.DL50001.Productofenzymedigestion)35 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用3.3.3重组表达载体pET-32a-VP2的PCR鉴定结果以重组表达载体pET-32a-VP2为模板，进行PCR扩增之后，经琼脂糖凝胶电泳，出现与预期相符的目的片段，522bp。结果见图12：M12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图12重组载体pET-32a-VP2的PCR鉴定结果(M.DL50001.PCR鉴定结果)Fig.12TheidentificationofproductPCRproductsofpET-32a-VP2(M.DL50001.ProductbyPCR)3.3.4重组表达载体pET-32a-VP2的酶切鉴定结果重组表达载体pET-32a-VP2经限制性内切酶SalI、EcoRI酶切，并经琼脂糖凝胶电泳后，得到与预期大小相符的目的片段。结果见图13：M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图13重组载体pET-32a-VP2的酶切鉴定结果(M.DL50001.酶切鉴定结果)Fig.13TheidentificationofpET-32a-VP2withrestrictionenzymedigestion(M.DL50001.Productofenzymedigestion)36 山东农业大学硕士学位论文3.3.5重组质粒pET-32a-VP2的序列测定结果经过PCR检测与酶切鉴定的阳性重组质粒pET-32a-VP2送往上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果经Maglign生物软件比对后，结果与国际标准毒株ADV-G的核苷酸序列同源性达到93.5%。3.3.6表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果经SDS-PAGE电泳后发现，诱导后的菌体出现了与预期大小相符的目的条带40KD，并且在诱导后4h的蛋白表达量最高，而未诱导的菌体没有出现明显的目的条带。空载体pET-32a在诱导后未出现相应的目的条带。结果见图14：M12345678910180KDa135KDa100KDa75KDa63KDa48KDa35KDa25KDa17KDa11KDa图14重组载体pET-32a-VP2表达产物SDS-PAGE分析结果(M.蛋白Marker1.未诱导的重组菌2-9.重组菌诱导1-8h的表达产物10.诱导4h的空载体)Fig.14SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinexpressed(M.ProteinMarker1.Productwithoutinducing2-9.ProductsinducedbyIPTG1-8hrespectively10.pET-32ainducedbyIPTG4h)3.3.7表达蛋白的Westernblot检测结果对经SDS-PAGE电泳结束的含有表达蛋白的胶片进行蛋白的免疫印记检测，结果发现PVDF膜上对应的蛋白分子量的位置出现了单一的目的条带，见图15。这证明了所表达的蛋白具有很好的反应原性。37 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用M1180KDa135KDa100KDa75KDa63KDa48KDa35KDa25KDa17KDa11KDa图15重组蛋白的Westernblot检测结果(M.蛋白Marker1重组蛋白)Fig.15TestresultoftherecombinantproteinwithWesternblot(M.ProteinMarker1.Therecombinantprotein)3.3.8纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果将分离胶中含有的目的条带，根据PAGE胶蛋白微量回收试剂盒的步骤切胶纯化后，进行SDS-PAGE电泳，结果出现单一条带。证明蛋白纯化良好。见图16：M1180KDa135KDa100KDa75KDa63KDa48KDa35KDa25KDa17KDa11KDa图16重组蛋白的纯化结果(M.蛋白Marker1纯化后的重组蛋白)Fig.15Testresultofpurificationoftherecombinantprotein(M.ProteinMarker1.Therecombinantproteinafter3.3.9抗原包被浓度和一抗稀释度的确定经过方阵滴定的方法确定抗原包被浓度和一抗稀释度，结果见表9显示：当抗原包被浓度为5.5ug/ml（1：100），一抗稀释度为1：100时，P/N值较大，此时P为1.042，N为0.202。38 山东农业大学硕士学位论文表9抗原最佳浓度与血清最佳稀释倍数的确定Tab.9Determinationoftheoptimalantigenconcentrationandserumdilution一抗稀释倍数抗原1：501：1001：2001：4001：800稀释倍数PNPNPNPNPN1：102.0720.9761.7410.5211.1330.3240.9550.2330.8320.0431：501.7520.8331.3350.3430.9530.3220.7760.1340.5450.0321：1001.3110.6541.0420.2020.8800.2190.6450.0890.4340.0331：2001.0320.5800.8960.1560.6650.1220.5340.0420.3330.0261：4000.9450.5330.6780.1370.5340.1230.4890.0560.3230.0193.3.10抗原包被条件的确定对稀释的抗原经37℃过夜包被、4℃过夜包被、37℃作用1h后4℃过夜包被，这三种情况的ELISA检测后，结果见表10：发现4℃过夜包被的效果最好，P/N的值最高。最终选择抗原的包被条件为4℃过夜包被。表10抗原包被条件的确定Tab.10Determinationoftheconditionofantigen血清OD450抗原包被条件平均值37℃过夜4℃过夜37℃1h后4℃过夜阳性血清1.9831.1431.844阴性血清0.5480.2080.389P/N值3.615.494.743.3.11封闭液的确定经2.5%脱脂牛奶、5%脱脂牛奶、1%BSA、1%明胶作为封闭液封闭后，测定OD450值。结果见表11：经过5%脱脂牛奶的封闭效果最好，P/N值最高，所以优先选择5%脱脂牛奶作为ELISA检测的封闭液。表11封闭液的确定Tab.11Determinationoftheblockingsolution血清OD450封闭液平均值2.5%脱脂牛奶5%脱脂牛奶1%BSA1%明胶阳性血清1.0431.2321.1541.044阴性血清0.2490.2130.2590.302P/N值4.185.784.453.4539 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用3.3.12封闭液作用时间的确定按照5%脱脂牛奶各封闭1h、2h、3h后测定OD450的值，发现5%脱脂牛奶封闭2h的作用效果最好，P/N值最高。最终选择封闭液的作用时间为2h。结果见表12：表12封闭液作用时间的确定Tab.12Determinantoftheblockingtime血清OD450封闭液的作用时间平均值1h2h3h阳性血清1.0241.1541.075阴性血清0.2460.1980.23P/N值4.165.824.673.3.13二抗最佳稀释度的确定二抗的稀释度采用1：1000、1：2000、1：4000、1：8000本别进行ELISA的检测，测定OD450的值。结果当二抗稀释到1：4000时的P/N值最高。最终确定二抗的稀释度为1：4000。结果见表13：表13二抗最佳稀释度的确定Tab.13Determinantforthedilutionofconjugate二抗的稀释度血清0D4501：10001：20001：40001：8000OD450(+)1.9991.8711.491.024OD450(-)0.4130.3450.2230.192P/N4.845.426.685.333.3.14底物最佳作用时间的确定TMB底物缓冲液的作用时间分别设定为10min、15min、20min，测定OD450值。结果当底物的作用时间为15min时,P/N值最高。因此，确定底物的作用时间为15min。结果见表14：表14底物最佳作用时间的确定Tab.14Determinantofthereactionofsubtracts血清OD450底物作用时间平均值10min15min20min阳性血清0.9881.0371.124阴性血清0.2110.1760.215P/N4.675.895.2140 山东农业大学硕士学位论文3.3.15临界值的确定对48份阴性血清样品进行ELISA检测，测定其OD450的值。结果计算所得平均值（X）为0.148，标准差（SD）为0.03138，根据公式临界值=平均值（X）+2标准差（SD），所得临界值为0.211。所以，当检测结果OD450大于0.211则判定为阳性。3.3.16特异性检测结果将实验室保存的水貂肠炎病毒（MEV）、水貂细小病毒（CPV）的阳性血清，进行ELISA检测。同时设置水貂阿留申病的阳性和阴性血清做对照，进行检测。检测结果为阴性，表明了该检测方法的特异性。结果见表15：表15特异性检测结果Tab.15TheresultofthespecifictestMEVCPVADV+ADV-OD4500.0320.0870.7690.169结果阴性阴性阳性阴性3.3.17敏感性检测结果一抗的稀释度从1：50、1：100倍比稀释到1：1600，结果见表16：发现当一抗的稀释度达到1:800时，0D450的值仍大于0.211，呈现阳性。证明该方法的敏感性良好。表16敏感性检测结果Tab.16Theresultofthesensitivitytest一抗稀释度血清0D4501：501：1001：2001：4001：8001：16000D450(+)1.1331.0250.8960.5890.2310.1890D450(-)0.2090.1880.1340.0870.0440.0423.3.18重复性检测结果对13份血清，用相同时间与不同时间表达纯化的蛋白进行检测，计算的变异系数都小于10%。证明该方法的重复性良好。3.3.19临床样本检测结果将84份水貂血清检测后发现，有22份血清大于临界值，为阳性。阳性率为26.2%。41 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用4讨论4.1水貂阿留申病毒的分离鉴定我们对送检的疑似患水貂阿留申病的水貂实质器官进行检测，用PCR的检测方法检测到一份阳性病料，对该病料用PBS在研钵中研磨，经0.22um的滤器过滤后同步接种到传代猫肾细胞中，于37℃温箱中培养。培养初期与正常传代的猫肾细胞比较，没有明显的细胞病变。盲传到第6代，与正常细胞相比，开始逐渐出现细胞病变，培养到第9代细胞病变明显：在接种病毒后的第3天，细胞开始逐渐变圆、脱落、死亡，形成大量空斑。对接种病毒的猫肾细胞提取DNA进行PCR检测，结果出现ADV阳性。将分离到的阿留申病毒进行测序，与参考序列比对后发现，核苷酸同源性在91.3%-100%。但是，我们将出现病变后的细胞继续进行传代，进行病毒的培养。随着传代次数的增加，细胞病变开始逐渐消失，此时，我们再对细胞培养物提取DNA，进行水貂阿留申病毒的检测，却呈现阴性。分析其中原因，不排除有人为操作的问题。但是，对该病毒的分离，一直呈现较低的分离率。目前，国内对该病毒的分离报道较少；国外对该病毒的分离，是上世纪80年代，由Bloom等用猫肾细胞在31.8℃的条件下用ADV-Utah强毒株首次分离到没有毒力的毒株-ADV-G(Bloometal.,1980)。分离到的ADV-G只能感染猫肾细胞，并且能在该细胞中任意复制(Aastedetal.,1984;vanDawenetal.,1983)。除此之外，其他强毒株都不能在体外进行分离培养，水貂阿留申病毒的致病力与在体外培养的能力成反比，如ADV-G没有致病力，但是却能在体外CRFK中进行培养；ADV-Utah有较强的致病性，但是却没有能在体外培养的能力。但是目前只发现了一株，既能在体外培养，又有较强的致病力ADV-SL3(Schuiereretal.,1997)。较低的分离率造成了对水貂阿留申病毒研究的困难。本实验室所分离的病毒，是对送检病料中检测到阳性的病料，经研磨后接种到猫肾细胞（CRFK）中的。而该病料的病死水貂可能是由于感染具有致病力的水貂阿留申病毒而死。核苷酸同源性分析可知该病毒株与ADV-G的核苷酸同源性较低，而与ADV-LN1、ADV-LN3、ADV-Beijing、ADV-Pullman核苷酸同源性较高。ADV-Pullman有致病力相对较低。我们此次，没有分离到出现稳定病变的水貂阿留申病毒株，可能与这种具有致病力的水貂阿留申毒株有关。从上世纪四十年代发现水貂阿留申病以来，到现在已经长达70年的历史，对该病42 山东农业大学硕士学位论文毒的分离一直是学界难以突破的难题。对该病也还没有特异性的治疗方法，因此，对该病毒的研究还有相当长的一段路要走。由于病毒的分离率低，对该病毒的的分析也只能通过对病料中病毒的PCR扩增的方法来完成对该病毒的序列分析，本实验室此次对水貂阿留申病毒的分离，希望能对该病的研究提供科学依据。4.2山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究目前，中国对AMDV的分子流行病学调查的研究很少。2014-2015年间，我们从山东省诸城采集134份水貂实质器官进行检测，发现有37株呈现水貂阿留申病阳性，阳性率达到27.6%，这证明我省的水貂阿留申病的流行还处于居高不下的地位，流行情况仍旧很严峻。这对水貂养殖户造成了一定的经济损失。因此，需要更多积极有效的措施来控制疾病的传播。而掌握该病的流行趋势，对疾病的控制和预防提供科学依据显得尤为重要。首先，我们对检测到的37株水貂阿留申病毒的VP2基因的编码区序列进行分析和比对，结果显示山东地区毒株序列存在大量的突变位点。将测序株与参考株经进化树分析后，分成5个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。VP2基因进化树显示89%的国内毒株处在进化树的第Ⅰ和第Ⅴ分支，有29株与国内报道的毒株AMDV-Beiing共处于第Ⅰ分支，占比达到78.4%，而这两个分支不包含国外毒株，这说明我国水貂阿留申病毒已经有别于国外毒株，形成了自己的独立进化支；余下的11%的国内毒株则与其他国外毒株有较近的亲缘关系。其中SD-20、SD-29、SD-34三株处于进化树的第Ⅲ分支，与相对于AMDV-Utah1毒力稍弱的强毒株AMDV-Pullman处于同一分支，这一发现可能意味着SD-20、SD-29、SD-34三个毒株是从美国引进的貂体内携带的AMDV-Pullman毒株进化而来。这表明了我省水貂养殖场的的水貂阿留申病毒中仍存在一些国外毒株流行，第Ⅳ组包含ADV-FarEast、ADV-LN2、ADV-LN3、ADV-LN1、ADV-Utah1-Kit、ADV-Utah，该组中，只有从辽宁分离出的毒株与国外毒株共处于同一进化支。虽然本实验室分离到的毒株与辽宁地区分离到的毒株同属于国内毒株，但是在长期的进化过程中已经在本地区中形成了独立的进化支，并且形成了向不同的方向进化的特点。第Ⅴ分支中只包含四株从山东地区分离到的毒株，SD-15、SD-21、SD-23、SD-28。虽然与第Ⅰ分支都只包含本地区的毒株，但是大多数分离到的毒株处于第Ⅰ分支，我们暂且认为可能山东地区的毒株主要在向第Ⅰ分支进化的趋势。这对找出本地区流行的水貂阿留申病毒的标准毒株，以便进一步对该病进行检测提供科学依据。43 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用VP2蛋白是主要的免疫原性蛋白，因此各国学者也主要针对VP2基因进行研究。VP2基因中有一段核苷酸区域突变率较高，该区域为超变区，位于VP2基因的690-730nt。该区域一直被人们认为与阿留申病毒的致病力有关，后来经过证实此区域与有致病力的水貂阿留申毒株相关性不大。有关研究已经将与致病力有关的基因区锁定在了超变区下游基因区域(Bloometal.,1998;Foxetal.,1999)，此区域中有5个氨基酸在致病毒株与非致病毒株中存在差别，而我们对此次从山东地区分离到的ADV毒株中也发现了这5个位点氨基酸的突变，与马建等的研究一致(马建,2005)。他们分别为352：I-V、395:H-Q、434:N-H、492:N-E、534:H-D。同时，我们也发现有2个位点氨基酸突变发生变化，分别为434：N-S、492：N-D。这两个突变都存在于SD-15、SD-21、SD-28中，而这三个毒株在进化树中被单独归于第Ⅴ分支，对于这些变化我们目前还没有确切的研究来表明它突变的意义，只能提供材料支持，待进一步研究。对分离株与参考株的VP2基因进行氨基酸同源性分析可知：测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%，与参考序列的相似性为87.7%-100%。纵观VP2的整个氨基酸序列中，突变较多,有超过100多个氨基酸的突变。其中，突变较集中的区域包括VP2：80-98、VP2：110-145、VP2：162-171、VP2：232-248、VP2：305-332、VP2：391-454、VP2：485-546、VP2：613-629。这些区域中，突变区域VP2:485-546，与免疫反应区VP2:429-524交叉，并且此区域包含决定ADV免疫发生机理和宿主范围的区域(McKennaetal.,1999)——VP2:428-446。在所有的突变位点中，只存在于中国毒株中的突变位点有74:D-E、79：L-V、89：T-K、204:V-I、248：S-A、305：K-T、308：T-S、359：Y-F、391：T-S、394：Q-K、419：L-I、436:I-M、574：N-D、595：K-R。其中，位点204：V-I、305:K-T、308:T-S、419：L-I、436：I-M的突变，突变毒株超过10个。419：L-I、436：N-D两个突变存在于VP2:428-446区域，可能影响水貂阿留申病毒的宿主范围的选择(McKennaetal.,1999)。除此之外，我们也观察到了桑宇(桑宇,2012)之前提到的突变位点433：D-E、433：D-N、436：I-M，王振军(王振军,2014)提到的282：K-N、317：L-K、327：E-Q位点的突变。总之，VP2是主要的免疫原性抗原，通过此次研究发现AMDV的核苷酸和氨基酸的突变率都很高，与之前的报道一致(马建,2005;桑宇,2012;王振军,2014)。所以，随着AMDV在国内饲养过程中基因的不断突变，再使用进口抗原检测ADV，可能会降低对水貂阿留申病检测的灵敏性和特异性，影响该病的净化效果。而目前，国内对44 山东农业大学硕士学位论文水貂阿留申病的分子流行病学调查的研究还相对较少。所以，要想提高对水貂阿留申病毒检测的灵敏性，我们需要根据本地区水貂阿留申病毒突变的规律来制作适合本地区的特异性诊断抗原，而本次研究对该地区水貂阿留申病的分子流行病学调查提供了科学依据，也对该地区研究水貂阿留申病的诊断抗原提供了科学依据。4.3间接ELISA检测方法的建立由于，目前对水貂阿留申病的检测主要是碘凝集试验（IAT）和对流免疫电泳（CIEP）。IAT虽然操作简单，但是非特异性高，会有很多假阳性、假阴性的出现；CIEP是目前世界上广泛使用的检测方法，但是该方法不易进行批量操作，而且操作复杂、耗时、而且有散毒的危险。现在，多国研究人员致力于寻找该病新的检测手法。所以，基于此，为了优化对水貂阿留申病毒的检测，本次研究建立了一种间接ELISA检测方法，该方法操作简单，适用于大批量检测，检测精度高，特异性强，而且对操作人员的水平要求不高，由于所用的检测抗原是表达的融合蛋白，所以该方法也避免了散毒的危险。由于VP2蛋白是水貂阿留申病毒的主要免疫原性抗原，是研究该病毒毒力、致病机理等的首选基因(梁冬莹etal.,2007)。所以，本实验室针对水貂阿留申病毒的VP2基因进行了蛋白表达。对表达系统的选择，我们选用了原核表达系统—大肠杆菌表达系统。随着分子生物学技术的发展，该表达系统也得到了逐步的完善和发展。大肠杆菌表达系统具有能高效表达、培养周期短、较低的成本、遗传背景清楚等优点。所以，本实验室选用了原核表达载体pET-32a，大小为5900bp，能在大肠杆菌表达系统中进行高效表达。针对VP2序列的高免疫反应区430-525区域，设计了一对含有限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ的特异性引物。将扩增出的基因连接到同时具有限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ的中进行表达。经过表达条件的优化，结果发现诱导剂IPTG的最适浓度在1mmol/L，在加入诱导剂后的1-8h后，随着诱导时间的增加表达量增高，达到最高值后，表达量又略呈下降趋势，所以确定的最终诱导时间为37℃诱导4h，此时的表达量最高，条件最优。将表达产物经SDS-PAGE鉴定后，获得了与预期大小相符的表达蛋白，目的蛋白大小为41KDa。将该蛋白经Westernblot检测后发现所表达蛋白能被阳性血清特异性识别，证明表达蛋白具有良好的反应原性。由于，我们考虑到表达的蛋白要用于间接ELISA检测方法的建立，所以，我们采用了比较经济、简单、高效的纯化蛋白的方法：切胶回收表达的蛋白（PAGE蛋白微量回收试剂盒）。当然，45 水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用考虑到大量回收蛋白的可能，我们所表达的蛋白中也带有His标签，可用镍柱进行大量纯化。由于，间接ELISA检测方法的原理是抗原与抗体的特异性反应，抗原与抗体的浓度只有在合适的比例下该方法的检测才具有真是可靠的，否则，抗原浓度过高或过低，都会造成非特异性结果的发生。所以，本试验用矩阵法首先确定了抗原与血清的最适浓度，其次对抗原包被条件、封闭液的选择、封闭时间、二抗最佳稀释度、底物最佳作用时间等条件进行优化。同时，进行了临界值的确定、进行了敏感性试验、特异性试验、重复性试验，最终建立了间接ELISA检测方法。通过方法的建立，确定了最佳优化条件：抗原浓度为5.5ug/ml，血清稀释度为1：400，抗原4℃包被过夜，选用5%的脱脂牛奶封闭2h，最适的血清作用时间为37℃1h，酶标二抗最适稀释倍数为1：10000，底物最佳作用时间为15min。用建立好的方法，应用于临床检测。对84份送检的血清样本进行检测，检出率为26.2%。为水貂阿留申病的检疫净化淘汰提供一种检测方法。46 山东农业大学硕士学位论文5结论5.1对山东诸城134份水貂脏器进行检测，检出率在27.6%。VP2基因分析，该基因核苷酸和氨基酸有较高的突变率。系统进化树分析，表明该地区水貂阿留申病毒已经形成了2个独立进化支。同时，仍存在一些与国外亲缘关系较近的毒株的流行。5.2应用所表达蛋白，建立了间接ELISA检测方法。用建立好的方法对送检病料进行检测，检出率为26.2%，为水貂阿留申病的检疫净化淘汰提供一种检测方法。47 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