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分类号：S855.3学校代码：10712UDC：636.09研究生学号：B08202密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究学科专业：预防兽医学研究方向：分子病原学与免疫学研究生李英指导教师：张彦明教授完成时间：2014年12月中国陕西杨凌 Classificationcode:S854;Q812Universitycode:10712UDC:591.3Postgraduatenumber:B08202Confidentialitylevel:OpenDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015RESEARCHONMAINTICKSMORPHOLOGYANDTICKSBORNEDISEASEINQINGHAIPROVINCE,CHINAMajor:PreventiveveterinaryResearchfield:MolecularetiologyandimmunologyNameofPostgraduate:LiYingAdviser:Prof.ZhangYanmingDateofsubmitted:December,2014YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：么％时间：只/j"年寸月於日导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位(毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我必须接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名:时间：年占月M曰 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位(毕业）论文及其相关的工作成果时，必须以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人（包括研究生本人）未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：>00年彡月W日导师签名:时间：年j月曰 青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究摘要蜱是一类通过吸食脊椎动物血液的寄生类节肢昆虫，可作为传播媒介向人类和动物传播多种致病性病原体，引起各种重要的自然疫源性疾病及人兽共患病。目前，全球经报道的蜱类（硬蜱科和软蜱科）超过900余种，其中在我国经报道的蜱类有11属120余种，其中包括软蜱10种和硬蜱100余种，蜱在地区分布上具有差异性。在我国经蜱传播疫病主要有10余种，包括蜱传森林脑炎（Tick-borneencephalitis，TBE），Q热（Q-fever），东方斑点热（Orientalspottedfever），北亚蜱传斑点热（North-Asiatickbornespottedfever），克里米亚-刚果出血热（Crimean-Congohemorrhagicfever）（新疆出血热，Xinjianghemorrhagicfever），科罗拉多热（Coloradofever），蜱传回归热（Tick-bornerelapsingfever），莱姆病（Lymeborreliosis），兔热病（Tularemia）和梨形虫病（Piroplasmosis）。上述蜱传疫病主要报道于我国的北部和东北部的新疆，内蒙古，黑龙江，吉林，辽宁与西南地区的云南，而青海鲜有报道。因此，阐明青海省主要媒介蜱类分布和蜱传主要疫病流行病学具有重要公共卫生意义。⑴采用形态学方法对青海省主要蜱类进行了种类鉴定，并观察部分部位的显微结构，结果表明青海省主要蜱种为青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis），草原革蜱（Dermacentornuttalli），森林革蜱（Dermacentorsilvarum）和残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）。应用扫描电镜观察了四种蜱的假头基、齿式、肛沟、生殖孔、爪垫、哈氏器和孔区等超微结构，表明各蜱在形态学上具体有明显差异，以上结构特征可作为蜱种属鉴定的依据。⑵根据已发表斑点热群立克次体外膜蛋白OmpA基因序列设计特异性引物，以青海省采集的蜱标本为模板，进行PCR检测，并对阳性样本的基因序列进行测序和序列分析，建立分子系统进化树。结果显示在454个蜱样本池中共检测到14个SFGR阳性样本，其中9个为西伯利亚立克次体阳性样本和5个为黑龙江立克次体阳性样本，总感染率为3.08%。序列分析结果显示西伯利亚立克次体青海株HUN与黑龙江立克次体虎林株HL-93（AF179364）、绥芬株HLJ-054（AF179362）共处一个分支，一致性分别为99.18%和99.51%；黑龙江立克次体青海株GL-1与西伯利亚立克次体前苏联株246（U43807）和北京株BJ-90（AF179365）同处一个分支，序列一致性分别为99.49%和99.67%。⑶根据人粒细胞无形体病预防控制技术指南合成无形体16SrRNA特异性引物，对青海省媒介蜱种带菌率进行了巢式PCR检测，并对阳性样本的基因序列进行了测序和序列分析，建立了分子系统进化树。结果显示在454个蜱样本池中共检测到67个无形体阳性样本，病原携带率为14.8%，不同地区及不同蜱种间无形体病原携带率无统计学 差异，且首次检测在青海血蜱检测到有无形体携带。序列分析结果显示青海无形体分离株HUN与日本无形体分离株（A.phagocytophilum，AY969010）和中国吉林无形体分离株（A.phagocytophilum，GQ412339）共处一个分支，一致性分别为98.73%和99.75%。⑷分析不同月份蜱类活动频率及羊泰勒虫感染率，结果为残缘璃眼蜱7130只（48.2%），草原革蜱1358只（9.1%）和青海血蜱6382只（42.9%），经统计学分析残缘璃眼蜱和青海血蜱所占比例显著多于草原革蜱（p<0.05）。采用梨形虫、泰勒科通用引物及种属特异性引物对617份羊血液样品进行PCR检测，并对阳性样品18SrRNA基因进行遗传进化分析；PCR检测结果显示青海省羊泰勒虫感染率为64.8%；其中吕氏泰勒虫感染率为37.6%、尤氏泰勒虫感染率为27.2%，混和感染率为19.8%，没有检测到绵羊泰勒虫感染，统计学分析显示吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫在羊群的感染率无统计学差异（p>0.05），吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫单虫种感染率显著高于混合感染率（p<0.05）。遗传进化分析显示青海省吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫与西北地区的虫株处于同一亚分支，而区别于北京地区吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫分离株与我国南方地区分离株，呈现区域聚集性；不同月份蜱类活动频率与羊泰勒虫感染率呈现季节相关性。综上所述，在本研究中我们明确了青海省主要蜱类为青海血蜱，草原革蜱，森林革蜱和残缘璃眼蜱，并描述了四种蜱的假头基，齿式，肛沟，生殖孔，爪垫，哈氏器和孔区等超微结构特征；明确了青海省蜱传斑点热群立克次体和无形体的蜱类带菌率及遗传进化趋势；明确了青海省羊泰勒虫的羊群感染率、遗传进化趋势及蜱类动态与羊泰勒虫羊群感染率的关系。本研究所得结果阐明了青海省蜱主要种类及主要蜱传疫病的流行率及遗传进化，丰富了蜱类研究数据，同时为青海省蜱传疫病的防控和公共卫生安全提供了可靠数据。关键词：蜱类；蜱传疫病；感染率；遗传进化 RESEARCHONMAINTICKSMORPHOLOGYANDTICKSBORNEDISEASEINQINGHAIPROVINCE,CHINAABSTRACTTicks(Acari:Ixodida)areparasiticacarithatsuckbloodfromthevertebratehosts.Theycantransmitanumberofpathogenicorganismstohumansanddomesticanimalsandcauseavarietyofimportantnaturalfocaldiseasesandzoonoses.Todate,morethan900speciesoftickshavebeenrecordedglobally,withtwomajorfamilies,namelyIxodidaeandArgasidae,theformergenerallyreferredtoashardticksandthelateralsoknownassoftticks.InChina,aboutelevengenerasoftickshavebeenrecordedwhichcoveredapproximately120species,including10speciesofArgasidaeandover100speciesofIxodidae.TicksspecieswerespecificindifferentzonesinChina.Thereweretenmajortick-bornediseasesreportedinChina,suchasTick-borneencephalitis(Forestencephalitis,TBE),Q-fever,Orientalspottedfever,North-Asiatickbornespottedfever,Crimean-Congohemorrhagicfever(Xinjianghemorrhagicfever),Coloradofever,Tick-bornerelapsingfever,Lymeborreliosis,tularemiaandpiroplasmosis.ThesediseasesweremostlyreportedinnorthernandnortheasternChinainareas,suchasXinjiang,InnerMongolia,Heilongjiang,Jilin,LiaoningandYunnanprovinces,andfewreportsonQinghaiprovince.SoinvestigationsonticksspeciesandepidemiologyoftickbornediseasesinQinghaiprovincewasveryimportantforpublichealth.⑴SpeciesidentificationonmajorticksspeciesinQinghaiprovincewereconductedbasedonmorphologicalcharacters.Theresultsshowedthattherewerefourticksspecies,includingHaemaphysalisqinghaiensis,Dermacentorsilvarum,DermacentornuttalliandHyalommadetritum.Atthesametime,theBasiscapituli,Tooth,Analditch,Footpad,Haller’sorgan,Porsseareaetalutalstructureoffourspeciestickswerealsoobservedbyelectronmicroscopic.EachtickshowThereweresignificantdifferencesinmorphologyoffourspec-iesticks.Theresultsindicatedthesecharacteroftheutalstructurecouldbeusedasabasisfortickspeciesidentification.⑵Onesetofspecificprimers,designedaccordingtoompAgenespecificforSpottedFeverGroupRickettsia(SFGR),wereusedtoamplifyompAgenefromDNAsamplesextractedfromtickspoolinQinghaiProvince,andthepositivesamplesweresequencedandgeneticallyanalyzedbyestablishmentofphylogenetictree.Of454samples,14sampleswere positiveforSFGR,including9samplespositiveforR.sibiricaand5samplespositiveforR.heilongjiangii,andtheinfectionratesreachedto3.08%.PhylogeneticanalysisbasedonnucleotidesequenceshowedthatR.sibiricaQinghaistrainHUNwererelatedandclusteredtogetherwithR.sibirica246strain(U43807)(99.49%)andR.sibiricaBJ-90strain(AF179365)(99.67%);R.heilongjiangiiQinghaistrainsGL-1wererelatedandclusteredtogetherwithR.heilongjiangiiSuifenstrainHLJ-054(AF179362)(99.18%)andR.heilongjiangiiHulinstrainHL-93(AF179364)(99.51%).⑶TwosetsofspecificnestPCRprimers,designedaccordingtotechnicaladviceofcontrolingandpreventiononhumangranulocyticanaplasmosis,wereusedtoamplify16SrRNAgenefromDNAsamplesextractedfromtickspoolinQinghaiProvince,andthepositivesamplesweresequencedandgeneticallyanalyzedbyestablishmentofphylogenetictree.Of454samples,67sampleswerepositiveforA.phagocytophilumandthecarrierratereachedto14.8%.Nosignificantlydifferencewasobservedamongdifferentregionsandticksspecies,andfirstlydetectedA.phagocytophiluminfectionsinHaemaphysalisqinghaiensis.PhylogeneticanalysisbasedonnucleotidesequenceshowedthatA.phagocytophilumQinghaistrainHUNwererelatedandclusteredtogetherwithA.phagocytophilumJapanstrain(AY969010)(98.73%)andA.phagocytophilumChinaJilin(GQ412339)(99.75%).⑷DynamicamountofticksandtheinfectionratesofTheileriaparasitesindifferentmonthsinQinghaiProvincewerealsoanalyzed.Hyalommadetritum,DermacentornuttalliandHaemaphysalisqinghaiensiswereidentifiedinthepresentstudy,andtheinfectionrateswere48.2%,9.1%and42.9%,respectively,andHyalommadetritumandHaemaphysalisqinghaiensispredominatedinQinghaiprovince;617bloodsamplesweredetectedbyPCRwithuniversalprimersofpiroplasmsandTheileriaparasitesaswellasspecificprimersofTheilerialuwenshuni,TheileriauilenbergiandTheileriaovis,andphylogeneticanalysiswereconductedbaseon18SrRNAofpositivesamples;PCRresultsshowedtheinfectionratesofTheileriaparasiteswere64.8%,andtheinfectionratesofTheilerialuwenshuniandTheileriauilenbergiwere37.6%and27.2%,respectively,co-infectionofTheilerialuwenshuniandTheileriauilenbergiwere19.8%,noTheileriaoviswasdetectedinthepresentstudy.NosignificantlydifferenceswereobservedbetweenTheilerialuwenshuniandTheileriauilenbergi(p>0.05),andsingleinfectionrateofTheilerialuwenshuniorTheileriauilenbergiwerealsohigherthanco-infection(p<0.05).PhylogeneticanalysisindicatedTheilerialuwenshuniandTheileriauilenbergiinthepresentstudywereinthesameclusterwiththenorthwestareasstrains,andseparatedfromBeijingstrainsorsouthstrains,andthestrainsinthesameclusterweredistributedasthesamearea.Inaddition,thecorrelativitywasobservedbetweendynamicamountofticksandinfectionrateofTheileriaparasitesinthedifferent monthsinQinghaiProvince.Inthepresentstudy,Haemaphysalisqinghaiensis,Hyalommadetritum,DermacentornuttalliandDermacentorsilvarumwerethemajorspeciesinQinghaiprovince,andthosewerealsodescribedthattheBasiscapituli,Tooth,Analditch,Footpad,Haller’sorgan,Porsseareaetalutalstructureoffourspeciesticks.TheresultsonTickbornediseasesshowedthattheinfectionratesofSFGRandA.phagocytophiluminticks,andalsoindicatedphylogeneticofSFGRandA.phagocytophilum;inaddition,EpidemiologicalsurveyofovineTheileriaparasitesinfectioninQinghaiProvincedocumentedinfectionrates,phylogenetic,andthecorrelativitybetweendynamicamountofticksandinfectionrateofTheileriaparasitesindifferentmonths.TheseresultsindicatedusthatmajorticksspeciesandtheepidemiologyandphylogeneticofmajortickbornediseasesinQinghaiprovince,andprovidednewinformationonticksspeciesandtheepidemiologyofmajortickbornediseasesinChina,atthesametime,alsoprovidedthescientificdataforthepreventionandcontroloftickbornediseasesandpublichealthinQinghaiprovince.Keywords:Ticks,Tickbornediseases,Infectionrates,Phylogenetic 目录文献综述....................................................................................................................................1第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展......................................................................................11.1蜱类生物学..................................................................................................................11.1.1蜱的传统学分类方法........................................................................................21.1.2蜱的现代系统分类............................................................................................31.1.3系统分类学研究方法........................................................................................41.1.4我国蜱类系统分类学研究................................................................................61.2蜱的化学和免疫学防治研究进展............................................................................101.2.1蜱的危害..........................................................................................................101.2.2蜱的化学防治..................................................................................................121.2.3蜱的免疫学防治..............................................................................................14第二章蜱传疫病研究进展....................................................................................................202.1蜱传病毒病................................................................................................................202.1.1蜱传脑炎..........................................................................................................202.1.2克里米亚-刚果出血热.....................................................................................212.2蜱传细菌病................................................................................................................222.2.1人类单核细胞埃立克体病(HME)..................................................................222.2.2人类粒细胞性无形体病..................................................................................222.2.3地中海斑疹热(MSF).......................................................................................232.2.4昆士兰热病（Q-fever）.................................................................................232.2.5北亚蜱传斑点热(NATBSF)............................................................................242.2.6莱姆疏螺旋体病(LB)......................................................................................242.3蜱传寄生虫病............................................................................................................252.4我国蜱传疫病研究进展............................................................................................27试验部分..................................................................................................................................30第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察........................................303.1材料与方法..............................................................................................................303.1.1材料..................................................................................................................303.1.2方法................................................................................................................313.1.3数据统计与分析..............................................................................................323.2结果...........................................................................................................................33 3.2.1草原革蜱（Dermacentornuttalli）的形态学与超微结构观察....................333.2.2青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）的形态学和超微结构观察......363.2.3残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）的形态学及超微结构观察..................383.2.4森林革蜱（Dermacentorsilvarum）的形态学及超微结构观察...............393.2.5青海省蜱的种类鉴定及分布情况..................................................................423.3讨论............................................................................................................................433.3.1青海省蜱的分布与流行学调查......................................................................433.3.2蜱形态学结构特征与鉴定分类......................................................................433.4小结............................................................................................................................44第四章蜱传斑点热群立克次体青海分离株鉴定与遗传进化分析....................................454.1材料与方法................................................................................................................454.1.1材料..................................................................................................................454.1.2方法..................................................................................................................464.2结果............................................................................................................................504.2.1蜱标本鉴定......................................................................................................504.2.2SFGRPCR检测及序列测定BLAST..............................................................514.2.3SFGR青海分离株遗传进化分析....................................................................524.3讨论............................................................................................................................534.4小结............................................................................................................................55第五章青海省媒介蜱感染及传播无形体分子流行病学研究............................................565.1材料与方法................................................................................................................565.1.1材料..................................................................................................................565.1.2方法..................................................................................................................575.2结果............................................................................................................................605.2.1蜱类标本鉴定..................................................................................................605.2.2青海省不同蜱体内嗜吞噬细胞无形体病原携带率......................................615.2.3青海省HGA序列比对及遗传进化分析........................................................625.3讨论............................................................................................................................635.4小结............................................................................................................................64第六章青海省蜱类传播羊泰勒虫病分子流行病学研究..................................................666.1材料与方法................................................................................................................676.1.1材料..................................................................................................................676.1.2方法...................................................................................................................676.2结果............................................................................................................................716.2.1青海省蜱类形态学鉴定..................................................................................71 6.2.2青海省羊泰勒虫感染率..................................................................................716.2.3青海省羊泰勒虫18SrRNA序列分析及遗传进化树构建...........................726.3讨论............................................................................................................................746.4小结............................................................................................................................75结论......................................................................................................................................76参考文献..................................................................................................................................77主要缩略词和中英文对照表（AbbreviationIndex）...........................................................93致谢......................................................................................................................................94作者简介..................................................................................................................................95 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展1文献综述第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展1.1蜱类生物学蜱是一种非永久性体外寄生虫,广泛寄生在牛、羊、马等家畜及其他陆生脊椎动物上（除鱼类），它们不仅吸血造成宿主损伤，其中有一些品种是很多病原体（如细菌、病毒、螺旋体、立克次体、原虫等）的传播媒介或储存宿主。依据Barker等(Weaveretal.1994)的分类系统，蜱总科Ixodidea属于节肢动物门Arthropoda，蛛形纲Arachnida，蜱螨亚纲Acari，寄螨总目Parasitiformes中的蜱目Ixodida，下分为硬蜱Ixodidae、软蜱Argasidae和纳蜱Nuttalliellidae三个科(Nava2009)。蜱的危害重大：（1）蜱有广泛宿主，繁殖能力极强，给畜牧业带来的损失极大(Jongejan2004)；（2）蜱吸血更为特殊，硬蜱属的雌蜱可吸附宿主4-14天，暴饮暴食后体重增加一百倍(Kaufman2007;2010)，为疾病的载体非常有效；（3）蜱携带多种病原体，本身也能排泄毒素，致使森林脑炎、斑点热、蜱瘫等临床疾病的发生(Jongejan2004;陈泽etal.2011)。被蜱叮咬后，可能特定情况下引发地方性人畜共患病--如出血热、森林脑炎、莱姆病巴贝斯虫病、Q热、蜱媒斑疹热、蜱瘫等。据统计，世界上约10%的蜱携带病原体。此外，存在于蜱体内的抗菌肽等活性功用物质有重要的医学研究及应用研究(邓国藩etal.1991;潘卫庆2007)。研究蜱类演变或生态学过程必需需要一个系统学框架和确切辨别有机体的能力，一个系统学框架和确切辨别有机体的能力也是寄生虫和寄生疾病的诊断和管理的强有力办法。有效而准确的方法研究不单为蜱类分类系统的建立和体系的发生关系奠定基础，同时为认识蜱类传染疾病途径和防控提供办法。近年来，生物学研究手段的进步使蜱的系统研究也取得了很多新的进展。但因为蜱的种类繁多，许多工作还有待完善。这些问题限制了蜱传疾病及蜱类防控等领域的深入研究。此外，分子生物学信息与传统研究方法相结合来分析蜱的系统进化时，如果能准确反应出蜱类不同群体间的系统进化关系，需要对先前的分类系统进行很大改变。因此，许多学者提出了许多观点，范围大，部分观点虽然同意，但在许多方面，学者们仍然保持他们的意见。然而与之相比，国内蜱类的研究很少，前期研究主要在蜱类物种识别及形态鉴定方面，其系统进化方面的研究相对很少。本文着重从蜱的传统系统分类、现代系统分类、系统分类方法、我国蜱类系统分类研究及存在的问题等进行综述。 2青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究1.1.1蜱的传统学分类方法根据蜱的形态学和生态学特征的类似或差别水平来进行蜱的传统学分类。蜱的传统学分类影响力最大的是以美国作为代表的西方思想学派和以苏联作为代表的东欧学派。西方思想学派和东欧学派都认可软蜱科、硬蜱科和纳蜱科的划分，但是属、种的划分存在争议。西方思想学派和东欧学派对硬蜱科的划分几近相同：前沟型Prostriata只包含硬蜱亚科Ixodinae硬蜱属Ixodes，其它硬蜱都为后沟型Metastriata--扇头蜱亚科Rhipicephalinae、璃眼蜱亚科Hyalomminae、血蜱亚科Haemaphysalinae和花蜱亚科Amblyomminae四种组成，以假设的从“衍生”到“原始”的次序列表（图1-1）。软蜱科的分类一向分歧大，俄国学者将软蜱科分成锐缘蜱亚科Argasinae和钝缘蜱亚科Ornithodorinae两个亚科。锐缘蜱Argas构成锐缘蜱亚科Argasinae；钝缘蜱亚科Ornithodorinae包括残喙蜱族Otobiini和钝缘蜱族Ornithodorini两个族。残喙蜱族Otobiini包含残喙蜱属Otobius和鼻泡蜱属Alveonasus两个属，钝缘蜱族Ornithodorini包含钝缘蜱属Ornithodoros和匙喙蜱属Antricola两个属。美国学者认为，两个亚科的划分有道理，却不认同残喙蜱族和钝缘蜱族两个族的划分。美国将Ogadenus亚属划分到Argasinae中，俄国则将其划分为Ornithodorinae、Otobiini、Alveonasus。除此之外，美国学者补充了单型属伪盾蜱属Nothoaspis的划分。图1-1蜱类进化假说Fig.1-1:Thephylogenetichypothesisoftick 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展31.1.2蜱的现代系统分类在90年初的分子生物学技术在蜱的分类领域的应用，改变了蜱的分类系统。软蜱中仍划分为两个亚科，但各亚科包括的属及种发生变化。Barker和Murrell(Barkeretal.2004)基于全证据分析对蜱类系统划分提出了新的假说(图1-2)。然而，因为软蜱科的分类缺少足够的分子生物学依椐，此分类体系还没有获得普遍认可，很多人仍是支持Hoogstraal(Hoogstraaletal.1985)软蜱的分类。在蜱类分类应用中分子生物学特性委实解决了许多形态学特征没办法解决的问题，如果分子生物学特性和形态学特征综合分析，将有助于更自然和更客观的系统分类体系的建立。图1-2Barker和Murrell蜱类系统进化假说Fig.1-2Thephylogenetichypothesisoftick二十世纪末以来，分子生物学技术已获得在蜱的分类和系统学研究领域的广泛应用，它使蜱的分类体系的不断完善，分类系统更为合理，自然。以Barker和Murrell2004(年的分类体系为基础提出了新分类体系BarkerSC2004)。(1)蜱亚目上升，同时寄螨目上升为寄螨总目(BarkerSC2004;HorakIG2002);(2)软蜱科的改变主要是属和亚属的改变;(3)硬蜱科亚科、属、主要表现在物种水平的变化：增加了一个新的亚科；须角蜱属和花蜱属构成花蜱亚科，Klompen等发现大多数盲花蜱应该归属于花蜱属(杨晓军2008)，盲花蜱属应该取消；扇头蜱亚科的改变新分类系统中，扇头蜱亚科包含巨足蜱 4青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究属、璃革蜱属、眼蜱属、扇革蜱属、扇头蜱属、斑蜱属(KlompenJSH2002)。1.1.3系统分类学研究方法1.1.3.1传统分类方法⑴形态学特征。大部分情况下光学显微镜鉴定蜱，依据蜱的形态学、表型不同建立蜱的分类系统。依据蜱的外部形态特征分类，特征有：基突和背突的长短、有无，假头基的形状，孔区的大小、形状和间距，耳状突的长短、有无，须肢形状，颈沟形状，口下板齿式，盾板形状，足基节形状，生殖孔位置，爪垫长短，气门板的形状等。鉴定蜱也有赖于电子显微镜下一些细微特征的帮助，如肛瓣体毛序、雄性的腹部骨骼、不同龄期幼虫蜱及若蜱差异、哈氏器感觉毛等，提高了电子显微镜形态学分类的鉴定水平。⑵生物学特征。大多数硬蜱一生中经历3个宿主。有些种类的蜱如果从幼蜱到若蜱蜕皮一直离不开宿主，称之为两宿主蜱类，如璃眼蜱属、扇头蜱属的少许种类。个别情况下，蜱一生都在1个宿主上--单宿主类，如花蜱、牛蜱属、革蜱。这些蜱可根据不同生活史来分类。有些蜱的生活史中宿主是可变的，作为分类依据就不行了，但此信息对蜱的分类和系统发育也有参考的价值。蜱普遍存在滞育现象，但因种不同的表现形式不同(Crosbieetal.1998;Norrisetal.1996;姜在阶1987)。很多方面因素可以造成蜱的生物学特征的改变，当前研究大部分是实验室观测蜱的生物学特征。孙明等在温度相对湿度适宜情况下，使小亚璃眼蜱吸食新西兰白兔、绵羊为血液，来观测小亚璃眼蜱生活各个时期生物学特性，形态，生活史，宿主关系，滞育现象和生活史中的转变现象；边尧等在温度26～32℃和相对湿度76％～82％条件下，实验室培养箱中对宿主分别为家兔、犬和牛的嗜群血蜱的生活状况观察和分析得出，雌蜱产卵量跟随饱血后雌蜱体重上升而上升，下降而下降，相比较之下嗜群血蜱更喜欢吸食兔的血液；我国残缘璃眼蜱的分布最广泛，研究最深入，如残缘璃眼蜱的室内传播繁殖、各种饲喂方法、产卵量的分布特点以及各个时期盾窝超微结构变化等；张菊仙等实验室饲养比较微小牛蜱、猛突血蜱和镰形扇头蜱的产卵和孵化特点，表明3种硬蜱在产卵期天数上无明显差异，但在孵化期差异极显著。蜱类生物学研究中的形态学特性相对来说形象、直观，研究系统复杂主要表现在以下两个方面：①描述物种在无法应用生物学种情况下，即便可以辨别物种，使用通常技术同样无法准确确鉴定物种（如残缘璃眼蜱、具角硬蜱、全环硬蜱）②科、属、种等阶元的进化关系问题一些形态学差别不够显著时，利用比较形态学方法对寄生虫的分类鉴定局限性较大。因此，少许生物学因素有必要进行补充--如生长特性、寄主范围等。分子生物学技术近年来的运用，对蜱鉴定和总体研究起至关重要的作用。⑶生物地理学。蜱的分布地理特异性明显。蜱类包括硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)3大类，而纳蜱科只分布于非洲大陆。硬蜱科和软蜱科（锐缘蜱属、钝缘蜱属、败蜱属）在我国有分布，华南区的硬蜱区系最为丰富，并 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展5((有其地区特点S1994;S1999)。陈泽等DobsonandBarker1999)通过实地考察和馆藏标本及文献进行蜱类的地理分布研究，用聚类分析的方法对中国蜱类的分布和地理区系进行分析，表明中国蜱类呈点状和带状分布，云南、甘肃、新疆、台湾、西藏、福建等省（自治区）种类最多（30～46种），而河南、江西省种类最少（4～6种）。⑷遗传学特征。最初人们用地衣红压片制备蜱的生殖器官法常规核型。Goroshchenko最早用地衣红压片研究翘缘锐缘蜱(Argasreflexus)的核型与分类的关系(LGY1962)，随后国外学者研究了大量的蜱类染色体(JR1966;LGY1962)。我国于20世纪80年代最早研究蜱类的染色体和核型(周洪福，蓝明扬，孟阳春1985;1995)。遗传杂交实验为鉴定蜱种的重要方法，但该方法耗费时间、步骤繁多、一般不用。1.1.3.2现代蜱类分类方法⑴蛋白质电泳。在蜱类中，蛋白质电泳技术可以较详尽地说明各种群体之间的遗传相似度(Klompenetal.1996)、蜱的种类鉴别及不同的生活史阶段、区分形态近似的近缘种(BARHCN1999)，所以被普遍用于各类寄生虫种内和种间变异深入研究。刘志刚(刘志刚，宋杰益，熊国强1993)对3种硬蜱蛋白质对比研究表明，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地区别划分和判定蜱的种、属。Jackson等检测分布在SoutheasternAustralia的硬蜱Ixodesholocyclus和I．cornuatus异型酶，发现异型酶能有效地区分表型特性极为近似的这2个种。⑵DNA/RNA序列测定。在Sanger等的酶法及Maxam和Gilbert的化学降解法的基础上发展为现在普遍应用的序列测定技术。这些年来，依据各种蜱的线粒体12S核糖体DNA，16S核糖体DNA和核18S序列数据分析蜱类体系发生学和种间关系。Hlinka等分析核糖体RNA中ITS2区域二级结构的共同点和差异之处，研究了硬蜱系统的演变方面(Hlinkaetal.2002)。⑶RFLP限制性酶切技术。RFLP是1985年左右兴起的一种DNA多态分析技术，主要用来研究种群间变异、种群内变异、基因流水平、种群有效大小、亲缘关系、杂交区带和相似度。线粒体DNARFLP分析表明单种群内的变化是罕见的，但大多数物种存在种内变异，因此可用于研究种群系统发育。目前与蜱类系统发育相关的研究不多(Navajasetal.2000)。⑷RAPDPCR技术。Williams基于PCR创造了随机扩增多态性DNA技术，因为它简单、快速、便捷、灵敏和材料要求低、用更少的材料、经济，很快得到广泛应用，主要用于进行物种鉴定、构建遗传图谱、物种亲缘关系和系统分类的研究。但是RAPD为显性标记，判定杂合子不是十分有效，这就造成可能过高估计不同样品间的亲缘关系。另外RAPD受反应条件的影响较大，不同试验条件下的结果无法统一比较，造成应用RAPD技术分歧很大(徐宏发2001)。⑸全证据方法全证据方法(totalevidencemethods)是一种系统学分析的方法，它是结合了DNA分子序列和形态学特征数据的分析方式。这种方法使蜱类系统学的研究 6青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究突飞猛进。Klompen等考察了硬蜱间的系统关系，运用的正是形态性状的125个指标及28S线粒体，18S线粒体，16S线粒体的核糖体DNA序列数据的3个分子数据集相结合的全证据方法。结果显示，此种分析不赞同前沟型Prostriata，后沟型Metastriata的谱系倒十分赞同。大多数扇头蜱属的分类和先前依据形态学的分类是一致的(BeatiandKeirans2001)。Horak等把之前的蜱类分类系统和全证据分析结果调整统一蜱类分类系统，结果阐明蜱类共3科、17属、867种。其中，软蜱科4个属183个种，硬蜱科12个属683个种，纳蜱科只有纳蜱属(Nuttalliella)代表(Barkereral.2004)。⑹单链构象多态性技术单链构象多态性(SSCP)技术是依据已经DNA序列核苷酸合成双引物，扩增出目的DNA序列，扩增产物经变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测的分子标记方法。Mixson等用SSCP技术分析种群，肩突硬蜱研究结果表明，遗传变异的水平南方显著高于北方。由此表明SSCP确实是一种有效的分子标记技术，可用于蜱的种群遗传和进化生物类研究。⑺微卫星DNA指纹图谱技术利用微卫星位点的大小的变化可以提供物种鉴定的分子标记。微卫星位点的大小变化，原因是大量重复拷贝的差异和复制期间DNA聚合酶滑移所引起，一般利用引物进行PCR扩增其重复序列，然后梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测测序。微卫星DNA指纹图谱技术已被用于检测蜱类及其他寄生虫的遗传变异。但国内还没有与蜱类研究相关的报道。1.1.4我国蜱类系统分类学研究在中国这一领域的研究是有限的，蜱的物种识别及形态学鉴定，早期的研究主要局限于此，非常有限的系统发育方面的研究。我们国家研究蜱类的历史很长，最先东汉（公元121年）许慎在《说文解字》中描述了蜱。然而我国蜱类研究曾停滞不前，与发达国家相差很多。目前，我国较有影响力的蜱类纪录有3个：①1978年，邓国藩记载的《中国经济昆虫志：第十五册》，其中。记载蜱种类70余种，由于时间比较早，限于当时的水平，蜱品种不全；②1991年，邓国藩和姜在阶记载的《中国经济昆虫志：第三十九册》，其中硬蜱科中20种硬蜱属，13种革蜱属，43种血蜱属，4种花蜱属，9种璃眼蜱属，4种盲花蜱属，5种扇头蜱属，2种异扇蜱属、1种牛蜱属，共计9属、101种和亚种；③1997年于心等记载的《新疆蜱类志》，描述了新疆42种蜱。硬蜱科的硬蜱属中新增添了伯氏硬蜱(I.berlesei)、雷氏硬蜱(I.redikorzevi)、哈萨克硬蜱(I．kazakstani)，异扇蜱属中新增添了洛氏异扇蜱(A.lotozky)，扇头蜱属中新增添了俄扇头蜱(R.rossicus)、舒氏扇头蜱(R．schulzei)；软蜱科中包含锐缘蜱属(3种)、钝缘蜱属(3种)。然而之后的几十年里，蜱类研究的工作进展缓慢，大量标本毁坏甚至遗失。我国自1990以来一直采用如下分类系统。即：将蜱划分到蜱螨亚纲寄螨目蜱亚目蜱总科，蜱总科分为软蜱科 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展7Argasidae、硬蜱科Ixodidae和纳蜱科Nuttalliellidae。软蜱科由锐缘蜱亚科Argasinae和钝缘蜱亚科Ornithodorinae两部分组成，锐缘蜱亚科包含锐缘蜱属，钝缘蜱亚科包含残喙蜱属、钝缘蜱属、匙喙蜱属和伪盾蜱属；纳蜱科只包含纳蜱亚科中的纳蜱属；硬蜱科包含硬蜱亚科、花蜱亚科和扇头蜱亚科3种，其中硬蜱亚科包括硬蜱属，花蜱亚科包括花蜱属、盲花蜱属、革蜱属r和血蜱属4种，扇头蜱亚科包括璃眼蜱属、异扇蜱属、暗眼蜱属、牛蜱属、扇头蜱属、斑蜱属、诺蜱属、扇革蜱属及巨足蜱属)。目前，杨晓军等、Chen等已对我国蜱类重新进行了厘定，共计2科10属117种。清楚地表明，我国关于蜱类系统学研究是非常有限的，我国的系统学研究蜱类还处在初始阶段，这方面中国和其他国家之间存在巨大的差距。近年来蜱类分类系统变动很大。根据新的分类系统，我国已考察发现的蜱类、2科、10属、119种(裘明华1998)。虽然我国的历史悠久，文化底蕴深厚，1991年后蜱类发展缓慢，在中国的分类系统使用邓国藩（邓国藩etal.1978;1989），邓国藩和姜在阶(邓国藩姜在阶1991)的分类系统后，1991年后没有变化。目前我国蜱类的种类和数量不能准确确定，也无法体现最新的分类系统变更(杨晓军2007;周金林2004)。而国际上很多国家对这一领域的研究却突飞猛进，因此在我国急需我们要及时更正错误，首先对已记载的种类重新整理和厘定；其次，弄明白这些蜱类的生物特性、寄主类型和分布特性，为蜱类的系统研究做好准备；最后运用多证据方法分析我国的蜱类系统发育情况，提高我国蜱类系统研究水平。1.1.5存在的问题及展望自应用分子生物学技术系统研究蜱的分类学以来，形态学特性、生态学特性无法解决的蜱类问题一定程度上得到缓解，使人们对蜱类有了新的了解和认识。但即使是这样，还是有很多问题尚未得到解决。1.1.5.1蜱类姐妹群蜱类的姐妹群分歧点在于，一种观点坚持巨螨类是蜱类的姐妹群；另一种观点坚持中气门类是蜱类的姐妹群。目前的证据虽然都支持巨螨类是蜱类的姐妹群，但证据不足够充分，还需更广泛的分析研究和更充分的证据。首先确定蜱类的姐妹群，其次确定蜱类体系进化树的最底层，最终发现蜱的逐渐进化过程和规律。1.1.5.2蜱类3个科间的系统发生关系然而，到现在仍然无法解决蜱总科下3个科（软蜱科、硬蜱科和纳蜱科）之间的系统发生关系，原因是自发现纳蜱，无法采集到纳蜱标本，只有一只雌蜱标本，表现型特性明显不足，由此造成的纳蜱分子学数据始终没有办法获得，解决蜱类3个科间的系统发生关系可谓是困难重重(KlompenJSH2000)。 8青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究1.1.5.3硬蜱亚科单源性硬蜱属是否为单系类群存在分歧，通常将其看作单系类群，但有事实证明澳大利亚硬蜱和其它硬蜱两部分共同构成硬蜱属。澳大利亚硬蜱由塔斯曼硬蜱I.tasmani、尤利硬蜱I.uriae、全环硬蜱I.holocyclus、鸭嘴兽硬蜱I.ornithorhynchi和安特奇硬蜱I.antechini五部分构成，其余硬蜱构成另一谱系。硬蜱属中线粒体控制区的研究证实了硬蜱属的非单源性。一部分硬蜱亚属的分类尚未最终确定，2003年Xu等发现硬蜱亚属的蓖子硬蜱有11种，并非为一个单一的类群。Guglielmone等(Guglielmoneetal.2006)依据斯氏硬碑I.stilesi16S核糖体DNA序列和表型特征发现，与Cifford的分类有不同，此结果表明斯氏硬碑I.stilesi不属于硬蜱亚属。所以，硬蜱亚属的分类地位还需深入讨论分析，尽可能深入分析硬蜱属的全部种类，彻底弄清楚硬蜱属内的系统进化问题。1.1.5.4花蜱亚科和凹沟蜱亚科得到众学者认可的观点是撤销盲花蜱属，与此同时明确凹沟蜱亚科和花蜱亚科的分类地位。然而在Miller等(Milleretal.2007)分析楔齿蜥花蜱A.sphenodonti的18S核糖体DNA时发觉，楔齿蜥花蜱(原盲花蜱属的原始种)在系统进化树中的分类进化有点儿奇怪，它既不能与花蜱亚科一起分类，也无法像凹沟蜱亚科那样为单系类群。Miller等分析楔齿蜥花婢应该划分为一个新的亚属，此外，楔齿蜥花蜱和其它种（如红鹿花蜱A.elaphense）、其他亚属之间关系也不明确，还需继续讨论分析。花蜱属各个类群间纵横交错的关系，使其下属的亚属在分类上有很多分歧。SantoDias(SantoDiasetal.1993)基于雄蜱的基节建立了Anastosiella亚属。Camicas等(Camicasetal.1998)对Anastosiella进行了修改订正，有斑花蜱复组（themaculatumgroup）由有斑花蜱、纽曼花蜱、微跗花蜱、虎斑花蜱和特立斯特花蜱五部分组成；卵圆花蜱复组(theovalegroup)由宽环花蜱A.aureolatum和卵圆花蜱A.ovale两部分组成。但是Estrada-Pena等(Estrada-Penaetal.2005)对这种划分持反对意见，原因是16S核糖体DNA和幼蜱的表型特性的分析结果不支持上述划分。他们认为Anastosiella亚属不包含纽曼花蜱、微跗花蜱及卵圆花蜱复组中的两个种，仅包括有斑花蜱、虎斑花蜱和特立斯特花蜱。所以花蜱属中亚属的分类不明确，还需继续讨论分析，寻找更多证据来支持观点。今后可能会将楔齿蜥花蜱A.sphenodonti创建为一个新的属。1.1.5.5血蜱亚科和璃眼蜱亚科血蜱属的划分也是有分歧的。Hoogstaal和Aeschlimann(Hoogstaaletal.1982)基于血蜱亚科、璃眼蜱亚科和扇头蜱亚科的腿、须肢上都有刺，判断它们亲缘关系比较近。但是分析16S核糖体DNA序列时却看到血蜱和花蜱在进化树的同一进化分枝上，与其它硬蜱的关系也不是很清楚。Hoogstaal和Aeschlimann(Hoogstaaletal.1982)认为璃眼蜱亚科是最古老的，而且应该位于扇头蜱亚科的最底部，源于璃眼蜱的延长口下板和须肢为最原始性状。但Black和Piesman（Blacketal.1994）分析表明璃眼蜱与扇头蜱亚科在进化树的同一分枝上。Black等(Blacketal.1997)依据18S核糖体DNA，Klompen等 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展9(Klompenetal.1997)依据表型和发育等归纳分析表明璃眼蜱属于扇头蜱亚科。当然，Hoogstaal和Aeschlimann(Hoogstaaletal.1982)的观点一定程度上有助于璃眼蜱的分类地位明确。但是，现在来看，璃眼蜱亚科和血蜱亚科划定为后沟型蜱类最古老类群的事实依据明显不够充分，反而璃眼蜱和扇头蜱亚科却可能有更相似的渊源。陈雪洁等室内环境下记录了钝刺血蜱各个发育时期的体重、生命周期、吸血以及雌蜱的产卵等特性的变化情况，依据钝刺血蜱的16S核糖体DNA序列建立发育进化树分析它的染色体状况。这部分研究为日后进一步分析钝刺血蜱做了大量准备工作。并且陈雪洁等支持孤雌生殖残缘璃眼蜱的物种划分，发现孤雌生殖的进化过程不会跟随其基因组总量的细微变化而发生变化，自然选择、基因突变和基因漂移不会使孤雌生殖残缘璃眼蜱逐渐改变为一个相对独立的物种。1.1.5.6扇头蜱亚科普遍学者认同将以前的牛蜱属划分到扇头蜱属下，成为扇头蜱属的一个亚属。虽然许多学者建议璃眼蜱应包含在扇头蜱亚科之内，但很是有很多学者反对。学者们对美洲微小扇头蜱、非洲微小扇头蜱、亚洲微小扇头蜱和澳洲的微小扇头蜱的12S核糖体DNA分析后，表明美洲的标本与非洲的标本在进化树的同一进化枝上(支持率99%)，而澳洲的标本则与美洲、非洲标本不同，位于进化树的另一进化枝上(支持率78%)。不可思议的是，来自尼泊尔的微小扇头蜱与埃及的环形扇头蜱R.annulatus尽管支持率较低(51%)，但渊源相似，可能关系较近，而且，Spickett和Malan(Spickettetal.1978)发现澳洲与非洲的微小扇头蜱不能成功杂交，同时Labruna等(Labrunaetal.2007)发现美洲和非洲的微小扇头蜱能成功杂交，但澳洲和非洲及澳洲和美洲的微小扇头蜱均不能成功杂交。16S核糖体DNA序列分析中验证了这一点。因此，微小扇头蜱可能是由非洲传到美洲，美洲-非洲种群的微小扇头蜱可能与澳洲微小扇头蜱不是同一种。可见微小扇头蜱的起源与分化问题还需进一步验证。Szabo等(Szaboetal.2005)通过研究巴西和阿根廷两个地区血红扇头蜱的生物学特性、线粒体12S核糖体DNA，发现两者差异很大，杂交实验发现巴西和阿根廷两个地区的杂交后代无生殖力。而分析12S核糖体DNA的结果显示阿根廷的血红扇头蜱与欧洲类群基因亲缘关系更近，同时巴西的血红扇头蜱与非洲类群具有更近的基因亲缘关系，因此阿根廷的血红扇头蜱很可能起源于欧洲，而巴西的血红扇头蜱很可能起源于非洲。以上可见扇头蜱属各类群间分类地位及系统进化关系比较复杂，也充分体现了这个属还需要整体上深入研究。1.1.5.7中国的蜱类系统分类学需要深入研究尽管中国历史悠久，文化底蕴深厚，然而蜱类在后期却发展很慢，原因如下：①历史原因中国曾经历的历史浩劫严重破坏了社会和经济，也严重阻碍了自然科学的发展；②社会偏见现今人们更注重的是直接经济利润，而做分类则需要很大的耐心，见效慢，做传统分类学则需要更长时间积累经验，所以这一领域甚少能引起注意；③蜱类分类 10青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究学研究交接的断层这是中国蜱类系统分类领域严重滞后的最重要原因。在邓曾国等学家后10年内，这项工作一直停滞不前，蜱的种类鉴定，描述，区系调查，分类系统和使用等方面非常困惑。而与国际相比，世界上许多国家蜱类的研究却迅速发展--许多蜱类的分类地位变化、种名订正、新种发现、旧种名遗弃或重新启用等。因此，在中国急需对这些错误及变更及时更正，同时更要利用中国的蜱类物种及分布的区系特点结合分子生物学特征进行系统研究，以弥补中国蜱类系统分类方面的空白，从而为以后有效防治蜱类寄生及蜱传病做好基础。实践证明，解决蜱类系统分类问题依赖任何单一的方法都是不行的。形态学特征描述和分子生物学相综合的系统全证据方法，再结合蜱类宿主特征、古生物学材料是蜱类体系发育难题解决的最有效途径。在中国的蜱类系统学研究的方法主要集中在传统的形态描述和初步阶段的物种鉴定，所以今后还应从以下三个方面继续深入研究：①通过广泛的本底调查，对已记叙的种类从头整顿归类，运用DNA分子的方法应用相关的有混淆种物种，为蜱类系统分类奠定基础；②运用更多的物种特异性DNA序列的扩增，类型和范围和宿主的生物学特性的表型特征的分布特点，深入了解蜱，结合形态学的不同群体之间的关系对整个系统发育分析，为了使系统成为更加客观的自然分类系统，从而为其它领域的深入发展的夯实基础；③最后中国的蜱类用全证据的方法分析系统发育，提高中国蜱类研究水平。伴随着更新方法和新技术的普及应用，研究蜱类系统分类学必将获得更大的发展。1.2蜱的化学和免疫学防治研究进展蜱是一种常见的体表暂时性寄生虫，全世界至今为止已发现蜱800余种，其中包括硬蜱科700多种，软蜱科150种，纳蜱科1种(龚海燕，周金林2005)。我国已记录的硬蜱科就有约100种，软蜱科10种。蜱通过吸食宿主的血获得营养并繁衍生息，在蜱的寄生过程中，会引起宿主消瘦、贫血等病状，从而影响畜禽等宿主的生产性能；蜱还是许多重要疾病的传播媒介，严重危害宿主健康，并造成巨大的经济损失。如何合理的防治蜱虫，也日益受到人们的重视。目前常用的方法是化学试剂法，但是由于药物残留、抗药性等原因，效果不是很理想。随着生物技术的不断发展，通过免疫学的方法来控制蜱害，已广泛被国内外学者、专家所认同。1.2.1蜱的危害蜱寄生过程，首先是通过口器插入宿主皮肤从而固定自己的身体，并叮刺吸食宿主的血液，在吸血的过程中蜱会向宿主体内分泌含有多种物质的唾液，不仅严重影响宿主的健康，同时也是血热、巴贝斯虫病和泰勒虫病等重要疾病的传播媒介(郝雪峰2008)。其危害主要包括以下几方面。1.2.1.1直接危害 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展11蜱的幼虫、若虫、成虫均能吸血寄生，其宿主包括哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类甚至是人。主要是通过口器侵入动物或人的颈部、腋窝、大腿内侧等较薄皮肤且不易被骚动的部位，吸食血液同时造成局部充血、水肿和急性炎症反应，并能引起丘疹、水疱等皮肤性疾病甚至是继发性感染，导致动物表现为的消瘦、贫血、麻痹等症状。其中硬蜱中唾液中含有神经毒素，可使上行性肌肉麻痹，引起宿主呼吸衰竭，这中现象被称为蜱瘫痪。人被叮咬后会出现局部红斑、水肿，如若被强毒性蜱虫叮咬后，还会出现坏死、发热、头晕、恶心等全身症状。据统计显示，一只寄生在牛身上且处于发育过程中的雌蜱，从宿主体内每吸取1.5mL血液，将直接导致其宿主的体重减少约250mg。研究证明，每只亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)雌蜱要吸食大约8.9mL血液，因此多个蜱同时寄生时，将会严重影响该宿主动物的生产性能。另外由于蜱的叮咬破坏皮肤完整性，造成动物皮革质量下降，经济价值甚至可下降20%~30%(范雄林1998)。由于蜱在叮咬过程中，唾液腺能够分泌毒素并释放到宿主体内，造成宿主表现为厌食、体重下降和代谢障碍等症状，同时蜱叮刺宿主皮肤时会使宿主产生水肿、出血、胶原纤维溶解和中性粒细胞浸润的急性炎症等反应；某些种类的蜱（如残缘璃眼蜱等）唾液腺内还能够分泌一种神经毒素，通过抑制肌神经接头乙酰胆碱的释放，造成宿主运动性纤维传导障碍，从而引起急性上行性的肌萎缩性麻痹，甚至能够造成动物的死亡。日本和澳大利亚等地的学者研究表明，微小牛蜱（Boophilusmicroplus）能使被感染牛的外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞减少，当牛重度感染时体内的B淋巴细胞也会减少，达到抑制牛的免疫应答的效果，从而使蜱的存活及蜱传病的发生。1.2.1.2间接危害蜱叮咬宿主时除其唾液分泌毒素会影响宿主健康外，其本身还是一些人兽共患病的传播媒介和贮存宿主。蜱是人类和动物疾病的第二大重要的传播媒介或贮藏宿主，有研究显示，蜱可携带的森林脑炎、蜱传斑疹伤寒、出Q热、血热、野兔热等自然疫源性疾病和人兽共患病的病毒、原虫、回归螺旋体、细菌分别为83种、32种、17种和14种。(郭莉，毛光琼，吴宣2010;秦哲，冯立，秦德柱2013)。据统计，在热带的各种蜱及蜱传病的使得大约1亿头牛受到威胁，其中古巴曾由于携带牛双芽巴贝斯虫病、牛边缘无浆体病蜱的危害，造成100000头牛的死亡。2009年的一项调查显示，我国东北地区健康人血清中立克次体抗体检出率为15.67%(张志强，吴益民，冯立2011)。2010年夏天，河南商城县多人被蜱虫咬伤后，不治身亡，一度引起当地村民的恐慌，据报道该地区2009年曾出现死亡病例，但2010年尤其多，成为蜱虫“重灾区”。研究显示我国南方极有可能由于蜱虫携带新型布尼亚病毒，叮咬人后患 12青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究者相继出现的“无形体病”(曹树林2010)，后刘洋等研究发现蜱中新布尼亚病毒核酸检测阳性，继而推测蜱可能是新布尼亚病毒致发热伴血小板减少综合征的传播媒介或储存宿主(刘洋2012)。截至2011年6月份，截至2011年6月份已发现该病例280多人，其中死亡10余人(刘琪，王伟利，孟庆峰2013)。2012年4－7月赵焱等对新疆北部地区某边防部队官兵中人粒细胞无形体病、森林脑炎和莱姆病进行了血清流行病学调查结果显示，该边防部队官兵出现不同程度的感染，因此应引起高度重视，加强蜱传疾病的防工作治(赵焱，刘然，张桂林等2014)。1.2.1.3经济损失宿主在蜱的影响下，生产性能受到了不同程度的影响，并造成巨大的经济损失。据统计显示，蜱及蜱传病感染危害者全世界每年约有8亿头动物，其中尤为严重的南美、澳大利亚每年造成的经济损失因分别高达10亿美元和1亿美元(JDC1997)，据世界粮农组织（FAO）报道，全世界每年的直接经济损失高达70亿美元(董保豫2014)。蜱及蜱传播疾病在非洲是最严重的动物疾病，其中每年防治肯尼亚需要0.16亿美元，赞比亚0.1亿美元，津巴布韦0.093亿美元，尼日利亚0.16亿美元，坦桑尼亚0.26亿美元。从全球性经济观点来看，微小牛蜱属于危害最严重的蜱之一，每年给全世界牛的生产方面带来数千万美元的经济损失(Guerreroetal.2006)，在我国新疆由于蜱及蜱传病，共引起30000多头家畜死亡数约，包括羊、马、牛分别约为25500只、400匹、500头，导致2000万元以上的经济损失(赵海平2007)。综上可以发现，国内外发展畜牧业特别是草地畜牧业迫切需要解决的课题之一就是蜱的防治。1.2.2蜱的化学防治1.2.2.1蜱虫防治化学药品化学药物是防治是目前蜱虫防治中最常用、最有效的方法。砷是最早被使用的杀虫剂，在二战后逐渐被氯制品所取代，包括有机磷农药（敌百虫、敌敌畏等）、机氯农药（666）、有机氮农药（塔克蒂克、氨丙啉等）等，由于有机氯制剂等毒性过大、残效较长、产生抗药性，现已被禁用。后来市场上又逐渐出现了拟除虫菊酯类化合物和抗生素类药物。SpickettAM和FivazBH验证，杀虫剂能有效杀灭蜱和减少蜱传病的发生。⑴有机磷制剂1950年，有机磷制剂作为一种替代有机氯制剂的杀虫剂，第一次被应用。该类药物能够能造成蜱迅速瘫痪或死亡的机制是通过抑制乙酰胆碱酯酶，从而阻断神经传递。实验证实，虽然此类化合物相对有机氯制剂稳定性相对低，并存在遇水和紫外线易分解的问题，但是其毒性较小。虽然研究显示，虽然大部分野生动物健康被有机磷制剂的影响相对较小，但是长期大剂量使用也会导致哺乳动物体内胆碱酯酶的活性下降。同时发现，长期使用也会导致耐药性蜱株产生，如1963年研究者就发现了具有抗有机磷制剂的蜱株。⑵氨基甲酸酯类化合物和拟除虫菊酯类化合物 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展13目前使用的杀蜱剂主要包括氨基甲酸酯类化合物、拟除虫菊酯类化合物、抗生素类药物等，这些化学药物与有机磷制剂相比，各有优缺点。氨基甲酸酯类化合物的毒性较小，但其价格较昂贵，造成使用成本高的问题。相比较之下，目前多采用灭净菊酯类等的拟除虫菊酯类化合物。常用于浸泡避蜱的使用剂量为：20~40mg/m2剂量的10%α-氯氰菊酯；50mg/m2剂量的5%氟氯氰菊酯水乳剂；15~25mg/m2剂量的1%溴氰菊酯；200mg/m2剂量的10%醚菊酯水乳剂；15~20mg/m2剂量的2%~5%高效氯氟氰菊酯(ShanahanGJ1996)。另有研究显示，选择0.05％溴氰菊脂药液进行喷洒、药浴或洗刷，能杀死山羊身上的蜱类(尚以顺2014)。但是这类药物也存在抗药性问题，英国已经发现了对合成除虫菊酯类化合物具有光谱抗药性个体(AlgerNE1972)。1.2.2.2蜱虫的防治措施蜱虫作为疾病传播媒介与病原体具有相互的关联性社会、经济、科学技术，甚至政治方面等的许多问题都在蜱虫的控制过程中被涉及到。因此，关于控制蜱虫应考虑经济、社会、政治等多方面因素，遵循综合控制的原则。控制某一区域的蜱虫，首先对自然环境、自然宿主、气候条件、季节消长及危害程度等生态环境进行调查，并同时掌握该区域内蜱虫的种类；其次对宿主生活习性的调查，了解和掌握其的活动规律。这样才能够根据当地的实际情况，采取更有效、适宜的防治措施。在防治蜱虫的化学药品使用上，也应注意“因地制宜”的方式，对不同环境选择不同的药品。室内、封闭性畜舍，由于通风相对较差，且与宿主接触较多，应主要选用无刺激性气味、对人畜低毒、对环境无污染的杀虫制剂，如联苯菊酯和氯菊酯等。其中地板、踢脚线、低墙等可能残留蜱的幼虫和若虫的地方，可采用水乳剂或悬浮剂型的滞留杀虫剂喷洒。室外包括人和家畜经常活动的地方，可选用使用氯菊酯、氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯和氟虫腈等不同剂型均可以作为滞留杀虫剂而使用，喷洒方式可以采用背负式压缩喷雾器进行。值得注意的是，在喷洒药物时要全面，对有覆盖物的地方应提前掀开覆盖物，防止遗漏处蜱虫滋生。家畜身体表面，应选用容易穿透动物的毛发的悬浮剂和乳剂制剂，其适宜浓度是：氯菊酯5%、氟虫腈1%。人类蜱类驱避剂常见的有风油精、花露水和清凉油等，其主要作用是止痒。1.2.2.3蜱虫的抗药性由于没有专门针对蜱防治的化学杀虫剂，其防治的化学药物使用多是借鉴其他有害昆虫的防治方法。因此如果某一地区防治蜱虫过程中出现常规剂量防治效果下降的主要原因，是耐药性虫株由于化学药物反复使用或使用不当的产生。在澳大利亚1942年发现对许多有机氯农药有抗药性的蜱虫个体发现之前，滴滴涕是当时唯一使用的防治蜱虫的产品。随后有机磷的化合物被广泛应用，但是之后的不久就出现了对其具有抗药性的 14青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究蜱虫。溴氰菊酯是我国80年代引进的，之后相继发现了抗药性个体，统计发现蝇类对溴氰菊酯的最高抗药性可达到2000多倍(孟凤霞，刘起勇，鲁亮，等2008)。由于抗药性个体的产生，人们为达到防治效果，不得不加大药物使用量来，从而进一步加大了畜产品和环境中药物残留加重，使得抗药性个体逐渐增多，造成恶性循环。1.2.3蜱的免疫学防治从社会和科学关注的角度分析，依靠药物灭蜱存在着化学药品长期使用会影响肉食品安全、污染环境以及蜱抗药性的产生等许多限制性因素。因此，完全依赖化学药物预防不是长久之计，为了环境的可持续发展，应该寻求一种替代化学防治的方法，随着免疫学、生物技术和分子生物学等技术的发展与完善，免疫学防治应运而生，并逐渐被国内外学者、专家所认同。免疫学防治被认为是蜱防治的一种可持续的控制方法，也是目前各国专家学者比较提倡的一种方法。当微生物、寄生虫等“非己”侵入机体后，机体会自发的产生特异性和非特异性免疫应答，简单的来说就是在蜱吸血过程中，由于唾液腺分泌的病原注入宿主，会引起宿主自身的免疫反应，以此排除“非己”。比如赵忠芳等对兔非特异性免疫力抗残缘璃眼蜱幼虫感染能力的研究证明，若抑制非特异性免疫的发生，则会使宿主对蜱抵抗力相对较弱，增强非特异性免疫可以加强兔对蜱抵抗力。1994年，RidingGA等(RidingGVetal.1994)从半饱血微小牛蜱雌蜱中分离出的一种羧基二肽酶，即Bm91。1996年，WilladsenP等研究证实黄牛接种Bm86抗原后，可诱导机体产生免疫反应，Bm91能增强疫苗Bm86的作用(Willadsenetal.1996)。这些事实证明，宿主的非特异性免疫和特异性免疫均对蜱发挥了免疫作用。然而蜱虫之所以能够成功的寄生于宿主体表，并能够成功饱血，说明蜱的自身已经形成了一套逃避宿主的免疫防御系统。1.2.3.2抗凝血机制蜱虫之所以能够成功从宿主体内吸食足够的血液，关键是其自身能够分泌抗组织血液凝固的因子，1990年Waxman等(Waxmanetal.1990)就成功的从非洲钝缘蜱中分离了第一个蜱源抗凝血分子(tickanticoagulantpeptide，TAP)。随着TAP的发现，防病灭蜱进入了一个新的阶段。人们通过凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、排阻层析和高压液相色谱等技术的实验研究，不断的从蜱的唾液里鉴定、分离出新的抗凝分子，随着这些抗凝分子的发现，不断完善的了抑制宿主凝血反应的机制。Joubert等(Joubertetal.1995)从蜱的唾液腺纯化出了一种大小为17-kDa的非竞争抑制剂，该物质通过抑制Xa因子的活性，达到抑制血液的凝固的效果。程远国等(程远国，吴厚勇，李德昌1999)成功的将“longicornin”（种能特异性地抑制胶原诱导的血小板聚集反应的胶原特异性血小板聚集抑制因子）从残缘璃眼蜱唾液腺匀浆纯化出来。WeissBL等(WeissBLetal.2004)从雄蜱睾丸内发现了一种重组蛋白，该重组蛋白能够从中识别出一种重要的重组饱血因子(recAhEF)。 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展151.2.3.3蜱免疫消除机制赵忠芳等(赵忠芳1998)关于动物对残缘璃眼蜱幼虫感染的免疫应答的研究结果显示，Wistar大鼠被残缘璃眼蜱幼虫长时间感染，会引起免疫力反应抑制。由此说明，蜱感染虽然能够引起宿主的非特异免疫和特异免疫，但是蜱自身可以通过偏离、绕行或者抑制等手段来逃避宿主的免疫反应，达到自我保护的效果。1981年，蜱存在为达到自我保护的目的即使自身免受宿主抗体袭击，蜱可以通过唾液腺排出那些自身伴随吸血过程中吸入的宿主的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)分子(Ackermanetal.1981)。Wang等在十几年之后即1994年的研究中发现，蜱在吸血过程中同时吸入了宿主IgG，并免疫球蛋白结合(immunoglobulin-bindingproteins，IGBP)存在于蜱的血淋巴和唾液腺中，这一结果进一步阐明了蜱自身对宿主的存在着免疫消除机制(Wangetal.1994;1995)。2000年，Valenzuela(Valenzuelaetal.2000)等在肩突硬蜱cDNA表达文库中发现唾液腺抗补体蛋白(Isac)，表明蜱唾液腺与重组蛋白rIsac通过阻碍补体C3的沉积，使得补体旁路则被抑制，从而引起机体的免疫抑制。同年，BergmanDK等从安氏革蜱唾液腺中分离到了一种免疫抑制物，该免疫抑制蛋白的分子量为36ku（Da-p36），吸血到第6天分泌量达到最大，吸血到第8天的时候的饱血蜱Da-p36的分泌量显著降低，证明蜱可以通过将Da-p36分泌到唾液中达到免疫抑制(Bergmanetal.2000)。2001年，R.DeanGillespie等发现了一种通过与鼠和人的IL-2结合的蛋白的存在于肩突硬蜱的唾液，达到抑制IL-2与其相应的受体结合，进而影响宿主的抗蜱免疫反应，同时增加病原传播的机率(Gillespieetal.2001)。1.2.3.4抗蜱疫苗的功能性抗原微小牛蜱、残缘璃眼蜱、镰形扇头蜱、蓖子硬蜱、美洲花蜱等蜱作为研究获得功能性抗原基因的品种，被众多专家和学者所研究。⑴唾液腺研究显示，当蜱的口器进入宿主的体表叮咬宿主时，唾液腺会分泌一些含有生物活性物质的唾液，这些唾液不仅可以延迟宿主被叮咬部位血液凝固的时间，同时含有各种各样的酶和生物活性分子，使蜱能够逃避宿主的免疫反应，同时传播疾病。如研究证明，达明硬蜱（Ixodesdammini）的唾液内不仅有能够抑制凝血的腺苷三磷酸双磷酸酶，能够抑制肥大细胞以及增加叮咬处血流的前列腺素E2，还含有抑制补体旁路途径的具有生物活性的9kDa的分子蛋白(刘军，丁熙成，姜悦平1997)。因此可以表明，蜱唾液腺中含有大量酶和活性分子，所以不仅是抗蜱疫苗候选抗原的主要来源，同时对蜱传播疾病具有重要意义。在相关的研究中，人们发现了多种抗蜱疫苗候选抗原。Brown发现20KD抗原能诱导豚鼠有效的免疫原性存在于美洲花蜱唾液腺中。LeboulleG等发现一种可调节T淋巴细胞和巨噬细胞反应的新蛋白在蓖子硬蜱唾液腺中被表达(Leboulleetal.2002)。MejriN等发现蓖子硬蜱的唾液腺粗提物(SGE)中和唾液中含有能降低淋巴结T细胞和敏感的脾T细胞的应答反应的成分(MejriN2002)。OgdenNH的研究进一步证明 16青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究了蜱唾液腺内物质能够引起宿主的免疫反应，即应用自然感染蜱的免疫血清与蜱唾液腺粗提物反应(Ogdenetal.2002)。ValenzuelaJG等从蜱唾液腺中克隆到一种抗补体蛋白-Isac蛋白，并证明其调节宿主免疫反应中起着重要的作用(ValenzuelaJGetal.2002)。刘志刚等(刘志刚，宋杰益，彭卫东等1994)研究证明中华硬蜱的唾液腺蛋白中存在着能够有效的诱导宿主产生抗体的蛋白分子。赵金国等(赵金国，曾巧英，殷宏2008)小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达结果显示，得到的融合蛋白表达产物，能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别。⑵中肠蜱的消化系统由前肠、中肠和后肠组成，其中前肠是特殊的吸血唧筒；后肠是消化残余物和马氏管内含物的排出管；中肠能够消化和储存养分，因此是食物消化的主要场所，另外由于其上皮细胞也可以和宿主抗体发上免疫反应。其中功能性抗原Bm86，就来源于中肠的上皮细胞，McKennaRV等进一步研究显示，半饱血的微小牛蜱雌蜱中分离出BMA7抗原与Bm86联合应用时能增加后者的免疫原性(McKennaetal.1998)。JittapalapongS等研究蜱中肠粗提物免疫实验动物的结果显示，中肠粗提物免疫可不同程度影响蜱的生育能力、吸附率和吸血能力(Jittapalapongetal.2000)。Nakajima等将76ku的中肠蛋白与克隆的8个分泌抗体杂交瘤细胞反应，证明该蛋白具有良好的免疫原性(Nakajimaetal.2003)。杨银书等对家兔采用草原革蜱中肠组织抗原免疫，发现成虫率、产卵量和孵化率明显下降，结果表明草原革蜱中肠组织可有效的免疫蜱虫(杨银书，赵红斌，史智勇等2003)。⑶其他抗原各国专家学者除了唾液腺和中肠的抗原进行先关研究为，针对血淋巴、生殖腺和卵以及蜱的交叉免疫抗原方面也有不同程度的研究发现。研究显示，蜱内起到营养物质运输、防御免疫等功能的血淋巴内也存在抗原物质。如TellanRL等研究发现雌蜱血淋巴中的一个多肽能够被卵黄磷蛋白的免疫血清可识(Tellametal.2002)；一种分子质量为11ku的hebraein的新抗菌蛋白被LaiR等在希伯来花蜱雌蜱的血淋巴中分离到(Laietal.2004)。蜱虫的卵在蜱吸血过程中逐渐发育成熟，FriesenKJ等(FriesenKJ2004)从饱血的希伯来雌蜱的卵中分离得到；TellamRL等(Renardetal.2000)从微小牛蜱的卵中分离到卵黄磷蛋白的复合体，分子量为44ku-107ku，疫接种绵羊后可减少微小牛蜱的产卵量。接种针对特定病原体（如某种细菌或病毒）的疫苗，使机体产生针对另一病原体的免疫力即交叉免疫（crossimmunity），其中交叉免疫反应与机体某些组织抗原成分相同的外来抗原即共同抗原，刺激机体产生的共同抗体，发生交叉免疫反应，可引起免疫损伤。针对蜱虫的交叉免疫反应也有相关报道研究。赵忠芳等(赵忠芳，纪炳纯，索勋等2003)残缘璃眼蜱、越南血蜱和微小牛蜱的不同龄期虫体和幼虫的研究中发现，残缘璃眼蜱三个龄期虫体之间、残缘璃眼蜱与微小牛蜱幼虫和越南血蜱幼虫之间均存在共同抗 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展17原。赵洪斌等(赵洪斌，杨银书，史志勇等2004)应用草原革蜱中肠抗原免疫家兔，然后选取森林革蜱若虫和雌性成虫叮咬被免疫的家兔，结果表明草原革蜱中肠抗原诱导的免疫反应对森林革蜱存在交叉免疫现象。史志勇等(史志勇，杨银书，赵洪斌等2004)在草原革蜱（D.Nuttalli）中肠抗原诱导宿主产生的残缘璃眼蜱（H.longicornis）的交叉免疫的研究结果显示，产卵量、卵孵化率发生显著性变化，表明两种蜱可能存在共同抗原。1.2.3.5功能性抗原基因的筛选研究显示，蜱唾液腺是抗蜱疫苗候选抗原的主要来源，但是作为疫苗候选抗原的功能会由于其其易被宿主免疫系统直接识别这一现象而降低。继而，隐藏抗原成为抗蜱疫苗另一种选择。功能型抗原基因的筛选，就成为了疫苗的开发首要的问题。目前已经建立的全长cDNA文库包括变异革蜱、杂色花蜱、蓖子硬蜱、肩突硬蜱、残缘璃眼蜱、美洲花蜱、希伯来花蜱等，抗凝血因子、几丁质酶、铁蛋白、分化前的巨噬细胞移动因子(Jaworskietal.2001)等基因也被从中分离出来。我国建的cDNA文库包括镰形扇头蜱、青海血蜱、残缘璃眼蜱、森林革蜱半饱血雄蜱。高金亮(高金亮2004)等采用两种不同的免疫途径制备了羊抗青海血蟀唾液腺蛋白阳性血清和羊抗青海血蝉唾液蛋白阳性血清，发现有5个基因为青海血蟀所固有的新发现基因，并证明了表达产物具有良好的免疫原性和反应原性。李金杰(李金杰2008)其中为研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基础的是发现基因HqLA-7、HqLA-9的表达产物具有较好的反应原性的发现。龚海燕等(龚海燕，周金林，周勇志等2005)成功建立镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA文库后，研究验证了RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。刘建刚等成功地构建了残缘璃眼蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库，获得了有潜在生物学功能的EST(刘建刚2009)。AlmazanC等(Almazanetal.2003)建立了肩突硬蜱胚胎的cDNA表达文库，并鉴定出几种有免疫作用的蛋白。另外，有些研究者基于基因的保守性这一特性，筛选得到了不同蜱虫的功能基因。李文卉(李文卉2005)利用保守基因，对微小牛蜱饥饿幼蜱进行了Bm86基因的核苷酸序列筛选，获得的基因序列与微小牛蜱中的Bm86基因具有高度同源性，并且证明得到的基因分泌表达的外源蛋白具有免疫反应性。杨彩明等(杨彩明，杨光友，张晓谦等2008)根据基因的保守性首次从孤雌生殖残缘璃眼蜱四川株克隆到P27/30基因。1.2.3.6抗蜱功能性抗原的鉴定⑴免疫印迹免疫印迹是由凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。GillHS等用免疫印迹法证实超敏兔血清能与吸血96h的小亚璃眼蜱雌蜱唾液及唾液腺中蛋白发生反应(Gilletal.1986)。李金杰(李金杰2008)应用免疫印迹法发现青海血蜱其中两个基因的表达产物具有较好的免疫反应原性。Myung-JoYOU(Myung-JoYou2004)等通过免疫印迹试验表明残缘璃眼蜱的免疫原中有大量的分子与宿主的免疫机制有关。 18青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究⑵RNA干扰技术RNA干扰（RNAi）是指在进化过程中具有高度保守性的由双链RNA所诱发的同源mRNA高效特异性降解，进而引起特异地阻断体内特定基因表达或使其沉默，诱使细胞表现出特定基因表型缺失。在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA（antisenseRNA）的过程中发现了RNAi，但直到1998年才被Fire等证实其功能，并命名为RNAi。WeissBL等在美洲花蜱雌蜱的研究中，证明了RNAi可用来研究与宿主免疫逃避有关的重要蛋白功能的可行性。LogulloC等应用RNAi技术，表明孤星雌蜱唾液腺的一种唾液腺小泡相关蛋白cDNA同源体与受前列腺素刺激后唾液腺胞外合成蛋白有关(Logulloetal.2002)。ArdMN等用RNA干扰技术屏蔽微小牛蜱的3个保护性抗原基因Bm86、Bm91和Subolesio得到特异性的基因沉默，并证实了饲喂以后饥饿成蜱发生基因沉默现象(Nijhofetal.2007)。⑶核酸序列分析要选取得到蜱功能性抗原基因，首要的是对该基因进行功能的鉴定。具体方式是在该基因测序的基础上，运用DNAMAN等分子生物软件翻译得到模拟蛋白，再与NCBI蛋白数据库中的已知蛋白进行同源性比对，分析推断蛋白结构和功能等。一般认为，蛋白序列之间的同源性超过30%，就可以初步推断该蛋白可能是同源的，然后通过动物实验鉴定该种基因是否为保护性抗原。马腾等(马腾，周勇志，向飞宇等2008)应用该方法从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA得到了镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因。1.2.3.7商业化的疫苗随着科学技术的发展，早在上世纪90年代中期，人们根据蜱Bm86基因表达产物研制出了TickGARDTM(Willadsenetal.1995)和GavacTM(Rodriguezetal.1995)两种商业化疫苗，TickGARDTM等在巴西的一项野外评价结果显示，经过免疫后的牛，感染蜱的数目下降89%。但Bm86只对包括微小牛蜱在内的少数几种蜱具有抗性，deVosS等(deVosSetal.2001)比较了用Bm86免疫的牛对几种不同蜱的保护效果，结果证明了Bm86免疫对微小牛蜱、美洲钝蜱效果明显，但是对尾扇头蜱和璃眼蜱均没有保护效果。人们为了延长免疫应答时机，在Bm86抗原中加入一种皂角苷类的佐剂，使得Bm86免疫效果得到改进。也有学者另辟蹊径，选取它的肠抗原与Bm86联合免疫，改善Bm86免疫效果。Willadsen等(Willadsenetal.1996)的发现采用微小牛蜱的中肠抗原Bm86和Bm91免疫牛，其效果比用其中之一单独免疫牛产生的免疫效应更好。2000年JonssonNN等(JonssonNNetal.2000)研制的商业化重组疫苗TickGARDPLU可以有效的提高了免疫，证实了蜱的分子免疫学防控成为可能。2008年CanalesM等学者(Canalesetal.2008)采用重组DNA技术，分别克隆了非洲株和亚洲株微小牛蜱（B.microplus）的Ba86保护性抗原、消色牛蜱（B.decoloratus）的Bd86保护性抗原和环形牛蜱（B.annulatus）的Bm86保护性抗原，并在酵母中表达，并证明了非洲和亚洲地区不同株的微小牛蜱的疫苗候选抗原的制备可以选用Bm86、Ba86、Bd86。Macedo-Ribei 第一章蜱类生物学与抗蜱研究进展19roS等(Macedo-Ribeiroetal.2008)从微小牛蜱体中分离得到Boophilin即一类新的抑制剂，得到广泛应用。 20青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究第二章蜱传疫病研究进展蜱虫具有相当大的医学和兽医学重要性，因为它们通过叮咬行为伤害寄主并携带很多病原体。其可以携带和传播的病原体包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、原生动物、衣原体、支原体和线虫等(BoucherP1994)。根据蜱虫携带的病原体种类的不同，将蜱传疫病分为三种：蜱传病毒病、蜱传细菌病和蜱传寄生虫病，下面对这三类蜱传疫病分别进行介绍。2.1蜱传病毒病2.1.1蜱传脑炎蜱传脑炎（Tick-borneencephalitis，TBE），在中国也被称为森林脑炎，是一种侵害人类中枢神经系统的急性病毒性传染病(BoucherP1996)。该病是由黄热病毒家族的一员蜱传脑炎病毒(TBEV)引起的，最初在1937年被分离到。一种与此种病毒密切相关的位于远东欧亚大陆的俄罗斯春夏脑炎病毒(RSSEV)导致一种类似的更加严重的临床症状(Campanellaetal.2003)。这种疾病最常见的表现为脑膜炎(围绕着大脑和脊髓的膜的炎症)，脑炎(大脑的炎症)，或脑膜脑炎(大脑和脑膜炎症)。尽管TBE是公认的最常见的神经系统疾病，而轻微的发热性疾病也可能发生。10%-20%感染该病毒的病人会留下长期或永久性的神经性后遗症(ChenX2000)。蜱虫作为TBEV的载体和宿主，其主要的寄主是小型啮齿类动物，人类是其临时性寄主。大型动物喂养蜱虫的寄主，但不在维持病毒中发挥作用。病毒可长期感染蜱虫并且其传播途径可从幼虫到蛹到蜱虫成虫，也可从母体到受精卵(JF1989)。TBE病发最高峰时期是在蜱虫活动的4月至11月，人们在农村地区被蜱虫叮咬感染。感染也可能通过食用山羊、绵羊、牛的生奶感染。现在人际传播尚未有报道，但母婴垂直传播感染已有发生(Frey1994)。TBE在欧洲的许多地区、前苏联和亚洲是一种重要的传染病，符合硬蜱的分布规律(Hahnetal.1988)。每年的发病率也是不同的。TBE的潜伏期通常是7-14天，在这期间无症状。最初出现典型的发热症状持续2-4天。会出现一些非特异性症状，包括发热、不适、厌食、肌肉酸痛、头痛、恶心和/或呕吐(FrolovI1996)。大约8天的疾病缓解期后，该病的第二个发病阶段发生在20-30%的病人，此类病人会出现中枢神经系统与脑膜炎的症状(如发烧、头痛，脖子僵硬)或脑炎(如嗜睡，大脑错乱，感觉障碍和/或运动麻痹)或脑膜脑炎等异常。与RSSE病相比，TBE时一种在成人中发病比儿童更严重的疾病(LevinsonR1990)。在该病的第一感染阶段，最常见的实验室异常指标为白细胞降低(白血球减少症)和血小板数降低(血小板减少症)。血清中肝酶也可能轻微升高。到第二阶段神经症状开 第二章蜱传疫病研究进展21始出现时，血液中白细胞数量增加，脑脊液(CSF)通常被发现(Powersetal.2001)。病毒可以在感染该病的第一阶段在血液中被分离到。特异性诊断方法通常是检测血液中特异的IgM或检测通常在第二个阶段出现的脑脊液(Schlesingeretal.1999)。大约有三分之二的病人感染TBE病毒，只出现早期症状。剩下的三分之一患者会经历典型的临床神经症状。这类病人的康复时间可能会很长，后遗症的发生率可能在30至60%，甚至伴随长期或永久性的神经症状(Thompsonetal.1997)。没有特效药物治疗TBE。脑膜炎、脑炎或脑膜脑炎病人需要根据其严重程度进行住院治疗和支持性护理。抗炎药，如糖皮质激素，被认为是在特定的情况下缓解症状时使用。插管和通气支持可能是必要的(Weaveretal.1993)。人们在疾病流行地区休闲娱乐或户外作业时(例如，猎人，露营者，森林工人、农民)通过接触受感染的蜱虫而存在潜在的感染风险(Weaveretal.1994)。此外，随着旅游业的发展，前往风土性区域旅游也同样扩大了感染TBE的风险。像其他蜱传播的传染病，TBEV感染可以通过使用驱虫剂和穿防护服来预防蜱虫叮咬。疫苗可以在某些疾病流行地区使用；然而，在儿童中产生的不良接种反应限制了疫苗的效用(Westonetal.2002)。2.1.2克里米亚-刚果出血热克里米亚-刚果出血热(克里米亚—刚果出血热)(CCHF)，也被称为中国新疆出血热，是由于感染蜱传播的病毒Nairovirus家族之一(Blanco2004)。该病广泛流行于亚洲、非洲和欧洲，死亡率约为3%-30%，发病高峰期为4月到5月，发病高峰与当地蜱的活动高峰相吻合(Scaffidietal.1981)。克里米亚—刚果出血热于1944-1945年首次在乌克兰的克里米亚半岛被描述。该病毒在1967年从颅内接种的乳鼠血液和组织中分离出的，该病毒后来被证明与刚果病毒具有相同的抗原性和生物学特性。这导致了该病被称为克里米亚-刚果出血热，该病毒被称为克里米亚-刚果出血热病毒(Skhirietal.2004)。硬蜱是该病的主要传播媒介，以发热、出血为典型症状，是一种人畜共患病，其发病具有明显的地方性和季节性(Skhirietal.2004)。该病于1965年在我国新疆首次被发现，因此又称为新疆出血热。克里米亚-刚果出血热病毒属于布尼亚病毒科内罗病毒属，为单股负链RNA病毒(Vitaleetal.2001)。在非洲、亚洲、东南欧洲和中东地区等全球的30多个国家均分离到该病毒。1989年以后在伊朗、哈萨克斯坦、阿富汗、巴基斯坦、前南斯拉夫科索沃、南非、保加利亚、前苏联地区、土耳其东部黑海地区以及我国都有发生。蜱虫作为该病毒的储存宿主和传播载体(Walkeretal.1987)。主要传播途径包括蜱与蜱之间的垂直传播，也可以跨龄传播，或者在蜱间通过性途径传播，也可以在脊椎动物蜱与之间进行水平传播。人感染该病毒一般通过蜱的叮咬，以及密切接触感染动物或病人的分泌物、排泄物等(Walkeretal.1994)。CCHFV目前已经在一种刺蚊和至少31种蜱和中被分离出，其中最重要的是璃眼蜱属。亚洲、欧洲和非洲的CCHFV分布大致与 22青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究璃眼蜱属的分布是相一致的，同时在其他类型的蜱中也分离出了该病毒，这可能与CCHFV的全球性分布有关。目前CCHFV的抗体已从多种野生哺乳动物及牛、山羊、绵羊、家狗和野兔等多种驯养动物的血清中被检测到(Altschuletal.1997)。2.2蜱传细菌病2.2.1人类单核细胞埃立克体病(HME)自然灾害，战争，商务全球化、国际贸易、移民以及旅游增加了传染病的传播风险。斑疹热(SFG)立克次氏体病在全球范围内是重要的蜱传播的人类传染病。其中由立克次氏体引起的非洲蜱咬热(ATBF)被认为是当前在撒哈拉沙漠以南非洲最普遍的立克次氏体病(Bacellar1999)。在西班牙，从南非返程的旅客中报道有3例ATBF病人通过PCR检测方法被确诊(Bacellaretal.2003)。在非洲已经发现有几种作为斑疹热(SFG)立克次氏体宿主的蜱虫物种。蜱虫是导致人类和动物在全球范围内患病的各种病原菌，原生动物和病毒的重要载体。像伯纳特氏立克次氏体被认为是重要的新兴媒介传播病原体(Sousaetal.2003)。埃立克体属物种，立克次氏体以及某种包柔氏螺旋体物种已在世界各地被报道，而且也一直在与人类和动物的疾病息息相关(Benson1999)。埃立克体属物种是严格的细胞内革兰氏阴性细菌寄生于单核细胞、粒细胞或血小板，该菌属是导致动物及世界上不同地域人们患上各种媒介传播疾病的元凶(Farlowetal.2002)。人类单核细胞埃立克体病(HME)是由查菲埃立克体感染所致，这是一种新兴的蜱传播的传染性疾病。该病一般的临床症状有发烧(100%)、皮疹(67%)、肌痛(58%)、呕吐、腹泻，头痛(25%)(Fournieretal.2004)。诊断HME仍然是主要基于临床症状的综合评价，实验室检测和流行病学数据。因为大多数内科医生对HME不熟悉的，这种疾病通经常被误诊而且很多情况下发展成更严重的情况，或者由于不正当使用四环素或强力霉素而成为该菌携带者(Gimenez1964)。自从1987年HME被首次报道后，该疾病已经在美国多达30个州，欧洲，非洲，中东和亚洲被报道(Klevytskaetal.2001)。在2002年，曾经报道了韩国一例病人通过血清学检测发现感染埃立克体。此外，在早期研究中，埃立克体在森林硬蜱虫中被检测到(Moxonetal.1994)。大部分长角蜱虫也被发现感染埃立克体，但其感染的种属专一性还没有鉴定。最近，我们在韩国有检测到感染了查菲埃立克体的马、牛和猫(未公开数据)(Ogata2001)。2.2.2人类粒细胞性无形体病人类粒细胞性无形体病(HGA)是另一种新兴的蜱传人畜共患病，于1990年首次在美国报道，1997欧洲在报道(Ogataetal.2000)。它的病原立克次氏体被重新从埃立克体属分到了无形体属。2001年将改病的名字从人类粒细胞埃里希体病改为人类粒细胞无形体病。该病的发生是通过病原体通过感染人类中性粒细胞引起的(Ogataetal.2000)。HGA 第二章蜱传疫病研究进展23的临床症状与人类单核细胞埃立克体病很相似。疾病发生后的10天或更多天，该病引起的死亡率大约为0.6%，包括具有典型免疫功能不全的个体。2006年在安徽省确诊了第一例由噬吞噬细胞无形体引起的人类粒细胞无形体病，并引发该病的爆发。包括1例原发病和9例可能与原发病例由血液或呼吸道分泌物通过皮肤或粘膜接触感染的继发感染比例(Pourceletal.2003)。这种病例包括死亡人数在中国的安徽、天津、山东、黑龙江、新疆和海南都有报道。在中国，全沟血蜱、残缘璃眼蜱和嗜群血蜱被认为是该病的主要传播者，但是详细的传播过程仍没有研究清楚。2.2.3地中海斑疹热(MSF)地中海斑疹热(MSF)是一种蜱传播的立克次氏体引起的急性发热性疾病。蜱虫咬人后症状是发热、皮疹和黑色焦痂(Peaketal.1996)。患MSF的病人经过7天的发热、不适和严重的头痛，心脏听诊器会发现患者混乱的房颤心律以及由心电图显示快速的心室反应(Regneryetal.1991)。MSF的患者被诊断出现皮疹后，开始口服强力霉素治疗。免疫荧光抗体试验可证实其为立克次氏体感染。7天的治疗后病人康复。心律失常是MSF病人的罕见并发症。炎症可能在房颤的发病机制中发挥作用。立克次氏体是一种细胞内的细菌，可能引发房颤。我们的病人以前是健康的、无心脏病史。这表明，立克次氏体对MSF患者的心脏功能具有潜在的攻击性(Raoultetal.1997)。感染的宿主是棕色的狗蜱虫扇头蜱属，在地中海地区广泛存在(Rouxetal.1997)。在意大利，每年大约有400例MSF病人。近一半的病例发生在西西里，这是最流行的地区之一。大多数情况下病人经过7天的治疗后可以康复，然而，严重者会引发心脏病的高发病率和死亡率。并发症主要包括肝、肾、心脏损害(Spurgiesz2003)。2.2.4昆士兰热病（Q-fever）昆士兰热病是一种由急性疾病由革兰氏阴性细菌伯纳特氏立克次氏体引起的。它于1935年首次在澳大利亚被发现，于1937年见刊(Stothardetal.1994)。在中国最初报道于1950年，该病在野生动物(老鼠)和牲畜体内传播，并通过蜱虫作为传播媒介。其病原体可以在蜱虫体内存在很长一段时间，并可通过有性繁殖而传播。昆士兰热病是一种由革兰氏阴性细菌伯纳特氏立克次氏体引起的急性自然疫源性疾病。它于1935年首次在澳大利亚被发现，并于1937年被描述(Sekeyovaetal.2001)。在中国最初是在1950年被报道，昆士兰热病在野生动物(老鼠)和牲畜中自然传播。其病原体可以在蜱虫体内存活很长一段时间，并且可以扩散到卵中。在疫区发现过森林硬蜱，乳突钝缘蜱，铃头血蜱，亚洲血蜱，亚东璃眼蜱和扇头蜱属被天然感染(Supplyetal.2001)。近年来，新报告显示，昆士兰热可能是由于通过除蜱传播之外的其他传播途径感染的伯纳特氏立克次氏体。从德国南部疫区收集的未寄生的矩头蜱属经巢式PCR检测为伯纳特氏立克次氏体阴性。在瑞典南部和中部29个不同的地方收集来的887只蓖子硬蜱成虫也被报道与上述同样的结果。伯纳特氏立克次氏体据报道在欧洲的蓖子硬蜱体内 24青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究寄生不到2%的。尽管伯纳特氏立克次氏体细菌被发现在40多个蜱虫物种中(主要是硬蜱属、扇头蜱属、花蜱属中分离和矩头蝉属)，伯纳特氏立克次氏体很容易通过灰尘或气溶胶传染给健康人。因此蜱虫可能不是一个必要的伯纳特氏立克次氏体传载体。毕竟，没有更充足的证据表明昆士兰热病是只是被蜱虫叮咬传播给人类的(vanWoenseletal.1998)。在中国血清学方法进行流行病学调查显示，昆士兰热疫情目前在内蒙古、四川，新疆，云南，西藏等24个省/直辖市都有爆发(YangHC2001)。2.2.5北亚蜱传斑点热(NATBSF)北亚蜱传斑点热(NATBSF)也被称为西伯利亚蜱传播的斑疹伤寒，北亚蜱传立克次体病、北亚洲蜱虫斑疹伤寒和北亚热。其病原体是立克次氏体，小型啮齿动物是其主要的感染源。这种蜱传疾病在1936年首次在俄罗斯被报道(Halburetal.1996)。自从这种类型的传染病在北亚许多共和国变得很常见，对NATBSF疾病的研究加大了投入力度。1958年内蒙古首次在人类和动物的血清中检测到立克次氏体抗体。1962年在我国黑龙江省虎林市发现了首例从野生啮齿动物田鼠中分离到HL-84株西伯利亚立克次体。之后1974年在新疆自治州的泾河县JH-7株西伯利亚立克次氏体从矩头蜱属中被分离到。1984年又在一病人体内分离到An-84株(Mengelingetal.1998)。该病病原体可以传至鸡蛋中并可存活两年。由于北亚蜱传斑点热(NATBSF)这种疾病的诊断的方法尚未标准化，该病在中国的流行情况尚不确定；然而，黑龙江北部、内蒙古、新疆、北京、广东、吉林、辽宁7省/市出现病例报告。自然疫源地存在于已报告的中国北方大部分地区(位于东经90°~135°和北纬40°~50°)；血清学的线索也被发现在中国南方部分地区，人类和啮齿动物的血清中也同样发现血清学线索(Mengetal.1996)。2.2.6莱姆疏螺旋体病(LB)莱莱姆疏螺旋体病(LB)，在中国也称为莱姆病，是一种由包柔氏螺旋体引起的天然病灶疾病。LB通常表现为一种急性疾病。如果不及时治疗它只在一小部分患者中表现为慢性病(Keyetal.2001)。该病在1975年在美国首次被发现。该病毒分布十分广泛，据报道分布在五大洲的70多个国家。此外，受灾地区继续扩大，这种疾病的发病率正在上升(Zhouetal.2009)。该病1985年在中国首次被报道，在黑龙江海林县林区(Mengelingetal.1998)。莱姆病的发病高峰发生在6月到8月。其主要载体是中国北部粒形硬蜱虫，中国南部硬蜱属以及二棘血蜱。该病已确认在29个省/直辖市流行。中国的主要流行病区在东北和西北地区的森林和华北一些地区。在黑龙江，吉林，辽宁，内蒙古，每年超过300万人遭受蜱虫叮咬，其中，大约有30000人感染莱姆疏螺旋体；在2-17年内大约10%的未治疗的新病例可能会变成慢性病(Fengetal.2008)。莱姆病是一种可引起人和动物多个器官和系统损害，进而造成全身感染的广泛性流行性传染病，慢性游走性红斑(ECM)是其特征性症状(deLimaetal.2006)。该病不仅影 第二章蜱传疫病研究进展25响动物健康，给畜牧业带来很大损失，还对人类健康带来造成威胁，近年来，已有多个国家和地区报道了人感染莱姆病的病例，我国也出现了人感染莱姆病的病例。因此，不管是兽医学界还是医学界对该病都高度重视。伯氏疏螺旋体作为莱姆病的病原体是螺旋体科疏螺旋体属的新种。莱姆病螺旋体的组成结构有表层、外膜、鞭毛、原生质柱，其中外膜蛋白中的OspA、OspB、OspC等具有抗原性。伯氏疏螺旋体具有嗜氧性，革兰氏染色呈阴性(Meulenbergetal.1997)。莱姆病是一种当蜱在叮咬吸血时通过唾液将疏螺旋体传染给人的蜱传传染病。蜱吸吮了具有菌血症动物的血后就会被感染，受感染的蜱再吸血时，就引起新的宿主传染通，这个在感染过程是通过它的唾液将病原体传染新的宿主完成的(TorrisonJL1996)。蜱的幼虫、若虫和成虫三个阶段的成长发育过程中一直都在叮刺吸血。吸吮带带菌鼠血受到感染的幼虫，在其发育到若虫后再叮刺其他动物后，又可把螺旋体传给其他动物。带菌的成虫通过叮咬吸血也可造成其他动物的感染。幼虫寄生在小型动物身上，因此只引起小型动物感染，而若虫即在小型动物身上吸血又在大型动物身上吸血，因此即可造成小型动物感染又可造成大型动物感染。成虫主要在大行动物身上吸血，造成大型动物的感染(Swansonetal.2006)。因为蜱的若虫个体很小，寄生在宿主体表不易被发现，加之若虫的活跃季节和人和动物户外活动较多的季节重合，加之在这个季节中人们衣着较少，体表爆较多，为若虫的叮咬吸血创造了条件。因此，人和动物感染莱姆病，由蜱的若虫感染原因很大。成虫一年四季都较活跃，一年四季都可传播莱姆病(Thomasetal.2001)。对于马属动物感染莱姆病主要原因应该是成年蜱的传播，因为只有成年蜱才能在马身上吸血(Caoetal.2003)。作为一种自然疫源性疾病的病原体—莱姆病螺旋体，其病原携带者很广，既有野生动物携带者，又有家畜和鸟类携带者(Huangetal.2006)。国外研究者已经从鹿、熊、马、鼠等20多种哺乳类动物和7中鸟类中分离到了改病原体。在我国也有人的研究表明牛、羊、鼠等多种动物可感染本病(Zeidneretal.2000)。因此，莱姆病螺旋体可以在蜱和脊椎动物间循环往复。当人感染莱姆病时，可根据病情的不同情况使用抗生素治疗，如四环素、头孢曲松、阿莫西林等在临床上都取得了不错的效果(Nyarkoetal.2006)。但需要注意的是，本病的治疗需用药量较大且疗程较长，而且治疗后容易出现赫克斯海默氏反应。2.3蜱传寄生虫病巴贝斯虫病(Babesiosis)又称蜱传热等，是由蜱虫传播的寄生于牛、马、羊、犬及其它野生动物红细胞内的巴贝斯科巴贝斯属的多种巴贝斯虫所引起的疾病的总称(ZhangF2008)。巴贝斯虫是蜱传原生动物血寄生虫，在全世界具有经济学、兽医学和医学影响。他们被认为是在哺乳动物血液中被发现的继锥虫以后第二种最常见的寄生虫，而且他们还被发现可感染鸟类。他们在脊椎动物宿主红细胞内是无性繁殖。他们被称为梨形虫目 26青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究或梨浆虫(Caoetal.2000)。巴贝斯虫的有性生殖阶段通常发生在硬蜱虫中，蜱虫通过叮咬过程进行血液中获取和传播寄生虫的(Parolaetal.2005)。VictorBabe在1888年第一个在罗马尼亚牛科动物红细胞内发现微生物从而导致血红蛋白尿；他后来在羊血液中也观察到类似生物体(Caoetal.2006)。五年后，在美国，Smith和Kilbour描述了红细胞内寄生虫的存在是导致蜱传德克萨斯州牛热的原因，这是第一个证明是脊椎动物的蜱传病原体的描述(Zhanetal.2008)。Babes(Zhangetal.2008)描述了这种寄生虫，随后Smith和Kilbour将其分别命名为牛巴贝斯虫，羊巴贝斯虫和牛双芽巴贝斯虫(FanMY1999)。此后不久，巴贝斯虫寄生于其它家畜的血液中也被发现，如那些最终被Galli-Valerio(1895)和Koch(1904)命名为犬属巴贝斯虫和b.caballi，它们分别寄生于狗和马的红细胞(Bownetal.2003)。由于这些早期发现，多达100多种巴贝斯虫物种被发现，而且由于显微镜的发展，细胞生物学和分子生物学技术的进步，使得我们对于巴贝斯虫的知识领域有了飞速的拓展(AiCX1987)。巴贝斯虫主要感染三类宿主：牲畜、人类和一些野生动物物种(Wielingaetal.2006)。一般来说，巴贝斯虫感染分不同的严重程度，严重程度通常与宿主的年龄、免疫状态，并发与其他病原体感染和遗传因素有关。通常急性巴贝西虫在不同的宿主上感染的常见临床症状包括发热、贫血、血红蛋白尿，黄疸，萎靡不振、嗜睡和厌食症，而慢性感染状态一般无症状(Ammermanetal.2004)。在家畜中，牛巴贝斯虫病，或红色水热，通常被称为是最重要的蜱传牛寄生虫病。牛巴贝斯虫病直接导致死亡、堕胎、肉奶产量下降以及潜在的生产损失、贸易限制和牛贸易限制(FournierPE2003)。硬蜱是巴贝斯虫病的唯一传播载体。在全世界己发现的700多种硬蜱中有约26种硬蜱可作为巴贝斯虫的传播载体(Dumpisetal.1999)。不同种硬蜱传播的病原体种类也各不相同，因此推断某地区可能存在的血液原虫种类，可以通过检测该地区存在的媒介蜱种类。媒介蜱、病原体(巴贝斯虫)和易感动物三者构成了巴贝斯虫病流行的基本要素，三者形成一个流行链，缺一不可。巴贝斯虫是一种必须在细胞内永久寄生的寄生虫，不能离开宿主而独立生存于自然界(Kaiseretal.2000)。巴贝斯虫对宿主(即易感的家畜)有比较严格的选择性，不同的巴贝斯虫需要特定种属的蜱作为传播者，也就是说，1种巴贝斯虫只能在特定种属的蜱体内繁殖和发育(Mikiene2002)。巴贝斯虫对宿主的要求专一性较强，每一种巴贝斯虫的传播都需要特定的蜱来传播，即一种巴贝斯虫的繁殖发育只能在不一种特定种属的蜱内进行。大部分巴贝斯虫对感染动物的种类专一性也较强，比如感染牛的巴贝斯虫马和羊对其就不敏感，这是自然免疫的结果，这种生物学特性是病原体与宿主间长期进化抗争形成的(Haglundetal.1996)。有的巴贝斯虫可以有多种蜱来传播，比如马的驽巴贝斯虫可以由革蜱属的蜱和璃眼蜱属的多种蜱来传播。有的不同种类的巴贝斯虫可以由同一种蜱来传播，如双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫可同时被微小牛峰传播(Logaretal.2000)。由于硬蜱的生存繁 第二章蜱传疫病研究进展27衍对生态环境的要求不同，造成了不同蜱种的分布地域不同。蜱的四个变态期—卵、幼虫、若虫、成虫期对环境和气候的要求比较严格，因此特定地区，特定形态的蜱的活动较固定，因此巴贝斯虫的流行具有明显的地区性和季节性(Anderssonetal.1998)。不同的气候条件、不同的蜱种，就会引起不同的巴贝斯虫病，发病季节也不同(AzadA.F.1998)。如马的鸳巴贝斯虫病由革蜱和璃眼蜱传播，而这两种蜱主要分布在我国的北方地区，当革蜱作为传播媒介时，该病在2月下旬开始出现，3、4月份流行最严重，到5月下旬逐渐消失；当璃眼蜱作为传播媒介时，则3月下旬开始流行，5、6月份最为严重，7月份慢慢消失(Baldridgeetal.2004)。作为牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的传播媒介的微小牛蜱繁殖一代的时间大约为2个月，一年可以繁殖4—5代，因此该病的发生主要取决于蜱在当年发生的次数(Baldridgeetal.2008)。在我国的多数区域，这种蜱的成虫在4月上旬开始出现，最早的3月底出现，到4月下旬、5月份数量最多，6月份开始减少，到7月份就逐渐消失，因此牛的这两种巴贝斯虫病多在每年的4—9份流行(Bell-Sakyietal.2007)。由于巴贝斯虫对宿主的要求具有特异性，只有媒介蜱吸血被病原感染的动物时才能受到感染，而只有被感染的媒介蜱叮咬易感动物时才能形成该病的流行，巴贝斯虫、媒介蜱、易感动物三者之间关系复杂又息息相关，因此，为了搞清楚某地区的巴贝斯虫流行状况与分布必须详细调查该地区病原种类、媒介蜱种类、宿主种类、数量和感染状况(BlancJ.L.1932)。为了更好地对巴贝斯虫进行预防，可以将农牧区划分为4个安全等级的区域：（1）安全区域。此区域虽有易感动物，但没有病原和相应的媒介蜱，相对安全，“清洁”。（2）受威胁区域。此类区域不仅存在易感动物，还存在相应的媒介蜱，但没有病原；或者有病原和易感动物，没有相应的蜱。此类地区虽然暂时安全，一旦所缺的流行因素加入就会引起巴贝斯虫病的发生。（3）隐性感染区域。在该类地区引起巴贝斯虫病流行的三个因素都有，并且有过该病的流行史，由于当地采取了带虫免疫，或者蜱的孽生和活动由于某些原因导致减少，所以该病暂时没有发生和流行，造成了“假安全”现象，一旦条件恢复，就会爆发流行疾病。并且该类地区一旦疫情爆发，往往来势凶猛，甚至可造成全群覆没。（4）流行区域。改类区域存在引起疾病流行的各个因素，并且每年都有该病流行(Braytonetal.2005)。2.4我国蜱传疫病研究进展近年来，我国作为媒介传播疾病的一个重要病区，由于多发的疾病以及随之对牲畜和人类健康造成的重大伤害使蜱传播的疾病得到了广泛关注。我国发现的最常见的人类蜱传播的疾病包括莱姆疏螺旋体病(在中国被称为莱姆病)、蜱传脑炎(在中国被称为森林脑炎)，克里米亚-刚果出血热(在中国新疆称为出血热)、昆士兰热病、兔热病和北亚蜱传斑点热病(孟阳春1995)。近年来，在中国一些新兴的蜱传播疾病，如人类单核细胞的埃立克体病毒传染，人类粒细胞性无形体病以及新型的布尼亚病毒的感染已被频繁报 28青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究道。其他蜱传播的疾病，在中国并不经常报道包括科罗拉多发烧，东方斑疹热、梨形虫病(许荣满1998)。很明显，努力加强政府管理，采取更有效的预防、诊断及治疗措施，以及对蜱虫进行控制，以减少蜱传疫病在我国的传播。我国已鉴定出大约10个属的蜱虫，119种蜱虫，包括100种硬蜱科和19种软蜱科。蜱传播的疾病在全球广泛分布(Burgdorfer1984)。它们主要是天然病灶疾病，最常发生在森林，灌木和半荒漠草原。在全球范围内，独特的和流行病学重要的蜱传疾病，包括蜱传脑炎、科萨努尔森林病，克里米亚-刚果出血热和落基山斑疹热在过去的30年中大大增加了。由于我国广阔的领土、复杂的地理环境使得蜱虫的种类丰富而多样，因此蜱传播的疾病在我国的大部分地区流行，严重影响人类健康。近年来，蜱传播的疾病发生在我国几乎所有的省、自治区/直辖市，其感染率持续上升2%。新兴蜱传播的疾病的病例在山东，河南、河北、安徽等省份已连续报道。因此，蜱传播的疾病的预防和控制已经迫在眉睫(Cerauletal.2007)。不同的蜱传疫病在我国的分布地区有各自的特点。如莱姆病于1985年在中国首次被报道，在黑龙江海林县林区。莱姆病的发病高峰发生在6月到8月。其主要载体是中国北部粒形硬蜱虫，中国南部硬蜱属以及二棘血蜱。该病已确认在29个省、直辖市流行(delaFuenteetal.2007)。中国的主要流行病区在东北和西北地区的森林和华北一些地区。在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古每年超过300万人遭受蜱虫叮咬，其中，大约有30000人感染莱姆疏螺旋体；在2-17年内大约10%的未治疗的新病例可能会变成慢性病。在中国，TBE在1942年被首次发现，TBEV最初于1952年与病人和蜱虫(Ellisonetal.2008)。TBEV三个亚型中，欧洲、西伯利亚、远东亚型，后者是流行在中国北方，也出现在中国西部和西南部。主要载体物种是在中国北方硬蜱属和中国南方硬蜱属；在极少数情况下，革蜱属也被确认为是TBEV载体。TBE在中国大多发生在5月到8月，达到一个峰值在5月底和6月初(Fournieretal.2009)。TBE的分布与蜱虫的分布密切相关。在中国大陆存在TBE的两个自然疫源地，东北部地区集中在内蒙古、黑龙江、吉林，以及新疆疫区(Goddard2003)。从1980年到1998年，2202例TBE病爆发，而从1995年到1998年，只有420人被诊断出感染。据统计分析，从1952年到1998年TBE似乎每5到7年发病率达到一个高峰。TBE发病有明显的特征并且其分布在近几十年来有了明显的改变。随着旅游业的发展，近年来森林生态环境的破坏，疾病的发病率正在上升(Hayesetal.1982)。到目前为止在中国，克里米亚—刚果出血热病例报告只有在新疆和Jungar抗体阳性病例报告在7省、直辖市(青海、云南、四川、内蒙古、安徽、海南和东北伊利)(Hayesetal.1979)。克里米亚—刚果出血热的自然疫源地证实在塔里木盆地、准噶尔盆地，塔里木河和新疆伊犁河谷边界，腾冲彝族自治县、西双版纳、云南孟连、内蒙古自治区以及四川、海南、安徽、青海。沙漠和草原作为一个疾病与自然疫源地，克里米亚—刚果出血热传播主要是通过亚洲璃眼蜱(Hilletal.2005)。在中国，硬蜱虫害可能在某些情况下作为载体，羊和兔子疫区的牧场是其主要的感染源，但急性感染患者也可以作为病源； 第二章蜱传疫病研究进展29病原体可以坚持几个月的蜱虫。在中国，兔热病病原体是在1957年第一次隔绝地松鼠，并在1959年报道了第一例人感染。之后，自然疫源地存在报道在西藏、新疆、甘肃。兔热病病例报告主要在7省、直辖市北京、黑龙江、内蒙古、青海、山东、西藏、新疆(Jongejanetal.2007)。1986年，31例人感染被报道在山东省一个肉类加工厂，从那时起，在中国没有进一步的病例报告。北亚蜱传斑点热(NATBSF)这种疾病诊断的方法由于尚未标准化，它流行在中国尚未确定；然而，病例报告7省/市北部的黑龙江、内蒙古、新疆、北京、广东、吉林、辽宁，自然疫源地存在已报告在中国北方大部分地区(位于东经90°~135°和北纬40°~50°)；血清学的线索也被发现在人类和啮齿动物的血清在中国南方部分地区(Kroberetal.2007)。总之，病媒传播疾病的发病率和患病率在空间分布区域特性，和相对分布的蜱传疾病在中国。蜱传疾病的高发病率存在在中国北方地区如新疆、内蒙古、黑龙江、辽宁、吉林、和云南中国东北等地(Kurttietal.2005)。主要蜱传播的疾病高发地区包括莱莱姆疏螺旋体病、Q热病和TBE。其他虱传播疾病在中国不经常报道包括科罗拉多发烧、梨形虫病、东方斑疹热。几个原因蜱传播的疾病的广泛传播在中国存在。首先，蜱虫的无数物种分布广泛，有不同的生活习惯和许多主机，包括鸟类、爬行动物、哺乳动物。其次，地域辽阔，地理气候变化复杂，多样的生态环境在中国提供各种对蜱虫栖息地(Heinzenetal.1993)。第三，迅速发展国际和国米——地区交换为tickborne疾病的传播创造了有利条件。最后，疫区蜱传播的疾病正逐渐扩大的变化和生态破坏森林环境。不断努力仍需要蜱传播的疾病的预防和治疗在中国。分布在中国所有物种的蜱虫应尽可能彻底调查，以便有针对性的进行破坏的蜱虫可以在活跃的季节。蜱传疾病的快速诊断和机制研究的病原体的传播需要加强。需要更有效的药物和疫苗预防蜱传播的疾病，必须开发新的蜱虫的预防方法。最后，综合生物防治蜱虫会带来高效、高速、长期在中国和无污染的效果(Hintonetal.2009)。 30青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究试验部分第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察蜱的分布与地理地貌、植被等地理条件密切相关，其中硬蜱(Hardticks)是牛羊体表常见的一类专营吸血性非永久的体表寄生虫(邓国藩1991)，直接表现为叮咬动物，引起动物骚动不安和伤口感染，蜱携带病原体与蜱的种类密切相关(Jongejanetal，2004;刘联坤2011)，据统计，世界上约10%的蜱携带病原体，致使动物生产性能下降，由于蜱的危害大(Jongejanetal.2004)，第十八世纪就进行了蜱的命名和蜱的分类研究。查清我省硬蜱的种类，对开展蜱类研究和蜱传疫病的的防治工作有重要意义。蜱的分类早期以形态学特征为依据，外部形态特征主要有：假头基的形状，基突及背突的有无、长短，孔区的形状、大小及间距，耳状突的有无、长短，须肢形状，口下板齿式，盾板形状，颈沟形状，生殖孔位置，足基节形状，爪垫长短，气门板的形状等(Barkeretal.2004;杨银书1991)。随着生物学工具在种类鉴定中广泛应用，用电镜扫描技术观察各个组织间的形态结构的区别，成为鉴定硬蜱亚种及相近种类鉴定的有效方法(Chenetal.2012)，硬蜱的哈氏器（Haller’sorgan）显微结构观察就是常用的硬蜱分类的依据之一。哈氏器位于虫体第一对足跗节背面，由于哈氏器的结构与很多昆虫的听觉器官非常相似，后来LahilleNuttall等通过实验证实哈氏器是蜱的嗅觉器官，蜱通过哈氏器感受宿主的呼吸、气味及同类的性信息素等(BruyneM1994)，哈氏器对蜱类的交配、集群、寻找宿主、躲避危害等起重要作用。目前哈氏器超微结构观察可作为通常哈氏器的观察部位为远端毛，前窝（Anteriorpit)内感毛数量，后囊（Capsule)，感毛（sensillum)数量，囊孔的形状以及后毛的数量等(杨银书1991)。本研究采集不同地区的蜱种，通过形态学和扫描电镜对青海省蜱样本整体形态学和哈氏器、口下板、孔区和爪垫等进行了观察，详细描述并比较其形态结构，调查蜱种的分布情况，为青海省硬蜱的亚种分类鉴定和区系传染情况提供参考依据。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1蜱样品采集蜱样本采集地区包括海西（都兰县、德令哈市、天峻县、乌兰县、格尔木市）、海南（共和县）、黄南（同仁县）、果洛（久治县、达日县）、玉树（曲麻莱县）、海北（海晏县、刚察县）、海东（民和县）、西宁市（湟源县、大通县、互助县）八个地区，合计16个县市，基本覆盖青海省主要地理生态区域，即包括青海湖环湖地区、灌木丛生的河 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察31谷地带和芨芨草丛生的地区，采集点分布情况见图3-1。2011年6月-12月于青海省的海西、海南、黄南、果洛及玉树共采集蜱标本10304只；2012年1月-2012年12月在海西、果洛、海北、海东及西宁市5个地区共采集蜱标本14870只；2011年6月-12月在青海省天峻县采集牦牛体表及野外生境中采集蜱标本1679只（表3-1）。图3-1试验蜱种样本采集地区示意图Fig.3-1Schematicmapofthetickfortesting3.1.1.2仪器和设备1000型精密电子天平（美国双杰兄弟（集团）有限公司）、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、Axiostarplus光学显微镜（蔡司光学仪器有限公司）、DS-350体视显微镜（南京江南光电股份有限公司）、S-520型扫描电镜（日本日立公司）、HV-85全自动高压灭菌锅（日本Hirayama公司）3.1.2方法3.1.2.1蜱采集方法3.1.2.1.1人工布旗法选择在灌木生长茂盛的山上，一端贯以木棍的生羊皮并固定，席地拖拽。拖拽时，手持棍子伸向一侧，使羊皮平铺于地面上，俯身慢慢拖羊皮往前走，地面上的蜱即可附着在生羊皮上。每行走50米到100米时反转布旗查找表面的爬行蜱，用镊子将蜱摘下并分装于瓶中，作好标记，带回实验室待鉴定。3.1.2.1.2动物体表采集法在调查区域内，采集放牧牛、羊体表蜱类标本时，首先保定好动物，重点观察腋下、耳廓、腹股沟、肛门等处，对于正在吸食血液或吸足血液的 32青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究蜱类，用镊子轻轻夹取蜱标本贴近皮肤处，垂直从皮肤上拔出来，防止蜱标本头节断裂在动物皮肤内，然后小心拔下置于洁净采集管中，作好标记和编号后，带回实验室待检。3.1.2.2样品制片与保存3.1.2.2.1蜱玻片标本制作与保存制作标本步骤：将蜱投入沸水中1-2min，使其肢体伸直，转入已经加温的10%KOH溶液中消化5-30min，然后依次经30%酒精、50%酒精、75%酒精、80%酒精、90%酒精和100%酒精分别脱水10min，最后用二甲苯透明10min，加拿大树胶封片，凝固后保存、待虫种鉴定用。其中样品的消化、脱水及透明时间，依据虫体大小、吸血量多少而定。3.1.2.3形态学观察将蜱放在体视显微镜的载物台上进行观察，主要观察虫体表面盾板大小，是否有花纹或凹陷；气门板的形状；是否具眼；盾板后缘是否有缘垛；在光学显微镜下观察虫体假头基形态、有无基突、须肢长短、口下板齿式、足基节是否有距，气门板形状、盾板大小、肛门及肛沟的位置等外部结构特征。3.1.2.4电镜样本制备方法及步骤(1)用5%戊二醛固定蜱种样本24h左右。(2)使用无水乙醇进行脱水，重复数次（3次），脱水时间为1h/次，最后再使用丙酮进行脱水，24h后加入二甲苯溶液。(3)超声清洗脱水后的样本，去除样本中的微小杂质。(4)将二甲苯替换为丙酮溶液，再次清洗，程序为清洗每次1h，连续2次。(5)使用少量叔丁醇进行样本的固化，操作步骤为：样本浸没在叔丁醇中，放超低温冰箱中，低温存放24h。(6)冷冻固化好的样本，真空干燥后，可以进行喷金并使用扫描电镜对样本镜检观察。3.1.2.5虫体种类鉴定根据已发表文献及《医学蜱螨学》蜱类分类检索表进行蜱类标本形态学种、属鉴定。于解剖镜下观察蜱类标本背部表面是否有盾板，花纹或凹陷；此外观察气门板的形状；是否具眼；盾板后缘是否存在缘垛；进一步观察虫体假头基形态、基突、须肢、口下板齿式、足基节、气门板形状、盾板大小、肛门及肛沟的位置等结构特征，使用电镜进行蜱标本形态学种属进一步鉴定蜱类种属。3.1.3数据统计与分析采用统计学SPASS软件进行数据处理，各试验数据结果以平均值±标准差来表示，P＜0.05表示为差异具有显著性。 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察333.2结果3.2.1草原革蜱（Dermacentornuttalli）的形态学与超微结构观察3.2.1.1草原革蜱（Dermacentornuttalli）的形态学鉴定（1）假头基位于躯体前端，躯体背面覆盖有几丁质盾板，几丁质盾板覆盖蜱背面三分之一或全部（图3-2）。（2）肛沟围绕肛门之后，且很明显（图3-3）。（3）假头基呈矩形且在其上面有两个明显的孔区或没有孔区（图3-6）。（4）外形体表呈现体宽较长，长卵圆形而且须肢粗短。（5）盾板的上面有眼睛而且在足基节上有两个明显的距。（6）侧沟长而明显；盾板珐琅彩较多而较浓（图3-2）。（7）跗节Ⅳ背面有不发达的钝刺且须肢外缘圆形凸出不成角状（图3-4）。(8)足转节I背面后缘的距较短且末端粗短（图3-5）。图3-2草原革蜱的形态学观察（背部）图3-3草原革蜱的形态学观察（腹部）Fig.3-2MorphologicalindentificationFig.3-3MorphologicalindentificationofofDermacentornuttali（Dorsalview）Dermacentornuttali(ventralview)图3-4草原革蜱的形态学观察（跗节Ⅳ）图3-5草原革蜱的形态学观察（转节I）Fig.3-4MorphologicalindentificationFig.3-5MorphologicalindentificationofofDermacentornuttali（TarsusⅣ）Dermacentornuttali（CoxaI） 34青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究图3-6草原革蜱的形态学观察（假头基）Fig.3-6MorphologicalindentificationofDermacentornuttali（Basiscapituli）3.2.1.2草原革蜱（Dermacentornuttalli）超微结构观察（1）假头基粗短而明显，有耳状突，齿式为3/3（图3-7，3-8）。（2）肛沟围绕肛门之后，且肛门明显凸起（图3-9）。（3）爪前段弯曲弧度较小，爪末端较钝，爪垫较厚实，爪与爪垫的比值较大（图3-10）。（4）生殖孔上有生殖前板，明显高于生殖沟，形如锅盖盖住生殖孔（图3-11）。（5）足上四对基节明显依次增大，外距较内距短（图3-12）。（6）草原革蜱雌雄蜱的哈氏器结构均有前窝（Anteriorpit)和后囊（Capsule)构成(图3-13，3-14)。（7）草原革蜱孔区呈倒“八”字形，孔内有明显的凹点（图3-15）。图3-7草原革蜱的超微结构观察（假头基）图3-8草原革蜱的超微结构观察（假头基）Fig.3-7UltrastructureindentificationofFig.3-8UltrastructureindentificationofDermacentornuttali（Basiscapituli）Dermacentornuttali（Basiscapituli）图3-9草原革蜱的超微结构观察（肛沟）图3-10草原革蜱的超微结构观察（爪垫）Fig.3-9UltrastructureindentificationofFig.3-10UltrastructureindentificationofDermacentornuttali（Analditch）Dermacentornuttali（Footpad） 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察35图3-11草原革蜱的超微结构观察（生殖孔）图3-12草原革蜱的超微结构观察（基节）Fig.3-11UltrastructureindentificationofFig.3-12UltrastructureindentificationofDermacentornuttali（Genitalopening）Dermacentornuttali（Basesection）图3-13草原革蜱的超微结构观察（哈氏器）图3-14草原革蜱的超微结构观察（哈氏器）Fig.3-13UltrastructureindentificationofFig.3-14UltrastructureindentificationofDermacentornuttali(Haller'sorgan，♀）Dermacentornuttali(Haller'sorgan，♂）a;后囊（Capsule)b:前窝（Anteriorpit)a;后囊（Capsule)b:前窝（Anteriorpit)c:囊孔(baghole)c:囊孔(baghole)图3-15草原革蜱的超微结构观察（孔区）Fig.3-15UltrastructureindentificationofDermacentornuttali(porosearea）A：孔区(porosearea）扫描电镜观察可见，草原革蜱雌蜱哈氏器的前窝和后囊外围轮廓大致呈规则的圆形，囊孔边缘模糊呈锯齿状，前窝相比后囊面积小，约占后囊面积的1/3。雄蜱哈氏器前窝和后囊外围轮廓大致呈规则的圆形，囊孔边缘模糊呈锯齿状，前窝相对后囊面积小，大概占后囊面积的1/3。 36青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究蜱的口下板（hypostome)位于螯肢腹面，口下板与螯肢合拢形成蜱的口腔，其形状大致有矛状、剑状和压舌板状等，形状的大小以及长度因种而异，在分类鉴定中，蜱的齿式（即按中线两侧的齿列数来表示，例如3丨3）可以作为分类鉴定的依据。草原革蜱的齿式为3丨3，中线处有较小的齿，每列齿数为6-7个。蜱的孔区（porosearea)位于雌蜱假头基上，孔区内有许多小凹点，具有感觉功能。孔区的形状和大小因种而异，大多数孔区的形状为椭圆形或者圆形。3.2.2青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）的形态学和超微结构观察3.2.2.1青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）的形态学（1）假头基位于躯体前端，呈矩形，躯体背面覆盖有几丁质盾板（图3-16）。（2）肛沟围绕肛门之后（图3-17）。（3）蜱躯体窄长，呈卵圆形，须肢粗短。。（4）盾板无眼，无珐琅斑，足基节只有一个距。（5）须肢第二节后外角有突出，两侧须肢外缘相合呈梯形；须肢第三节背面后缘无刺。（6）基节I、II、III、IV节均有内距，粗短，末端较钝，略微超出该节后缘。图3-16青海血蜱形态学观察（背部）图3-17青海血蜱形态学观察（腹部）Fig.3-17MorphologicalindentificationofFig.3-16MorphologicalindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis（ventralview）Haemaphysalisqinghaiensis（Dorsalview）3.2.2.2青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）的超微结构观察（1）假头基粗短，须肢呈三角形，须肢第二节呈角状，齿式为6/6（图3-18，3-19）。（2）肛沟围绕肛门之后，且肛沟与肛门之间的距离较远（图3-20）。（3）爪前段几乎无弯曲弧度，爪末端较钝，爪垫较薄，爪与爪垫的比值较小（图3-21）。（4）生殖孔上有生殖前板，生殖前板水平面低于生殖沟（图3-22）。（5）足上四对基节明显依次增大，外距较内距短（图3-23）。（6）哈氏器结构均有前窝（Anteriorpit)和后囊（Capsule)构成，轮廓大致呈“梯形”(图3-24，3-25)。（7）孔区呈“八”字形，孔内有明显的凹点（图3-26）。 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察37图3-18青海血蜱的超微结构观察（假头基）图3-19青海血蜱的超微结构观察（假头基）Fig.3-18UltrastructureindentificationofFig.3-19UltrastructureindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis（Basiscapituli）Haemaphysalisqinghaiensis（Basiscapituli）图3-20青海血蜱的超微结构观察（肛沟）图3-21青海血蜱的超微结构观察（爪垫）Fig.3-20UltrastructureindentificationofFig.3-21UltrastructureindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis（Analditch）Haemaphysalisqinghaiensis（Footpad）图3-22青海血蜱的超微结构观察（生殖孔）图3-23青海血蜱的超微结构观察（基节）Fig.3-22UltrastructureindentificationofFig.3-23UltrastructureindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis（Genitalopening）Haemaphysalisqinghaiensis（Basesection）图3-24青海血蜱的超微结构观察（哈氏器♀）图3-25青海血蜱的超微结构观察（哈氏器♂）Fig.3-24UltrastructureindentificationofFig.3-25UltrastructureindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis(Haller'sorgan♀）Haemaphysalisqinghaiensis(Haller'sorgan♂）a;后囊（Capsule)b:前窝（Anteriorpit)a;后囊（Capsule)b:前窝（Anteriorpit)c:囊孔(baghole)c:囊孔(baghole) 38青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究图3-26青海血蜱的超微结构观察（孔区）Fig.3-26UltrastructureindentificationofHaemaphysalisqinghaiensis(porosearea）A：孔区(porosearea）3.2.3残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）的形态学及超微结构观察3.2.3.1残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）的形态学观察（1）假头位于躯体前端，假头基呈近梯形（图3-27）。（2）肛沟围绕肛门之后，不明显（图3-28）。（3）盾板有或无花斑，侧沟不明显。（4）气门板呈逗点状。（5）有眼，须肢长。图3-27残缘璃眼蜱形态学观察（背部）图3-28残缘璃眼蜱形态学观察（腹部）Fig.3-27MorphologicalindentificationofFig.3-28MorphologicalindentificationofHyalommadetritum(Dorsalview)Hyalommadetritum(ventralview)3.2.3.2残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）的超微结构观察（1）假头基长而明显呈长条形，须肢第三节呈三角形，齿式为5/5（图3-29，3-30）。（2）肛沟围绕肛门之后，肛门凸起（图3-31）。（3）爪前段稍有弯曲，爪较长，爪末端较尖，爪垫较厚，爪与爪垫的比值较小（图3-32）。（4）生殖孔上无生殖前板，生殖孔为圆形，中心有凹陷处（图3-33）。 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察39（5）足上四对基节明显依次增大，但增大幅度不明显（图3-34）。（6）孔区呈梨形，孔内表面不光滑（图3-29）。图3-29残缘璃眼蜱的超微结构观察（假头基）图3-30残缘璃眼蜱的超微结构观察（假头基）Fig.3-29UltrastructureindentificationofFig.3-29UltrastructureindentificationofHyalommadetritum（Basiscapituli）Hyalommadetritum（Basiscapituli）图3-31残缘璃眼蜱的超微结构观察（肛沟）图3-32残缘璃眼蜱的超微结构观察（爪垫）Fig.3-31UltrastructureindentificationofFig.3-32UltrastructureindentificationofHyalommadetritum（Analditch）Hyalommadetritum（Footpad）图3-33残缘璃眼蜱的超微结构观察（生殖孔）图3-34残缘璃眼蜱的超微结构观察（基节）Fig.3-22UltrastructureindentificationofFig.3-23UltrastructureindentificationofHyalommadetritum（Genitalopening）Hyalommadetritum（Basesection）3.2.4森林革蜱（Dermacentorsilvarum）的形态学及超微结构观察3.2.4.1森林革蜱（Dermacentorsilvarum）的形态学观察（1）将蜱放在体视显微镜的载物台上，进行观察，假头基基突发达，长约等于其基部之宽，末端钝，躯体背面无几丁质盾板覆盖。（2）观察盾板，珐琅彩覆盖盾板大部分表面，表面粗、细刻点混杂，分布较为稠密（雌蜱）。(图3-35) 40青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究（3）观察肛沟，可见其肛沟围绕肛门之后（图3-36）。（4）观察假头基，假头基矩形，后缘平直，基突粗短而钝（雌蜱）（图3-38）。（4）观察生殖孔，生殖孔有翼状突（雌蜱）（图3-37）。（5）观察足基节，基节Ⅳ外距的末端超出该节后缘（雌蜱）（图3-39）。（6）观察足转节I，足转Ⅰ节背面后缘的距略长，末端尖细（雌蜱）（图3-40）。图3-36森林革蜱形态学观察（雌蜱腹部）图3-35森林革蜱形态学观察（雌蜱背部）Fig.3-36MorphologicalindentificationofFig.3-35MorphologicalindentificationofDermacentorsilvarum(♀,ventralview)Dermacentorsilvarum(♀,Dorsalview)图3-37森林革蜱形态学观察（雌蜱生殖孔）图3-38森林革蜱形态学观察（雌蜱假头基）Fig.3-37MorphologicalindentificationofFig.3-38MorphologicalindentificationofDermacentorsilvarum(♀,Genitalopening)Dermacentorsilvarum(♀,Basiscapituli)图3-40森林革蜱形态学观察（雌蜱转节Ⅰ）图3-39森林革蜱形态学观察（雌蜱基节Ⅳ）Fig.3-40MorphologicalindentificationofFig.3-39MorphologicalindentificationofDermacentorsilvarum(♀,TrochanterⅠ)Dermacentorsilvarum(♀,CoxaⅣ) 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察413.2.4.2森林革蜱（Dermacentorsilvarum）的超微结构观察（1）假头基粗短，无耳状突，齿式为5/5（图3-41，3-42）。（2）肛沟围绕肛门之后，肛门凸起（图3-43）。（3）爪前段高度弯曲，爪末端较钝，爪垫较厚，爪与爪垫的比值较大（图3-44）。（4）生殖孔上无生殖前板，有明显的翼状突（图3-45）。（5）足上四对基节明显依次增大，外距长度大于于内距长度（图3-46）。（6）孔区呈梨形，内有棘突（图3-41，3-42）。图3-41森林革蜱的超微结构观察（假头基）图3-42森林革蜱的超微结构观察（假头基）Fig.3-41UltrastructureindentificationofFig.3-41UltrastructureindentificationofDermacentorsilvarum（Basiscapituli）Dermacentorsilvarum（Basiscapituli）图3-43森林革蜱的超微结构观察（肛沟）图3-44森林革蜱的超微结构观察（爪垫）Fig.3-43UltrastructureindentificationofFig.3-44UltrastructureindentificationofDermacentorsilvarum（Analditch）Dermacentorsilvarum（Footpad）图3-45森林革蜱的超微结构观察（生殖孔）图3-46森林革蜱的超微结构观察（基节）Fig.3-45UltrastructureindentificationofFig.3-46UltrastructureindentificationofDermacentorsilvarum（Genitalopening）Dermacentorsilvarum（Basesection） 42青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究3.2.5青海省蜱的种类鉴定及分布情况2011年6月-12月共采集蜱标本10304只，经鉴定共有青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）7871只（76.4%）、草原革蜱（Dermacentornuttalli）1171只（11.4%）和森林革蜱（Dermacentorsilvarum）1262只（12.2%）三种蜱种存在于调查区域。在本研究中，2012年1月-2012年12月在海西、果洛、海北、海东及西宁市5个地区共采集野外环境及羊群体表蜱标本14870只，经形态学观察共鉴定出有残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）7130只（48.2%），草原革蜱（Dermacentornuttalli）1358只（9.1%）和青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）6382只（42.9%），经统计学分析残缘璃眼蜱和青海血蜱所占比例显著多于草原革蜱（p<0.05）。2011年6月-12月在天峻县的羊体表及野外生境中采集蜱类1679只，经鉴定有青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）559只（33.3%），草原革蜱（Dermacentornuttalli）808只（48.1%）和森林革蜱（Dermacentorsilvarum）312只（18.6%）（见表3-1）。上述分离鉴定总体结果表明，青海省主要蜱种为青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis，14812，55.16%），草原革蜱（Dermacentornuttalli，3337，12.43%），森林革蜱（Dermacentorsilvarum，1574，5.85%）和残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum，7130，26.55%）。表明青海血蜱为调查区域的优势蜱种，并且蜱种类分布具有明显的地域性。表3-1青海省蜱类鉴定结果及分布情况Table3-1MorphologicalidentificationofticksspeciesinQinghaiProvince蜱类种类海西海南黄南果洛玉树海北海东西宁合计TicksspeciesHaixiHainanHuangnanGuoluoYushuHaibeiHaidongXiningTotal1501a1300a1349a938a1294a青海血蜱148122075b2934b2369b362b131bH.qinghaiensis（55.16%）559c356a93a504a344a61a草原革蜱3337385b263b156b275b92bD.nuttalli（12.43%）808c残缘璃眼蜱71301302a1104a950a1677a2097aH.detritum（26.55%）森林革蜱227b142b230b581b82b1574D.silvarum（5.85%）312c合计268537525333927553715305280329593452Total（100%）a.2012年1月-2012年12月在海西、果洛、海北、海东及西宁市5个地区共采集鉴定蜱标本数b.2011年6月-12月海西、海南、黄南、果洛及玉树共采集鉴定蜱标本数c.表示在2011年6月-12月在青海省天峻县采集羊体表及野外生境中采集鉴定蜱标本数 第三章青海省主要蜱类的种类鉴定及主要部位超微结构观察433.3讨论3.3.1青海省蜱的分布与流行学调查蜱是一种非永久性体外寄生虫，广泛寄生在牛、羊、马等家畜及其他陆生脊椎动物上（除鱼类），被蜱叮咬后，可能特定情况下引发地方性人畜共患病--如出血热、森林脑炎、莱姆病巴贝斯虫病、Q热、蜱媒斑疹热、蜱瘫等。蜱病的流行具有区域性。本实验取材来自于青海省不同地区，由于自然环境呈现多样性，故蜱的种类和分布也较丰富，本试验调查表明，青海血蜱主要生活在灌木草甸草场，草原革蜱主要生活在芨芨草丛生的地区，其他研究也得到相似结果(TsunodaT2000)。经本次分离得到的有血蜱属（Haemaphysalis）的青海血蜱（H.qinghaiensis）、璃眼蜱属（Hyalomma）残缘璃眼蜱（H.detritum）、革蜱属（Dermacentor）草原革蜱（D.nuttalli）和森林革蜱（D.silvarum）；样品采集分布地区广，涵盖青海省大部分生态环境，区域跨至16个县市，同时反映出放牧羊群感染率明显高于舍饲羊群。试验中在不同地区分离鉴定出的蜱种类不一致，可能与宿主及寄生虫的流行病学相关，调查发现残缘璃眼蜱亦有寄生于牛腹股内、尾臀部的情况，在山羊则未发现，这是否与宿主不同有关尚待进一步研究。不同蜱种的流行也具有季节性变化，本试验中青海血蜱和草原革蜱在青海省家畜体表寄生的时间是春季，2月份开始感染，在家畜体表寄生吸血，于4月下旬至5月份落地，这一时期正值青海省枯草最后季节，期间家畜自身由于刚刚经历生殖泌乳期，加之渡过漫长的枯草季节，机体本身已经十分衰弱，加之大量蜱侵袭，吸血、排毒、机械损伤等，引起畜禽营养不良、贫血、衰竭等，甚至造成死亡。3.3.2蜱形态学结构特征与鉴定分类世界上许多国家蜱类的研究迅速发展，包括蜱类的分类地位变化、种名订正、新种发现、旧种名遗弃或重新启用等，国内对蜱的数量和种类没有一个完全的统计，有些种类还缺少对应的中文名称(陈泽2008)。范雄林等(范雄林等1998)曾认为我国蜱类有2科11属112种，许荣满则认为有120种(许荣满1998)；最近几年未见有蜱类分类的著作，特别是我国蜱类系统分类不健全，蜱类名录收录不全，分类方法没有更新，需要投入更多的经费和精力加强我国蜱类研究，对一些错误分类及时纠正，对新的分类及时更新，种类变更及时更正，还需要利用好我国的地方性蜱类物种资源，了解其分布的区系特点，更重要的是掌握其携带病原体的能力，对地区性蜱传播规律进行系统研究，以此来完善中国蜱类系统分类方面的或缺和不足，为畜牧养殖业出现的蜱类危害能提供有效的防治措施，为研究蜱的生活史及蜱传疫病的流行学调查提供直接的依据。目前蜱的传统分类主要还是以形态学和生态学特性的相似或差异程度为依据。我国幅员辽阔，物种资源丰富，在一定的环境中同一物种也存在较大的差异，如蜱的某一形态特征可能会发生改变，特别是容易受到分类观察者的主观判断，这也就造成在形态学分类正出现了不同的分类体系，不同学者看法也不尽相同。有证据表明，形态分类可 44青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究以作为蜱种分类的直接依据，据邓国藩等所描述，位于蜱体前端有假头（分为假头基、须肢、螯肢和口下板）以及第1对足跗节接近端部的哈氏器(Haller’sorgan)具有典型的特征。近年来用扫描电镜，研究哈氏器的细微结构广泛用于硬蜱的种类鉴别。在软蜱科的划分上，有学者不支持这一观点，如Barker和Murrell(2004)的结果与其他分类法相比，存在争议，这需要有充分的证据来验证该系统分类法，目前还是倾向于Hoostraal提出的软蜱划分方法。通过比较发现，草原革蜱和青海血蜱的哈氏器在哈氏器的外围轮廓上，前者为圆形，而后者为梯形；前者囊孔边界模糊呈锯齿状，而后者囊孔边界清晰呈条状。此实验所观察到的两种蜱的哈氏器的结构与王多、刘敬泽等（2003）报道的残缘璃眼蜱的哈氏器有差异。鉴于此，说明哈氏器的结构因种属的差异而不同，可以作为种属鉴定的依据。比较各成蜱齿式的形态结构，发现：青海血蜱的齿式为6|6，残缘璃眼蜱的齿式为5|5，森林革蜱齿式为4|4，草原革蜱的齿式为3|3，说明齿式的排列方式因种属的不同而不同，可以作为鉴定依据。各蜱的孔区形态结构有明显的区别，草原革蜱孔区呈倒“八”字形，青海血蜱孔区呈正“八”字形，两者孔内有凹点的孔；而森林革蜱和残缘璃眼蜱的孔区均呈“梨形”，但前者孔区内有棘突，后者孔内没有棘突。鉴此，蜱的孔区的形状、孔内形态等可以作为近似蜱种的鉴定依据之一。草原革蜱爪与爪垫的比值明显大于青海血蜱爪与爪垫的比值。说明爪垫在不同种属直接存在差异，爪的基部有发达程度不一，可以作为种属鉴定的理论依据之一。本试验中证明，青海省蜱类的分布具有明显的地区性，不同采样地区蜱种不全相同，但以青海血蜱为主要种类，进一步通过分子生物学的方法（如蜱类线粒体基因的特征，核糖体小RNA干涉，形态学描述结合分子生物学全证据方法等）加以鉴定，实现完善我国蜱类系统分类问题。蜱类寄生调查中，要注重研究蜱类的宿主（主要是牛，羊，人）特征、研究寄生虫生活史、比较不同种的蜱类进化关系，这些研究能成为鉴定蜱分类及其演化提供直接依据，更有助于建立更自然、客观的蜱系统分类体系。随着分离鉴定采样地区分布的增加，新的方法和技术在研究中被越来越多的应用，我国蜱类的分布和分类学研究肯定会取得新进展，但面临的必然是一项长期而艰巨的的任务。3.4小结应用传统的形态学方法对对分离自青海省各地市的蜱进行了系统的鉴定，所有分离到的蜱属于以下四大类：草原革蜱、青海血蜱、森林革蜱及残缘璃眼蜱。应用扫描电镜观察了四种蜱的假头基，齿式，肛沟，生殖孔，爪垫，哈氏器和孔区等超微结构，表明他们在形态学上具体有明显差异，本研究证实这些结构特征可作为蜱的种属鉴定的依据。同时，本部分的统计数据为研究青海省蜱的生态学提供了数据支持。 第四章蜱传斑点热群立克次体青海分离株鉴定与遗传进化分析45第四章蜱传斑点热群立克次体青海分离株鉴定与遗传进化分析立克次氏体（Rickettsia）是一类专性寄生于真核细胞内的革兰氏阴性原核生物，是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物。立克次体属(Rickettsia)的立克次体分为2个群，即斑疹伤寒群立克次体(TyphusGroupRickettsiae)和斑点热群立克次体(SpottedFeverGroupRickettsiae，SFGR)。斑点热是一群病原体为斑点热群立克次体(SFGR)引起的疾病总称，包括：落矶山斑点热、钮扣热、北亚蜱传斑点热、昆士兰斑点热、立克次体痘和日本红疹热等十种。人感染发病后可出现发热、虫咬溃疡、局部淋巴结肿大、皮疹、头痛等临床表现，晚期可因心、肝、肾等脏器功能衰竭而死亡(JP2000;Parolaetal.2013;Walker1989)。迄今为止，国际上共鉴定出10余种斑点热群立克次体，其中已证明对人有致病意义的有6种，即立氏立克次体（R.rickettsii）、西伯利亚立克次体（R.sibirica）、康氏立克次体（R.conorii）、澳大利亚立克次体（R.australia）、小蛛立克次体（R.akari）和日本立克次体（R.japonica）(叶晓东2008)。我国自1958年开始了斑点热群立克次体的研究，并在血清学上了证实了斑点热群立克次体在我国存在感染；并于1962年从黑龙江虎饶地区东方田鼠（Microtusfortis）体内首次分离到了斑点热群西伯利亚立克次体（R.siberian）(叶晓东2008)。此后范明远等也于1964年报道了内蒙古当地居民曾经感染北亚热和立克次体痘的血清学证据(范明远1964)。此后我国科学家广泛开展了斑点热群立克次体的流行病学调查及病原学研究工作，结果显示西伯利亚立克次体、内蒙古立克次体、黑龙江立克次体等在我国广泛存在，且由西伯利亚立克次体感染引起的北亚蜱传斑点热病在我国分布较为广泛。近年来，随着全球气候变暖，新的蜱传疫病层出不穷，新发及再发立克次体感染逐年上升，虽然我国病原生物学家对蜱传斑点热群立克次体的分布进行了大量调查，但是仅局限于部分省区，且所调查省区均有SFGR感染阳性的报道，因此可推断SFGR在我国广泛分布。青海省地处我国青藏高原，有着独特的地理生态及气候，且关于蜱传斑点热群立克次体遗传变异及多样性的资料较少，是否存在新的蜱传斑点热群变种尚需详实的分子流行病学资料。本研究拟对青海省的蜱传斑点热立克次体进行分子流行病学研究，并进行菌株遗传进化分析。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1主要仪器及试剂体视显微镜（XTL-2400，北京市科仪电光仪器厂），数码相机（OLYMPUS，6400），数码显微镜（DMB5-2231-5，MOTIC公司），隔水式恒温培养箱（GHP-9080，上海一恒科技有限公司)，昆虫保存液（70%酒精，5%甘油），白布旗（85cm×85cm），培养皿， 46青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究镊子，试管，塑料瓶，毛刷等。琼脂糖，LB平板培养基，LB液体培养基，TAE缓冲液，EB核酸燃料。BloodGenMiniKit（0.1-1mL）血液基因组柱式小量提取试剂盒（0.1-1mL）（北京康为世纪生物科技有限公司），2×TaqMasterMix（含染料）（北京康为世纪生物科技有限公司），快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），pUC-TTA克隆试剂盒（含载体，连接酶，感受态细胞）（北京康为世纪生物科技有限公司）。4.1.1.2蜱类样本蜱类样本来自放牧牛、羊体表及野外生境。4.1.2方法4.1.2.1蜱标本采集见第三章。4.1.2.2蜱类标本制作与保存见第三章。4.1.2.3蜱类鉴定见第三章。4.1.2.4蜱类标本DNA提取将所有采集到且经形态学种属鉴定的蜱标本于75%乙醇中消毒体表，无菌PBS反复洗涤3次，滤纸吸干。每个样品池均取同一采集地区及同一种属3-8只未饱血或1-3只饱血的蜱标本于白色乳钵内，加液氮研磨至粉末后移入1.5mL离心管中。我们采用商业化的UniversalGenDNAKit通用型柱式基因组提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）根据产品说明书进行蜱标本的DNA基因组抽提，所有提取的蜱标本基因组于-20℃保存备用。具体步骤如下：⑴3-8只未饱血或1-3只饱血的蜱标本于白色乳钵内，加液氮研磨至粉末后移入1.5mL离心管中。加入200ΜlBufferSA，涡旋混匀。⑵向以上溶液中加入20μLProtease，混匀。⑶加入200μLBufferGL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1min。⑷56℃孵育10min，其间颠倒混匀数次。⑸加入200μL无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。离心1-2min，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。⑹将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube)的吸附柱(SpinColumnDM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000r/min离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑺向吸附柱中加入500μLBufferGW1（使用前加入无水乙醇），10,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑻向吸附柱中加入500μLBufferGW2（使用前检查是否加入无水乙醇），10,000 第四章蜱传斑点热群立克次体青海分离株鉴定与遗传进化分析47r/min离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。为了进一步提纯DNA，重复上述操作1次。⑼10,000r/min离心2min，弃去收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。⑽将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μLBufferGE或灭菌水，室温放置2-5min，10,000r/min离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。4.1.2.5斑点热群立克次体PCR检测引物设计与合成根据已发表文献SFGR190kD外膜蛋白A（outermembraneproteinA，OmpA）基因设计特异性PCR扩增引物：F-P：5’-ATGGCGAATATTTCTCCAAAA-3’；R-P：5’-GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-3’，扩增目的片段长度~631bp（Rr190.70p/Rr190.701n）（ZouY，WangQ，FuZ，etal.2011）。引物序列由北京六合华大基因（BGI）科技股份有限公司合成。4.1.2.6斑点热群立克次体PCR扩增PCR反应试剂采用2×TaqMasterMix(含染料)（北京康为世纪生物科技有限公司）进行PCR反应检测斑点热群立克次体，PCR反应体系（50μL）参照试剂盒说明书配制。⑴PCR反应体系:2×TaqMasterMix25μL，ForwardPrimer2μL(10µM)，ReversePrimer2μL(10µM)，TemplateDNA2μL，RNase-FreeWater19μL，总反应体系为50μL反应体系。⑵PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃30s；72℃60s，35个循环；72℃7min。4.1.2.7PCR扩增产物电泳⑴称取0.5g琼脂糖于一锥形瓶中，加入50mL的电泳缓冲液（1×TAE）融化，旋摇使之均匀混合。⑵融化的琼脂糖冷却至55℃，加入5μL溴化乙锭溶液(10mg/mL)，使其终浓度为0.5μg/mL，轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。⑶将凝胶平板两端用胶纸封闭，放置样孔梳，梳齿位置在平板底面上0.5~1.0mm，以保证琼脂糖浇灌至平板时形成符合要求的加样孔。倒入融化的琼脂糖，需保证在梳子的下方不留气泡，凝胶表面的气泡需要在凝胶凝固之前将之排除，凝胶的厚度在0.5~1cm。⑷待凝胶溶液完全凝结，室温下30～45min。从凝胶平板上取下封闭的胶纸，取下样孔梳，小心不要撕裂样品孔。⑸将装有凝胶的平板放入电泳槽中，加入足量的电泳缓冲液，覆盖并超过凝胶约1mm（或刚好浸及整个样孔），需保证样孔中没有气泡。⑹取样品5μL，与1-2μL6×LoadingBuffer混合，用微量移液枪反复吸吹混匀， 48青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究再将混合液点到凝胶孔中，设立适当的DNA相对分子质量标志物（Marker），加至样品孔的左侧孔内。⑺确保导线正确连接，使DNA在凝胶中向阳极（红色插头）侧泳动。将电压设定为90V，将凝胶装置加盖，开始电泳。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。⑻当上样缓冲液中的溴酚蓝颜料迁移至凝胶的1/2~2/3处时，关闭电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖。⑼将电泳后的凝胶置于凝胶成像系统（Tanon-1600，天能生物科技有限公司）观察结果。4.1.2.8斑点热群立克次体OmpA基因PCR产物回收采用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）进行斑点热群立克次体OmpA基因PCR产物回收⑴将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管（自备）中称重。⑵向胶块中加入3倍体积BufferPG；当琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积BufferPG（如凝胶重为100mg，其体积可视为100μL，依此类推）。⑶50℃孵育10min，其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。⑷加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀(如凝胶重100mg，则加入100μL的异丙醇）。⑸向已装入收集管（CollectionTube）中的吸附柱（SpinColumnDM）中加入200μLBufferPS，13,000r/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑹将步骤3或4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，13,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。⑺向吸附柱中加入500μLBufferPG，13,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。⑻向吸附柱中加入750μLBufferPW（使用前加入无水乙醇），13,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。⑼13，000r/min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。⑽将吸附柱放到一个新的1.5mL离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLBufferEB（pH8.5），室温放置2min。13,000r/min离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。4.1.2.9斑点热群立克次体OmpA基因T载体克隆采用pUC-TTA克隆试剂盒（含载体，连接酶，感受态细胞）（北京康为世纪生物科技有限公司）进行斑点热群立克次体OmpA基因克隆。 第四章蜱传斑点热群立克次体青海分离株鉴定与遗传进化分析49⑴TA克隆反应体系：PCRProduct（Purified）7L，pUCT-vector、T4DNALigaseBuffer（10×）和T4DNALigase各1L。⑵16℃连接过夜。⑶将连接产物3L加入至50LDH5α感受态细胞中（请将感受态细胞置于冰上融化），冰浴30min。⑷42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。⑸加入450L无菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，200r/min振荡培养45min，使菌体复苏。⑹取50L，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16h。⑺蓝白斑筛选后，LB液体培养基摇菌后将菌液送送北京六合华大基因（BGI）有限公司进行序列测定鉴定。4.1.2.10斑点热群立克次体OmpA基因遗传进化分析经鉴定的阳性克隆于LB液体培养基中37℃摇菌培养12～16h，取菌液1mL送国家人类基因组北方研究中心进行序列测定。测序结果经DNASTARSeqEdit剪辑拼装后与GenBank中发表的SFGROmpA基因（表6-1）(Rouxetal.1996;Zhangetal.2000;Zouetal.2011;冯帅2013;张健之1996;邹亚学2011)进行BLAST一致性比对分析，然后利用MEGA6.06和DNA6.0软件进行遗传进化距离和同源性分析并构建分子系统进化树。表4-1用于比对分析的蜱传斑点热群立克次体参考基因序列Table4-1ThegenesequencesofSpottedFeverGroupRickettsiaforcontrastiveanalysis立克次体种类名称注册号国家RickettsiaNameAccessionNo.Country马塞立克次体MtulU43799法国日本立克次体YMU43795日本扇头蜱立克次体3-7-6U43803密西西比内蒙古立克次体HA-91U43796中国内蒙古西伯利亚立克次体BJ-90AF179365中国北京西伯利亚立克次体246U43807前苏联斑点热群立克次体JL-02AY093696中国吉林斯洛伐克立克次体13-BU43808斯洛伐克黑龙江立克次体HLJ-054AF179362中国黑龙江绥汾黑龙江立克次体HL-93AF179364中国黑龙江虎林福建立克次体FUJAF169629中国福建 50青海省主要蜱种形态学及蜱传疫病分子流行病学研究蒙大拿立克次体VR-611U43801俄亥俄立氏立克次体RU43804加拿大非洲立克次体ESF-5U43790埃塞俄比亚S株SU43805前苏联康氏立克次体M1U43794前苏联斑点热群立克次体DnS28AF120018前苏联斯洛伐克立克次体IRS4AF141911斯洛伐克斯洛伐克立克次体IRS3AF141909斯洛伐克斑点热群立克次体JL-3DQ188830中国吉林珲春斑点热群立克次体JL-95DQ188831中国吉林珲春河北株立克次体暂定种QHD-1HQ651815中国河北秦皇岛河北株立克次体暂定种QHD-3HQ651817中国河北秦皇岛河北株立克次体暂定种TS-1HQ651818中国河北唐山河北株立克次体暂定种TS-2HQ651819中国河北唐山河北株立克次体暂定种ZJK-1HQ651823中国河北张家口河北株立克次体暂定种ZJK-2HQ651824中国河北张家口斑点热群立克次体GL-1中国青海果洛斑点热群立克次体HUN中国青海黄南4.1.2.11数据分析本研究不同地区间SFGR感染率差异采用SPSS16.0软件进行Chip-Square统计学分析；P<0.01表示差异极显著，0.01
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