人类乳头瘤病毒感染与肺癌关系的系统评价与Meta分析

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码气囊陰ｒ＾＠￡±±１？．‘打蠢．＂＂巧人类乳头瘤病毒感染与肺癌关系的’４．ｔｅ；隸专；■＾统评价与Ｍｅ诗，，系ｔａ分析．締巧＾公。，公‘．ｉ的ｔ看：户生姓名：吕学英萨．．繼指导教师、职称：奉水东副教授心方雜誦－辩鮮；学科专业：公共卫生与预防医学，茂：话／；号、麵－ｔｏｔ：於苗攤巧隊刪驚；！；熏終撫游洗需 人类乳头瘤病毒感染与肺癌关系的系统评价与Ｍｅｔａ分析论文作者签名：疹化＾指导教师签名；４＾＾论文评阅人１：史寺永轉评河人２：王乐三评阅人３：答辩委员会主席：委员１：蒼取聲王委员２：琴委员３；義咏吁委员４＝轉挪委贡５：委员６：答辩日期：文月 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进斤的研究工作及取得的研巧成果。尽我所知，除了论文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我巧同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：年月日ｋＩ南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博巧±学位期间在导师指导下完成＾的学位论文。论文的研巧成果归南华大学所有，本论文的研巧内容不得其它本位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校单论有或权部保留学位文，允许学位论文被査阅和借阅；学校可公布学位论文的全部分内容，可Ｗ采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部口规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕±学位论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研巧所将本学位论文收录到《中国学文位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论，解密后适用该授权。作者签名：年ｂ月日Ｉ导师签名：＃朗日獻Ｖ＾ 人类乳头瘤病毒感染与肺癌关系的系统评价与Meta分析摘要：背景：人类乳头瘤病毒（HPV）感染是否与肺癌相关以及关联的强度有多大，目前仍存在争议。目的：系统评估及定量分析肺癌组织中HPV感染的水平以及与肺癌发生的关系，为肺癌的预防和临床治疗提供理论依据。方法：以人类乳头瘤病毒和肺癌或肺肿瘤为关键词，检索国内外相关中英文数据库，按事先制定的文献纳入和排除标准筛选文献，共纳入102篇有效研究，分别对68篇横断面研究（累积检测肺癌病人6449例）进行HPV感染率的定量估计，34篇病例对照研究（累积病例2882例，对照1174例）进行OR的定量估计。采用Stata12.0进行统计学检验，双侧P<0.05为有统计学意义。异质性检验评估使用Q及I2统计量，发表偏倚使用漏斗图、Begg秩相关、Egger线性回归法和剪补法进行识别及评估。结果：肺癌HPV感染率为15.7%，95%CI为（11.4%–20.6%）。其中亚洲、欧洲、美洲地区的感染率及95%CI分别为19.9%（13.1%–27.7%），8.8%（4.8%–13.8%），17.0%（6.5%–31.3%）；PCR法、ISH法、IHC法检测HPV的感染率及95%CI分别为14.2%（9.6%–19.5%），11.0%（5.1%–18.8%），36.3%（30.2%–42.6%）。HPV感染与肺癌的OR为7.02，95%CI：5.03–9.80，P<0.001。其中HPV感染与肺鳞癌的OR为8.23,95%CI:5.43–12.46，P<0.001；HPV感染与肺腺癌的OR为5.16,95%CI:3.25–8.21，P<0.001。结论：1.HPV在肺癌中的感染率为15.7%，与检测地区和检测方I 法有关；2.HPV感染是肺癌的危险因素，HPV感染患肺癌的危险是非感染的7.02倍；3.HPV感染与肺癌组织学类型有关，肺鳞癌发生危险高于肺腺癌。关键词：HPV；肺癌；鳞癌；腺癌；II THEASSOCIATIONBETWEENHUMANPAPILLOMAVIRUSINFECTIONSANDLUNGCANCER:ASYSTEMATICASSESSMENTANDMETA-ANALYSISXueyingLv(Publichealthandpreventivemedcine)DirectedbySuidongFengassociateProfessorAbstract：Background：Whetherhumanpapillomavirus(HPV)infectionisstronglyassociatedwithlungcancerstillremainscontroversial.Objective:OurstudyisaimedatsystematicallyevaluatingandquantificationallyanalysisingtheprevalenceofHPVinfectioninlungcancertissueandthepotentialcausalassociationbetweenHPVandlungcancer,inordertoprovidetheoryevidenceforthetreatmentandpreventmentoflungcancerpatients.Methods:Usingthesearchterms“lungcancerorlungtumororlungcarcinoma”,“HPV”andtheircombinations,wehaveacomprehensivesearchoftherelevantdatabasesathomeandabroad.Accordingtoanestablishedinclusionandexclusioncriteria,weselected102eligiblestudies.Werespectivelyconductedaquantitativeestimateoftheinfectionratein68cross-sectionalstudies,foratotalof6449lungcancerpatientsdetectedtheHPVinfectionrate;aquantitativeestimateofoddsratio(OR)in34medicalrecordcontrolstudies,foratotalof2882lungIII cancerpatientsand1174non-cancercontrols.AllstatisticaltestswereperformedwiththeStata12.0(StataCorporation,CollegeStation,TX,USA).A2-tailedP<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.HeterogeneityamongstudieswasexaminedusingtheCochran’sQtestbycalculatingthePvalueandquantifiedusingtheI2statistic.Publicationbiaswasdetectedandassessedbyfunnelplot,BeggrankcorrelationandEgger’slinearregressiontest,trimandfillmethod.Results:Thepooledrateof68cross-sectionalstudiesshowedthat15.7%(95%confidenceinterval(CI):17.2%–25.9%)oflungcancerpatientswereinfectedbyHPV.Furthermore，theinfectionrateinAsiancountries,Europeancountries,NorthandSouthAmericarespectivelywas19.9%（95%CI:13.1%–27.7%），8.8%（95%CI:4.8%–13.8%），17.0%（95%CI:6.5%–31.3%）；theinfectionratedetectedbyPCR、ISHandIHCrespectivelywas14.2%（95%CI:9.6%–19.5%），11.0%（95%CI:5.1%–18.8%），36.3%（95%CI:30.2%–42.6%）.ThepooledORvalueof34case-controlstudiesshowedthatHPVinfectionwasassociatedwithlungcancer(OR=7.02,95%CI:5.03–9.80,P<0.001).Furthermore,similarresultswerealsoobservedinlungsquamouscellcarcinoma(SCC)(OR=8.23,95%CI:5.43–12.46,P<0.001),andlungadenocarcinoma(AC)(OR=5.16,95%CI:3.25–8.21,P<0.001).Conclusions:1.TheHPVinfectionrateoflungcancerpatientsis15.7%andisrelatedtotheareaandmethodofdetection.2.HPVinfectionmaybeariskfactorforlungcancer,theriskofHPVinfectioninIV lungcancerpatientsisseventimesthatofnon-cancerpatients.3.HPVinfectionisassociatedwiththehistologicaltypeoflungcancer,andtheoccurrenceriskofSCCishigherthanthatofAC.Keywords:HPV;lungcancer;SCC;AC；V 目录摘要...........................................................................................................IAbstract..................................................................................................III第1章前言............................................................................................1第2章资料与方法................................................................................32.1资料来源............................................................................................32.2文献纳入/排除标准...........................................................................32.3质量控制............................................................................................32.4文献数据提取...................................................................................42.5统计分析...........................................................................................4第3章结果............................................................................................73.1肺癌HPV感染率的Meta分析.......................................................73.1.1纳入研究的一般特征....................................................................73.1.2Meta分析........................................................................................93.1.3分层分析........................................................................................93.2HPV感染与肺癌的关系...................................................................93.2.1文献检索概况.................................................................................93.2.2文献质量评价结果.......................................................................113.2.3异质性的识别..............................................................................123.2.4异质性的处理..............................................................................133.2.5发表偏倚及敏感性分析...............................................................163.3HPV感染与不同组织学类型肺癌的关系....................................17VII 3.3.1HPV与肺鳞癌..............................................................................173.3.2HPV与肺腺癌..............................................................................18第4章讨论..........................................................................................214.1肺癌HPV感染的状况...................................................................214.2HPV感染与肺癌的关系.................................................................224.3本研究的局限性.............................................................................234.4HPV与肺癌防治.............................................................................23第5章结论..........................................................................................25参考文献................................................................................................27文献综述................................................................................................39作者攻读学位期间的科研成果...........................................................47附录........................................................................................................49VIII 第1章前言第1章前言人类乳头瘤病毒（HPV）为双链DNA病毒，是宫颈癌的主要致病因素，也可能涉及口腔、食管、鼻喉及支气管肿瘤等多种恶性肿瘤的发生。目前研究发现的HPV型别多达65种，具有一个共同的特点——亲上皮细胞性，按照其在肛门与生殖器癌发展中的潜在作用，可分为高危险型（主要包括16、18、31和33型）及低危险型（主要包括6和11型）。高危型HPV可能促进癌变，因为其DNA常与宿主基因组发生整合，而低危型HPV则主要存在于子宫颈的良性损伤中且不与宿主细胞整合[1]。高危型HPV感染导致肺癌可能主要通过致癌蛋白E6/E7的表达，使p53和Rb蛋白失活，从而干扰细胞循环及细胞的肿瘤抑制功能，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖及转移所致[2,3]。亦有研究表明PI3K/Akt信号途径和c-Jun涉及HPV16E6和E7诱导的HIF-1a、VEGF和IL-8表达和血管生成，通过加强c-Jun和HIF-1a之间的相互作用可促进HIF-1a蛋白的稳定性，因此有助于NSCLC细胞的血管生成[4,5]。此外，高危型HPV还可能与FIHT基因缺失有关[6,7]；HPV-16整合入肺腺癌患者宿主细胞，使其外显子19缺失，可导致EGFR基因突变[8]；而HPV诱导的细胞因子8活化，可上调MMP-2和MMP-9的表达,增加肺腺癌发生的可能性[9]。很多证据，如肺鳞癌的形态学改变与生殖器的HPV损伤相似，用免疫组织化学方法可在肺癌中检测到HPV抗原[10]，用PCR、原位杂交技术及印迹技术可检测到HPVDNA及致癌基因转录物HPVE6/E7mRNA[11,12]，甚至在肺癌病人呼出的呼吸浓缩物（EBC）细胞中可检测到HPV[13]等均支持HPV在肺癌的发生中可能扮演重要角色。然而在不同国家和地区的肺肿瘤中，HPV显示出明显不一致的检出率，且检测到的HPV型别及其与性别、组织学类型等临床特征的关系亦不尽相同。1979年，Syrjanmen等[14]首次发现肺癌支气管中上皮细胞的改变与因HPV感染导致的生殖器官损伤在形态学上极其相似，表明HPV可能涉及支气管鳞状细胞损伤。Hirayasu等[15]发现日本冲绳市肺癌患者HPVDNA检出率明显高于新泻市（79%Vs30%），且HPV感染与高分化鳞癌明显相关，与吸烟状况无关。研究显示HPV可能涉及肺鳞癌的发展，影响鳞癌的组织分化[16]。一项中国的研究[17]显示1 南华大学硕士学位论文非小细胞肺癌（Nonsmallcelllungcancer，NSCLC）患者中检出相当高的HPV16/18型（44.1%），且肺鳞癌与肺腺癌之间有明显差异。但韩国的一项研究[18]显示在肺癌组织中可检测到HPV16、18和33型，其检出率分别为10.7%、9.8%、33%，且与组织学类型及分化情况无关，与Hirayasu等的结果不一致。近些年，腺癌在肺癌中的比例逐渐升高，鳞癌呈下降趋势，特别是非吸烟腺癌的增长引人关注。来自希腊的一项研究[19]发现HPVDNA阳性（主要为HPV16和11型）者主要为腺癌。与中国台湾的一项研究[20]结果相似。关于HPV感染与肺癌的关系，也有许多研究持否定的观点。有研究[21,22]表明HPV对肺癌发生发展的作用很小，因为肺癌标本中HPV检出率相当低。亦有研究[23-25]显示在肺癌标本中检测不到HPVDNA，表明HPV可能不参与肺癌致病。还有研究[26]显示HPV阳性肺肿瘤大部分发生在过去有HPV相关疾病的其它患者，因此可能代表转移瘤。综上所述，HPV在不同地区、不同性别、不同吸烟状况、不同组织学类型及分化的肺癌患者中感染率均不相同，而阐述其与肺癌发生发展病因学关系的报道亦很罕见。此外，HPV的检出水平跟研究样本的来源、样本量以及检测方法等也有一定关系。因此，HPV感染在肺癌中所扮演的角色尚无定论。为解决各研究存在的有争议的问题，本研究拟采用系统评价及Meta分析的方法对目前发表的相关文献进行综合评估及定量分析，探讨各研究间的异质性，以便正确估计HPV感染在肺癌中的作用，为肺癌的预防和临床治疗提供理论依据。2 第2章材料与方法第2章资料与方法2.1资料来源根据课题的目的、意义，明确课题的主题和研究要点以及主要特征，检索PubMed、Springer、WebofScience、中国知网、万方数据库、中国生物医学文献数据库、维普数据库等中英文数据库，以人类乳头瘤病毒（humanpapillomavirus）、肺癌（lungcancer）或肺肿瘤（lungcarcinoma，lungtumor）为检索词，采用主题词与自由词相结合的方法，并辅以手工的方法检索1979年1月-2015年4月的相关研究文献。搜索的文献包括学位论文、会议、手稿等灰色文献。排列整理所检索的文献，选择出综述、社论进一步查找额外可用的文献。2.2文献纳入/排除标准研究对象为肺部肿瘤患者，且通过手术切除和支气管镜活检获得了肺组织标本。根据纳入及排除标准（见下），选择可获得系统评价及meta分析相应数据的文献（具体见流程图）。横断面研究的纳入标准：①组织学诊断为肺癌者。②样本为患者肿瘤组织。③有明确的检测方法。④分析指标为HPV感染率。病例对照研究文献的纳入标准：①研究为病例对照，可比较HPV感染在肺肿瘤组织和非肿瘤肺组织中的不同。②病例及对照组组织学诊断明确。③HPV感染定义为组织中检测到HPVDNA或HPVE6/E7蛋白。④有足够的信息用于评估OR值和95%的置信区间。⑤在几个研究中患者数目出现重叠的，仅纳入样本量最大和信息详细、满足以上所有标准的研究。排除标准：①使用外周血细胞或血清为样本的研究。②细胞及动物实验研究。③综述及meta分析。④评论及个案报道。⑤重复发表及患者数目出现重叠的小样本研究。2.3质量控制系统评价/Meta分析是二次研究，其质量取决于纳入的原始研究的质量。本研究中，使用纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle-OttawaScale，NOS）对所纳入的病例对照研究文献进行质量评分，满分为9分，分别从研究人群选择（4分）、3 南华大学硕士学位论文组间可比性（2分）、暴露因素的测量（3分）3方面进行评分。考虑到横断面研究的meta分析仅是对肺癌患者中HPV感染率的简单合并，纳入文献量大，文献中需提取的信息量却很少，因此未作质量评价。使用关键词人类乳头瘤病毒（HPV）、肺癌或肺肿瘤系统搜索文献共505篇非肺癌或未测HPV280篇潜在的相关文献共225篇细胞或动物实验48篇综述39篇重复数据14篇其他22篇检测肺癌或良性肺疾病患者肺组织中HPV的研究102篇横断面研究68篇病例对照研究34篇病例组为单纯鳞癌7篇病例组为混合组织类型27篇文献筛选流程图2.4文献数据提取按纳入标准选择所需文献并尽可能获得全文。文献数据由两名调查者独立提取并交叉核实，不一致的地方须讨论直至意见一致或由第三方研究人员参与决定。按照研究需要，摘录以下信息：研究作者、发表时间、研究地区、组织来源、检测方法、肺癌组织学类型、样本大小、HPV型别、HPV在病例组和对照组中的感染例数。2.5统计分析采用Stata12.0进行数据处理和统计学检验，双侧P<0.05时认为具有统计学意义。对提取的数据进行Meta分析，定量评估肺癌患者的HPV感染率，肺癌病4 第2章材料与方法例组与对照组中HPV感染暴露比值比（OR值）及相应的95%置信区间（95%CI），Z值用于检验合并OR值及95%CI的统计学意义。通过评估Q统计量检测异质性，并使用I2统计量判断异质性程度的大小[27]。当同时满足P>0.1和I2≤40%时,采用固定效应模型合并其结果，反之则选用随机效应模型，并通过Meta回归及亚组分析进一步评估异质性来源。此外，使用敏感性分析评估合并结果的稳健程度。采用漏斗图及漏斗图对称性检验（Begg秩相关法和Egger回归法）对发表偏倚的潜在影响进行评估[28,29]。当存在发表偏倚时，采用剪补法进一步综合评估其结果。5 南华大学硕士学位论文6 第3章结果第3章结果3.1肺癌HPV感染率的Meta分析3.1.1纳入研究的一般特征共纳入横断面研究68篇（表1），累积检测肺癌病人6449例。其中亚洲（主要包括中国大陆、中国台湾、日本等国家）、欧洲（主要包括法国、希腊、芬兰等国家）、美洲（主要为美国）地区患者分别为3918、1908、623例。检测HPV的方法主要有聚合酶链反应技术（PCR）、原位杂交技术（ISH）、免疫组织化学技术（IHC），或者多种方法联合检测HPV。表1：肺癌HPV感染文献信息研究发表研究检测HPV+作者时间地区方法样本量例数龚金凤[30]2008中国IHC6025王翔[31]1998中国PCR5619田希兰[32]2005中国IHC10248张烜[33]1995中国PCR344俞明锋[34]2000中国PCR4014王国付[35]2002中国IHC5611李明[36]2014中国PCR9825魏俊飞[37]2008中国PCR6343刘鸿瑞[38]1993中国ISH495Miyagi[16]2001日本PCR12141Tsuhako[39]1998日本PCR2318Hirayasu[15]1996日本PCR4334Szabo[40]1994日本PCR470Kinoshita[41]1995日本PCR363Kaya[42]2001土耳其ISH263Halimi[43]2011伊朗PCR303Jain[44]2005印度PCR402Park[18]2007韩国PCR11258Baba[45]2009日本PCR5711Zafer[46]2004土耳其PCR402日本、韩国、中国、新加Goto[47]2011坡PCR304207 南华大学硕士学位论文Hartley[48]2015黎巴嫩PCR190Hsu[49]2009台湾IHC21780Lim[50]2009新加坡ISH1100巴基斯坦、中国、巴布亚Aguayo[12]2010新几内亚PCR598Iwakawa[51]2010日本PCR2970Kato[8]2012日本PCR427Chen[52]2013台湾IHC31991Jafari[53]2013伊朗PCR509Tung[54]2013台湾IHC15168Fan[55]2015中国PCR26222Isa[56]2015日本PCR961Zhang[57]2010中国PCR10418笪冀平[58]1996中国PCR4022Wang[59]2014台湾IHC21074Koshiol[60]2011印度PCR3990Sagawa[61]1995日本PCR81繆若羽[62]2008中国PCR290Carey[25]1990英国ISH150Noutsou[63]1996希腊PCR9915Thomas[64]1996法国PCR315Miasko[65]2001波兰PCR404Clavel[22]2000法国ISH1855Papadopoulou[66]1998希腊PCR5236vanBoerdonk[67]2013荷兰PCR2233Vassilis[68]1999希腊PCR680Syrjanen[69]1989芬兰ISH13112Welt[24]1997德国PCR380Stremlau[70]1985德国ISH241Soini[2]1996芬兰ISH4313Ciotti[71]2006意大利、罗马PCR388Syrjanen[72]2012芬兰PCR774Branica[73]2010克罗地亚PCR843Coissard[21]2005法国PCR2184GiulianiL[74]2007意大利、芬兰PCR7810Gorgoulis[75]1999希腊PCR680Sagerup[76]2014挪威PCR33413Nuorva[77]1995芬兰ISH228Marquez-Medina[78]2013西班牙PCR401Bohlmeyer[79]1998美国PCR342Castillo[80]2005拉丁美洲PCR3610Carlson[81]2007美国PCR120Aguayo[11]2007智利PCR6920Joh[82]2010美国PCR3058 第3章结果Badillo-Almaraz[83]2013墨西哥PCR3916Yanagawa[26]2013加拿大PCR3365Yousem[84]1992美国ISH629Kulski[85]1990美国ISH523.1.2Meta分析因肺癌患者中HPV感染率P<0.2的数据很多，且存在P=0的数据故采用双反正弦法经数据转换后合并效应量。输出结果为：固定效应模型合并效应量及95%CI为0.698（0.674,0.723），合并值具有统计学意义（Z=56.073，P=0.000）；随机效应模型合并效应量及95%CI为0.816（0.690,0.942），合并值具有统计学意义（Z=12.690，P=0.000）。因各研究间存在明显异质性（Q=1694.722，P=0.000），故采用随机效应模型合并效应量。根据公式P=(sin(tpda/2))2，以disp(sin(0.816/2))^2(sin(0.690/2))^2(sin(0.942/2))^2命令得出原数据单个率合并结果，其总合并率为15.7%，95%CI为（11.4%,20.6%）。3.1.3分层分析按地区对亚洲、欧洲、美洲肺癌患者HPV感染状况进行分层分析，得出各地区HPV感染率及其95%CI分别为19.9%（13.1%,27.7%），8.8%（4.8%,13.8%），17.0%（6.5%,31.3%）。其中，中国（N=1890）肺癌患者HPV感染率最高，为29.2%（21.4%,37.5%）。按检测方法进行分层，得出PCR法、ISH法、IHC法检测HPV感染率及95%CI分别为14.2%（9.6%,19.5%），11.0%（5.1%,18.8%），36.3%（30.2%,42.6%）。3.2HPV感染与肺癌的关系3.2.1文献检索概况共纳入病例对照研究的文献34篇（表2），其中病例2882例，对照1174例。纳入研究的HPV检测方法主要采用聚合酶链反应技术（PCR），有5篇研究则采用原位杂交技术（ISH），3篇研究采用免疫组织化学技术（IHC）。所获样本来源于经冷冻或石蜡包埋处理的新鲜手术切除组织或支气管镜活检组织。HPV检测出的亚型主要为高危型16、18。此外，有7篇研究肺癌病例组织学类型全部为鳞癌，27篇研究肺癌病例组织含多种组织学类型，包括鳞癌、腺癌等。22篇研究给出了具体的组织学类型（主要为鳞癌和腺癌）及相应HPV检出情况（表3）。9 南华大学硕士学位论文表2：纳入病例对照研究文献信息研究出版研究检测组织病例组对照组病例组对照组HPV型别作者时间地区方法来源HPV+HPV+样本样本孔令慧[86]2011中国11201471316、18葛云洁[87]2002中国1180421016、18杜华贞[88]2014中国22258805516蒋春樊[89]2007中国11351892016、18柳兴源[90]2014中国11371791116、18郭峻莉[91]2006中国13311761316、18李雪莲[7]2008中国11328984316、18潘显光[92]1996中国13250401816、18周菊[93]2015中国11302632416、18周颖[94]2015中国11251602016、18张锦丰[95]2012中国22172432716戚好文[96]1999中国3293227534未知姜蕊[97]2005中国11211603016、18杨渝浩[98]1998中国1239580406/11、8、16、18、31/33、35宋长芹[99]1997中国1300481016、18张明[100]2009中国13301681216、18胡尔西坦[101]2000中国124411104016、18陈卫强[102]2005中国32614126726、11、16、18黄邦杏[103]2006中国13191441816、18武丽娜[104]2015中国11271491416、18胡克[105]1997中国13160502216、18Bejui[106]1990法国325033106、11、16、18Cheng[20]2001台湾1377161416016、18Galvan[23]2012英、意1100100100未知Gatta[107]2012意大利1221502316、18Wang[108]2010中国11190451616、18Wang[17]2008中国1113843139616、18Fei[109]2006中国32232733416、18Nadji[110]2006伊朗123381298916、18、6、11、26、31徐毅[111]2009中国32320441516、18Yan[112]2009中国1243161097116、18、6Sarchianaki[19]2013希腊121901001616、18、31、33、59、6、11郑建伟[113]2010中国22212453016、18Carpagnano[13]2011意大利12120736816、31、30、39注：检测方法：1=PCR法，2=IHC法，3=ISH法，组织来源：1=冷冻，2=包埋，3=两者兼有。10 第3章结果表3：鳞、腺癌HPV感染文献信息研究作者鳞癌例数HPV阳性腺癌例数HPV阳性对照组样本HPV阳性数数量数孔令慧（2011）2916184131杜华贞（2014）5519254108蒋春樊（2007）6326269551柳兴源（2014）35214416201郭峻莉（2006）41183513111李雪莲（2008）39759251334周菊（2015）29152411242周颖（2015）4218187201张锦丰（2012）20132313272戚好文（1999）134655610342姜蕊（2005）3718233301杨渝浩（1998）50293010405张明（2009）31162611121黄邦杏（2006）3013146181武丽娜（2015）3017194141胡克（1997）2713162220Wang（2008）2151129826964Fei（2006）41133210342Nadji（2006）10424163898Yan（2009）72373767116Sarchianaki（2013）3945012160Carpagnano（2011）3643786803.2.2文献质量评价结果通过NOS量表对纳入的文献质量进行评分（表4），34篇文献评分结果多为6分，表现为“对照的选择（与病例同一人群的住院人员为对照）”，“设计和统计分析时考虑病例和对照的可比性”条目不得分，其中7项研究可达7分,组间可比性方面比6分组多得1分。11 南华大学硕士学位论文表4：病例-对照研究NOS评分研究作者得分研究作者得分孔令慧6陈卫强6葛云洁6黄邦杏6杜华贞7武丽娜6蒋春樊6胡克6柳兴源6Bejui-Thivolet,F6郭峻莉6ChengYW7李雪莲7GalvanA6潘显光6GattaLB7周菊6WangYH6周颖6WangYP6张锦丰6FeiY6戚好文6NadjiSA7姜蕊6徐毅6杨渝浩6YanY7宋长芹6SarchianakiE6张明6郑建伟6胡尔西坦·尼牙孜6CarpagnanoGE73.2.3异质性的识别共纳入HPV感染与肺癌关系的病例对照研究34篇，获得异质性检验统计量Q=46.59，P=0.036，OR值变异对异质性的贡献I2=33.5%，表明所纳入的各研究之间存在轻-中度的异质性。采用随机效应模型合并效应量，得到OR=7.020，其95%CI为（5.026，9.803），合并的OR值具有统计学意义（Z=11.44，P=0.000）。输出的森林图（图1）中宋长芹和Galvan两项研究因病例组、对照组的HPV感染阳性数均为0，无法计算OR值而被排除；按图所示的排列顺序依次编号，研究25与研究3、7、22、29的可信区间无重叠，研究23、27与研究17、25、2812 第3章结果的可信区间重叠较少，提示研究间可能存在异质性。Study%IDOR(95%CI)Weight孔令慧(2011)8.89(1.07,74.08)2.03葛云洁(2002)5.17(0.27,97.34)1.16杜华贞(2014)2.67(1.10,6.48)6.29蒋春樊(2007)12.31(1.58,96.18)2.14柳兴源(2014)8.81(1.08,72.13)2.06郭峻莉(2006)8.27(1.02,66.88)2.08李雪莲(2008)2.12(0.88,5.10)6.35潘显光(1996)60.87(3.42,1083.36)1.20周菊(2015)10.00(2.17,46.17)3.35周颖(2015)13.57(1.70,108.13)2.11张锦丰(2012)8.17(1.71,39.08)3.25戚好文(1999)8.18(1.92,34.86)3.61姜蕊(2005)15.62(1.98,122.87)2.13杨渝浩(1998)6.66(2.37,18.74)5.42张明(2009)8.68(1.06,71.08)2.06胡尔西坦·尼牙孜(2000)26.00(3.44,196.24)2.20陈卫强(2005)15.95(5.49,46.38)5.24黄邦杏(2006)12.92(1.58,105.84)2.06武丽娜(2015)15.95(1.93,131.65)2.05胡克(1997)21.52(1.23,377.00)1.21Bejui-Thivolet,F(1990)4.05(0.21,79.81)1.13ChengYW(2001)3.31(1.71,6.41)7.82GattaLB(2012)0.92(0.08,10.65)1.59WangYH(2010)24.28(1.37,429.83)1.21WangYP(2008)18.14(6.50,50.58)5.46FeiY(2006)7.36(1.62,33.37)3.41NadjiSA(2006)3.48(1.52,7.96)6.67徐毅(2009)80.60(4.48,1451.31)1.19YanY(2009)2.85(1.47,5.54)7.79SarchianakiE(2013)7.90(0.45,137.40)1.22郑建伟(2010)12.25(2.60,57.69)3.29CarpagnanoGE(2011)27.85(1.61,480.23)1.23宋长芹(1997)(Excluded)0.00GalvanA(2012)(Excluded)0.00Overall(I-squared=33.5%,p=0.036)7.02(5.03,9.80)100.00NOTE:Weightsarefromrandomeffectsanalysis.0006911451图1HPV感染与肺癌关系森林图3.2.4异质性的处理通过亚组分析进行异质性处理，以研究的NOS评分来分组，可分为6分和7分两个亚组，其I2均为0.0%，说明每个亚组均无异质性，但将两组合并则I2=33.5%，提示存在轻度的异质性，提示NOS评分不同，可能是异质性的来源之一，见森林图（图2）。因此以研究的NOS评分来进行亚组分析，可以减少因研究质量不同而造成的异质性。如果以肺癌病例组组织学类型来分，可分为两个亚组：肺癌病例混合组（包含鳞癌、腺癌等类型）（1）和单纯肺鳞癌组（2），其I2分别为24.2%和26.6%，每个亚组均存在轻度异质性，将两亚组合并I2=33.5%，13 南华大学硕士学位论文仍为轻度异质性，提示肺癌病例组织学类型可能与异质性关系不大，见森林图（图3）。采用Meta回归对多个协变量进行分析，结果亦提示仅NOS评分与异质性有关（P=0.000），而出版年（P=0.987）、研究人群（赋值1=中国，2=非中国）（P=0.738）、检测方法（P=0.626）、样本组织（P=0.992）、肺癌病例组组织学类型（P=0.330）均与异质性无关。Study%IDOR(95%CI)Weight1孔令慧(2011)8.89(1.07,74.08)2.03葛云洁(2002)5.17(0.27,97.34)1.16蒋春樊(2007)12.31(1.58,96.18)2.14柳兴源(2014)8.81(1.08,72.13)2.06郭峻莉(2006)8.27(1.02,66.88)2.08潘显光(1996)60.87(3.42,1083.36)1.20周菊(2015)10.00(2.17,46.17)3.35周颖(2015)13.57(1.70,108.13)2.11张锦丰(2012)8.17(1.71,39.08)3.25戚好文(1999)8.18(1.92,34.86)3.61姜蕊(2005)15.62(1.98,122.87)2.13杨渝浩(1998)6.66(2.37,18.74)5.42张明(2009)8.68(1.06,71.08)2.06胡尔西坦·尼牙孜(2000)26.00(3.44,196.24)2.20陈卫强(2005)15.95(5.49,46.38)5.24黄邦杏(2006)12.92(1.58,105.84)2.06武丽娜(2015)15.95(1.93,131.65)2.05胡克(1997)21.52(1.23,377.00)1.21Bejui-Thivolet,F(1990)4.05(0.21,79.81)1.13GattaLB(2012)0.92(0.08,10.65)1.59WangYP(2008)18.14(6.50,50.58)5.46FeiY(2006)7.36(1.62,33.37)3.41徐毅(2009)80.60(4.48,1451.31)1.19SarchianakiE(2013)7.90(0.45,137.40)1.22郑建伟(2010)12.25(2.60,57.69)3.29宋长芹(1997)(Excluded)0.00GalvanA(2012)(Excluded)0.00Subtotal(I-squared=0.0%,p=0.976)11.06(7.78,15.71)62.66.2杜华贞(2014)2.67(1.10,6.48)6.29李雪莲(2008)2.12(0.88,5.10)6.35ChengYW(2001)3.31(1.71,6.41)7.82WangYH(2010)24.28(1.37,429.83)1.21NadjiSA(2006)3.48(1.52,7.96)6.67YanY(2009)2.85(1.47,5.54)7.79CarpagnanoGE(2011)27.85(1.61,480.23)1.23Subtotal(I-squared=0.0%,p=0.480)3.09(2.21,4.32)37.34.Overall(I-squared=33.5%,p=0.036)7.02(5.03,9.80)100.00NOTE:Weightsarefromrandomeffectsanalysis.0006911451图2按研究NOS评分进行亚组分析的森林图14 第3章结果Study%IDOR(95%CI)Weight1孔令慧(2011)8.89(1.07,74.08)2.03葛云洁(2002)5.17(0.27,97.34)1.16杜华贞(2014)2.67(1.10,6.48)6.29蒋春樊(2007)12.31(1.58,96.18)2.14柳兴源(2014)8.81(1.08,72.13)2.06郭峻莉(2006)8.27(1.02,66.88)2.08李雪莲(2008)2.12(0.88,5.10)6.35周菊(2015)10.00(2.17,46.17)3.35周颖(2015)13.57(1.70,108.13)2.11张锦丰(2012)8.17(1.71,39.08)3.25戚好文(1999)8.18(1.92,34.86)3.61姜蕊(2005)15.62(1.98,122.87)2.13杨渝浩(1998)6.66(2.37,18.74)5.42张明(2009)8.68(1.06,71.08)2.06胡尔西坦·尼牙孜(2000)26.00(3.44,196.24)2.20黄邦杏(2006)12.92(1.58,105.84)2.06武丽娜(2015)15.95(1.93,131.65)2.05胡克(1997)21.52(1.23,377.00)1.21ChengYW(2001)3.31(1.71,6.41)7.82WangYP(2008)18.14(6.50,50.58)5.46FeiY(2006)7.36(1.62,33.37)3.41NadjiSA(2006)3.48(1.52,7.96)6.67YanY(2009)2.85(1.47,5.54)7.79SarchianakiE(2013)7.90(0.45,137.40)1.22CarpagnanoGE(2011)27.85(1.61,480.23)1.23宋长芹(1997)(Excluded)0.00GalvanA(2012)(Excluded)0.00Subtotal(I-squared=24.2%,p=0.136)5.91(4.27,8.19)85.14.2潘显光(1996)60.87(3.42,1083.36)1.20陈卫强(2005)15.95(5.49,46.38)5.24Bejui-Thivolet,F(1990)4.05(0.21,79.81)1.13GattaLB(2012)0.92(0.08,10.65)1.59WangYH(2010)24.28(1.37,429.83)1.21徐毅(2009)80.60(4.48,1451.31)1.19郑建伟(2010)12.25(2.60,57.69)3.29Subtotal(I-squared=26.6%,p=0.226)13.04(5.15,33.03)14.86.Overall(I-squared=33.5%,p=0.036)7.02(5.03,9.80)100.00NOTE:Weightsarefromrandomeffectsanalysis.0006911451图3按病例组组织学类型进行亚组分析的森林图15 南华大学硕士学位论文3.2.5发表偏倚及敏感性分析绘制漏斗图（图4），可见存在明显不对称。漏斗图不对性检验中Begg秩相关检验所得P=0.089，Egger线性回归法所得P=0.000，提示存在发表偏倚。假设漏斗图不对称仅由发表偏倚造成，采用剪补法进一步评估发表偏倚对合并效应量的影响。剪补前固定效应模型所得效应指标（logOR）合并结果为1.738（1.495，1.981）；随机效应模型所得效应指标合并结果为1.928（1.606，2.250）。采用linear法经6次迭代估计缺失的研究数目为14，将估计缺失的研究纳入之后，重新对所有研究进行Meta分析，固定效应模型所得效应指标合并结果为1.354（1.137，1.571），随机效应模型所得效应指标合并结果为1.442（1.088，1.796）。前后合并效应量估计值波动在0.5以内，变化不显著，说明发表性偏倚影响不大，结果比较稳定。添补14项研究后所得到的漏斗图明显对称。敏感性分析（图5）中见无明显异常研究，提示各单项研究对合并效应量的影响不大。Funnelplotwithpseudo95%confidencelimits0.51StandardErrorofLogOR1.5-20246LogOddsRatio图4HPV感染与肺癌关系的漏斗图16 第3章结果Meta-analysisestimates,givennamedstudyisomittedLowerCILimitEstimateUpperCILimit孔令慧(2011)葛云洁(2002)杜华贞(2014)蒋春樊(2007)柳兴源(2014)郭峻莉(2006)李雪莲(2008)潘显光(1996)周菊(2015)周颖(2015)张锦丰(2012)戚好文(1999)姜蕊(2005)杨渝浩(1998)宋长芹(1997)张明(2009)胡尔西坦·尼牙孜(2000)陈卫强(2005)黄邦杏(2006)武丽娜(2015)胡克(1997)Bejui-Thivolet,F(1990)ChengYW(2001)GalvanA(2012)GattaLB(2012)WangYH(2010)WangYP(2008)FeiY(2006)NadjiSA(2006)徐毅(2009)YanY(2009)SarchianakiE(2013)郑建伟(2010)CarpagnanoGE(2011)4.645.037.029.8010.55图5HPV感染与肺癌关系的敏感性分析3.3HPV感染与不同组织学类型肺癌的关系因病例组设计的不同，为方便两种组织学类型的比较，此处仅纳入同时包含鳞癌、腺癌数据的22篇研究进行分层Meta分析，以探讨HPV感染与鳞癌、腺癌的关系。3.3.1HPV与肺鳞癌异质性检验Q=33.95P=0.037，OR值变异对异质性的贡献I2=38.1%，表明所纳入的各研究之间存在轻-中度的异质性。采用随机效应模型合并效应量，结果为8.230，其95%CI为（5.434，12.464），合并结果具有统计学意义。按NOS评分进行亚组分析，两个亚组其I2均为0.0%，说明每个亚组均无异质性，但将两亚组合并则I2=38.1%，提示存在轻-中度的异质性，表明两亚组之间存在异质性，研究质量评分可能是异质性来源之一，结果见森林图（图6）。敏感性分析显示Wang等的研究对合并效应量影响最大，但无统计学显著性，删除后合并效应量变化不明显。Begg秩相关检验所得P=0.284，Egger线性回归法所得P=0.001，提示存在发表偏倚，但剪补前后，其合并估计值并未发生显著变化。17 南华大学硕士学位论文Study%IDOR(95%CI)Weight6孔令慧(2011)14.77(1.69,129.00)2.90蒋春樊(2007)13.35(1.68,106.07)3.11柳兴源(2014)15.00(1.72,130.59)2.91郭峻莉(2006)9.39(1.11,79.12)2.98周菊(2015)11.79(2.33,59.58)4.45周颖(2015)14.25(1.74,116.57)3.04张锦丰(2012)23.21(4.21,128.15)4.14戚好文(1999)15.07(3.47,65.43)5.07姜蕊(2005)27.47(3.38,223.26)3.06杨渝浩(1998)9.67(3.24,28.82)7.07张明(2009)11.73(1.35,102.24)2.91黄邦杏(2006)13.00(1.53,110.73)2.95武丽娜(2015)17.00(1.96,147.16)2.92胡克(1997)41.90(2.31,760.53)1.79WangYP(2008)25.01(8.87,70.49)7.44FeiY(2006)7.43(1.54,35.80)4.64SarchianakiE(2013)4.18(0.21,82.32)1.70Subtotal(I-squared=0.0%,p=0.998)14.47(9.47,22.10)63.08.7杜华贞(2014)3.10(1.22,7.88)8.15李雪莲(2008)2.12(0.88,5.10)8.57NadjiSA(2006)3.04(1.29,7.16)8.71YanY(2009)3.63(1.76,7.49)9.76CarpagnanoGE(2011)18.40(0.96,351.89)1.73Subtotal(I-squared=0.0%,p=0.678)3.09(2.04,4.68)36.92.Overall(I-squared=38.1%,p=0.037)8.23(5.43,12.46)100.00NOTE:Weightsarefromrandomeffectsanalysis.001311761图6HPV与肺鳞癌关系的森林图3.3.2HPV与肺腺癌异质性检验结果显示：Q=32.42（P=0.053），I2=35.2%，采用随机效应模型合并效应量，结果为5.164（3.250，8.206），合并结果有统计学意义。以研究的NOS评分进行亚组分析，得到6分组和7分组的I2分别为0.0%和80.6%，一起合并时I2为35.2%，提示两亚组之间可能无明显异质性，NOS评分与异质性关系不大，结果见森林图（图7）。此外，7分组的合并结果不具有统计学意义（Z=1.61，P=0.106）。敏感性分析显示YanY的研究对合并效应量影响最大，但并无统计学显著性。Begg秩相关检验所得P=0.284，Egger线性回归法所得P=0.070，95%CI包含0，提示不存在发表偏倚。18 第3章结果Study%IDOR(95%CI)Weight6孔令慧(2011)3.43(0.34,34.99)3.10蒋春樊(2007)10.06(1.15,87.85)3.44柳兴源(2014)5.71(0.67,48.83)3.50郭峻莉(2006)7.09(0.82,61.00)3.48周菊(2015)9.31(1.78,48.72)5.02周颖(2015)12.09(1.31,111.66)3.31张锦丰(2012)16.25(3.09,85.42)5.01戚好文(1999)3.48(0.71,16.95)5.31姜蕊(2005)4.35(0.42,44.88)3.07杨渝浩(1998)3.50(1.05,11.69)7.19张明(2009)8.07(0.90,72.08)3.39黄邦杏(2006)12.75(1.31,124.36)3.19武丽娜(2015)3.47(0.34,35.06)3.12胡克(1997)7.76(0.35,173.48)1.92WangYP(2008)8.31(2.77,24.87)7.85FeiY(2006)7.27(1.45,36.47)5.19SarchianakiE(2013)10.71(0.60,191.81)2.18Subtotal(I-squared=0.0%,p=0.997)6.75(4.33,10.52)69.27.7杜华贞(2014)1.12(0.30,4.13)6.63李雪莲(2008)13.67(4.52,41.33)7.79NadjiSA(2006)2.34(0.55,9.96)5.90YanY(2009)0.67(0.24,1.88)8.24CarpagnanoGE(2011)40.86(2.28,731.85)2.18Subtotal(I-squared=80.6%,p=0.000)3.18(0.78,12.99)30.73.Overall(I-squared=35.2%,p=0.053)5.16(3.25,8.21)100.00NOTE:Weightsarefromrandomeffectsanalysis.001371732图7HPV与肺腺癌关系的森林图19 南华大学硕士学位论文20 第4章讨论第4章讨论肺癌是人类恶性肿瘤中致死率最高的癌症，其发生及演变是一个复杂的过程。吸烟被公认为是最主要的致病因素，然而吸烟者发展成肺癌的比例不足20%，因此其它因素，如烹调油烟、二氧化硅、石棉、砷、住宅内氡等暴露亦成为关注的焦点。但HPV感染与肺癌的关系一直存在一定的争议性。研究显示宫颈癌，头颈部癌、肺癌及健康对象的血浆中均可检测出HPVDNA[114-117]，表明HPV在机体组织存在的广泛性。但通过血清学检测HPV可能仅表示HPV的暴露，无法定位感染的位点[118]。因此，我们排除使用外周血细胞及血清样本的研究，仅选用以肺癌组织为检测样本的研究来定量分析肺癌HPV的感染水平及与肺癌的关系。4.1肺癌HPV感染的状况自从Syrjanmen首次提出HPV感染可能涉及支气管鳞状细胞癌之后，大量的研究采用不同方法对肺癌组织中的HPV进行了检测，但不同研究的感染率结果存在较大差异。基于此，我们通过Meta分析对68个横断面研究进行综合定量分析，合并效应量显示，肺癌癌组织中的HPV检出率为15.7%，略低于Srinivasan等[119]的报道结果（20.7%）。按地区分层分析中，欧洲、中国和台湾地区患者HPV率低于Syrjanen等[120]的报道（欧洲：16.9%，中国和台湾：37.7%）。中国肺癌患者的HPV检出率总体高于其他地区，美洲地区的相关研究则相对较少，可能会对合并结果产生一定影响。Hasegawa等[121]也报道了非吸烟非小细胞肺癌HPV检出率在各地区中的差异。Ragin等[122]报道了HPV16/18感染与性别、年龄、种族、吸烟、组织学类型、临床分期的关系及对总生存率的影响。因此，肺癌患者的性别、来源地区、吸烟状况及组织学类型等都可能与HPV感染率有关。按检测方法分层，IHC法检测的HPV感染率高于PCR法和ISH法，PCR法略高于ISH法，所以使用不同敏感性的检测方法可能会对结果产生一定影响。在中国内地和台湾的几项研究[30,32,35,49,52,54,59]中，使用IHC法检测HPVE6或E7蛋白表达以确定HPV感染，似乎均有较高的检出率。其他研究[16,26,39,47]显示，PCR和ISH21 南华大学硕士学位论文检测HPVDNA似乎有较高的一致性。然而亦有研究表明ISH法检测HPVDNA的敏感性较低，PCR法则可能产生较高的假阳性[123]，PCR法检测为阳性的患者在联合ISH法检测时可能不显示阳性信号[79]。此外，使用不适当的引物对检测方法的敏感性也会产生影响。在HPV阳性病例中E2基因旁的L1基因的整合部分可能是缺失的，因此选择MY09/MY11引物进行HPV检测可能会导致阴性结果。综上可知，进一步的研究应统一检测方法、引物设置，以便获得肺癌HPV感染率与性别、吸烟、地区等因素相关关系的更可靠数据。4.2HPV感染与肺癌的关系HPV感染导致肺癌发生的机制，主要是由HPVDNA与宿主基因组整合后转录和表达致癌蛋白E6/E7，致抑癌基因P53突变或失活引起。然而部分肺癌尽管其肿瘤组织中存在HPVDNA，但HPV整合入宿主基因组的病毒载量极低，几乎无E6/E7mRNA及蛋白的表达，因此很难确定其对癌变的作用[11,45]。Anantharaman等[124]认为HPV感染与肺癌之间不存在病因学关系，因为研究发现HPVDNA的检测存在很高的假阳性，且可能受吸烟及组织学类型等因素的影响。尽管约10%的肺肿瘤HPVDNA阳性，但是检测不到致癌蛋白E6/E7的表达。肺癌中HPV感染与生存预后的研究表明HPV感染患者生存结果（总生存率）明显优于未感染者，HPV16和HPV18阴性I期NSCLC患者预后较差[49,59]。此外，还有一些研究[67,125,126]表明HPV阳性肺癌可能是来自于HPV相关的其他原发癌的肺转移，而肺癌的发生并非HPV感染所致。因此，HPV感染与肺癌的关系尚难定论，有待于进一步的基础研究与流行病学研究进行确认。本研究我们采用Meta分析对HPV感染与肺癌的关系进行综合定量评估，希望得到一个量化的判断结果。合并效应量OR显示，在肺癌组织中HPV感染的风险明显高于良性肺疾病患者肺组织或癌旁非肿瘤组织，表明HPV感染与肺癌发生有关（OR=7.020，95%CI=（5.026，9.803），P<0.001）。通过组织学类型分层分析亦可得到相似的结果（鳞癌：OR=8.230，95%CI=（5.434，12.464），P<0.001；腺癌：OR=5.164，95%CI=（3.250，8.206），P<0.001），与Zhai等[127]的研究结果相似。与同一对照组相比，HPV与鳞癌关系的合并效应量明显高于腺癌，表明HPV感染致肺鳞癌发生的危险高于肺腺癌，这与鳞癌组织中HPV感染率高于腺癌密切相关。Meta回归分析提示研究间异质性与出版时间、研究地区、HPV检测方法、22 第4章讨论样本组织类型等无关，与研究质量评分有关。这可能与研究质量评分较高的组其病例组与对照组组间可比性较好，对性别、吸烟因素进行了匹配或控制，而质量评分较低的组未对任何干扰因素进行控制有关。众所周知，吸烟是肺癌的主要致病因素，而不同性别其吸烟状况亦有所不同，因此，吸烟和性别可能成为HPV感染与肺癌关系评估的重要干扰因素。此外，因对照组样本的难获得性，导致各研究中病例组与对照组数目相差较大，效应量OR值及其95%置信区间波动较大。HPV感染与肺癌关系的漏斗图表现为不对称，在漏斗图的底部出现一个角落的缺失，表明研究结果可能受到发表偏倚的影响。在这种情况下Meta分析往往会高估HPV感染与肺癌的联系。我们采用剪补法进一步综合定量评估，发现剪补前后合并估计值并无明显变化，表明发表偏倚影响较小或无。实际上，发表偏倚并不是漏斗图不对称的唯一原因，研究设计、结果解释等原因亦可导致漏斗图不对称。在HPV感染与鳞癌、腺癌的关系分析中，Wang和Yan等研究的OR值相对分散，删除后异质性明显减少，但合并结果并未发生显著变化，故异质性可能来源于小样本抽样误差。4.3本研究的局限性所纳入横断面研究中，患者来源地区、肺癌组织学类型、检测HPV感染的方法、检测HPV所使用的引物及探针等多种多样，这很大程度地影响了HPV检出率，使HPV检出率在不同研究中波动较大，以至我们对检出率的定量合并应持审慎态度。在探索HPV感染与肺癌病因关系的Meta分析中，亦存在以下不足。首先，我们纳入的研究主要来源于国内，其他地区则因感染率较低而研究相对较少，这可能低估地区及种族差异在HPV与肺癌关系评价中的作用。其次，考虑到病例组与对照组之间的可比性，吸烟状况、性别、年龄等因素可能需要进行控制，而我们所纳入的多数研究无相关数据可供分析。同时，部分研究病例组数目远大于对照组数目亦可能影响合并效应的真实性及稳定性。最后，小细胞肺癌可能有较低的HPV感染率[48,81]，但在我们的分析中小细胞癌的样本量小且数据不完整[87,96,100,101,105,110]，以至于无法评估其与HPV的关系。因此，应增加国外研究数据，全面考虑年龄、性别、吸烟状况及组织学类型等因素的影响，结果才会更加可信。23 南华大学硕士学位论文4.4HPV与肺癌防治HPV感染可能是肺癌的致病因素之一，因此其疫苗可能用于肺癌的预防，减少肺癌的发生。少数研究者探索了HPV在HPV相关恶性肿瘤中的抗癌潜能。在老鼠肺肿瘤模型中，Sig/E7/LAMP-1疫苗可能引起已建立的TC-1肺肿瘤衰退，阻止和治疗HPV16E7表达的肿瘤细胞的血行播散，注射该疫苗的老鼠与对照组+相比产生了最高的CD8T细胞介导的免疫，最高的T辅助I型细胞因子应答，最高的E7特异性抗体滴度及最低平均肺结节数。目前HPV在肺癌中的作用还不明确，有待进一步研究以指导临床实践。24 第5章结论第5章结论1.HPV在肺癌中的感染率为15.7%，与检测地区和检测方法有关；2.HPV感染是肺癌的危险因素，HPV感染患肺癌的危险是非感染的7.02倍；3.HP感染与肺癌的组织学类型有关，鳞癌发生危险高于腺癌。25 南华大学硕士学位论文26 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文献综述文献综述HPV感染在肺癌致病机制中的研究吕学英综述，奉水东审校HPV感染可能与肺癌有关，主要通过与宿主基因组整合并表达E6和E7致癌蛋白在肺癌机制中起作用。现从HPV感染引起p53突变或失活，影响其他基因表达，促进肿瘤侵袭三个方面探索HPV在肺癌中的致病作用。关键词HPV肺癌人类乳头瘤病毒（HPV）是双链DNA病毒，为宫颈癌常见致病因素。在肺、舌、颈部恶性肿瘤组织中检测到HPVDNA，且这些HPV阳性患者并无生殖器、皮肤等感染性疾病，表明HPV可能与部分人类非皮肤及非生殖器肿瘤有关[1]。大量研究在肺癌组织标本中检测到较高的HPVDNA，且以高危型别为主，表明高危型HPV感染可能在肺癌发生及进展中起作用，尽管部分患者中整合入宿主基因组的病毒载量较低，E6、E7致癌蛋白表达较弱，然亦可能足够促进癌变[2-8]，为此推测HPV可能是肺癌的环境致病因素之一。故了解HPV感染在肺癌致病机制中的作用将有助于肺癌的预防及治疗。HPV感染致p53突变或失活在宫颈癌致病研究中发现，HPV整合入宿主染色体并表达E6和E7蛋白可分别导致p53失活和pRb抑制，而HPV感染肺癌患者可能涉及相同的机制，且以E6作用为主。p53基因为人体抑癌基因，参与调控细胞生长、凋亡和DNA修复，当其发生突变或失活后，因失去对细胞循环、增长的调控作用而导致肿瘤发生。HPV感染可能促进或协同p53突变或异常表达，增加肺癌发生风险。p53突变后蛋白的半衰期延长，因而容易在病理组织中检测到异常累积。在肺鳞癌患者中，配对检测发现HPV阳性组（n=9）有5例存在TP53突变，且主要发生在外显子5上；而阴性组仅一例存在突变[9]。HPV阳性组p53免疫着色阳性率高于阴性组，有46.7%的样本同时存在HPV感染和p53突变，且共存与淋巴结转移阳性，高TNM分期显著相关。表明HPV16/18感染和p53突变可能协调肺鳞癌的发展，其共存与肺癌预后差有关[10]。通过界定扩增指数（PI）与39 南华大学硕士学位论文凋亡指数（AI）来探测细胞扩增及凋亡情况，发现HPV阳性组的PI高于阴性组，而AI则与之相反。该研究亦强调HPV与NSCLC有关联，尤其是鳞癌患者；HPV感染可下调pRB和增加突变的p53，诱导细胞扩增和抑制凋亡[11]。然FeiY等研究表明，中国武汉HPV16/18感染模式不同于台湾，不同地区中国居民中其作用可能不同[12]。在台湾，HPV16/18E6的表达在女性，腺癌，非吸烟肺癌患者中明显高于男性，鳞癌，吸烟患者。在肿瘤组织中，E6与p53表达反向相关，E6表达可促进p53降解，并降低下游功能p21WAF1/CIP1和mdm2mRNA水平。E6阳性肺癌细胞经E6敲除后，其倍增时间延长，菌落形成率及克隆效率降低。表明E6所致p53失活可能促进细胞增殖和菌落形成，有助于台湾非吸烟女性肺腺癌发生、发展[13]。进一步研究，p53表达与HPVE6反向相关，但与HPVDNA不相关，就p53蛋白的降解而言，HPVE6的表达可能比HPVDNA的存在更重要。多元回归分析性别、吸烟状况、肿瘤类型、p53多态性、HPV16/18DNA和HPV16/18E6在肺癌组织中对p53蛋白降解的影响：Arg/Arg基因型的风险是Arg/Pro或Pro/Pro的1.776倍；HPV16/18E6阳性是阴性的3.021倍，故p53多态性和HPV16/18E6是肺癌病人p53蛋白下调的参与者[14]。p53Arg等位基因和Arg/Arg基因型可能为肺癌的危险因素，然其作用独立于HPV感染，在肺癌中与HPV感染无明显关联[15-17]。因此，HPV感染与p53表达相关，尤其在台湾非吸烟女性肺腺癌病人中，可通过E6表达降解p53蛋白参与肺癌机制。HPV对其他基因表达的影响HPV感染不仅影响p53表达改变，亦可能参与其他基因转录、活化，修饰及表达。在日本，HPVDNA的存在与EGFR突变有关（p=0.021），全部HPV16阳性肺腺癌考虑有HPV整合入宿主基因组，且有外显子19缺失[18]。在台湾，E6可能通过增加活性氧生产，提高肺癌细胞中的8-OH-dG（氧化DNA损伤）水平，从而介导DNA错配修复，指挥supF突变形成，与较高的EGFR突变有关[19]。而在女性肺癌患者中，HPV感染可能直接或间接通过增加DNMT3b表达促进p16INK4a启动子高甲基化，导致p16INK4a基因失活，使p16INK4a蛋白不表达，有助于HPV相关的肺癌机制；且16型还可能涉及FHITLOH（杂合性缺失）率增加介导的FHIT蛋白缺乏表达[20-22]。TIMP-3为金属蛋白酶组织抑制因子，具有抑制内皮细胞增殖、迁移、促进细胞凋亡的作用。然在HPV16/18E6阳性肺癌40 文献综述中，TIMP-3LOH和启动子甲基化，低TIMP-3表达流行。E6过表达可能通过增加DNMT1在TIMP-3启动子上的DNA结合活性，从而促进TIMP-3启动子甲基化，导致TIMP-3蛋白表达降低[23]。hTERTmRNA表达亦在E6阳性肺癌中较高，E6表达可能有助于hTERT转录活化。经E6-或hTERT-RNAi转染后，E6阳性细胞的端粒酶活性大幅度下降，且克隆形成减少甚至不形成。表明hTERT基因通过E6作用的转录活化，至少在E6阳性肺癌细胞中起重要作用，而使用特定的端粒酶抑制剂，hTERT基因有可能作为HPV感染性肺癌治疗的分子靶[24]。基因芯片技术分析转基因老鼠肺肿瘤模型和人类非小细胞肺癌（SCLC）发现，两基因组有多个共同上调和下调的基因。而转基因鼠SCLC中受E6/E7共表达影响的分子和细胞功能，在人类SCLC亦涉及，与细胞发展、循环、生长和增殖有关[25]。E6和E7表达促进肿瘤侵袭近期研究表明，HPVE6和E7表达可能促进多种细胞因子和血管生成因子分泌，这些生物因子可能一起作用，提供炎症和HPV感染之间在肺癌中关联的证据，且通过抑制细胞凋亡，加强肺癌变所需要的细胞增生、繁殖及肿瘤血管生成，以促进肿瘤侵袭。HPV16E6阳性时，肺癌细胞中IL-10蛋白和mRNA表达较高，E6似乎促进IL-10表达，且是以一种与IL-10mRNA水平相一致的模式。敲除IL-10，可使E6阳性细胞IL-10表达减少，细胞倍增时间延长，代表性的软琼脂克隆增长明显缩小，且裸鼠体内出现的肺肿瘤结节数目降低。同时，IL-10可能翻译激活CIP2A转录，而CIP2A对IL-10介导的细胞侵袭有责任。该研究支持——IL-10介导的CIP2A可能在肺腺癌的肿瘤侵袭中起重要作用[26]。肺癌组织中IL-6和Mcl-1表达与HPVDNA共处。IL-6分泌在E6或E7阳性肺癌细胞中明显升高，Mcl-1表达亦剧烈增加，升高的IL-6水平和上调的Mcl-1表达相当，特定敲除E6或E7，IL-6及Mcl-1表达则减少。同时，Mcl-1表达可被PI3K抑制剂抑制，故HPV16/18感染可能经PI3K信号途径上调IL-6和抗凋亡的Mcl-1表达[27]。而由TIMP-3损失经TNFα/NF-κB轴所致IL-6表达的提高，可能对肺癌细胞侵袭和基质非依赖性软琼脂增长有责任[23]。IL-17也与HPV16/18感染相关，其作用与IL-6相似，IL-17RNA在E6阳性肺癌细胞中的上调及分泌增多，亦可导致Mcl-141 南华大学硕士学位论文RNA和蛋白表达增加[28]。另外，IL-8RNA表达在PonA处理的H1299-HPV16E6细胞中的上调可显著增加MMP-2和MMP-9RNA水平，使用IL-8siRNA对抗转录和特异性抗体中和活化联合处理，MMP-2和MMP-9表达则降低，因此在部分HPV16阳性肺癌细胞中，MMPs由IL-8介导上调[29]。MMPs为基质金属蛋白酶，可通过降解细胞外基质促进肿瘤的浸润及转移。HPV16E6和E7过表达还可能通过翻译或转录后机制促进HIF-1a蛋白累积，上调VEGF在蛋白和mRNA水平上的表达。人工基底膜栓子混合E6和E7转染的肺癌细胞可引起肿瘤血管生成，裸鼠移植体中可见更高的血红素水平，和明显加强的HIF-1a和VEGF表达。E6和E7过表达亦增强其他血管生成相关因子，如血管生成素，CXCL-16,FGF-2和IL-8的表达[30]。故致癌蛋白明显增加NSCLC细胞在试管内和活体内的血管生成潜力，通过增加HIF-1a，VEGF和其他血管生成相关因子，而经HIF-1a/VEGF途径的肿瘤血管生成，可能作为HPV相关肺癌预防及治疗的潜在分子靶。进一步研究，E6和E7过表达可激活PI3K/Akt/mTOR信号途径，且HIF-1a表达和其介导的VEGF和IL-8表达是依赖c-Jun的，通过阻塞26S蛋白酶体依赖的降解途径[31]。亦首次了解到，EGCG在致癌蛋白诱导的NSCLC血管形成上的抑制作用，可能潜在地归因于由HIF-1a支配的VEGF,IL-8,和CD31表达的抑制和Akt的激活，为——HIF-1a可能是EGCG对抗HPV相关的NSCLC血管生成的潜在目标，提供了实质性的证据[32]。从以上可以看出，HPV感染与宿主基因组整合后，可能影响多个基因的表达，调控多个信号通路，其导致肺癌发生发展的机制极为复杂。42 参考文献参考文献[1]OstrowRS,ManiasDA,FongWJ,etal.AsurveyofhumancancersforhumanpapillomavirusDNAbyfilterhybridization[J].Cancer1987;59(3):429-34.[2]ParkMS,ChangYS,ShinJH,etal.TheprevalenceofhumanpapillomavirusinfectioninKoreannon-smallcelllungcancerpatients[J].YonseiMedicalJournal2007;48(1):69-77.[3]HirayasuT,IwamasaT,KamadaY,etal.HumanpapillomavirusDNAinsquamouscellcarcinomaofthelung[J].JournalofClinicalPathology1996;49(10):810-7.[4]胡克,李清泉,杨炯,胡苏萍.肺癌组织中人乳头瘤病毒16和18型DNA相关序列的检测[J].中华实验和临床病毒学杂志,1997,02:54-56.[5]ChengYW,ChiouHL,SheuGT,etal.Theassociationofhumanpapillomavirus16/18infectionwithlungcanceramongnonsmokingTaiwanesewomen[J].CancerResearch2001;61(7):2799-803.[6]AguayoF,CastilloA,KoriyamaC,etal.Humanpapillomavirus-16isintegratedinlungcarcinomas:astudyinChile[J].BritishJournalofCancer2007;97(1):85-91.[7]NadjiSA,Mokhtari-AzadT,MahmoodiM,etal.RelationshipbetweenlungcancerandhumanpapillomavirusinnorthofIran,Mazandaranprovince[J].CancerLetters2007;248(1):41-6.[8]Koriyama.Humanpapillomavirusisfrequentlydetectedingefitinib-responsivelungadenocarcinomas[J].Oncologyreports2010;23(4).[9]JafariH,GharemohammadlouR,FakhrjouA,etal.GenotypingofHumanPapillomavirusandTP53MutaionsatExons5to7inLungCancerPatientsfromIran[J].BioImpacts:BI2013;3(3):135-40.[10]YuY,YangA,HuS,etal.Significanceofhumanpapillomavirus16/18infectioninassociationwithp53mutationinlungcarcinomas[J].TheClinicalRespiratoryJournal2013;7(1):27-33.[11]CastilloA,AguayoF,KoriyamaC,etal.Humanpapillomavirusinlung43 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南华大学硕士学位论文[31]ZhangE,FengX,LiuF,etal.RolesofPI3K/Aktandc-Junsignalingpathwaysinhumanpapillomavirustype16oncoprotein-inducedHIF-1alpha,VEGF,andIL-8expressionandinvitroangiogenesisinnon-smallcelllungcancercells[J].PloSONE2014;9(7):e103440.[32]HeL,ZhangE,ShiJ,etal.(-)-Epigallocatechin-3-gallateinhibitshumanpapillomavirus(HPV)-16oncoprotein-inducedangiogenesisinnon-smallcelllungcancercellsbytargetingHIF-1alpha[J].CancerChemotherapyandPharmacology2013;71(3):713-25.46 作者攻读学位期间的科研成果作者攻读学位期间的科研成果科研论文1、吕学英，奉水东.人类乳头瘤病毒感染在肺癌致病机制中的研究进展.癌症进展杂志，2016，14（2）：126-12847 南华大学硕士学位论文48 附录附录主要英文缩略语索引（ABBREVIATION）英文缩写英文全称中文名称AIapoptosisindex凋亡指数EGCGEpigallocatechingallate表没食子儿茶素没食子酸酯EGFREpidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体HIF-1Hypoxiainduciblefactor-1缺氧诱导因子-1HPVHumanpapillomavirus人类乳头瘤病毒hTERTHumantelomerasereversetranscriptase人端粒酶逆转录酶IHCImmunohistochemistry免疫组织化学ILInterleukin白细胞介素ISHInsituhybridization原位杂交LOHLossofheterozygosity杂合性丢失NSCLCNon-small-celllungcancer非小细胞肺癌PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PIproliferationindex扩增指数PI3KPhosphoinosmde-3-kinase胞内磷脂酰肌醇激酶SCLCSmallcelllungcancer小细胞肺癌TIMPTissueinhibitorofmetalloproteinase金属蛋白酶组织抑制剂VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子49 南华大学硕士学位论文50 致谢致谢三年研究生生涯即将划上句号，在这宝贵的三年时间里，我收获的不仅是学业和科研中的较大进步，更重要的是思想上也得到了进一步升华。本课题是在南华大学公共卫生学院奉水东副教授悉心的指导下完成的，导师丰厚的专业知识，严肃的科学态度，精益求精的工作作风，深刻地感染与激励着我，此时此刻，我的内心充满感激，在此谨向我的导师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。感谢公共卫生学院陈曦教授、蔡亚平教授、陈新教授、袁秀琴教授及数理学院朱惠延教授给我论文提出的宝贵建议。感谢张天成书记、田生军副书记、伍卫国老师等学院其他领导和老师在生活中对我的关心和帮助。感谢刘艳老师方法技术上的指导。感谢师兄廖立，师弟王军，师妹吴梦怡在学习和生活中对我的支持与帮助。感谢同窗孙源彬、彭媛娇、王小凤、朱玉凤、唐凯林、唐贤、路庆、杨青庭、李武等同学在整个研究生期间对我实验和生活热情的关心、帮助与支持。衷心感谢关心和帮助过我的老师和同学们！最后，万分感谢我的家人和朋友们对我一直以来的鼓励和支持。没有你们的无私的奉献和理解漫长的求学之路不会如此平坦安心！以后的学习和工作中，我将坚定自己的信念，继续努力，勇攀高峰！51