2型糖尿病患者脂肪来源干细胞促创面愈合能力的实验研究

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中图法分类号：R62学校代码：10661学号：2015307密级：公开硕士学位论文（专业型学位）2型糖尿病患者脂肪来源干细胞促创面愈合能力的实验研究Adipose-derivedstemcellsfromtype2diabeticpatientsforpromotingwoundhealing姓名：姚远镇专业：整形外科研究方向：创面修复导师：王波培养单位：遵义医学院2018年5月 遵义医学院硕士学位论文姚远镇遵义医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外及取得的研究成果，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研宄的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢－ｔＶ．学位论文作者签名：签字日期：年ｙ月ｑ日遵义医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解遵义医学院有关保留、使用学位论文的规定，目卩：遵义医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，ｇ卩容：遵义医学院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。学位论文作者签名：＾导师签名：签字日期：年公月＞日签字日期：年义月ｗ日ｊ 遵义医学院硕士学位论文姚远镇目录1.论文：2型糖尿病患者脂肪来源干细胞促创面愈合能力的实验研究中英缩略词对照表…………………………………………1中文摘要……………………………………………………2英文摘要……………………………………………………5前言…………………………………………………………9材料与方法…………………………………………………11结果…………………………………………………………20讨论…………………………………………………………30结论…………………………………………………………32参考文献……………………………………………………332.综述：………………………………………………………383.致谢…………………………………………………………504.作者简介……………………………………………………52课题基金来源：1.国家自然科学基金（81660323） 遵义医学院硕士学位论文姚远镇中英文缩略词表缩略词英文全称中文全称ASCsAdipose-derivedstemcells脂肪来源干细胞AGEsAdvancedGlycationEndProducts晚期糖基化终末产物CtCyclethreshold循环阈值ComplementarydexyribonucleiccDNA互补DNAacidDMEMDulbeccosmodifiedeaglemedium改良培养基DNAdexyribonucleicacid脱氧核糖核酸dASCsdiabeticAdipose-derivedstemcells糖尿病脂肪来源干细胞碱性成纤维细胞生长因FGFFibroblastgrowthfactor子GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白HGFHepatocytegrowthfactor肝细胞生长因子HEHematoxylineosin苏木精-伊红染色IGFsInsulin-likegrowthfactors胰岛素样生长因子MCP-1Monocytechemotacticprotein1单核细胞趋化蛋白-1mRNAMessageribonucleicacid信使RNAnASCsnormalAdipose-derivedstemcells正常脂肪来源干细胞ODOpticaldensity光密度PDGF-aPlatelet-dirivedgrowthfactor-a血小板源性生长因子-aPBSPhosPHatebuffetsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应SDF-1Stromalcell-derivedfactor-1基质细胞衍生因子-1TGF-βTransforminggrowthfactor-β转化生长因子-βVEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子1 遵义医学院硕士学位论文姚远镇2型糖尿病患者脂肪来源干细胞促创面愈合能力的实验研究中文摘要目的：通过分离、培养正常脂肪来源干细胞（normalAdipose-derivedstemcells，nASCs）与糖尿病脂肪来源干细胞（diabeticAdipose-derivedstemcells，dASCs），体外对比研究两种细胞的形态、表面标志、增殖与分化功能，体内对比研究两种细胞局部移植后压疮创面的愈合情况，探讨dASCs是否保留促创面愈合能力，为dASCs自体移植治疗慢性创面提供实验依据。方法：1、经知情同意后，于遵义医学院附属医院烧伤整形外科患者术中无菌条件下获取糖尿病病人脂肪组织和非糖尿病病人脂肪组织（即正常的脂肪组织）标本。采用胶原酶消化法提取脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells，ASCs），用含胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞，胰酶消化传代。倒置显微镜下观察两种不同来源细胞的形态，流式细胞仪检测第三代细胞表面标志的表达情况。2、取传至第三代的nASCs和dASCs，采用MTT法检测两种来源细胞的增殖能力并绘制生长曲线；将两种细胞接种于六孔板后分别诱导成脂、成骨，21天后分别行油红及茜素红染色观察成脂及成骨情况；取诱导成骨及成脂两周后的细胞进行实时荧光定量PCR检测脂肪特有基因PPAR-γ及成骨基因骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）mRNA的表达情况。3、建立小鼠背部皮肤压疮动物模型，随机分三组：nASCs移植组、dASCs移植组及PBS组（对照组，NC），每组8只。取增殖期的第三代细胞，用病毒包被好的绿色荧光蛋白（GFP）进行细胞转染标记细胞后，分别于每个压疮周边及基底部多点注射16×10个相应细胞，PBS组注射同等体积的PBS，观察创面的愈合情况。分别于注射后11天、21天分批处死小鼠后切取压疮创面组织行HE染色和Masson染色，观察创面组织炎症细胞浸润程度、表皮厚度及胶原蛋白沉积情况；进行CD31及S100免疫组化染色观察创面血管及神经细胞再生情况；第11天取创面组织行冰冻包埋切片追踪两种细胞在创面中的定植及存活情况。结果：1、成功从正常与糖尿病患者脂肪组织中分离提取出ASCs，原代接种8小时后可见贴壁细胞，传代后细胞生长明显加速；两种第3代细胞外形均一，多呈长梭形，2 遵义医学院硕士学位论文姚远镇呈放射样旋涡状生长，形态无明显区别。流式细胞仪检测两种第三代细胞CD90、CD105、CD73、CD44均呈阳性表达，CD34均呈阴性表达。2、MTT法检测细胞增殖能力结果显示nASCs增殖能力较dASCs强，生长速度较快；诱导分化结果显示nASCs与dASCs均可被诱导成脂及成骨，其中dASCs成脂能力强于nASCs，但成骨能力低于nASCs。实时定量PCR结果显示诱导后dASCs脂肪特有基因PPAR-γmRNA的表达水平高于nASCs，而成骨基因骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）mRNA的表达水平低于nASCs，差异均具有统计学意义（P<0.001）。3、成功建立小鼠背部皮肤压疮模型；行细胞移植后第5、9、13天nASCs组的创面愈合率分别为36.47±5.83%、89.18±2.14%、99.47±0.89%，dASCs组的为35.66±6.52%、60.40±7.67%、87.18±2.56，PBS组的为19.89±7.20%、46.32±4.21%、66.25±5.26%，nASCs组创面愈合最快，dASCs组愈合速度次之，PBS组创面愈合最慢。第11天取创面组织行HE染色结果显示nASCs组开始出现上皮化，而dASCs组与PBS组创面表面痂皮与基底组织分离；在nASCs组、dASCs组及PBS组中炎性细胞浸润程度依次递减，组间差异具有统计学意义（P<0.001）。第21天，炎性细胞浸润程度在三组中无明显区别；表皮厚度在nASCs组、dASCs组和PBS组依次递减，组间差距具有统计学意义（P<0.05）；三组中创面周边均可见再生的毛囊，其中dASCs创面中央可见新生毛囊。马松染色结果显示，第11天，dASCs组（48.38±1.36%）胶原沉积比nASCs组（45.85±1.95%）多，但无统计学意义；dASCs组和nASCs组胶原沉积明显大于PBS组（41.46±1.75%），差异有统计学意义（P<0.001）。第21天，nASCs组（56.93±1.67%）、dASCs组（54.17±1.71%）与PBS组（50.34±1.29%）胶原沉积依次递减，组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。CD31免疫组化结果显示，第11天，nASCs组（17.80±0.84）的血管数目与dASCs组（17.20±1.30）无显著差别；但两者血管数目均明显大于PBS组（8.00±1.41），差异具有统计学意义（P<0.001）。第21天，血管数目在nASCs组（20.00±1.87）、dASCs组（18.00±2.12）及PBS组（14.00±1.58）中依次递减，各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。S100免疫组化结果显示，第11天，nASCs组与dASCs组均未见阳性显色细胞；第21天，nASCs组（1.63±0.08）的雪旺氏细胞密度小于dASCs组（1.76±0.12），但无统计学意义；nASCs组和dASCs组均明显大于PBS组（0.55±0.04），差异具有统计学意义（P<0.001）。创面细胞追踪结果为，第11天后nASCs与dASCs均可定植于创面皮肤3 遵义医学院硕士学位论文姚远镇内。结论：1.和nASCs相比，dASCs的形态和表面标志无明显变化，其增殖和成骨分化能力下降，而成脂分化能力增加。2.dASCs局部移植可通过调节局部炎症、增加胶原沉积、促进血管新生和神经再生促进压疮创面愈合。3.dASCs局部移植仍具备促进创面愈合的能力，但其能力较nASCs减小。关键词：脂肪来源干细胞；糖尿病；创面愈合；慢性创面4 遵义医学院硕士学位论文姚远镇Adipose-derivedstemcellsfromtype2diabeticpatientsforpromotingwoundhealingAbstractObjective:Thenormaladiposederivedstemcells(nASCs)anddiabeticAdipose-derivedstemcells(dASCs)wereisolatedandcultured.Themorphology,surfacemarkers,proliferationanddifferentiationofthetwokindsofcellswerecomparativelystudiedinvitro.Thewoundhealingofpressureulcersaftertwokindsofcelltransplantationwascomparedinvitro.ToinvestigatewhetherdASCsretaintheabilityofpromotingwoundhealingandprovideexperimentalevidenceforautologoustransplantationofdASCsinthetreatmentofchronicwounds.Methods:1.AdiposetissuearederivedfromthepatientsfromAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollegeofBurnandPlasticSurgery.Afterinformedconsent,adiposetissuefromdiabeticandnon-diabeticpatientsisobtainedduringsurgeryundersterileconditions.Adipose-derivedstemcells(ASCs)wereextractedbycollagenasedigestion,culturedinlowglucoseDMEMmediumcontainingfetalbovineserumandpassagedbytrypsindigestion.Themorphologicalchangesofthecellsfromtwodifferentsourceswereobservedunderaninvertedmicroscope,andtheexpressionofthesurfacemarkersofthethirdgenerationcellswasdetectedbyflowcytometry.2.ThethirdgenerationofnASCsanddASCsweretakenasexperimentalcells,andtheproliferationabilityofthetwokindsofcellswasmeasuredbyMTTassayandthegrowthcurvewasdrawn.Thetwokindsofcellswereinducedtoadipogenesisandosteogenesisrespectively.After21days,theadipogenicandosteogenicconditionswereobservedbyoilredandalizarinredstaining,respectively.Real-timefluorescentquantitativePCRwasusedtodetecttheexpressionofPPAR-γandBMP-2andBGPmRNAinadipocytesandosteoblaststwoweeksafter.3.Animalmodelsofskinpressureulcersinmicebackwereestablishedandrandomly5 遵义医学院硕士学位论文姚远镇dividedintothreegroups:nASCstransplantationgroup,dASCstransplantationgroupandPBSgroup(Normalcontrolgroup,NC),8miceineachgroup.Thethirdgenerationofcellsintheproliferativephaseweretransfusedwithvirus-coatedgreenfluorescentprotein(GFP)andtheninjectedintothewoundsofeachpressureulcerat1×106cells.ThePBSgroupwasinjectedwiththesamevolumeofPBS.Thenobservethepressureulcerwoundhealing.Themiceweresacrificed11daysand21daysafterinjection.ThewoundsofthepressureulcerweredissectedandstainedwithHEandMasson.Thethicknessofepidermis,infiltrationofinflammatorycellsinwoundtissuesandcollagendepositionwereobserved.CD31andS100immunohistochemicalstainingwereusedtoobservetheconditionofbloodvesselregenerationandnerveregeneration.Atday11,Thetwokindsofcellcolonizationandsurvivalweretracked.Results:1、ASCsweresuccessfullyisolatedfromadiposetissueofnormalanddiabeticpatients.Theadherentcellswereobserved8hoursafterprimaryinoculation,andthegrowthofcellswasacceleratedafterpassage.Bothofthethirdgenerationcellswereuniforminshape,mostlyfusiforminshape,Growth,nosignificantdifferenceinmorphology.FlowcytometrydetectedtwokindsofthirdgenerationcellsCD90,CD105,CD73,CD44werepositiveexpression,CD34wasnegativeexpression.2.TheresultsofMTTassayshowedthattheproliferationabilityofnASCswasstrongerthanthatofdASCsandthegrowthratewasfast.TheinduceddifferentiationshowedthatbothnASCsanddASCscouldbeinducedtoadipogenesisandosteogenesis.TheadipogeniccapacityofdASCswasstrongerthanthatofnASCs,buttheosteogeniccapacityofdASCswaslowerthanthatofnASCs.Real-timequantitativePCRresultsshowedthattheexpressionofadipogenesisgenePPAR-γmRNAindASCswashigherthanthatinnASCsafterinduction,whereasosteogenesisgeneBMP-2andBGPmRNAexpressionwaslowerthanthatinnASCs.Thedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.001).3.Successfullyestablishedthemousebackskinpressureulcermodel.ThewoundhealingrateofnASCsgroupwas36.47±5.83%,89.18±2.14%and99.47±0.89%onthe5th,9thand13thdayafterthecelltransplantationrespectively,whilethedASCsgroupwas35.66±6.52%,60.40±7.67%and87.18±2.56,PBSgroupwas19.89±7.20%,46.32±4.21%6 遵义医学院硕士学位论文姚远镇and66.25±5.26%respectively,whichindicatedthatthewoundhealingofnASCsgroupwasthefastest,thehealingrateofdASCsgroupwasthesecond,thePBSgroupwasslowest.Ontheeleventhday,HEstainingshowedthatthenASCsgroupbegantohaveepithelialization,whilethedASCsgroupandthePBSgroupwereseparatedfromtheepidermisandbasaltissue.ThedegreeofinflammatorycellinfiltrationinthenASCsgroup,thedASCsgroup,andthePBSgroupdecreasedinturn.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).Onthe21stday,thedegreeofinflammatorycellinfiltrationwasnotsignificantlydifferentamongthethreegroups;theepidermalthicknesswasgraduallydecreasedinthenASCsgroup,thedASCsgroup,andthePBSgroup,andthedifferencebetweenthegroupswasstatisticallysignificant(P<0.05).Inthethreegroups,theregeneratedhairfollicleswereseenintheperipheryofthewound,inwhichthenascentfollicleswereseeninthecenterofdASCsgroup.MassonstainingshowedthatcollagendepositionindASCsgroup(48.38±1.36%)wasmorethanthatinnASCsgroup(45.85±1.95%)onday11,buttherewasnostatisticalsignificance.CollagendepositionindASCsgroupandnASCsgroupwassignificantlygreaterthanthatinPBSgroup(41.46±1.75%),withstatisticalsignificance(P<0.001).Onthe21thday,thecollagendepositioninnASCsgroup(56.93±1.67%),dASCsgroup(54.17±1.71%)andPBSgroup(50.34±1.29%)decreasedgradually,thedifferencebetweengroupswasstatisticallysignificant(P<0.05).TheresultsofCD31immunohistochemistryshowedthattherewasnosignificantdifferencebetweenthenASCsgroup(17.80±0.84)andthedASCsgroup(17.20±1.30)onthe11thday.ThenumberofbloodvesselsinnASCsgroupanddASCsgroupwassignificantlyhigherthanthatinPBSgroup(8.00±1.41),thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).Onthe21thday,thenumberofbloodvesselsdecreasedinthenASCsgroup(20.00±1.87),dASCsgroup(18.00±2.12)andPBSgroup(14.00±1.58),thedifferencesamongthegroupswerestatisticallysignificant(P<0.05).TheresultsofS100immunohistochemistryshowedthatonthe11thday,nopositivechromogeniccellswereobservedinthenASCsanddASCsgroups.Onthe21thday,theSchwanncelldensityinthenASCsgroup(1.63±0.08)waslowerthanthatinthedASCsgroup(1.76±0.12).However,itwasnotstatisticallysignificant.thenASCsgroupanddASCsgroupwere7 遵义医学院硕士学位论文姚远镇significantlylargerthanthePBSgroup(0.55±0.04),andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).WoundcelltracingresultsshowedthatbothnASCsanddASCscouldbecolonizedinthewoundedskinafter11days.Conclusion:1.ComparedwithnASCs,themorphologyandsurfacemarkersofdASCsshowednosignificantchanges,theirproliferationandosteogenicdifferentiationabilitydecreased,whileadipogenicdifferentiationabilityincreased.2.LocaltransplantationofdASCscanpromotewoundhealingbyregulatinglocalinflammation,increasingcollagendepositiononthewound,andpromotingangiogenesisandnerveregeneration.3.TheabilityofdASCstopromotewoundhealingwaslowerthannASCs.KeyWords:Adipose-derivedstemcells;diabetes;Woundhealing;Chronicwounds8 遵义医学院硕士学位论文姚远镇前言糖尿病是一种由于胰岛素作用障碍或分泌缺乏或所引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，在全球范围内影响超过3.47亿人，而我国是全球糖尿病患者人数最多的[1]国家。糖尿病足是糖尿病患者最常见、最严重的慢性并发症之一，同时也是全身多[2-4]个器官病变的重要标志之一，且是非创伤性截肢最主要的原因。仅在我国每年就有约超过100万糖尿病患者由于足部溃疡无法正常愈合而被迫截肢，这给患者造成沉[5]重生理和心理打击。糖尿病足常用的治疗方法较多，包括高压氧、超声波及电磁疗法的物理疗法，换药联合各种新型敷料及生长因子的保守治疗，以清创联合富血小板血浆（PRP）、脂肪移植、负压吸引等方式的相对微创的治疗，以皮瓣移植和植皮为主的整形手术治疗以及血管介入治疗，各个治疗方式有各自的相对适应症及优缺点[6-8]。[9]当前，干细胞疗法治疗糖尿病皮肤创面是最热门最有前景的方法之一。2002[10]年Zuk等首次从新鲜分离的脂肪基质血管成分中发现了具有多向分化能力的细胞群，并将其命名为脂肪来源干细胞(adipose-derivedstemcells,ASCs)。ASCs属于成体干细胞，表达间充质干细胞的特性，具有旁分泌、免疫调控、多项分化等潜能，其来源丰富（多来自腹部、腰部、大腿等脂肪堆积的部位），易获取，产量高，无伦理限制，且能达到瘦身塑形的目的，因此，ASCs已成为组织再生与修复研究领域中最理想的种子细胞。目前已有较多的基础研究报道应用异体ASCs移植治疗糖尿病创[11-14]面、压疮创面、放射性创面、烧伤创面等慢性创面，且有自体ASCs移植治疗慢[15-17]性创面的临床报道，并获得积极的效果。但在临床上，鲜有异体ASCs移植的报道，多数处于临床试验阶段。这是因为尽管间充质干细胞拥有较低的免疫原性，异体[18]间充质干细胞移植发生免疫排斥的风险仍然存在，因此，在临床应用领域，更关注ASCs自体移植的可行性。然而，糖尿病患者体内持续存在的高血糖及糖基化产物的微环境可能削弱各种细胞的促创面愈合能力。有研究显示，糖尿病内皮细胞的内皮粘附、增殖和小管形成能[19][20]力下降，骨髓间充质干细胞的生物学功能也发生改变。关于糖尿病脂肪来源干细胞(diabetesadipose-derivedstemcells,dASCs)，目前存在争议，多数研究报道[21-23]糖尿病高血糖的微环境削弱了dASCs的促创面愈合能力，少数研究认为dASCs仍[24,25]保留促创面愈合的能力。因此，本研究分别分离培养正常脂肪来源干细胞（normal9 遵义医学院硕士学位论文姚远镇Adipose-derivedstemcells，nASCs）及dASCs，对比研究两种细胞的形态、周期、增殖与分化功能，并建立小鼠压疮创面模型，将两种不同来源的ASCs局部移植于压疮创面处，观察两种细胞的促创面愈合能力。本研究为dASCs自体移植治疗糖尿病足提供基础研究资料。10 遵义医学院硕士学位论文姚远镇1材料与方法1.1主要实验材料获得患者知情同意并通过伦理批准后，于遵义医学院附属医院烧伤整形外科住院行手术治疗的患者中获取脂肪组织，包含非糖尿病患者（年龄42-54岁，血糖正常）及糖尿病患者（年龄42-54岁，糖尿病史5-9年，血糖9-15mmoL/L，未规律用药）各3人的脂肪组织标本，脂肪组织均来源于下肢皮下。获取的无菌脂肪组织于2小时内进入ASCs的提取流程。实验动物：由第三军医大学动物实验中心提供，雄性C57小鼠24只，体重22-25g，随机分为三组：nASCs移植组、dASCs移植组、PBS组，每组8只。为实验动物提供良好的生活环境及安全的食物和水源。涉及动物的所有研究均按照遵义医学院动物实验中心指定的指导方针进行，并获得遵义医学院伦理委员会批准。1.2主要实验仪器及耗材PCR扩增仪（C1000PCR，BIO-RAD，美国）酶标仪（SUNRISE，Tecan，奥地利）流式细胞仪（AccuriC6，BectonDickinson，美国）细胞培养板（6孔/12孔/24孔/96孔，Eppendorf，德国）倒置相差显微镜（IX-71-S8F，01ympus，日本）倒置荧光显微镜（DMIRB，Leica，德国）光学显微镜（CH20，01ympus，日本）超纯水制备系统（MILLI-QBiocel，MILLIPORE，美国）BeckmanTU1810紫外分光光度计（Beckman公司，美国）超净工作台（SW-CJ-2F，SunJing，中国）CO2细胞培养箱（3141，I/R，TheromForma，美国）高速低温离心机（Centrifuge5417R，Eppendorf，德国）低速冷冻离心机（Centrifuge5417R，Eppendorf，德国）微量加样器（5-10/20-200/200-1000ul，Eppendorf，德国）电子分析天平（1/10000，METTLER，德国）22无菌细胞培养瓶（25mm/75mm，CORNING，美国）11 遵义医学院硕士学位论文姚远镇外科手术器械（HC-A801，成和，中国）无菌塑料离心管（15ml/50ml，NEST，中国）普通吸头（1ml/200ul/10ul，ThermoScientific，美国）全自动高压消毒柜（ES-315，Tomy，日本）恒温干燥箱（Ecocell，MMM-group，德国）-86℃超低温保存箱（DW-86L486，Haier，中国）4℃/-20℃冰箱（CFCFree，SANYO，日本）滤器（XX8200237，Milipore，美国）水浴摇床（OLS200，Grant，英格兰）一次性塑料离心管（15ml/50ml，ThermoScientific，中国）直径为12mm厚度为5mm磁铁（上海琦颢机电有限公司）1.3主要实验试剂DMEM低糖培养（美国HyClone公司）0.25%胰蛋白酶+EDTA（美国HyClone公司）cDNA第一链合成试剂盒（美国ThermoFisher公司）I型胶原酶（美国Invitrogen公司）PBS缓冲液（北京奥博莱科技公司）二甲苯（中国国药集团化学试剂有限公司）氯仿（中国国药集团化学试剂有限公司）青链双抗（北京索来宝公司）无水乙醇（中国国药集团化学试剂有限公司）异丙醇（中国京化学试剂有限公司）慢病毒（吉赛生物公司）荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物公司）封闭液、抗体稀释液（大连宝生物公司）胎牛血清（FBS）（美国HyClone公司）MTT试剂盒（北京索来宝公司）CD31（美国abcam公司）S100（美国abcam公司）12 遵义医学院硕士学位论文姚远镇内参一抗GAPDH（江苏凯基生物技术股份有限公司）HE染色试剂盒（北京索来宝公司）逆转录试剂盒（大连宝生物公司）马松染色试剂盒（北京索来宝公司）脂肪干细胞成脂诱导试剂盒（CyagenBiosciences公司）脂肪干细胞成骨诱导试剂盒（CyagenBiosciences公司）脂肪干细胞成软骨诱导试剂盒（CyagenBiosciences公司）1.4主要试剂的配制（1）完全培养基：应用完全培养基时，按照要求将青霉素0.5ml+链霉素0.5ml+10ml胎牛血清+89mlDMEM低糖培养基加入干净无菌瓶子中，保存条件为4℃。（2）Ⅰ型胶原酶的配制：将100mgⅠ型胶原酶粉剂溶解于50ml的PBS缓冲溶液中，玻璃棒搅拌使其充分溶解，在超净台中用细菌过滤器（0.22um）过滤于无菌的离心管中，放置于-20℃下保存。（3）脂肪来源干细胞成骨、成脂诱导分化培养基：按诱导试剂合说明书进行配制及存放。（4）PBS缓冲液的配制：按说明，将粉剂PBS先放入烧杯中，加入2000ml三蒸水，使PBS完全溶解后，将PH调节于7.2-7.4间，分装后经高压灭菌。保存条件为4℃。1.5实验方法1.5.1ASCs原代提取、培养、传代选取各项检查无特殊异常需手术的患者，经患者知情并签署相关同意书并通过伦理批准，于术中无菌条件下收集少量皮下脂肪组织，立即运往实验室放置于4℃冰箱中，并在两小时内开始进行细胞提取。在超净台中将脂肪组织用预冷含双抗的PBS漂洗3遍，用高压的无菌手术器械去除脂肪组中的结缔组织包膜及血管，再次用PBS清洗。在小烧杯中充分将脂肪组织剪碎至糊状，将剪碎的脂肪组织转移至离心管，加入两倍体积的0.2%的Ⅰ型胶原酶，封口胶封口后放入到37℃恒温摇床以100转/分的摇速消化60分钟。加入含10%胎牛血清等体积的的完全培养基行终止消化。1200转/分离心10分钟，弃去上清，用完全培养基重悬沉淀，用200目筛网过滤。收集滤液于离心管，以1200转/分的转速再次离心5分钟，弃上清，完全培养基重悬沉淀。13 遵义医学院硕士学位论文姚远镇取包含干细胞的重悬液接种于75mm细胞培养瓶，放置于37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱培养，每2-3天换液。待ASCs生长密度约到达80%～90%左右时，去除原培养瓶内培养液，予PBS清洗三遍，加复温至37℃的0.25%胰蛋白酶于培养瓶中，将培养瓶放入细胞培养箱中2-3分钟，取出于显微镜下观察细胞变圆、部分漂浮后，即刻加入完全培养基终止消化，吸管吹打后转移至离心管，于1200转/分转速离心5分钟，细胞沉淀于管底。倒去离心管中上清，加入完全培养基应吸管吹打使细胞悬浮均匀，按1:2比例传代于新的培养瓶中培养。1.5.2流式鉴定ASCs的细胞表面抗原6取第3代细胞消化后制备的细胞悬液，予PBS清洗细胞并重悬，以1×10个ASCs每管并用下列抗体染色：抗CD90，抗CD105，抗CD73，抗CD44，抗CD34，样品在室温下避光温育30分钟，用PBS洗涤，然后用运用Kaluza软件的Mofloxdp流式细胞仪分析。1.5.3细胞增殖曲线绘制4将第3代nASCs和dASCs消化后制成细胞密度为5×10/m的细胞悬液，按每孔150μL接种至96孔板，每个时间段设6个复孔，设空白对照6孔，为不加细胞只加150μL培养液。第2天起，每天选择6个培养孔和6个空白对照孔各加入MTT溶液（5mg/mL）10μL，在37℃培养箱中继续孵育，4小时后吸出孔内上清液，每孔加入100μLFormanzan溶解液，在37℃培养箱内继续孵育。在普通光学显微镜下观察formazan全部溶解。应用酶联免疫检测仪检测在光密度（opticaldensity，OD）490nm（紫外光）处测量各孔的光密度OD值，并绘制细胞增殖曲线。1.5.4体外诱导ASCs向脂肪细胞分化及油红染色5取传至第三代用完全培养基制备的细胞悬液，按细胞数量为5×10个/孔接种于6孔板中，细胞完全贴壁后加入诱导分化成脂培养基（A液：87.5%A液基础培养基、10%专用胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺、0.2%胰岛素、0.1%3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1%罗格列酮、0.1%地塞米松；B液：87.8%B液基础培养基、10%专用胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺、0.2%胰岛素）交替换液诱导。诱导21天后，去除6孔板中的诱导培养基，并用PBS冲洗2次。每孔加2ml4%的中性甲醛溶液固定30分钟。去除中性甲醛，PBS冲洗两次。将1ml油红O染料工14 遵义医学院硕士学位论文姚远镇作液加入每个孔中染色30分钟。吸去油红O染料，PBS冲洗3次。应用显微镜观看成脂染色效果并照相记录。1.5.5体外诱导ASCs向成骨细胞分化及茜素红染色5取传至第三代用完全培养基制备的细胞悬液，按细胞数量为5×10个/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后加入成骨诱导分化培养基（86.79%基础培养基、10%专用血清、1%双抗、1%谷氨酰胺、0.2%抗坏血酸、1%β-甘油磷酸钠、0.01%地塞米松）开始诱导。诱导至21天后，去除诱导培养基，PBS冲洗2次。加入4%中性甲醛溶液2ml于每个孔中固定30分钟。去掉甲醛溶液，应用PBS冲洗两次。将1ml茜素红染液加入每个孔中染色5分钟。吸去茜素红染液，PBS冲洗3次。显微镜下观察成骨染色效果。1.5.6细胞标记8用病毒包被好的GFP对细胞进行转染标记：根据病毒滴度为1×10TU/ml设置感4染复数（MOI）为100、75、50、25、10、1，取第三代细胞以1×10cells/孔接种至96孔板中，加完全培养基100μl，当细胞融合率到50-60%时用含浓度为8μg/mlpolybrene完全培养基换液，分别按预先设计的MOI进行病毒转染，16小时更换完全培养基，荧光显微镜下观察细胞形态及转染率后48-72小时进行拍照，取最佳MOI为标准进行细胞转染标记。1.5.7实时荧光定量-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPAR-γ）、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）mRNA表达1.5.7.1总RNA的提取实验分为2组：（1）诱导组：nASCs和dASCs诱导成脂、成骨14天；（2）对照组：第三代nASCs、dASCs。2吸走孔板中的诱导分化培养基，PBS轻轻冲洗2次，根据每10cm的细胞面积加入1ml预冷的细胞裂解液TRIZOL，静置10分钟，并反复吹打使细胞完全脱离溶解。将裂解液转移至EP管，常温放置5分钟。加入氯仿，剧烈振荡15秒，常温放置2至3分钟。4℃下12000转/分离心15分钟。离心后液体分为三层，为无色水相上层、中间层以及红色酚氯仿下层。RNA全部被分配于水相中。将最上层的水相上层应用枪头转移到无RNA酶的EP管中。加等体积异丙醇以沉淀其中的RNA，手动震荡混匀后常温孵育10分钟，4℃下12000转/分离心10分钟。在管底部和侧壁上形成胶状沉淀15 遵义医学院硕士学位论文姚远镇块即为可见的RNA沉淀。倒掉上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水与无水乙醇配制）清洗RNA沉淀。手动震荡使其混匀后，4℃下7000转/分离心5分钟。去除管中的乙醇溶液，使沉淀于管底的RNA沉淀在室温空气中干燥10分钟。加入无RNA酶的DEPC水40μl并用枪反复吹打溶解RNA，并将RNA溶液保存于-80℃待用。1.5.7.2逆转录成cDNA（1）逆转录反应体系如下表1：表1逆转录反应体系试剂使用量5XPrimeScripBuffer2.0ulPrimeScriptRTEnzymeMix0.5ulOilgodTPrimer(50um)0.5ulRandom6mers(100um)0.5ulTotalRNA6.5ul（2）逆转录反应条件如下表2：表2逆转录反应条件温度条件37℃15分钟（反转录反应）85℃5秒（反转录酶失活反应）4℃保存1.5.7.3qPCR扩增（1）目的基因的引物序列见下表3：16 遵义医学院硕士学位论文姚远镇表3目的基因的引物序列基因名称引物序列PPAR-γFACCAAAGTGCAATCAAAGTGGARATGAGGGAGTTGGAAGGCTCTBMPFACTACCAGAAACGAGTGGGAARGCATCTGTTCTCGGAAAACCTBGPFGGCGCTACCTGTATCAATGGRGTGGTCAGCCAACTCGTCA（2）PCR反应体系如下表4：表4PCR反应体系试剂使用量第一链cDNA2ulPerfectshotTaq10ul上游引物（10um）1ul下游引物（10um）1ulRNaseFreeH2O6ul总体积20ul（3）qPCR扩增条件Step1：预变性（1Cycle）95℃30秒Step2：PCR反应（40Cycle）95℃5秒60℃30秒Step3：MeltCurve（4）qPCR结果分析以各样本Ct值作为统计参数：内参基因平均Ct值=（Ct1+Ct2+Ct3+Ct4+Ct5+Ct6）/6；△CT=目的基因Ct值-17 遵义医学院硕士学位论文姚远镇-△△内参基因平均Ct值；△△CT=实验组△CT-对照组△CT；目的基因的相对表达量=2CT。采用SPSS20.0统计软件进行数据分析处理，结果采用（均数±标准差）来表示。1.5.8建立小鼠背部皮肤压疮动物模型[12]参照报道的方法建立压疮模型。选取C57小鼠24只，经腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉生效后用电剪剃除小鼠背部毛发，在小鼠背部中央的头、尾端对称性提起皮肤，将两个直径为12mm、厚度为5mm的圆形磁铁夹住小鼠背部皮肤，使两个磁铁间保留有宽约0.5cm正常皮肤。磁铁夹住皮肤12小时后，去除磁铁12小时，此为一个周期。每只老鼠需完成两个周期。48小时后每只老鼠背部形成两个压疮创面。将24只小鼠48个压疮创面随机分为三组：nASCs移植组、dASCs移植组、PBS6组。用PBS悬浮增殖期第三代细胞并调整浓度为2×10个/ml，在压疮创面周边及基6底部，分别对应多点注射nASCs、dASCs及PBS0.5ml，即每个创面注射1×10个细胞，PBS组注射无细胞的PBS0.5ml。分别于移植后的第1、5、9、13、17、21天，应用数码相机进行跟踪拍照，拍照时压疮创缘放置钢制测量尺，并运用ImageJ软件计算创面的大小，并计算创面愈合率，公式：创面愈合率=（原始创面大小-剩余创面大小）/原始创面大小×100%。自注射起11天、21天分批处死小鼠，获取创面组织块，应用10%多聚甲醛固定组织块过夜，予以修剪、脱水、脱蜡、透明及石蜡包埋后切片。1.5.9创面组织染色1.5.9.1HE染色将切片放置在二甲苯中静置10分钟，更换另一瓶二甲苯后切片再次浸泡10分钟脱蜡；按顺序在无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中分别浸泡各5分钟脱水；然后予以三蒸水轻轻冲洗三次，每次5分钟。吸水纸将玻片中的水滴吸干，将切片放置于苏木素染色液中浸泡2分钟，三蒸水轻轻冲洗，再将切片放置于伊红染色液中浸泡2分钟，再次脱水，应用二甲苯透明，等待风干应用后中性树胶滴于切片上应用盖玻片封片。在显微镜下观察并拍照，并随机选取8个高倍镜视野，应用ImageJ软件进行炎症细胞计数及计算八个不同部位的表皮厚度。1.5.9.2Masson染色切片常规脱蜡、脱水、三蒸水冲洗；Weigert铁苏木素染色10分钟，酸性乙醇分化液分化、水洗，masson蓝化液反蓝、水洗，三蒸水缓慢轻轻冲洗1分钟，放置18 遵义医学院硕士学位论文姚远镇于丽春红品红染色液中浸泡染色5分钟，应用弱酸工作液缓慢冲洗1分钟，再用磷钼酸溶、弱酸工作液轻轻冲洗1分钟，放置于苯胺蓝染色液中染色1分钟后应用弱酸工作液清洗1分钟，95%及无水乙醇脱水，其中无水乙醇脱水三次每次10秒左右，二甲苯透明待风干后应用中性树胶滴于切片上用盖玻片封片。在显微镜下观察并拍照，随机选取8个高倍镜视野，应用ImageJ软件对胶原沉积含量百分比进行分析。1.5.9.3CD31、S100免疫组织化学染色切片常规脱蜡、脱水、三蒸水冲洗；3%H2O2浸泡15分钟，PBS清洗3次每次5分钟，浸泡于枸橼酸盐缓冲液中并在微波炉内加热15分钟，室温冷却，PBS清洗，山羊血清室温封闭60分钟，一抗（稀释比1:200）孵育4℃下过夜。约12小时后，应用PBS轻轻冲洗约15分钟分三次进行，在37℃下应用二抗工作液孵育半小时，应用PBS轻轻冲洗约15分钟分三次进行，37℃条件下应用碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液浸泡30分钟，应用PBS轻轻冲洗约15分钟分三次进行，DAB显色，三蒸水清洗两次每次5分钟，苏木素复染5分钟，三蒸水清洗，在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各3分钟，甲苯透明待风干后应用中性树胶滴于切片上用盖玻片封片。在显微镜下观察并拍照，随机选取8个高倍镜视野，应用ImageJ软件计数微血管数量及神经细胞百分比分析。1.5.10荧光示踪法追踪脂肪干细胞定植及存活情况于注射细胞后11天切取创缘及创面组织，立即予冰冻包埋剂固定后制作冰冻切片，PBS冲洗包埋剂，DAPI染细胞核5min后予以PBS清洗，甩干后于倒置荧光显微镜下观察，予蓝光激发，观察绿色荧光表达情况。1.6统计学方法实验结果均采用SPSS18.0及GraphPadPrism5统计软件进行统计学分析及作图，实验结果采用均数±标准差（x±S）表示。实验结果两两比较采用t检验；对实验结果进行正态检验及方差齐性检验，符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析，若表达差异有统计学意义，则进一步采用最小显著差法（LeastSignificantDifference，LSD）进行两两比较；P<0.05表示差异有统计学意义。19 遵义医学院硕士学位论文姚远镇2结果2.1ASCs的的形态成功从正常与糖尿病患者脂肪组织中分离出ASCs，原代接种8小时候可见贴壁细胞，48小时换液后贴壁细胞形态不一；后细胞生长速度加快，大多细胞逐渐伸展成长梭形，细胞9-10天融合可达80%-90%。传代后细胞生长明显加速，5天左右即可再次传代。两组第3代细胞外形均一，多呈长梭形，呈放射样旋涡状生长，形态无明显区别。如图1。图1第三代nASCs与dASCs细胞形态两组细胞均呈长梭形，呈放射样旋涡状生长倒置荧光显微镜(x40)。2.2ASCs的表型应用流式细胞仪检测传至第三代的细胞的表面标志物，nASCs的结果为CD90（97.57%）、CD105（99.70%）、CD73（97.65%）、CD44（99.98%）呈阳性表达，CD34（0.42%）呈阴性表达；dASCs的表面标志物为CD90（97.76%）、CD105（99.71%）、CD73（97.67%）、CD44（99.98%）呈阳性表达，CD34（0.46%）呈阴性表达。如图2。20 遵义医学院硕士学位论文姚远镇图2第三代nASCs与dASCs流式鉴定结果两组细胞的CD90、CD105、CD73、CD44均呈阳性表达，CD34均呈阴性表达。2.3ASCs的增殖能力采用MTT法检测第3代细胞增殖能力并绘制生长曲线，结果显示nASCs增殖能力较dASCs强，生长速度较快。第3天前两组细胞均处于生长停滞期，第3天到第6天细胞处于对数增长期，但nASCs曲线斜率更大，第6天后逐渐进入平台期。在相应的时间点中，dASCs的OD值均比nASCs的低。如图3。图3第三代nASCs与dASCs生长曲线nASCs增殖能力较dASCs强，生长速度较快。2.4ASCs三系诱导分化及实时定量PCR经成脂诱导培养后行油红染色，细胞内均可见大小不等的串珠样的红色圆形脂滴；经成骨诱导培养后行茜素红染色，细胞内均可见棕黑色钙结节生成。表明nASCs与dASCs均可成功诱导成脂肪细胞和成骨细胞。但dASCs中的脂滴比nASCs多，而生21 遵义医学院硕士学位论文姚远镇成的钙结节比nASCs少，表明dASCs成脂能力强于nASCs，但成骨能力低于nASCs。诱导成脂及成骨2周后，应用实时定量PCR检分别测成脂标记基因PPAR-γ、成骨细胞标记基因骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）mRNA。结果显示，dASCs表达PPAR-γmRNA明显高于nASCs，但骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）mRNA的表达明显低于nASCs，差异均具有统计学意义（P<0.001）。如图4及表5。PPAR-γ、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）和GAPDH扩增曲线及溶解曲线见图5。图4第三代nASCs与dASCs诱导成骨成脂结果和成骨与成脂相关基因相对表达统计结果(n=3)；A和C为nASCs与dASCs成骨诱导3周后，细胞内可见棕黑色钙结节沉积茜素红×100；B和D为nASCs与dASCs成脂诱导3周后，细胞内圆形脂滴经油红染色后呈红色颗粒样油红染色×100；E和F为成骨与成脂相关基因相对表达统计结果（***代表P<0.001）。表5成骨标记基因BMP-2、BGP及成脂标记基因PPAR-γ相对表达量（x±S）BMP-2BGPPPAR-γnASCs6.38±0.242.26±0.112.91±0.27dASCs3.04±0.281.50±0.086.88±0.6222 遵义医学院硕士学位论文姚远镇图5PPAR-γ、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素（BGP）和GAPDH扩增曲线及溶解曲线2.5压疮创面的观察成功建立小鼠背部皮肤压疮模型。nASCs组第9天时压疮处坏死皮肤已经脱落，13天时创面最先闭合，上皮化最快。dASCs组第11天时坏死皮肤脱落，13天时仍有鲜红色创面，17天时创面已经闭合，但遗留较大面积的裸露皮肤。PBS组第15天坏死皮肤脱落，17天时仍遗留结痂创面。21天时三组创面均已完全愈合。由此可知，nASCs组创面愈合速度最快，dASCs组愈合速度次之，PBS组创面愈合最慢。如图6及表6。23 遵义医学院硕士学位论文姚远镇图6三组创面愈合情况、创面愈合率统计图及压疮模型的建立。A三组压疮创面愈合大体图片；B三组创面愈合率统计图；C磁铁压迫小鼠背部皮肤建立压疮模型。（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。表6三组小鼠压疮创面愈合率（%）组别第1天第5天第9天第13天第17天nASCs8.59±2.5836.47±5.8389.18±2.1499.47±0.89100.00dASCs8.61±2.7335.66±6.5260.40±7.6787.18±2.56100.00NC8.63±3.4519.89±7.2046.32±4.2166.25±5.2686.91±5.382.6组织学检测2.6.1HE染色第11天，nASCs组创面最小，并且开始出现上皮化，而dASCs组与PBS组创面表面痂皮与基底组织分离，未出现上皮化；在nASCs组、dASCs组及PBS组中炎性细胞浸润程度依次递减，组间差异具有统计学意义（P<0.001）。第21天，炎性细胞浸24 遵义医学院硕士学位论文姚远镇润程度在三组中无明显区别；表皮厚度在nASCs组、dASCs组和PBS组依次递减，组间差距具有统计学意义（P<0.05）；三组中创面周边均可见再生的毛囊，其中dASCs创面中央可见新生毛囊。如图7及表7。图7三组压疮创面第11、21天HE染色结果、炎症细胞数目统计图及第21天三组表皮厚度统计图（n=8）HE×100/200（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。25 遵义医学院硕士学位论文姚远镇表7三组创面炎症细胞相对数（个）及表皮厚度（um）dASCsnASCsNC11天炎症细胞相对数（个）43.20±1.9259.00±1.5876.80±2.8621天炎症细胞相对数（个）42.00±2.4543.40±1.8242.80±2.5621天表皮厚度（um）49.44±9.1925.81±4.5314.38±2.282.6.2马松染色马松染色结果显示，第11天，dASCs组（48.38±1.36%）胶原沉积比nASCs组（45.85±1.95%）多，但差异无统计学意义；dASCs组和nASCs组胶原沉积明显大于PBS组（41.46±1.75%），差异有统计学意义（P<0.001）。如图8。图8第11天三组压疮创面胶原相对表达及统计图（n=8）Masson×100/400（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。第21天，nASCs组（56.93±1.67%）、dASCs组（54.17±1.71%）与PBS组（50.34±1.29%）胶原沉积依次递减，组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。如图9。26 遵义医学院硕士学位论文姚远镇图9第21天三组压疮创面胶原相对表达及统计图（n=8）Masson×100/400（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。2.7免疫组织化学检测2.7.1CD31免疫组织化学第11天，nASCs组（17.80±0.84）的血管数目与dASCs组（17.20±1.30）无显著差别，两者血管数目均明显大于PBS组（8.00±1.41），差异具有统计学意义（P<0.001）。第21天，血管数目在nASCs组（20.00±1.87）、dASCs组（18.00±2.12）及PBS组（14.00±1.58）中依次递减，各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。如图10。图10第11、21天三组压疮创面新生血管密度及统计图（n=8）CD31免疫组化×200（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。27 遵义医学院硕士学位论文姚远镇2.7.2S100免疫组织化学第11天，nASCs组与dASCs组均未见阳性显色细胞。第21天，nASCs（1.63±0.08）组的雪旺氏细胞密度小于dASCs（1.76±0.12），但两组间无统计学意义；nASCs组和dASCs均明显大于PBS组（0.55±0.04），差异具有统计学意义（P<0.001）。如图11。图11第11、21天三组压疮创面雪旺氏密度及统计图（n=8）S100免疫组化×400（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。2.7.3细胞追踪应用绿色荧光蛋白成功标记dASCs与nASCs；注射于创面后，第11天取创面组织行制作冰冻切片，荧光显微镜下可观察到dASCs组与nASCs组创面组织中均有绿色荧光表达，表明移植11天后dASCs和nASCs仍可定植于创面中。如图12。28 遵义医学院硕士学位论文姚远镇图12A、B分别为绿色荧光蛋白标记的dASCs和nASCs；C、D为第11天dASCs组和nASCs组压疮创面组织荧光追踪倒置荧光显微镜×200。29 遵义医学院硕士学位论文姚远镇3讨论随着社会生活方式的改变及人口老龄化的发展，糖尿病足及压疮等慢性创面的发生率逐渐增高。在寻求慢性创面新的治疗方式过程中，细胞疗法已成为研究热点。自发现ASCs以来，已证实其可促进多种慢性创面的愈合。有大量研究表明，ASCs可分泌多种生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）等，可分化为创面愈合所需要的细胞如表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞，还可调节创面的炎症反应，从而促进创[26-32]面的愈合。然而，dASCs是否仍保留促创面愈合能力，糖尿病患者是否可用自体的dASCs移植治疗糖尿病足等慢性创面，目前仍不明确。因此，本研究对比了nASCs与dASCs的生物学功能，发现两种细胞形态及所检测的细胞表面标志物无明显区别，均可向骨细胞、脂肪细胞分化，但dASCs成骨能力降低，而成脂能力增强，与nASCs相比，dASCs的增殖能力下降。将两种细胞注射于小鼠压疮创面，发现nASCs可明显加快小鼠压疮创面的愈合；而dASCs促创面愈合能力下降，但仍可降低创面局部炎症反应，增加表皮厚度，促进创面胶原沉积，增加创面局部血管新生及周围神经再生，从而促进小鼠压疮创面愈合，提高愈合质量。我们的研究显示dASCs与nASCs的形态及所检测的表面标记物均无明显区别，结[21][33]果与Cianfarani的报道相同。但是Nawrocka的研究认为这两种细胞形态呈多样性，在加入bFGF后细胞形态均有明显变化。还有有学者研究发现dASCs的免疫表型[34]发生改变，导致降低炎症反应的功能受损。ASCs已被证实可分化为多种细胞，这也是其被关注的重要原因之一。本研究结果表明，与nASCs相比，在相同的诱导条件下dASCs向脂肪细胞分化的能力增强，而向骨细胞分化的能力减弱。这与Cramer的研究结果一致，此外，Cramer等研究还发现较高的葡萄糖浓度可使体外培养的nASCs成骨和成软骨的能力降低，而成脂能力增加，应用胰岛素干预后dASCs的功能可得到[35][36]部分调节和恢复。有学者认为胰岛素抵抗和高血糖可能使ASCs的成脂能力增加，[37]高血糖环境及所产生的AGEs是ASCs同源成骨分化的不利因素。这与我们的临床发[38]现一致，即有24.3%的糖尿病患者出现肥胖，糖尿病也是骨质疏松症性骨折的危险[39]因素之一。我们的研究结果可能给糖尿病患者易合并肥胖及合并骨质疏松多了一种解释方式，也为解决糖尿病肥胖及骨质疏松的问题提供了一个思路。30 遵义医学院硕士学位论文姚远镇压疮为皮肤软组织长时间受到压迫，使局部血运循环受到影响，导致局部出现组织变性、坏死，是长期卧床或行动能力低下患者的严重健康问题。从本研究结果可知，与nASCs相比，dASCs促压疮创面愈合的能力降低，但是仍能加快压疮创面的愈合速[40]度。ASCs促进创面愈合主要与其分泌、分化、增值及免疫调节等功能相关。已有报道dASCs释放的HGF、VEGF、胰岛素样生长因子（IGFs）、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、FGF、血小板源性生长因子-a(PDGF-a)、趋化因子CCL-2、血管生成素样蛋白-4(ANGPTL-4)等明显减少，而这些因子在急慢性[21，23，41，42]创面的愈合中有着重要的作用。在增殖能力方面，有学者研究发现，dASCs[21,41,43][44]与nASCs相比增殖和迁移能力下降，且凋亡水平增加。Cheng发现高糖环境培养的nASCs同样表现出了增值、迁移能力下降、衰老加速，但多能标记物Sox-2、Oct-4[45]和Nanog的表达增强。Liu发现dASCs还减少前列腺素E2(PGE2)的分泌，而PGE2可降低炎性反应，发挥着免疫调节的作用。血管再生及胶原沉积是创面愈合的重要过程。在本研究中，组织学检查结果显示第11天时nASCs组与dASCs组的血管密度和胶原沉积量无显著差别，但均明显多高于PBS组；在第11天的炎性细胞浸润程度、21天的表皮层厚度和胶原沉积含量在nASCs组、dASCs组、PBS组依次递减。表明dASCs减轻局部炎症反应、增加表皮厚度、促进胶原沉积及促血管生成的功能虽然下降，但是并未完全消失，特别是在创面愈合早期dASCs仍可促进血管生成及胶原生成。在[23]Rennert的研究中应用dASCs与nASCs分别与人脐带血管内皮细胞共培养，结果表明dASCs组的血管内皮细胞出牙及形成的网状结构均较nASCs组少，发现dASCs与血[46]管形成和组织重塑相关的基因表达和蛋白水平明显低下。Policha认为人dASCs的血管分化能力受损。有学者认为，糖尿病对ASCs影响的机制可能是，降低再上皮化和角质细胞的增值，减少肉芽组织的形成和减慢真皮组织的再生，减少新血管化和血[24]管生成；dASCs还上调粘附分子和延长炎症期，从而使其促创面愈合能力的功能受[47]损。第21天组织学检查结果表明，与PBS组相比，nASCs组与dASCs组创面周边的再生毛囊更密集，其中dASCs创面中央可见新生毛囊。相关研究表明ASCs不仅可促[48]进创面生长，同时还能刺激毛囊并诱导毛发生长。已经证实ASCs条件培养含有多[49]种对头发生长有利的生长因子，且现已制备成相关产品并在临床应用中推广。神经功能的减退或缺失被认为是压疮复发的重要病理生理机制之一；神经病变也是糖尿病31 遵义医学院硕士学位论文姚远镇的严重并发症，也是糖尿病足发生的重要机制。众所周知ASCs可分泌多种促神经生[50-52]长的生长因子，如神经生长因子和脑源性神经营养因子等。在本研究中，第21天的S100免疫组化神经细胞染色结果表明，nASCs组和dASCs组神经细胞密度无明显区别，但是均比PBS组高。还有报道表明在体外环境下dASCs和高糖干预后的nASCs[44]均可有效的分化为神经样细胞，且dASCs分化能力较nASCs强。这可能说明在糖尿病的影响下，dASCs促神经生长的功能未发生明变化，甚至其能力得到增强。由此可知，dASCs在促进创面愈合的过程中，其神经再生的作用可能起着重要作用，同时也表明dASCs可能是治疗神经再生的理想细胞。4结论与nASCs相比，dASCs的形态和表面标志无明显变化，但其增殖和成骨分化能力下降，而成脂分化能力增加。dASCs局部移植可通过调节局部炎症、增加表皮厚度、增加创面胶原沉积、促进血管新生和神经再生，促进压疮创面愈合。dASCs局部移植仍具备促进慢性创面愈合的能力，但其能力较nASCs下降。32 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遵义医学院硕士学位论文姚远镇综述糖尿病脂肪来源干细胞生物学功能的研究进展姚远镇综述王波、邓呈亮审校脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells，ASCs）是存在于脂肪组织中的具有自我更新和多向分化潜能的成体间充质干细胞。应用脂肪干细胞治疗糖尿病创面[1][2][3][4][5]、压疮创面、放射性创面、烧伤创面、全层皮肤缺损创面的基础研究及部分[6,7]临床实验已经取得了良好的效果。因其有来源广泛、含量多、获取创伤小、免疫原性低等优势，临床应用前景十分广泛。糖尿病创面愈合困难的原因可能与晚期糖基化终末产物(AGEs)增多、长期的慢性炎症反应及外周神经功能障碍密切相关。糖尿病患者体内长期的高血糖环境及AGEs、活性氧、酮体等物质增多，对机体的ASCs生物[8,9]学功能产生影响，从而进一步影响创面的愈合。糖尿病创面是否可用糖尿病患者自体的ASCs即糖尿病脂肪来源干细胞（diabeticAdipose-derivedstemcells，dASCs）移植治疗目前仍存在争议，糖尿病影响ASCs生物学功能的部分研究结果尚不统一。因此，本文就dASCs的生物学功能研究做一综述，希望能为糖尿病创面自体dASCs治疗提供初步的参考依据。1.dASCs的一般特性及鉴定1.1分离与培养dASCs的分离和培养方法与正常脂肪来源干细胞（normalAdipose-derived[10,11]stemcells，nASCs）的培养方法相同，暂未发现特殊的分离与培养方式。自Zuk[12]发现ASCs以来，其分离及培养方法均以Zuk的基础上稍作变动。具体细节如胶原酶浓度、离心转速与时间、消化时间、换液时间、培养基成分等各个文献报道不完全一致。目前获取的ASCs多以胶原酶消化法为主。不同研究者分离获取ASCs的具体数量结果差异较大，这可能和脂肪取材方法、取材部位、性别、年龄、供体的健康状况及细胞分离方法等有关。1.2细胞形态[13][14]Cianfarani、Dzhoyashvili等人认为dASCs与nASCs的形态无显著异常。原代培养的dASCs接种3天后可见少量贴壁细胞，细胞形态呈圆形、多角形、梭形、38 遵义医学院硕士学位论文姚远镇成纤维样生长，培养10天左右细胞融合即可达80%，传代后的细胞生长速度加快，[15]5-6天融合可达80%，第二代、第三代以后细胞生长呈鱼群状排列，呈成纤维样形态。[16]而许言文报道在糖尿病足溃疡植皮时切取的脂肪获取的dASCs形态与nASCs的形态有明显的差别，并认为这种形态上的差异可能与糖尿病溃疡不易愈合有潜在的相关性。1.3标记物及鉴定特异性标记物可用于鉴别细胞群。目前为止，尚未发现ASCs的特异性标记物，这与脂肪供体、提取方法、分离、培养、细胞代数、体内外微环境、检测方法的差异[17]等各种相关因素有关。在2013年国际脂肪应用技术协会确定新分离的ASCs表型为CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而体外培养的ADSC表型为CD31-/CD44+/CD45-/CD73[18]+/CD90+/CD105+。现在对ASCs的鉴定多以贴壁的特征为基础，采用相对特异的细胞表面标记物联合多向诱导分化来实现。目前也无dASCs的特异性标记物，取糖尿病[14][19]患者或糖尿病鼠脂肪提取的ASCs就为dASCs。Dzhoyashvili、Cheng认为dASCs[20]和nASCs中的细胞表面标记类似。Trinh报道除了CD166/ALCAM在dASCs中与nASCs相比表达较高以外，其他间充质干细胞特有表面标记物在二者中都有类似的表达。[13]Cianfarani研究认为糖尿病来源的基质血管成分（SVF）和dASCs表面标记的表达[21]发生改变，阳性标记干细胞减少。Liu的研究结果显示dASCs获得了一种促炎性的免疫表型，增加主要组织相溶性复合体-II（MHC-II）和共刺激因子(CD40，CD80)的表达；在和糖尿病的SVF的上清液培养以后，nASCs也可以获得表型的改变。干细胞抗原CD34在体内、刚分离和体外培养初期的ASCs中表达，在体外长时间培养后，[22-25]其表达逐渐降低最后完全消失，说明了环境能对干细胞抗原的表达产生影响。糖尿病患者体内环境与正常人不同，异常的体内环境对ASCs表型是否产生了影响，并形成有鉴别意义的抗原仍有待研究。1.4成骨、成脂诱导分化诱导分化是鉴定ASCs的一种形式。dASCs已被证实有成骨、成脂及成软骨能力，故dASCs具有多向分化潜能。虽然对dASCs成骨、成脂分化能力的变化尚有不同的观[26-28]点，但是多数研究者认为dASCs成骨分化能力降低。若把糖尿病患者自体dASCs作种子细胞应用在骨组织工程中，其成骨能力下降的问题需要纳入考虑范围，避免因成骨能力不足而影响治疗效果。39 遵义医学院硕士学位论文姚远镇2.糖尿病对ASCs功能影响的研究糖尿病足是因血管病变、神经病变及感染所致的糖尿病严重并发症。已有文献报[1,29]道应用ASCs治疗糖尿病创面取得了良好的效果。但是，糖尿病患者机体长期处于高血糖环境下，带有乙醛基的还原糖在非酶促条件下把脂质、蛋白和核酸修饰形成的AGEs生成增多，进而可引起氧化应激和促炎反应，导致机体干细胞动员减少，影响[30-32]ASCs对受损内皮的修复，体外移植的干细胞也难以归巢、存活。对于dASCs功能受损的研究多以两种方法进行：一种取糖尿病病人或糖尿病鼠的dASCs，一种体外模拟糖尿病环境对ASCs进行体外培养，然后分别研究分析干细胞的相关特征及促进创面愈合的功能。已有文献报道糖尿病会对脂肪干细胞的分化、增殖、迁移、分泌及血管生成等功能产生影响，但是其作用机制尚未明了，部分研究结果也不相一致。2.1dASCs的分化功能dASCs分化功能的研究多集中在成骨、成脂上，对于其他方向分化的报道较少。[26]Cramer等研究结果显示，与nASCs相比，二型糖尿病患者的dASCs的成骨和成软骨能力下降，而成脂能力增强；在体外高葡萄糖浓度培养条件下可以降低nASCs成骨和成软骨的潜力，但成脂的能力增加，而应用胰岛素干预后dASCs的功能可以得到部[27]分调节和恢复。许晓茹在研究鼠dASCs成骨能力时发现，成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色较nASCs减弱，而成脂诱导后油红O染色较nASCs强。李冬[33]松体外模拟糖尿病坏境并对ASCs进行诱导成骨，认为高糖与AGEs是导致ASCs成[34]骨分化能力下降的不利因素。Kume同样认为AGEs削弱人间充质干细胞的成骨、成[20]脂及成软骨能力。Trinh认为dASCs与nASCs相比其成脂能力增加、脂肪特有基因如过氧化物酶体增殖物激活受体-g2（PPAR-g2）和脂联素的表达增强，而成骨能力及[19]成骨基因如Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的表达相当。而Cheng的报道显示高糖和低糖培养的人nASCs其成脂和成骨分化能力相当，在合适的诱导培养基中培养时，高糖培养nASCs和dASCs表现出分化成类神经元样细胞的能力增强。另一种观点认为与鼠[28][35]nASCs相比，dASCs成骨、成脂能力均降低。而Barbagallo则认为人dASCs不能[36]分化成为成熟的功能性脂肪细胞。Ghorbani在比较糖尿病诱导前后的皮下和内脏的ASCs增殖和分化能力的研究中，发现在糖尿病诱导之前，皮下的ASCs的成骨、成脂分化能力均高于附睾的ASCs；在糖尿病诱导之后，皮下ASCs和附睾的ASCs都能分化成脂肪细胞和成骨细胞，但是皮下ASCs分化水平比附睾的ASCs更高，并发现糖40 遵义医学院硕士学位论文姚远镇尿病减少了过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和脂蛋白脂酶(LPL)基因的表达，增加了SPP1和ALP基因的表达。2.2dASCs的增殖与迁移多数学者研究结果显示dASCs的增殖及迁移能力较nASCs低。对于鼠来源的[13][37]ASCs，Cianfarani、王哲的研究认为鼠dASCs与nASCs相比增殖和迁移能力下降；[38][39]Elftesi、Cronk发现鼠dASCs增殖能力降低，且凋亡水平增加。对于人来源的[16][20]ASCs，许言文、Trinh研究结果分别显示人dASCs的增殖、迁移能力低于nASCs，但是在对数增长期，在常氧和缺氧条件下dASCs和nASCs的平均倍增时间相似。对于[19]细胞干性的影响，Cheng研究表明人dASCs或高糖培养的nASCs表现出了增值下降，但多能标记物Sox-2、Oct-4和Nanog的表达增强，表明干性增强；高糖培养的nASCs迁移能力下降，衰老加速；在抗氧化剂存在的情况下，高糖培养的nASCs增殖活性增[26]加，而干性不增加。Cramer的研究还发现人dASCs较nASCs显示出了高水平的细胞衰老和细胞凋亡；与nASCs不同的是，dASCs的细胞凋亡是通过内在的通路诱导的；体外葡萄糖浓度的升高降低了人dASCs和nASCs的增殖能力，但是对dASCs的影响更[40]明显；加入胰岛素后细胞增殖能力增强，但nASCs增强更为明显。伍峰等用AGEs亚型—N羧甲基赖氨酸修饰白蛋白对ASCs进行体外培养，观察到AGEs能抑制ASCs[41]的增值、迁移能力，并导致凋亡增加；王哲报道结果同样显示AGEs可使dASCs[28]增殖能力和迁移能力明显下降。Rennert应用鼠dASCs与nASCs分别与人脐带血管内皮细胞共培养，发现dASCs组的血管内皮细胞出牙及形成的网状结构均较nASCs[42]组少。而有学者的研究则显示人dASCs的分离效率和增殖能力与正常人ASCs相同。[14]Dzhoyashvili发现冠心病合并糖尿病患者的ASCs与nASCs相比有更高的增值活性[36]和较短的端粒。对于不同部位来源的脂肪干细胞的研究，Ghorbani发现糖尿病增强了皮下ASCs的增殖能力，但是附睾的ASCs的增殖能力无增强。2.3dASCs的分泌功能糖尿病机体的ASCs在长期的异常内环境下，分泌功能同样发生了改变。对于鼠[13]来源的ASCs，Cianfarani的研究显示鼠dASCs释放肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子（IGFs）的量较低，dASCs的上清液[37]促进角质形成细胞和成纤维细胞增殖和迁移的能力降低。王哲同样发现鼠dASCs条件培养液中VEGF、HGF和IGF-1蛋白含量明显降低；且dASCs组移植于创面后1441 遵义医学院硕士学位论文姚远镇[39]天创面组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较nASCs组低，但较空白对照组高。Cronk还发现鼠dASCs较nASCs分泌的胰岛素样生长因子结合蛋白质-3(IGFBP-3)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、骨桥蛋白、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)明显减少，并认为[28]dASCs在糖尿病性视网膜病变中稳定微血管系统的能力减弱。在Rennert的研究中同样认为糖尿病可影响ASCs的分泌功能，认为鼠dASCs与nASCs相比，多种生长因子与细胞因子如VEGF-a、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、血小板源性生长因子-a(PDGF-a)、SDF-1和它们相关受体的相对基因表达量显著减少。供体年龄可能也影响ASCs的分泌能力，老龄小鼠dASCs虽仍有分泌VEGF的能力，但较小龄正常小鼠[38][43]nASCs的低。对于人来源的ASCs，Trinh研究发现人dASCs与nASCs相比，迁移因子如SDF-1、趋化因子受体-4（CXCR-4），生存因子如趋化因子受体-7（CXCR-7），早期炎症因子如趋化因子CCL-2，血管生成因子如血管生成素样蛋白-4(ANGPTL-4)等显著下调，这些因子能促进肿瘤细胞的增值、迁移和存活，且在急慢性创面的愈合中[26]有着重要的作用。在体外实验中，Cramer的研究表明体外高浓度的葡萄糖会导致人nASCs和dASCs的胰岛素抵抗基因如脂联素和抵抗素的表达存在显著的差异，应用胰[40]岛素干预时，dASCs基因表达的某些变化是不可逆转的。伍峰发现ASCs在高AGEs[41]环境下VEGF的分泌减少，血管新生能力减弱。王哲同样用含AGEs修饰的牛血清白蛋白的培养基培养人ASCs，结果显示AGEs可使ASCs的VEGF、HGF和IGF-1的mRNA[21]及蛋白表达水平显著降低。随后Liu还发现dASCs减少前列腺素E2(PGE2)的分泌。但是，冠心病合并糖尿病患者的dASCs分泌的HGF、胎盘生长因子(PlGF)显著升高，其dASCs条件培养基中的血管生成抑制因子如血小板反应蛋白、内皮抑素、纤溶酶原[14]激活物抑制剂-1(PAI-1)，与控制组相比明显升高。2.4dASCs的促血管生成能力[38]dASCs促血管生成作用，各个研究结果相对不一致。El-FtesiS认为老龄糖尿[28]病鼠来源的dASCs与小龄正常鼠的ASCs相比，其血管再生潜力受到损害。Rennert研究发现与nASCs组相比，dASCs组与血管形成和组织重塑相关的基因（基质金属蛋白酶-9、SDF-1、血管生成素-1、HGF、VEGF-a、基质金属蛋白酶-3）表达和蛋白（VEGF、基质金属蛋白酶-9、HGF）水平明显低下，认为糖尿病通过选择性消耗细胞亚群损害[42]鼠dASCs的血管生成潜能。Policha同样认为人dASCs的血管分化能力受损。[14]Dzhoyashvili也认为dASCs血管生成活性明显降低，从而限制了糖尿病患者自体42 遵义医学院硕士学位论文姚远镇[44]移植ASCs的治疗效果。而Kim却认为dASCs与nASCs相比，其促进伤口愈合的能力受损，但是尽管功能下降，dASCs保留了促进新血管化和血管生成的能力，并认为这种差异可能归因于细胞的年龄，也可能是糖尿病引起的效应在体内无法检测。3、改善dASCs生物学功能的研究基于以上等研究，多数学者认为受高糖和糖基化产物的影响，ASCs的内在特性[44]发生改变，导致促伤口愈合的能力降低。Kim认为糖尿病对ASCs影响的机制可能是:①降低再上皮化和角质细胞的增值；②减少肉芽组织的形成和减慢真皮组织的再生；[20]③减少新血管化和血管生成。Trinh等人发现dASCs上调粘附分子和延长炎症期，从而使其促创面愈合能力的功能受损。对于如何提高dASCs的功能并增强其创面修复[26]能力是解决糖尿病患者自体ASCs移植的重要途径。Cramer认为dASCs功能的完整性受损，一定程度上很可能与胰岛素的调节有关，提示胰岛素治疗在某些方面可以增[40]强或恢复ASCs的功能。伍峰的体外实验显示丹红注射液能显著促进ASCs增殖和迁移能力，抑制其凋亡，增加VEGF的分泌，并改善血管新生能力，认为丹红注射能改[45]善AGEs亚型—N羧甲基赖氨酸修饰白蛋白对ASCs的负面作用。王哲等人用普罗布考干预鼠dASCs的实验中发现，与dASCs组相比，dASCs+普罗布考组增殖和迁移能力增加，VEGF、HGF、IGF-1蛋白和mRNA表达水平上升，认为普罗布考对dASCs增殖、[43]迁移和分泌能力具有保护作用。Trinh等人研究发现用nASCs的微囊泡（Microvesicles，MVs)修饰dASCs，结果发现MVs具有改变miR29c和miR150表达的能力，并能上调在急性和慢性创面中有着重要作用的迁移因子SDF-1、CXCR-4、生存因子CXCR-7、早期炎症因子CCL-2和血管生成因子ANGPTL-4基因的表达；用MVs修饰的dASCs，增强了在体外和体内的迁移能力和促进创面愈合的能力。Trinh的另一项研究结果表明dASCs通过MAPK/ERK途径和HIF-1a在EGR1基因的启动子区域直接转录激活这两条途径使EGR-1表达增加,而EGR-1激活了许多生长因子的表达，如成纤维生长因子和转化生长因子-β，黏附分子(富半胱氨酸61，细胞间黏附分子-1和单核细胞趋化因子-1)，以及重组人肿瘤坏死因子α和白介素-6；认为高水平的EGR-1是造成dASCs创面愈合能力受损原因；并提出通过控制上游的MAPK/ERK信号和HIF因子来控制EGR-1的表达，可能是治疗二型糖尿病患者慢性创面与组织缺血的[20][46]一种新的治疗方法。Mehrabani应用甲磺酸去铁胺（DFO）干预dASCs，发现DFO可显著增强HIF-1a,VEGF,成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和SDF-1的基因和蛋43 遵义医学院硕士学位论文姚远镇白表达水平，并恢复了基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性，使dASCs条件培养基受损的血管生成潜力得到修复，认为应用DFO预处理可通过影响HIF-1a通[47]路来修复dASCs的血管生成潜力。在Nawrocka的研究中应用添加有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基对人dASCs对进行培养，发现bFGF通过改善细胞形态、增加细胞的增殖率、提高克隆的潜力、降低衰老和凋亡、增强胰岛素敏感性使dASCs的功能得到恢复，认为在克服氧化应激环境的不利影响中，bFGF的作用是有益的，[48]且bFGF剂量为5ng/ml时效果最显著。Peng的研究表明乙二醛酶过表达可有效的在体内外恢复dASCs的迁移、分化及促血管生成能力，从而使dASCs促血管生成功能的[28]缺陷得到逆转。而Rennert应用鼠dASCs与nASCs种植于有支持干细胞存活、维持干性特征和改善血管生成功能的仿生水凝胶支架中，发现两者的增殖和存活能力不变，但是dASCs的形态出现明显的异常，并认为体外环境的优化不能恢复dASCs的功能。4、小结与展望糖尿病对ASCs分化、增殖、迁移、分泌及血管生成功能影响的研究结果虽然不完全一致，但是糖尿病的微环境使ASCs的生物学功能特别是分泌功能受到影响的观点基本一致，而ADSC的分泌功能是促进创面愈合功能的主要方面之一，故糖尿病患者行自体脂肪移植或ASCs移植时，需考虑其ASCs功能下降的问题，避免因ASCs部分功能降低而未能达到预期的治疗效果。dASCs促进创面愈合功能受损的机制及如何改善dASCs的功能的研究仍需进一步深入，如何改进dASCs的移植途径，提高dASCs移植后的远期保留率，也是弥补dASCs功能下降的重要手段之一。最近有学者对脂肪进行了物理乳化，使其脂肪细胞结构破坏，而保留了脂肪干细胞的功能，用于局部注[49]射后同样保留促创面愈合的功能。还有有报道通过物理方法去除脂肪细胞，获得了一种全新的脂肪组织移植物，命名为细胞外基质血管基质成分胶，这种可注射型脂肪胶内仅含有高浓度的细胞外基质和血管基质成分，ASCs被天然的脂肪源性支架保护，有效的提高了ASCs移植后的远期保留率，且避免使用胶原酶及体外培养，不需严格的审批，可以直接在临床应用并推广；这篇报道给糖尿病创面的ASCs疗法带来了新[50]的思路。深信随着对dASCs功能受损机制和移植方法的进一步探索，糖尿病足患者自体dASCs移植将不再遥远。44 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遵义医学院硕士学位论文姚远镇致谢时光荏苒，三年的研究生学习生涯即将结束。在这三年时间里，有很多美好的回忆，也经历了很多挫折。三年的时间，刚开始感觉很长，现在又感觉很短暂。在此，我要首先感谢我最敬爱的导师—王波老师。在这三年的学习生涯中，王老师给了我特别的照顾。他学识渊博、治学严谨、幽默而慈爱，在王老师身上不仅仅是学到了知识，更多的是做人的道理。在我确定课题、完成实验、论文写作的过程中，另一个老师—邓呈亮老师给了我耐心的指导和帮助，让我体会到了一个研究者的乐趣与收获。老师的谆谆教诲，我都会铭记在心，作为信条来指引我前进的道路。同时，我还要感谢遵义医学院附属医院烧伤整形外科王达利教授、魏再荣教授、唐修俊、祁建平、孙广峰、聂开瑜、曾雪琴、金文虎、韩文杰、张文夺、张子阳、李书俊、吴毕华、李海、吴祥奎、杨成兰、张天华、胡鹏等各位老师，和烧伤整形全体护士老师，感谢各位老师在我在临床实践和学习过程中给予我无限的帮组。感谢消化实验室、细胞工程实验室、病理科各位老师的在实验过程中的耐心指导及帮组！深深的感谢我的同学和师兄师姐、师弟师妹们，是你们陪伴我一起度过了人生中最磨砺意志同时也是收获最多的三年，是你们给我平日的50 遵义医学院硕士学位论文姚远镇生活带来很多的乐趣，感谢你们让我收获到最珍贵的友谊，我将永生难忘。要特别感谢我的父母和家人，是你们托起了我全部人生，你们是我动力的源泉。感谢父母和兄弟姐妹为我所做的一切，我一定会继续拼搏，我将用自己所学努力工作，为他们提供更加美好的生活，绝不辜负家人对我的殷切期望。感谢遵义医学对我八年的悉心培养，祝母校的给位老师工作顺利！最后，感谢在百忙之中抽出时间参与论文审阅与答辩的各位专家与老师，谢谢你们提出的宝贵意见，谢谢你们!51 遵义医学院硕士学位论文姚远镇作者简介姚远镇，男，出生于1992年5月，贵州省黔东南苗族侗族自治州锦屏县人，2015毕业于遵义医学院临床医学专业，2015年9月考入遵义医学院整形外科，攻读硕士学位。在学期间参加的研究项目：MicroRNA210调控糖尿病脂肪来源干细胞生物学活性及促进创面愈合的实验研究。发表论文、著作、申请专利*序号论文题目期刊名称期刊级别年、卷、期、页本人排名面动脉穿支螺旋1中国修复重北图核心期2018年2月第321/8桨皮瓣修复上唇皮肤恶性肿瘤切建外科杂志刊卷2期210-214除后创面页糖尿病脂肪来源2中华烧伤杂北图核心期待排1/3干细胞生物学功志能的研究进展刊Chronicwound3SCI待排2/7treatmentwithhigh-densityExperimentananofatlandgraftingTherapeuticcombinedwithMedicinenegativepressurewoundtherapy人瘢痕疙瘩成纤4中国整形美科技核心期2018年第29卷22/6维细胞的干细胞容外科特性研究刊期80-84页糖尿病脂肪来5北图核心期2018年6月（待2/6源干细胞促进慢中华烧伤杂性创面愈合的实志刊排）验研究*填写本人排名情况（格式如“1/5”）。52