半定量和实时定量PCR步骤

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1、半定量和实时定量PCRH果实验原理：RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNART-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+选择性RNA逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo（dT）

2、或基因特异性的引物（GSP起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最彳i条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR在一步法RT-PCR中，逆车t录和PCR在同时为逆转录和PCRa化的条件下，在一只管中顺次进行。实验步骤：Trizol法RN砒取步骤1、提取总RNA2、逆转录反应3、PC即应以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂

3、解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30c孵育2到3分钟。4c下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNAB的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA混匀后15到30c孵育10分钟后，于4c下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNAM淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4、④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75充醇（75%^醇用DEPCH2直制），清洗RNA沉淀。混匀后，4c下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNAJf淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA寸，先加入无RNAB的水40“用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。2RN颇量本^测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其

5、在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA^^浓度和纯度。①浓度测定A260下读值为1表示40gRNA/ml。样品RNA浓度（闻/ml）计算公式为：A260X稀释倍数X40g/ml。具体计算如下：RNA§于40（LDEPCK中，取5ul,1:100稀释至495M的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21X100X40g/ml=840g/ml或0.84g/d取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35（L,剩余RNA总量为：35（LX0.84g/d=29.4g②纯度检测RNA^^

6、的A260/A280的比值即为RNA屯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C,10ml的10XMOPSt泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。10XMOPS1泳缓冲液浓度成分0.4MMOPSpH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25（L溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1XMOPS!泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA羊品取3闻RNA加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于

7、甲醛上样染液中至终浓度为10闻/ml。加热至70c孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至澳酚兰指-可编辑修改-示剂进胶至少2-3cm=④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5s核糖体RNA组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，

8、可能是由mRN弹口其它异型RNAa成。RNA制备过程中如果出现DNA亏染，将会在28S核糖体RNAt的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA勺降解表现为核糖体RNAI^q弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1逆转录buffer2履5逆转录MMLV0.5“2上游引物0.2科l6DEPC7R5^13下游引物0.2科17RNA1版2dl4dNTP0.1仙8总体积10M轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。