酒精性脂肪性肝病合并乙型肝炎病毒肝内复制小鼠模型的建立及其对胆固醇代谢的影响研究

《酒精性脂肪性肝病合并乙型肝炎病毒肝内复制小鼠模型的建立及其对胆固醇代谢的影响研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号学号Ｄ２０１４７８３００：Ｔ学校代码誦７密级在大寧博士学位论文｜｜ｌ＿＿＿ｉ“＿＿Ｉ学位申请人：王亚琦学科专业：感染病学１＿指导教师：宁琴教授＿答辩日期：２０１８年５月 独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研宄做出贡献的个人和集体，均己在文一中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的切法律后果。学位论文作者签名：日期：加８年《月ｗ日学位论文版权使用授权书、本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在解密后适用本授权书。年＾本论文属于不保密ｄｌ“”（请在以上方框内打ｖ）学位论文作者签名：１＾％指导教师签名：日期：年月日日期：年ｆ月曰 AdissertationsubmittedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnologyfortheDegreeofDoctorofMedicineEstablishmentofamurinemodelofalcoholicfattyliverdiseasecombinedwithinhepatichepatitisBviruspersistenceandthemetabolismresearchofcholesterolalterationPh.D.Candidate:WangYaqiMajor:InfectiousDiseaseSupervisor:Prof.QinNingHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2018 华中科技大学博士学位论文创新点概述论文题目：酒精性脂肪性肝病合并乙型肝炎病毒肝内复制小鼠模型的建立及其对胆固醇代谢的影响研究学科（专业）、研究方向：感染病学、病毒性肝炎和酒精性脂肪肝论文中的主要创新点（不够可附页）我国目前存在庞大HBV感染人群，全国估计约1亿人为慢性HBV感染,占全世界慢性HBV感染者的1/3；酒精性肝病（alcoholicliverdisease,ALD）是世界范围内慢性肝病的主要原因，随着社会经济发展及酒文化的影响，中国已经成为世界上饮酒量上升最快的国家；酒精已成为继病毒性肝炎后终末期肝病的第二大病因。在ALD和乙肝患者中，大多分别为酒精性脂肪肝和HBV无症状携带状态。两者均无明显肝功能异常及临床症状，若未行专科体检，难以发现，因而隐匿性强，易被忽视。HBV不仅仅激发机体病毒免疫过程，而且与代谢相关。研究证实肝细胞自身富含核受体可与HBV基因组结合，如HNF4a，PPARα，FXR等，因而，HBV亦被称之为“Metabolovirus”。肝脏胆固醇代谢与机体生理病理活动密切相关，而HBV感染合并酒精性脂肪肝是否对肝脏胆固醇代谢产生影响尚无报道。本研究立足于酒精性脂肪肝合并病毒性肝炎的疾病模型，从体内体外共同探讨了饮酒合并乙型肝炎病毒在肝内复制对胆固醇代谢的影响，并初步探究了其可能的机制。通过建立酒精性脂肪肝合并肝内HBV复制小鼠模型，我们检测了小鼠肝脏胆固醇的含量，并且进一步分析了胆固醇合成、摄取、转运、酯化水解及降解等各环节重要分子的改变，并在体外进行验证，我们发现饮酒合并乙型肝炎病毒持续复制能够显著增加肝脏胆固醇的水平，其通过上调SREBP-2/HMGCR胆固醇合成通路，同时下调CYP-7α抑制胆固醇的降解共同导致胆固醇总含量的增加，造成胆固醇在肝脏的蓄积。另外，PCSK9显著上调导致LDLR的表达受到抑制，从而使LDL向肝内的运转受到阻碍，导致血清LDL的水平显著增加。进一步在体外实验中，我们明确了HBc是HBV的病毒复制合并饮酒过程中，发挥协同效应的关键分子，在调节胆固醇的代谢中起到重要作用。本研究在动物模型的基础上探讨了酒精性脂肪肝合并HBV持续复制对胆固醇代 谢的影响及其分子机制，为该疾病提供了新的认知。目前国内外尚未见类似报道。博士学位论文主要研究成果的发表或获奖情况作者发表论文题目/刊物名称/刊物/奖励发表论文/获序号署名获奖成果名称获奖部门级别奖时间名次IntracellularhepatitisBvirusSCI期刊increaseshepaticcholesterolJournalof中科院大2018，59（1）：Lipid11depositioninalcoholicfattyliver类分区：生58-68Research物2区viahepatitisBcoreprotein 目录中文摘要……………………………………………………………………..1Abstract……………………………………………………………………………………..4第一部分酒精性脂肪肝合并乙型病毒性肝炎小鼠模型的建立前言………………………….……………………………….………………………………………….7材料与方法………………………….………………………………………………………………..8结果…………………………………………….……………………………………………………....14讨论…………………………………………………………………………………………………….19参考文献………………….……………………………….…………………………………………20第二部分酒精性脂肪肝合并HBV复制对肝脏胆固醇代谢的影响研究前言………………………….……………………………….………………………………………...23材料与方法………………………….………………………………………………………………24结果…………………………………………….………………………………………………………37讨论…………………………………………………………………………………………………….47参考文献………………….……………………………….………………………………………....49第三部分HBV病毒蛋白在酒精性脂肪肝合并HBV复制中对胆固醇代谢的影响研究前言………………………….……………………………….………………………………………...53材料与方法………………………….………………………………………………………………54结果…………………………………………….………………………………………………………70讨论…………………………………………………………………………………………………….74参考文献………………….……………………………….…………………………………………76综述………………………………….…………………………………………………….……...78主要缩略词中英文对照表……………………………………………………………………85附录.............................................…………………………………………………………….88致谢…………………………………………………….…….………………………………………..90 华中科技大学博士学位论文酒精性脂肪性肝病合并乙型肝炎病毒肝内复制小鼠模型的建立及其对胆固醇代谢的影响研究博士研究生：王亚琦博士生导师：宁琴教授华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科,同济医院感染性疾病研究所中文摘要【背景】HBV是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的疾病之一。全国估计约1亿人为慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染者的1/3。酒精性肝病（Alcoholicliverdisease，ALD）是一种常见的慢性肝脏疾病，主要由长期过量饮酒所致，其疾病谱包括酒精性脂肪性肝病（Alcoholicfattyliverdisease），酒精性脂肪性肝炎（Alcoholicsteatohepatitis，AH），以及AH相关的肝纤维化、酒精性肝硬化以及肝癌。近年来，随着人们饮食习惯的改变以及社会生活水平的进步，我国酒精类饮料的产量及消耗快速增长，酒精性肝病的发病率亦逐年攀升。值得关注的是，我国已经属于饮酒人群逐年激增的HBV高发区。大部分酒精性肝病患者为酒精性脂肪肝，大部分乙型肝炎患者为无症状携带者，两者均无明显肝功能异常及临床症状，若未行专科体检，难以发现，因此“隐匿性”强，较易为患者自身忽视。慢性饮酒合并HBV长期共存的潜在危害性尚未能引起广泛足够重视，缺乏统计学数据，尚缺乏其疾病作用机制研究。肝脏是机体重要的代谢器官，参与糖、脂、蛋白质等重要物质的代谢过程。胆固醇是维持机体生理功能的重要物质，其主要代谢过程也在肝脏中进行。胆固醇代谢紊乱可导致多种疾病的发生，而酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇代谢的影响尚不明确。本文通过建立一种酒精性脂肪肝合并HBV复制的小鼠模型，探讨其对胆固醇1 华中科技大学博士学位论文代谢的影响及可能的机制。【方法】通过高压尾静脉注射pGEM-4Z1.3HBV质粒到周龄6周的雄性FVB/Ncrl小鼠体内，同时酒精饮食干预6周，建立酒精性脂肪肝合并HBV复制的小鼠模型。观察小鼠体重动态变化、肝脏组织学变化、血清乙肝e抗原（HepatitisBeantigen，HBeAg）、谷丙转氨酶（Alanineaminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartateaminotansferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）的变化，同时检测血清总胆固醇（Totalcholesterol，TC）、高低密度脂蛋白以及肝脏胆固醇水平的改变，进而分析胆固醇合成相关分子，例如固醇调节元件结合蛋白1（Sterolregulatoryelement-bindingprotein1，SREBP-1）、固醇调节元件结合蛋白2（Sterolregulatoryelement-bindingprotein2，SREBP-2）、3-羟基-3-甲基戊二酸还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase，HMGCR）的变化情况，以及胆固醇摄取相关分子，如低密度脂蛋白受体（Lowdensitylipoproteinreceptor，LDLR）、枯草溶菌霉素转化酶9（Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9）和胆固醇降解相关分子胆固醇7α羟化酶（Cholesterol7alpha-hydroxylase，CYP-7α）、固醇27羟化酶（Sterol27-hydroxylase，CYP-27A1）以及胆固醇逆向转运及酯化水解通路的改变。同时构建真核表达载体pCDH-HBx、pCDH-HBs以及pCDH-HBc（依次编码乙肝病毒蛋白HBx、HBs和HBc），pCDH-HBx、pCDH-HBs、pCDH-HBc及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP空载质粒转染HepG2细胞，乙醇共刺激，检测上述胆固醇代谢相关分子表达情况。【结果】该小鼠模型体现了肝内HBV复制以及酒精性脂肪肝的病理特征。肝脏胆固醇水平在慢性饮酒合并HBV复制组中显著增高。参与胆固醇合成的重要分子SREBP-2和HMGCR在合并组中显著上调，而负责清除血清中低密度脂蛋白的LDLR的表达被其抑制分子PCSK9的上调所抑制，其水平呈下调趋势。参与胆固醇降解的关键酶CYP-7α的表达在合并组中也明显减少。而慢性饮酒合并HBV持续复制对胆固醇的逆向转运及酯化水解无明显影响。HepG2细胞中HBc蛋白过表达合并乙醇共刺激显著上调SREBP-2和HMGCR水平，并且明显抑制LDL的摄取及CYP-7α的表达。2 华中科技大学博士学位论文【结论】慢性饮酒合并HBV复制导致胆固醇在肝脏的蓄积，包括通过上调SREBP-2和HMGCR的表达增强胆固醇的合成，抑制CYP-7α的表达，减弱胆固醇的降解。同时上调PCSK9从而抑制LDLR的表达，减少肝脏对低密度脂蛋白的摄取，导致血清LDL清除障碍。另外，HBc蛋白可能在其中发挥重要作用。关键词：酒精性脂肪性肝病；乙型病毒性肝炎；胆固醇代谢；乙型肝炎病毒核心蛋白3 华中科技大学博士学位论文EstablishmentofamurinemodelofalcoholicfattyliverdiseasecombinedwithinhepatichepatitisBviruspersistenceandthemetabolismresearchofcholesterolalterationPh.D.Candidate:WangYaqiSupervisor:Prof.QinNingDepartmentandInstituteofInfectiousDiseaseTongjiHospitalofTongjiMedicalCollegeHuazhongUniversityofScienceandTechnologyAbstract【Background&Objective】HepatitisBvirus(HBV)infectionisaseriouspublichealthproblem,withapproximately93millionindividualschronicallyinfectedinourcountry,accountingforabout1/3ofpatientswithchronichepatitisBworldwide.Alcoholicliverdisease(ALD)isachronicliverdiseaseinducedbylong-termheavydrinking,includingalcoholicfattyliverdisease,alcoholicsteatohepatitis(AH)andAH-associatedliverfibrosis,cirrhosis,andhepatocellularcarcinoma.Inrecentyears,withthechangeofdietaryhabitanddevelopmentofoursociety,theproductionandconsumptionofalcoholicbeverageshavegrownrapidlyinChina.ThemorbidityofALDisincreasingbyyears.TheconcernisthatagreatportionofchronichepatitisB(CHB)patientsaresufferingconcomitantalcoholicliverdisease.However,itlackslargescaleepidemiologicalinvestigationofthesecomorbiditiescurrently,andthestudyonthediseaseislimited.Liverisakeymetabolicorgan,participatinginthemetabolismpathwaysofglucose,fat,andprotein.Cholesterolhomeostasisplaysanimportantroleinmaintainingnormalphysiologicalfunctions.Cholesterolmetabolizesmainlyintheliveraswell.Dysregulationofcholesterolresultsinmanydiseases.WhereastheeffectofALDcombinedwithHBV4 华中科技大学博士学位论文infectiononcholesterolmetabolismremainsunknown.Inourstudy,weconstructanovelmousemodelofALDcombinedwithHBVpersistencetoexploretheinfluenceoncholesterolmetabolismandthepotentialmechanism.【Methods】Six-week-oldmaleFVB/NcrlmicewerehydrodynamicallyinjectedwithapGEM-4Z-1.3HBVorcontrolvectorandthenfedwithanethanolorcontroldietfor6weeks.Thechangesofbodyweight,hepatitisBeantigen(HBeAg),liverhistology,serumalanineaminotransferase(ALT),aspartateaminotransferase(AST),triglycerides,cholesterolandlivercholesterollevelswereobserved.Thencholesterolmetabolism-relatedmoleculessuchassterolregulatoryelement-bindingprotein1(SREBP-1),sterolregulatoryelement-bindingprotein2(SREBP-2),3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase(HMGCR),lowdensitylipoproteinreceptor(LDLR),proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9(PCSK9)，cholesterol7alpha-hydroxylase(CYP-7α)，sterol27-hydroxylase(CYP-27A1)andothermetabolismpathwaysinvolvedinexporttransportationandde-esterificationweremeasured.HepatitisBX(HBx),HepatitisBsurface(HBs)orHepatitisBcore(HBc)proteinexpressionplasmidwasconstructedandtransfectedinHepG2cellswithethanolstimulation.Theexpressionofabovemoleculeswasanalyzed.【Results】CharacteristichepaticHBVpersistenceandalcoholicfattyliverwerepresentinthismodel.Thelivercholesterollevelwasincreasedsignificantlyinthechronicalcohol5 华中科技大学博士学位论文consumptioncombinedwithHBVgroupcomparedwiththeothergroups.SREBP-2andHMGCR,importantforcholesterolbiosynthesis,wereup-regulatedinthecombinedtreatmentgroupwhileCYP-7α,akeyenzymeincholesteroldegradation,wassignificantlydecreased.LDLR,responsibleforclearingcirculatingLDL,wasdown-regulatedviatheincreaseofPCSK9.OverexpressionofHBcproteinwithethanolstimulationinHepG2cellsresultedinthesignificantenhancementinHMGCRandSREBP-2levelsandobviousinhibitionofLDLintakingandCYP-7αexpression.【Conclusions】ChronicalcoholconsumptioncombinedwithHBVledtoanaccumulationofcholesterolintheliver.Thisaccumulationinvolvedtheup-regulationofcholesterolbiosynthesisviaSREBP-2/HMGCRandthedown-regulationofcholesteroldegradationthroughCYP-7α.Inaddition,theenhancedexpressionofPCSK9induceddecreaseofLDLR,whichresultedinthedisorderofLDLclearanceintheplasma.Besides,HBcproteinmaybeinvolvedinthealterationofcholesterolmetabolism.Keywords:alcoholicliverdisease;hepatitisBvirus;cholesterolmetabolism;hepatitisBcoreprotein6 华中科技大学博士学位论文第一部分酒精性脂肪肝合并乙型病毒性肝炎小鼠模型的建立前言ALD是长期大量饮酒而导致的慢性肝脏疾病，全球死亡率约为0.9%[1]，是西方慢性肝脏疾病的主要病因之一，造成美国48%肝硬化相关死亡[2]。近年来，随着社会经济的增长，人们生活水平的提高，饮食习惯的改变，酒精饮品的生产与消耗在我国快速增长[3]，由酒精所导致肝损伤的发病率亦逐年攀升，约占我国肝脏疾病的14.8%[4]。HBV感染是一个严重危害人类健康的世界性公共卫生问题，能引起多种肝损害，包括急慢性病毒性肝炎，甚至与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关[5]。全球约有20亿人被证明感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿[6]。我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区，全国约1亿人是HBV携带者，其中有2000万人为慢性乙肝患者[7]。由于酒精消费的高度流行，HBV合并ALD的患者也在不断增多。值得关注的是，我国已经属于饮酒人群逐年激增的HBV高发区。大部分酒精性肝病患者为酒精性脂肪肝，大部分乙型肝炎患者为无症状携带者，两者均无明显肝功能异常及临床症状，若未行专科体检，难以发现，因此“隐匿性”强，较易为患者自身忽视。慢性饮酒合并HBV长期共存的潜在危害性尚未能引起广泛足够重视，缺乏统计学数据，尚缺乏其疾病作用机制研究。许多研究发现过量的酒精消耗会加速慢乙肝的自然病程。慢乙肝患者大量摄入酒精是发生进展性肝硬化[8,9]、肝细胞肝癌[10,11,12]以及肝脏相关死亡率[13,14]的高危风险因素。肝脏是机体重要的代谢器官，糖、脂、蛋白质等重要物质均在肝脏中代谢。近年来，许多研究发现，HBV在人类疾病发展中带来的不仅仅是肝脏病毒免疫学的事件，同时在肝细胞代谢中发挥了重要作用。肝细胞自身富含核受体可与HBV基因组结合，如HNF4a，PPARα，FXR等，因而，HBV亦被称之为“Metabolovirus”[15]。有研究发现，通过对HepG2细胞以及HepG2.2.15细胞进行蛋白组学、代谢组学以及分子生物学的分析，调节糖酵解途径的酶以及一些参与三羧酸循环的酶在HepG2.2.15细胞中的表达明显上调[16]，说明HBV感染对糖代谢可产生一定影响。除此之外，诸多研究发现HBV感染对脂肪酸的代谢也有重要影响，多数研究显示，HBV感染可以促7 华中科技大学博士学位论文进脂肪酸的合成[17,18]。同时，HBV感染对磷脂、核酸等代谢均有影响[16,19]。另一方面，ALD也能导致脂质代谢的紊乱，脂质在肝脏堆积，形成脂肪肝，同时，对胆固醇代谢也造成严重影响。因此，ALD合并HBV感染可能会进一步加重肝脏代谢的失衡。然而，目前尚无理想的ALD合并HBV感染的动物模型用于对该疾病进行研究。有文献报道[20]，市售某品牌白酒喂养C57BL/6JHBV-Tg小鼠建立ALD合并HBV感染的模型，该模型可以持续表达HBsAg，由于HBV抗原在胚胎阶段就持续表达。然而市售商品化酒类，除酒精以外的成分丰富，不确定因素多，不适宜用来作为酒精饲料喂养小鼠。转基因小鼠产生免疫耐受，与HBV自然感染存在一定差异；本实验室采用pGEM-4Z1.3HBV尾静脉高压注射FVB/Ncrl雄性小鼠，结合AIN93酒精液体饲料喂养，可建立具有ALD合并HBV复制能力的小鼠模型，为该疾病的研究提供新的动物模型。材料与方法1.材料1.1实验动物FVB/Ncrl小鼠，雄性，SPF级，5-6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于智能型大小鼠独立通气笼系统中饲养，自由摄取饮食，适应性饲养1周后开始实验。1.2质粒真核表达载体pGEM-4Z1.3HBV由国立台湾大学医学院陈培哲教授友情赠予并保存于本实验室；载体pGEM-4Z购于Promega公司。1.3主要试剂去内毒素质粒小提试剂盒（OMEGA）；Trans109化学感受态细胞（北京全式金生物）；AIN93酒精液体饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司TP4020）；AIN93标准对照液体饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司TP4020C）；4%多聚甲醛（武汉塞维尔生物科技有限公司）；油红O粉末（美国Sigma）；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥SP9002）；DABKit（北京中杉金桥ZLI-9018）；208 华中科技大学博士学位论文×柠檬酸修复液（武汉塞维尔生物科技有限公司G1202）；苏木素染色液（碧云天C0107）；Anti-HBcAg（Abcam）。1.4主要溶液配制（1）PBS缓冲液成分用量备注NaCl8.0gpH调至7.2-7.4KCl0.2g4℃保存Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24gddH2O定容至1000ml（2）油红O染液储存液：油红O粉0.5g，加入100ml异丙醇，60℃水浴溶解，室温冷却，封口，4℃避光保存。（3）LB液体培养基成分用量备注NaCl5gpH调至7.0Yeastextract2.5g高温高压灭菌Peptone5g4℃保存ddH2O定容至500ml（4）LA固体培养基成分用量备注NaCl2.5gpH调至7.0Yeastextract1.25g高温高压灭菌Peptone2.5g55-60℃水浴Agarpowder3.75g无菌条件下制备LA平板ddH2O定容至250ml待凝固后4℃避光防潮保存注：本实验选用氨苄青霉素作为筛选抗生素，需提前配制，-20℃避光保存，使用时1000倍稀释。9 华中科技大学博士学位论文（5）DAB显色工作液的配制：在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50μl）试剂1（DAB浓缩液），混合均匀，即配成DAB工作液，现配现用，6小时内使用。1.5主要仪器与设备全自动生化分析仪（瑞士，RocheCobas8000）；全自动化学发光仪（美国，雅培i4000）；智能型大小鼠独立通气笼（苏州市苏杭实验动物设备厂）；电子天平（MettlerToledo公司）；高压灭菌器（日本，Sanyo）；数显鼓风干燥箱（上海博讯GZX-9000）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；电热恒温培养箱（上海智城公司）；全温震荡培养箱（上海智城公司）；普通水浴箱（北京长源）；生物安全柜（苏净集团安泰公司）；振荡摇床（上海智城公司）；-20℃中低温冰箱和-80℃超低温冰箱（日本，Sanyo）；制冰机（宁波GrantFM70）；微波炉（格兰仕）；4℃冰箱（海尔，西门子和容声）；分析天平（MettlerToledoAG285）；台式高速离心机（美国，Beckman）；核酸蛋白分析仪（美国，BeckmanCoulterDU730）；pH计（MettlerToledo）；低温高速离心机（美国，ThermoFisherScientific）；精密调温水浴箱（杭州博日N-20W）；光学显微镜（日本，OlympusOptiealCo.,Ltd）；数码相机（日本，Nikon-4500）。2.方法2.1pGEM-4Z1.3HBV和pGEM-4Z质粒的转化（1）在超净台中取5μlpGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒加入25μlTrans109感受态细胞，轻柔混匀，冰浴30min。（2）提前将水浴锅开启至42℃，冰浴后立即转入42℃水浴中热激45秒，快速转移至冰上静置2min。（3）再向其中加入500μlLB培养基（37℃预热），37℃恒温摇床，180rpm，摇菌40min。（4）超净台中将160μl菌液（若菌液浓度高可适当稀释）均匀涂在LA固体琼脂板上，将琼脂板正置于37℃恒温培养箱中，待表面菌液被吸收后，将平板倒置培养过夜（约12-14小时），可见单个菌落形成。2.2单克隆细菌挑取及菌液保种（1）将琼脂板放入超净台中，挑取单个菌落，加入5mlLB液体培养基，充分混匀，再加入1000×氨苄青霉素，混匀，37℃恒温摇床振摇过夜，250rpm×14小时。10 华中科技大学博士学位论文（2）无菌台中将浑浊菌液取出，加入50%无菌甘油保种，充分混匀后，-80℃保存。2.3菌液摇菌和质粒提取超净台中，取30μl保种菌液加入30mlLB液体培养基中，充分混匀，再向其中加入30μl1000×氨苄青霉素，混匀，放入37℃恒温摇床振摇过夜，250rpm，摇菌约14小时。去内毒素小提质粒，使用OMEGAEndo-freePlasmidMiniKitⅡ试剂盒，步骤如下：（1）实验准备：SolutionⅠ在使用前先加入RnaseA，混匀，置于2-8℃保存；按照说明书在漂洗液DNAWashBuffer中加入无水乙醇；（2）柱平衡步骤：向吸附柱ColumnⅡ（吸附柱放入收集管）加入150μl平衡液GPS，静置3-5min，12000rpm离心2min，弃掉收集液，再空甩1min备用；（3）取摇好的菌液5000g，离心10min，充分弃去上清；（4）每管加入500μlSolutionⅠ/RNaseA，充分吹打混匀；（5）将悬液移入新的2ml离心管中，加入500μlSolutionⅡ，轻柔颠倒混匀数次，室温静置2min；（6）加入250μl冰浴BufferN3，轻柔混匀，直到形成白色沉淀物，4℃离心，12000g，10min；（7）轻轻吸取上清放入新的1.5ml离心管中，加入0.1体积ETR（上清：ETR=10:1），上下颠倒混匀，冰浴10min；（8）42℃水浴5min，此时溶液变浑浊，12000g，室温离心3min，ETR变蓝色沉淀；（9）将上清移入新的2ml离心管中，加入0.5体积无水乙醇，轻柔颠倒混匀；（10）取上步液体700μl到ColumnⅡ，10000g，1min离心，弃去收集液；（11）若液体不止700μl，则重复上一步，直至所有液体全部过柱；（12）用500μlBufferHB洗柱子，10000g，1min离心；（13）加700μlDNAWashBuffer，10000g，1min离心；（14）重复上一步（15）弃去收集液，空甩，13000g，3min；11 华中科技大学博士学位论文（16）将柱子放入新的EP管中，转入无菌台，向滤膜中心滴加120μlEndo-freeElutionBuffer，静置2min，离心13000g，1min，所得液体即为质粒，将所得质粒作好标记，检测浓度及纯度，于-20℃条件下保存。2.4FVB/Ncrl小鼠高压尾静脉注射pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒（1）6-7周龄SPF级雄性FVB/Ncrl小鼠，随机分成Control和HBV两组。Control组予以pGEM-4Z对照质粒进行尾静脉高压注射，HBV组予以pGEM-4Z1.3HBV质粒尾静脉高压注射。（2）根据小鼠体重，将10μgpGEM-4Z/pGEM-4Z1.3HBV质粒分别溶解于相当于小鼠体重8%PBS缓冲液中，制成质粒溶液，然后在6-8秒钟内将质粒溶液经尾静脉快速注射入到对应分组小鼠体内。2.5FVB/Ncrl小鼠酒精饮食干预尾静脉高压注射质粒观察一周后，Control组及HBV组的小鼠分别再随机分成Pair-fed和EtOH两组，Pair-fed组予以AIN93对照饲料喂养，EtOH组予以AIN93酒精饲料喂养，每只小鼠每天的进食量为5ml液体饲料，自由饮水，按1%酒精饲料喂养3天，3%酒精饲料喂养4天，进行一周过渡饲养，而后5%酒精饲料喂养6周至实验终点。饲料成分如下：成分含量主料120g维生素2.5g矿物质8.7g95%食用酒精1-5%（v/v）蒸馏水1000ml2.6日常观察小鼠每天的一般状态，每周称取小鼠体重。2.7肝脏组织学检查（1）于酒精饮食干预6周进行取材，处理各组小鼠，于处理前12小时对小鼠禁食；（2）用乙醚麻醉约30秒，眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，于75%酒精中浸泡5min，将摘取眼球取得的血液室温静置1-2小时，于室温下3000rpm，离心15min，收取上12 华中科技大学博士学位论文清，-80℃保存备用；（3）将小鼠四肢固定，用眼科弯镊夹取皮肤，眼科剪呈T型剪开皮肤，将皮肤与腹膜分离干净，换干净的眼科剪和眼科镊剪开腹膜，将肝脏充分暴露出来，再换一副干净的眼科剪小心分离肝脏，取出肝脏，称取肝脏重量，剪出约5mm正方形于4%多聚甲醛中固定24h，进行石蜡包埋、切片，免疫组织化学染色备用。另取一部分进行冰冻切片，油红O染色备用。其余组织装入冻存管，-80℃保存备用。2.8油红O染色（1）用60%异丙醇漂洗冰冻切片；（2）放入油红O染液中浸泡5-15min；（3）60%异丙醇漂洗，去除多余的染料，用水冲洗2min；（4）复染核，将切片放入苏木素染液中浸泡5min，用水冲洗2min；（5）中性树脂封片，显微镜下观察，拍照。2.9免疫组织化学染色采用北京中杉金桥生物技术有限公司提供的生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（1）石蜡切片，常规脱蜡至水；（2）抗原修复：配制20×柠檬酸钠修复液，微波炉高火3min，将切片放入修复液中，微波炉中高火5min→4min→3min，微波3次，每次中间间隔30s-1min，注意不要干片，自然冷却至室温；（3）组画笔画圈，3%H2O2去离子水孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3min×3次；（4）封闭：滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15-30min，倾去，勿洗；（5）滴加Anti-HBcAg（1:200稀释），放入湿盒4℃孵育过夜；（6）室温复温45min，PBS振洗3次，每次3min；（7）二抗孵育：滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min；（8）PBS振洗，3min×3次；（9）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10-15min；（10）PBS振洗，3min×3次；13 华中科技大学博士学位论文（11）DAB显色剂显色；（12）自来水充分冲洗（12）复染核：将切片于苏木素染液中浸泡5min，自来水充分冲洗；（13）中性树脂封片，光学显微镜下观察，拍照。2.10血清HBeAg及生化检测：雅培i4000全自动化学发光仪检测血清HBeAg，罗氏全自动生化分析仪检测ALT、AST、TG。2.11统计分析计量资料采用均数±标准误表示，用GraphPadPrism5进行统计分析及绘图，多组间的比较采用One-way方差分析的检验方法，p<0.05认为有统计学差异。结果1、尾静脉高压注射质粒后HBV在FVB小鼠体内持续复制的情况：血清HBeAg可用来作为监测HBV持续复制的指标，实验结果显示，以S/CO=1作为Cut-off值，HBV+Pair-fed组小鼠、HBV+EtOH组小鼠在实验终点时血清中HBeAg表达均阳性，S/CO>1，数值越高表明HBeAg滴度越强；而Pair-fed组、EtOH组小鼠血清中HBeAg的表达为阴性，S/CO<1（如图1-1）。同时，我们还对肝脏HBcAg的表达进行了检测，免疫组化的结果显示，在注射了1.3HBV质粒的两组小鼠中HBcAg均能持续表达，而注射对照质粒的两组小鼠HBcAg表达则为阴性（如图1-2）。因此，这两个结果可以说明HBV复制子能在FVB/Ncrl小鼠肝脏中持续复制。2、酒精饮食干预后FVB小鼠一般情况观察及体重动态变化：在给FVB小鼠进行饮食干预后，我们观察到进行酒精饮食干预的小鼠，呈现嗜睡，精神萎靡，走路步态不稳等醉酒态，毛发无光泽，一般情况较对照饮食干预小鼠差。四组小鼠体重在造模开始时基线水平无差异，在喂养过程中Pair-fed组及HBV+Pair-fed组小鼠体重呈略微上升趋势，EtOH组及HBV+EtOH组小鼠体重逐渐减轻，至造模终点时间Pair-fed组小鼠体重为29.9±1.1g（n=7），HBV+Pair-fed组体14 华中科技大学博士学位论文图1-1.小鼠血清HBeAg的表达水平图1-2.小鼠肝组织HBcAg的表达（免疫组织化学染色，400×），→所示为HBcAg阳性表达。15 华中科技大学博士学位论文图1-3.小鼠体重变化曲线.a:Pair-fedvsEtOHp<0.001;b:HBV+Pair-fedvsHBV+EtOHp<0.001重为33.4±1.0g（n=7），EtOH组体重为23.0±0.4g（n=9），HBV+EtOH组小鼠为21.3±0.6g（n=8），EtOH组及HBV+EtOH组小鼠体重明显减轻，具有显著统计学差异（图1-3）。3、酒精饮食干预后FVB小鼠肝脏病理学改变：酒精饮食喂养6周后，小鼠肝脏指数较对照饮食小鼠明显增高，有显著统计学差异（如图1-4），说明酒精饮食的小鼠出现酒精中毒。Pair-fed组小鼠肝脏指数平均为5.31±0.15g（n=7），EtOH组平均肝脏指数为6.85±0.42g（n=9），HBV+Pair-fed组小鼠肝脏指数为4.82±0.12g（n=7），HBV+EtOH组小鼠肝脏指数为6.16±0.13g（n=8）。肝组织病理切片油红O染色结果如图1-5所示Pair-fed组肝脏组织结构完整，肝索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝小叶轮廓清晰，肝细胞细胞质丰富；HBV+Pair-fed组肝索排列无明显紊乱，肝细胞细胞质清晰透明；EtOH组及HBV+EtOH组肝窦扩张，肝细胞肿胀，细胞质疏松，其内可见红染的脂滴。4、酒精饮食干预FVB小鼠血清甘油三酯变化：饮食干预6周后，进行酒精饮食喂养的小鼠血清TG水平显著高于对照饮食小鼠，有统计学差异，其外周血清TG水平分别为Pair-fed组小鼠1.03±0.08（n=7）；EtOH组小鼠1.44±0.26（n=9）；HBV+Pair-fed组小鼠1.23±0.09（n=7）；HBV+EtOH组小鼠2.20±0.15（n=8）。16 华中科技大学博士学位论文图1-4.小鼠肝脏指数.肝脏指数=小鼠肝脏重量/小鼠体重×100%；酒精饮食干预的小鼠，其肝脏指数较对照饮食小鼠明显增高。***p<0.001图1-5.小鼠肝组织油红O染色（200×）17 华中科技大学博士学位论文图1-6.小鼠血清甘油三酯含量酒精饮食干预小鼠血清甘油三酯含量显著升高。*p<0.055、酒精饮食干预FVB小鼠血清转氨酶的改变：酒精饮食干预6周后，两组小鼠血清ALT水平较对照饮食的小鼠均有轻微升高，且有统计学差异（图1-7）。四组小鼠血清ALT水平分别为Pair-fed组小鼠63±8U/L（n=7），EtOH组小鼠为100±13U/L（n=9），HBV+Pair-fed组为42±3U/L（n=7），HBV+EtOH组为82±9U/L（n=8）。同样地，AST水平在酒精饮食处理小鼠中也呈现显著升高的结果，具有统计学差异（图1-8）。各组小鼠AST水平分别为Pair-fed组110±8U/L（n=7），EtOH组182±26U/L（n=9），HBV+Pair-fed组99±8U/L（n=7），HBV+EtOH组166±18U/L（n=8）。图1-7.小鼠血清ALT水平.*p<0.05图1-8.小鼠血清AST水平.*p<0.0518 华中科技大学博士学位论文讨论HBV感染具有种属特异性，这也为HBV感染动物模型的建立造成一定的局限。免疫健全的动物模型对于HBV持续感染的因素研究是较为理想的，虽然小鼠不能自然感染野生型HBV，但是当病毒DNA直接输送至肝细胞里时，小鼠的肝细胞可以作为HBV复制的场所，因此若HBVDNA能有效的进入小鼠肝脏，那么遗传背景均一的近交系小鼠对于HBV持续复制的研究是较为理想的动物模型。Shih-HuiChen等[21]发现，将HBV复制子DNA分别注入Balb/c、C57BL/6和FVB/Ncrl小鼠体内，只有FVB/N小鼠能够持续复制HBV，其持续复制时间甚至能达到50周，而在Balb/c、C57BL/6小鼠中，HBV复制子DNA很快就被清除。ALD是由于长期大量饮酒而导致的慢性肝损伤。肝细胞脂肪变是其最典型的病理改变。酒精的直接代谢产物乙醛能直接对肝细胞产生毒性作用，引起脂肪变，同时酒精能引起氧化还原反应的改变，过多的还原性等价物能够促进脂肪酸的合成并抑制其氧化，从而导致甘油三酯在肝细胞的堆积。另一方面，氧化应激与脂质过氧化也是引起肝细胞脂质沉积的重要因素。目前，ALD动物模型的建立相对较为成熟。因C57BL/6小鼠具有较强的嗜酒性，因此采用Lieber-DeCarli酒精饮食[22]喂养C57BL/6小鼠，是目前最常见的ALD造模方法。不同品系，不同性别的小鼠对于酒精的耐受程度不同，对模型的建立会产生一定影响。本研究采用FVB/Ncrl小鼠尾静脉高压注射1.3HBV质粒并结合AIN93酒精液体饲料喂养建立HBV复制合并酒精性脂肪肝的模型，国内外尚无先例报道。通过尾静脉高压注射1.3HBV质粒，可持续观察到小鼠血清HBeAg的阳性表达，并且可在肝脏检测到HBcAg的持续表达，可以说明HBV在小鼠体内的持续复制。AIN93酒精液体饲料与Lieber-DeCarli酒精饲料相比其脂肪酸的构成以及维生素、矿物质的含量略有差别，营养素更加平衡。本研究采用AIN93酒精液体饲料喂养小鼠，6周即可形成酒精性脂肪肝，一般表现为慢性酒精消耗的症状，肝脏病理改变以脂肪变性为主；，血清甘油三脂增高，血清转氨酶轻度升高。本研究成功建立了酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠模型，对后期针对该疾病的研究具有十分重要的意义。19 华中科技大学博士学位论文参考文献1.RehmJ,SamokhvalovAV,ShieldKD.Globalburdenofalcoholicliverdisease[J].JHepatol2013;59:160-168.2.WangM,YouQ,LorK,etal.Chronicalcoholingestionmodulateshepaticmacrophagepopulationsandfunctionsinmice[J].JLeukocBiol2014;96:657-665.3.WorldHealthOrgnization.Globalstatusreportonalcoholandhealth2014[Z].2014.4.WangFS,FanJG,ZhangZ,etal.Theglobalburdenofliverdisease:ThemajorimpactofChina[J].Hepatology2014;60:2099-2108.5.MauraDandri,StephenLocarnini.NewinsightinthepathobiologyofhepatitisBvirusinfection[J].Gut2012;61Suppl1:i6-17.6.LiawYF,ChuCM.HepatitisBvirusinfection[J].Lancet2009;373(9663):582-592.7.中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[J].中华肝脏病杂志，2015,7（3）：1-18.8.MotaA,GuedesF,AreiasJ,etal.AlcoholconsumptionamongpatientswithhepatitisBinfectioninnorthernPortugalconsideringgenderandhepatitisBvirusgenotypedifferences[J].Alcohol2010;44:149-156.9.StroffoliniT,CottocelliG,MeddaE,etal.Interactionofalcoholintakeandcofactorsontheriskofcirrhosis[J].LiverInt2010;30:867-870.10.YotsuyanaqiH,HashidumeK,SuzukiM,etal.RoleofhepatitisBvirusinhepatocarcinogenesisinalcoholics[J].AlcoholClinExpRes2004;28:181S-185S.20 华中科技大学博士学位论文11.FranceschiS,MontellaM,PoleselJ,etal.Hepatitisviruses,alcohol,andtobaccointheetiologyofhepatocellularcarcinomainItaly[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev2006;15:683-689.12.LinCW,LinCC,MoLR,etal.HeavyalcoholconsumptionincreasestheincidenceofhepatocelluarcarcinomainhepatitisBvirus-relatedcirrhosis[J].JHepatol2013;58:730-735.13.RibesJ,ClèriesR,RubióA,etal.CofactorsassociatedwithliverdiseasemortalityinanHBsAg-positiveMediterraneancohort:20yearsoffollow-up[J].IntJCancer2006;119:687-694.14.BedogniG,MiglioliL,MasuttiF,etal.NaturalcourseofchronicHCVandHBV344infectionandroleofalcoholinthegeneralpopulation:thedionysosstudy[J].AmJGastroenterol2008;103:2248-2253.15.GeierA.HepatitisBvirus:the"metabolovirus"highjackscholesterolandbileacidmetabolism[J].Hepatology2014;60(5):1458-6016.LiH,ZhuW,ZhangL,etal.ThemetabolicresponsestohepatitisBvirusinfectionshednewlightonpathogenesisandtargetsfortreatment[J].SciRep2015;5:842117.YangF,YanS,HeY,etal.ExpressionofhepatitisBvirusproteinsintransgenicmicealterslipidmetabolismandinducesoxidativestressintheliver[J].JHepatol2008;48:12-19.18.HajjouM,NorelR,CarverR,etal.cDNAmicroarrayanalysisofHBVtransgenicmouseliveridentifiesgenesinlipidbiosyntheticandgrowthcontrolpathwaysaffectedbyHBV[J].JMedVirol2005;77:57-65.21 华中科技大学博士学位论文19.DanYueY,ChengL,MaJ,etal.HepatitisBvirusXprotein(HBx)-inducedabnormalitiesofnucleicacidmetabolismrevealedby(1)H-NMR-basedmetabonomics[J].SciRep2016;6:2443020.李娜，易学瑞，袁有成等.酒精对C57背景HBV转基因小鼠肝脏肝损伤的所用[J].华南国防医学杂志2013；27:220-224.21.Shih-HuiChen,Hui-LinWu,Jia-HorngKao,etal.PersistentHepatitisBvirusreplicationinaFVB/Nmousemodel:Impactofhostandviralfactors[J].PLoSOne2012;7:e36984.22.LieberCS,DeCarliLM,SorrellMF.Experimentmethodsofethanoladministration[J].Hepatology1989;10:501-510.22 华中科技大学博士学位论文第二部分酒精性脂肪肝合并HBV复制对肝脏胆固醇代谢的影响研究前言胆固醇稳态在维持机体正常生理功能中发挥着重要的作用。它是细胞膜的正常组成部分，维持着细胞膜的稳定性和流动性，同时胆固醇在支持细胞内转运，信号通路的转导以及神经传导中都起着十分关键的作用[1,2]。除此之外，胆固醇也是类固醇激素和胆汁酸生物合成的重要前体[3]。胆固醇的生物合成是一个十分复杂的过程，有近30步酶促反应。大致分为三个阶段：第一个阶段是由乙酰辅酶A合成异戊烯焦磷酸的过程，在这一步中，2分子乙酰辅酶A经硫解酶、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶以及羟甲基戊二酸还原酶（HMGCR）的催化作用，生成甲羟戊酸，甲羟戊酸再经磷酸化、脱羧三步酶促反应生成异戊烯焦磷酸；第二个阶段是由异戊烯焦磷酸合成30C的鲨烯的过程；第三个阶段是鲨烯转换为胆固醇的过程。在这三个阶段中，最为重要的是第一个阶段，HMGCR是整个环节的限速酶，调控胆固醇的生物合成。同时胆固醇的合成还受到固醇调节元件结合蛋白家族的调控（sterolregulatoryelement-bindingproteins,SREBPs），SREBPs是一类锚定于内质网的细胞内胆固醇敏感器，含有碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构，是bHLH-Zip超家族的一员[4]，具有转录因子的功能。SREBPs主要有三种亚型，SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。其中SREBP-1a对于脂肪酸和胆固醇的合成均有调控作用，SREBP-1c只能调控脂肪酸的合成而SREBP-2主要负责胆固醇合成相关基因的表达调控，包括HMGCR和LDLR等。75%的胆固醇可在肝脏转变为胆汁酸，随胆汁排入肠道，参与脂类的消化与吸收，这是胆固醇代谢的主要去路，在该过程中CYP-7α是整个环节的关键酶。胆固醇的逆向转运也是机体维持胆固醇代谢平衡的一条重要途径。它是指将肝外多余的胆固醇运回到肝脏并排到胆汁中进行消化。多种蛋白参与该途径，其中腺苷三磷酸结合盒转运体（ATPbindingcassettetransport，ABC）超家族成员在其中起到重要作用。ABCA1主要负责促进胆固醇外流，并与apoA-I结合；ABCG1主要负责促进胆固醇外流，并23 华中科技大学博士学位论文与HDL结合[5]；而ABCG5和ABCG8可能与肝脏向胆汁排泄胆固醇的机制相关[6]。另外，在生理情况下，细胞内胆固醇的吸收与外流保持着动态平衡，在这一过程中，一方面多余的游离胆固醇被酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶（ACAT）酯化生成胆固醇酯，另一方面胆固醇酯被中性胆固醇酯水解酶（nCEH）水解生成游离胆固醇和脂肪酸[7]。这一酯化与水解的动态平衡在胆固醇代谢中也起着重要作用。胆固醇代谢紊乱是多种疾病的基本特征，包括动脉粥样硬化[8,9]、代谢性疾病甚至在肿瘤中也能观察到[10-13]。近来有研究发现，HBV感染能够诱导胆固醇合成基因HMGCR以及LDLR的上调[14]，也有研究者观察到HBx蛋白能够增强SREBP-1a的表达[15]，同时HBV与其新发现的受体钠牛磺胆酸共转运蛋白结合，可以抑制其摄取胆汁酸的功能，从而导致CYP-7α的上调以及SREBP-2和HMGCR的代偿性合成增加[16]。也有许多证据显示，慢性饮酒也能使胆固醇代谢紊乱[17,18]。而慢性饮酒合并HBV感染对胆固醇的影响尚未可知。本研究采用前一部分研究中建立的酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠模型，探讨该疾病对胆固醇代谢的作用。材料与方法1.材料1.1实验动物FVB/Ncrl小鼠，雄性，SPF级，5-6周龄，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，于智能型大小鼠独立通气笼系统中饲养，自由摄取饮食，适应性饲养1周后开始实验。1.2质粒真核表达载体pGEM-4Z1.3HBV由国立台湾大学医学院陈培哲教授友情赠予并保存于本实验室；载体pGEM-4Z购于Promega公司。1.3细胞株：HepG2细胞购自中科院上海生科院细胞资源中心。1.4主要试剂AIN93酒精液体饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司TP4020）；AIN93标准对照液体饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司TP4020C）；4%多聚甲醛（武汉塞维尔生物科技有限公司）；20×柠檬酸修复液（武汉塞维尔生物科技有限公司G1202）；24 华中科技大学博士学位论文苏木素染色液（碧云天C0107）；TrizolReagent(Invitrogen)；DEPC原液（武汉塞维尔生物科技有限公司）；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(TOYOBO)；彩色预染蛋白Marker（Fermentas）；Tween20（Sigma）；Western及IP细胞裂解液、Western一抗二抗去除液（弱碱性）、免疫荧光抗淬灭封片剂（碧云天）；DAPI免疫荧光核染色剂（SantaCruz）；蛋白酶抑制剂（南京凯基生物）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）；PVDF膜（Millipore）；试剂盒：总胆固醇（TCH酶法）测试盒（南京建成生物工程研究所）；ReverTraAce○RqPCRRTKit(TOYOBOFSQ-101)；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥SP9001）；DABKit（北京中杉金桥ZLI-9018）；Lipofectamine3000转染试剂盒（Invitrogen）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（ThermoScientific）、NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionKit(Pierce/ThermoScientific)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天）；ECL化学发光检测试剂盒（联科生物）；DMEMbasic培养基、胎牛血清（Gibco）；Opti-MEM（Invitrogen）；胰酶消化液（碧云天）；抗体：Anti-HMGCR、Anti-SREBP-2、Anti-LDLR、Anti-GAPDH（均为Abcam）；Anti-CYP-7α（SantaCruz）；Anti-PCSK9（Proteintech）；Anti-β-actin（Boster）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗（CellSignalingTechnology），FITC标记山羊抗兔IgG二抗（Boster）。1.5主要溶液配制（1）PBS缓冲液：成分用量备注NaCl8.0gpH调至7.2-7.4KCl0.2g4℃保存Na2HPO4·12H2O3.58g用于细胞培养时，于高温KH2PO40.24g高压进行灭菌，4℃保存ddH2O定容至1000ml（2）0.1%DEPC灭菌水：成分用量备注25 华中科技大学博士学位论文DEPC原液100μl充分混匀后，通风橱过夜蒸馏水100ml高温高压灭菌，4度保存注：溶液的配制应在通风橱中进行,因DEPC原液含有剧毒。（3）1×SDS-PAGE电泳缓冲液：成分用量备注Tris-base3.03gSDS较难溶解，可用磁力搅Glycine18.77g拌器进行溶解，溶解后室温SDS1.0g保存。该溶液可重复回收利ddH2O定容至1000ml用3-5次。（4）10%分离胶的配制：8ml体积（两块胶用量）：ddH2O2.16ml，30%Acr-Bis（29:1）2.64ml，1MTris，pH8.83.04ml，10%SDS80μl，10%过硫酸铵80μl，TEMED3.2μl。注：10%分离胶适合分离分子量为20-80KD的蛋白。30%Acr-Bis（29:1）和TEMED溶液4℃避光保存，其余溶液室温保存，使用前，各溶液需先平衡至室温。（5）5%浓缩胶缓冲液4ml体积（两块胶用量）：ddH2O2.7ml，30%Acr-Bis（29:1）670μl，1MTris，pH8.8500μl，10%SDS40μl，10%过硫酸铵40μl，TEMED4μl。（6）1×SDS-PAGE转移缓冲液：成分用量备注Tris-base5.8gGlycine2.9gSDS0.37g甲醇200mlddH2O定容至1000ml（7）10×TBS缓冲液：成分用量备注26 华中科技大学博士学位论文Tris-base12.1g调节pH值至7.6，室温下保存。NaCl40g使用时，稀释为1×TBS溶液。ddH2O定容至1000ml（8）1×TBST缓冲液：10×TBS溶液100ml加入900mlddH2O中，充分混匀，再向其中加入500μlTween20溶液，混匀，现配现用，4℃保存。（9）5%BSA封闭液：称取5.0gBSA，加入100mlTBST缓冲液中，充分混匀，4℃保存，可重复利用。（10）DAB显色工作液的配制：在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50μl）试剂1（DAB浓缩液），混合均匀，即配成DAB工作液，现配现用，6小时内使用。（11）ECL化学发光试剂工作液的配制：A液：B液=1:1，6小时内使用，室温避光。保存。1.6主要仪器设备全自动生化分析仪（瑞士，RocheCobas8000）；智能型大小鼠独立通气笼（苏州市苏杭实验动物设备厂）；pH计（MettlerToledo）；高压灭菌器（日本，Sanyo）；核酸蛋白分析仪（美国，BeckmanCoulterDU730）；电子天平（MettlerToledo公司）；数显鼓风干燥箱（上海博讯GZX-9000）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；模块化低氧培养装置（美国，Billups-Rothenberg）；生物安全柜（苏净集团安泰公司）；电热恒温培养箱（上海智城公司）；电泳仪电源（北京六一厂）；精密调温水浴箱（杭州博日N-20W）；全温震荡培养箱（上海智城公司）；普通水浴箱（北京长源）；振荡摇床（上海智城公司）；-20℃中低温冰箱和-80℃超低温冰箱（日本，Sanyo）；制冰机（宁波GrantFM70）；核酸蛋白分析仪（美国，BeckmanCoulterDU730）；台式高速离心机（美国，Beckman）；酶标仪（Bio-Rad）；微波炉（格兰仕）；磁力搅拌器（德国，IKARH-KT/C）；低温高速离心机（美国，ThermoFisherScientific）；4℃冰箱（海尔，西门子和容声）；光学显微镜（日本，OlympusOptiealCo.,Ltd）；数码相机（日本，Nikon-4500）；分析天平（MettlerToledoAG285）；CFX96Real-timePCR仪（Bio-Rad）；Westernblot半干转转印系统（Bio-Rad）；ChemDocTMXRS化学发光成像系统（Bio-Rad）；CO2细胞恒温培养箱（HeraeusBB5060）；荧光倒置27 华中科技大学博士学位论文显微镜（FV1000）。1.7PCR引物序列GenePrimerforreal-timepolymerasechainreactionmβ-actinSense:5’-GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3’Antisense:5’-TGTCGTCCCAGTTGGTAACA-3’mHMGCRSense:5’-GGTTCTTTCCGTGCTGTGTT-3’Antisense:5’-CCATTTTTAACCCACGGAGA-3’mSREBP-2Sense:5’-ACAGACACAAGGGCTAGGCT-3’Antisense:5’-GTGCTTCAACCCCACCTACT-3’mLDLRSense:5’-GAACTCAGGGCCTCTGTCTG-3’Antisense:5’-GAAACCATGCGTGTATCCCT-3’mCYP-7αSense:5’-CAGGGAGATGCTCTGTGTTCA-3’Antisense:5’-AGGCATACATCCCTTCCGTGA-3’mPCSK9Sense:5’-CCTGGAGTTTATTCGGAAGAGTC-3’Antisense:5’-GGATGCGGCTATACCCACC-3’mLALSense:5’-TGCCCACGGGAACTGTATC-3’Antisense:5’-ATCCCCAGCGCATGATTATCT-3’mABCG1Sense:5’-GTGGATGAGGTTGAGACAGACC-3’Antisense:5’-CCTCGGGTACAGAGTAGGAAAG-3’mABCG5Sense:5-CCAGATTATGTGCATCTTAGGCA-3’Antisense:5’-CTGCTCAGAAAAACGTCGCT-3’mABCG8Sense:5’-AGCCTCACTACTCGACGTGAT-3’Antisense:5’-ACTGGGTTGCCCATTTATCCA-3’mCYP-27A1Sense:5’-ACACGGATGCCTTAAACGAGG-3’Antisense:5’-GCAGCCAATCCTTTTCTCAAAC-3’mACAT2Sense:5’-CCCGTGGTCATCGTCTCAG-3’Antisense:5’-GGACAGGGCACCATTGAAGG-3’mABCA1Sense:5’-GCTTGTTGGCCTCAGTTAAGG-3’Antisense:5’-GTAGCTCAGGCGTACAGAGAT-3’mnCEH1Sense:5’-TTGAATACAGGCTAGTCCCACA-3’Antisense:5’-CAACGTAGGTAAACTGTTGTCCC-3’mSREBP-1Sense:5’-CAAGGCCATCGACTACATCCG-3’Antisense:5’-CACCACTTCGGGTTTCATGC-3’hHMGCRSense:5’-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3’Antisense:5’-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3’hSREBP-2Sense:5’-CGTCCACCACCGACAGATGA-3’Antisense:5’-GAAGGCTGGAGACCAGGAAGA-3’hGAPDHSense:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’Antisense:5’GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’28 华中科技大学博士学位论文2.方法2.1FVB/Ncrl小鼠高压尾静脉注射pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒（1）6-7周龄SPF级雄性FVB/Ncrl小鼠，随机分成Control和HBV两组。Control组予以pGEM-4Z对照质粒进行尾静脉高压注射，HBV组予以pGEM-4Z1.3HBV质粒尾静脉高压注射。（2）根据小鼠体重，将10μgpGEM-4Z/pGEM-4Z1.3HBV质粒分别溶解于相当于小鼠体重8%PBS缓冲液中，制成质粒溶液，然后在6-8秒钟内将质粒溶液经尾静脉快速注射入到对应分组小鼠体内。2.2FVB/Ncrl小鼠酒精饮食干预尾静脉高压注射质粒观察一周后，Control组及HBV组的小鼠分别再随机分成Pair-fed和EtOH两组，Pair-fed组予以AIN93对照饲料喂养，EtOH组予以AIN93酒精饲料喂养，每只小鼠每天的进食量为5ml液体饲料，自由饮水，按1%酒精饲料喂养3天，3%酒精饲料喂养4天，进行一周过渡饲养，而后5%酒精饲料喂养6周至实验终点。饲料成分如下：成分含量主料120g维生素2.5g矿物质8.7g95%食用酒精1-5%（v/v）蒸馏水1000ml2.3肝脏取材（1）于酒精饮食干预6周进行取材，处理各组小鼠，于处理前12小时对小鼠禁食；（2）用乙醚麻醉约30秒，眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，于75%酒精中浸泡5min，将摘取眼球取得的血液室温静置1-2小时，于室温下3000rpm，离心15min，收取上清，-80℃保存备用；（3）将小鼠四肢固定，用眼科弯镊夹取皮肤，眼科剪呈T型剪开皮肤，将皮肤与腹膜分离干净，换干净的眼科剪和眼科镊剪开腹膜，将肝脏充分暴露出来，再换一副干29 华中科技大学博士学位论文净的眼科剪小心分离肝脏，取出肝脏，剪出约5mm正方形于4%多聚甲醛中固定24h，进行石蜡包埋、切片，免疫组织化学染色备用。另取一部分进行冰冻切片，油红O染色备用。其余组织装入冻存管，-80℃保存备用。2.4血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量的测定：罗氏全自动生化分析仪检测血清TC、HDL、LDL。2.5肝脏总胆固醇含量的测定采用TCH总胆固醇测定试剂盒检测（南京建成）（1）样本处理：称取冻存的小鼠肝组织30-50mg，加入100μl冰浴无水乙醇，用电动匀浆器匀浆，室温2000rpm，离心8min，取上清作为组织匀浆液备用；（2）将校准品以及组织匀浆液以1:100与单试剂混匀，每个样本设置一个复孔，以蒸馏水作为空白对照；（3）取一块平底96孔板，每孔加入200μl上述配制好的空白品、校准品和样本，置于37℃平衡5-10min；（4）取出96孔板，在500nm波长下检测吸收光；（5）计算结果：胆固醇浓度=（测量值-空白值）/（校准值-空白值）×5.55mmol/L肝组织胆固醇含量=胆固醇浓度×胆固醇分子量×匀浆体积/组织重量（胆固醇分子量为386.65g/mol）。2.6肝组织/细胞总RNA的提取，采用Trizol抽提的方法，步骤如下：（1）加入Trizol的肝组织匀浆/细胞解冻后室温下孵育3min；（2）向其中加入200μl的氯仿，剧烈震荡混匀30s，冰上放置3min；12000g，4℃离心15min；（3）吸取上层液相500μl，至新的EP管中，注意千万不要吸取中间层，以免影响RNA纯度；（4）加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀数次，室温静置10min，12000g，4℃离心15min，RNA沉于管底；（5）尽量弃去上清，防止RNA沉淀丢失，每管加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），充分吹打，弹起漂洗沉淀；30 华中科技大学博士学位论文（6）8000g，室温离心10min；（7）小心弃去上清，真空干燥RNA沉淀，用适量的DEPC水溶解RNA。2.7逆转录反应（1）检测所提取RNA溶液的浓度与纯度，纯度λ260/λ280在1.8-2.0之间为宜。（2）将RNA于65℃水浴5min，而后置于冰上；（3）添加反应体系：成分用量RNAtemplate2ug5×RTBuffer4μlRTEnzymeMix1μlPrimerMix1μlNuclease-freeWaterupto20μl（4）逆转录反应：PCR仪控温，在37℃条件下，进行15min逆转录反应；在98℃条件下，进行5min酶失活反应；反应结束后，保存于-20℃冰箱。2.8Real-timePCR反应（1）反应体系成分用量RealtimePCRMasterMix-Plus10μlcDNA1μl上游引物1μl下游引物1μlNuclease-freeWater7μl（2）反应条件：95℃预变性3min，开始进入循环，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，循环40次；65℃-95℃熔解曲线。-△△t（3）采用2法比较各目的基因的相对含量。2.9免疫组织化学染色检测小鼠肝组织细胞SREBP-2和PCSK9的表达采用北京中杉金桥生物技术有限公司提供的生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒31 华中科技大学博士学位论文（1）石蜡切片，常规脱蜡至水；（2）抗原修复：配制20×柠檬酸钠修复液，微波炉高火3min，将切片放入修复液中，微波炉中高火5min→4min→3min，微波3次，每次中间间隔30s-1min，注意不要干片，自然冷却至室温；（3）组画笔画圈，3%H2O2去离子水孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS振洗3次，每次3min；（4）封闭：滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15-30min，倾去，勿洗；（5）滴加Anti-SREBP-2（1:100稀释）、Anti-PCSK9（1:200），放入湿盒4℃孵育过夜；（6）室温复温45min，PBS振洗，3min×3次；（7）二抗孵育：生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育30min；（8）PBS振洗，3min×3次；（9）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10-15min；（10）PBS振洗，3min×3次；（11）DAB显色剂显色；（12）自来水充分冲洗（12）复染核：将切片于苏木素染液中浸泡5min，自来水充分冲洗；（13）中性树脂封片。（14）光学显微镜下观察，拍照。2.10复苏细胞，传代培养与冻存复苏细胞：（1）从液氮罐中将HepG2细胞系取出，迅速置于PE手套中，放入37℃水浴锅中，轻柔快速振摇，使其解冻；（2）移入超净台，将细胞液轻柔吹打，缓慢滴入15ml离心管中（加入时倾斜离心管，枪头沿管壁缓慢滴加）；（3）再向其中加入5ml含10%FBS的DMEM培养基（加培养基时，同样倾斜离心管，枪头沿管壁缓慢滴加），轻柔吹打混匀，600rpm，低速离心5min。32 华中科技大学博士学位论文（4）弃去上清，再加入5mlDMEM培养基（含10%FBS），轻柔吹打混匀，尽量将细胞吹打成单个细胞悬液，将细胞悬液转移至小培养瓶中，置于显微镜下观察，作好标记，用75%酒精将瓶口一圈喷洒消毒，放入5%CO2，37℃恒温培养箱中培养。传代培养：HepG2细胞为贴壁细胞，按照贴壁细胞的传代方法。（1）于复苏1-2天后观察细胞，细胞融合度达到90%左右，可以考虑细胞传代。37℃水浴预热胰酶消化液、PBS以及含10%FBS的DMEM培养基；（2）在超净台中吸弃原培养基，加入3mlPBS，静置1-2min；（3）吸弃PBS，加入1ml胰酶消化液，室温或37℃培养箱静置3-5min，轻拍瓶身，细胞从壁上脱落可加入10ml新鲜培养基终止消化；轻柔吹打混匀，使细胞尽量呈单细胞悬液；（4）吸取5ml细胞悬液转移至新的小细胞培养瓶中，75%酒精喷洒瓶口消毒后，放入含5%CO2，37℃恒温培养箱中培养。传代至4-6代可进行实验或保种。细胞冻存：（1）配制冻存液：DMSO：FBS=1:9,4℃避光保存，即配即用；（2）取4-6代细胞，消化并充分重悬之后，800rpm离心5min，吸弃培养基，加入适量冻存液，充分吹打混匀，调整细胞密度，分装至细胞冻存管中，每管加入1ml细胞液，作好标记；（3）于4℃冰箱中放置30min，再转入-20℃冰箱放置30min，最后转入-80℃过夜，次日转入液氮罐长期保存。2.11HepG2细胞转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒（1）转染前一天铺板：6孔板，每孔铺1×106个细胞；（2）配制稀释的Lipo3000：120μlOpti-MEM+5μlLipo3000，室温静置5min；（3）配制稀释的DNA：pGEM-4Z1.3HBV或者pGEM-4Z质粒2.0ug+4μlP3000TM+120μlOpti-MEM；（4）将上述稀释的Lipo3000和稀释的DNA混匀，室温静置20min；（5）将铺好的细胞板取出，换新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，将上述混合物加入对应细胞孔中，做好标记，喷洒酒精，放入5%CO2,37℃培养中培养。33 华中科技大学博士学位论文2.12酒精刺激培养转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒的HepG2细胞（1）转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒的HepG2细胞培养24小时后，取出对应细胞板，按100mM浓度向其中加入无水乙醇（11.3μl/2ml培养基），对照加入相同体积的PBS。（2）取出模块化低氧培养装置，向培养装置底部放入一个装有200ml蒸馏水的玻璃皿，里面加入相当于细胞培养内液2倍浓度的无水乙醇（200mM），将加入无水乙醇的细胞板放入装置，盖上盖子，固定并夹闭O形夹具。（3）向装置内充入5%CO2，控制气流速率为20L/min，4min可充满装置，将放入37℃恒温箱，24小时后收取细胞。2.13Westernblot2.13.1提取小鼠肝组织细胞细胞核及胞浆蛋白采用核浆蛋白分离提取试剂盒（Pierce/ThermoScientific）（1）每个样本称取约30mg-40mg小鼠肝组织，作好标记，用冰浴PBS洗涤2-3次，500g离心2-3min；（2）弃上清，每管加入200μl含蛋白酶抑制剂的冰CERⅠ，轻柔吹打混匀；（3）使用振荡器高速振动15-20s，充分混匀，冰上放置10min；（4）每管加入11μlCERⅡ；（5）高速振动5s，充分混匀后，冰上放置1min；（6）高速振动5s，16000g，4℃离心10min；（7）将上清胞浆蛋白迅速吸入预先冰浴的EP管中，作好标记，分装好备用或者-80℃保存；（8）离心管中剩余沉淀分别加入100μl冰浴的NER（预先加入Cocktail蛋白酶抑制剂），充分混匀后，高速振动15-20s，然后于冰上静置，10min后再振动一次，共重复4次；（9）将EP管放入低温离心机中，16000g，4℃离心10min，将上清核蛋白迅速吸入预先冰浴的EP管中，作好标记，分装备用或者-80℃保存。2.13.2HepG2细胞核及胞浆蛋白的提取34 华中科技大学博士学位论文采用核浆蛋白分离提取试剂盒（Pierce/ThermoScientific）（1）准备待提取蛋白的HepG2细胞，加入适量冰浴PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，弃废液，胰酶消化，将细胞转入1.5mlEP管，500g，离心5min；（2）后续步骤操作及注意事项同上。2.13.3蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度检测试剂盒（Piece/ThermoScientific）（1）标准品的配制：按照说明书，配制A-H蛋白浓度检测标准品，分装，取一次用量，其余-80℃保存，避免反复冻融；（2）蛋白样本的稀释：将待测蛋白样本于冰上解冻，振动混匀，每个样本分别取10μl加入50μl0.9%生理盐水中，6倍稀释，充分混匀；（3）工作液的配制：A液：B液=50:1，按比例取适量溶液混合；（4）取平底96孔板，每孔加入200μl工作液，加样时应避免气泡的产生；（5）每孔再依次分别加入25μl的标准品（设置复孔）、25μl待测样本（设置复孔）并设置空白孔，避免产生气泡；（6）37℃，避光孵育30min；（7）590nm波长检测样本吸光度，绘制标准曲线，计算样本的蛋白浓度。2.13.4Westernblot（1）清洗玻璃板：先用自来水清洗干净，再用蒸馏水清洗，烤箱内烘干；（2）玻璃板对齐卡紧后置于架子上夹好，确保夹子夹紧以免造成漏胶；（3）灌胶：配制10%分离胶，充分混匀，用1ml的枪头吸取分离胶溶液沿玻璃板加入，加到液面升至离绿框上沿5mm处即可；缓慢地在胶面上封一层水压胶，加入时注意要轻柔，避免用力过猛造成冲胶，避免产生气泡导致压线不齐。当看到水与分离胶之间出现明显分界线时，说明胶已凝固，再静置5min，待胶充分凝固将水弃去，用吸水纸将水彻底吸干；配制5%的浓缩胶，充分混匀后灌胶，将分离胶上剩余的空间灌满，注意避免产生气泡，灌满后垂直插入梳子，凝胶过程中可补胶；（4）蛋白样本上样：将制备好的凝胶板放入电泳槽，向电泳槽及玻璃板内侧内加入电泳缓冲液，垂直向上轻柔缓慢拔出梳子。向待加样的蛋白样本中加入5×蛋白上样35 华中科技大学博士学位论文缓冲液，充分混匀后，加热煮沸5-10min。用微量加样器分别向加样孔中加入蛋白Marker和蛋白样品，每孔蛋白上样量为20ug。（5）电泳：一般浓缩胶用80V进行恒压电泳，跑至分离胶时可用100V恒压电泳，总时长约为2小时。（6）半干转转膜：待测目的蛋白分子量在100KD以内，适于半干转方法转膜。准备14张名片大小中性滤纸以及等大的PVDF膜，将中性滤纸放入转移缓冲液中浸泡湿润，取7张充分擀走气泡，放在半干转转印槽最底层，PVDF膜在甲醇溶液中激活至少15s后，用镊子夹取放于滤纸上，擀走气泡，将凝胶板放在转移缓冲液中轻柔撬开，切去浓缩胶以及多余分离胶，将分离胶小心剥下置于PVDF膜上，擀走气泡，最上层再覆盖7层湿润过的中性滤纸，从上至下形成滤纸-胶-膜-滤纸的三明治结构，用吸水纸吸干多余的液体，盖上电极板，充分压紧锁住，放入转印抽屉内，设置半干转条件：25V恒压，30min。（7）完成转膜后，将膜按照预测目的条带的位置剪膜，作好标记，放入5%BSA封闭液中封闭1-2小时；配制一抗稀释液（Anti-GAPDH1:10000；Anti-HMGCR1:5000；Anti-SREBP-21:600；Anti-CYP-7α1:1000；Anti-LDLR1:500；Anti-PCSK91：600），将封闭好的膜放入含一抗稀释液的抗体盒中，膜完全浸入一抗稀释液，4℃，脱色摇床，摇动过夜。次日，取出PVDF膜，放入TBST溶液中，室温摇床上洗涤3次，每次10min，按照一抗来源配制二抗稀释液，将PVDF膜放入抗体盒是其完全浸入二抗稀释液，室温摇床孵育45min，用镊子小心取出膜，TBST室温摇床洗涤5次，每次10min；（8）化学发光反应：采用ECL化学发光试剂盒（联科生物），配制工作液，A液：B液=1：1，充分混合，将膜放入ChemiDocTMXRS化学发光成像系统中，将配制好的工作液覆盖于膜上，设置曝光条件，进行曝光并分析结果。若需检测多个蛋白分子的表达情况，且目的蛋白大小接近不便于剪膜分离，可用曝光过的膜蒸馏水洗涤5min，加入蛋白一抗二抗去除液，室温摇床10min，TBST洗涤3次，重新封闭进行免疫反应。2.14免疫荧光染色36 华中科技大学博士学位论文（1）制作细胞爬片，HepG2细胞转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒，并用酒精刺激培养，方法同前。（2）酒精刺激24小时后取出细胞板，弃去培养基，置于摇床上，加入PBS缓冲液，轻摇洗涤细胞爬片3次，每次5min；（3）将细胞爬片置于冰浴的4%多聚甲醛中固定30min；（4）PBS振洗，5min×3次，再用0.5%Triton-100溶液室温下通透20min；（5）PBS振洗，5min×3次，5%BSA封闭，37℃孵育30min；（6）加入Anti-SREBP-2（1:100）一抗稀释液，放入湿盒，4℃孵育过夜；（7）次日取出，室温复温45min，PBS振洗，5min×3次；（8）加入FITC标记的抗兔IgG荧光二抗稀释液（1:32），37℃孵育1小时，从该步骤起，操作均需在避光条件下进行；（9）PBS振洗，5min×3次，DAPI核染色剂染核5min；（10）PBS振洗，5min×4次，加入抗荧光淬封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察并拍照。2.15统计分析计量资料采用均数±标准误表示，用GraphPadPrism5进行统计分析及绘图，多组间的比较采用One-way方差分析的检验方法，p<0.05认为有统计学差异。结果1、酒精性脂肪肝合并HBV复制共同明显增加血清胆固醇含量对小鼠血清进行总胆固醇含量的检测，我们发现单独的HBV持续复制的因素就能上调血清总胆固醇水平相较于Pair-fed组小鼠（p<0.001），而合并酒精饮食干预后，胆固醇水平被进一步上调，相较于HBV+Pair-fed组小鼠（p<0.05）和EtOH组小鼠（p<0.001）（图2-1A）。血清HDL和LDL水平呈现相反的变化，血清HDL水平在EtOH组小鼠、HBV+Pair-fed组小鼠和HBV+EtOH组小鼠均有下降（图2-1B），而血清LDL水平HBV+EtOH组相较于其他组显著升高（p<0.001）（图2-1C）。2、酒精性脂肪肝合并HBV复制共同明显增加肝脏胆固醇含量同时，我们也检测了小鼠肝脏的胆固醇水平，发现了与血清中类似的结果。在37 华中科技大学博士学位论文HBV持续复制的小鼠肝脏胆固醇较对照组显著升高（p<0.05），然而进行酒精饮食处理后，胆固醇在肝脏的蓄积进一步增强，有显著统计学差异（p<0.01）（图2-2）。ABC图2-1.小鼠血清胆固醇、HDL、LDL水平A．小鼠血清胆固醇含量；B.小鼠血清HDL含量；C.小鼠血清LDL含量；Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001图2-2.小鼠肝脏胆固醇含量Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.0013、酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇生物合成的影响酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠血清及肝脏胆固醇水平的明显升高说明慢性饮酒合并HBV持续复制可能导致胆固醇代谢的紊乱。因此，我们检测了胆固醇合成相38 华中科技大学博士学位论文关的基因表达水平。胆固醇合成受到转录因子SREBPs的调控，因而我们首先检测了SREBPs在肝脏中的表达水平，结果发现，如图2-3A显示，SREBP-1的表达相较于Pair-fed组虽在HBV+Pair-fed组有显著升高，但在HBV+EtOH组中并未见进一步的增高，而SREBP-2的表达在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中相较于Pair-fed组（p<0.01），EtOH组（p<0.01）以及HBV+Pair-fed组小鼠（p<0.01）则有显著的上调，说明胆固醇的合成主要还是受到SREBP-2的调控。进一步，我们还观察了SREBP-2在肝脏的活化情况，如图2-3B，酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠肝脏SREBP-2的核移位明显增强。接着，我们分析了HMGCR的表达水平，HMGCR是胆固醇合成过程中的限速酶，受到SREBP-2的调控。HMGCR的mRNA水平在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中呈现4-8倍增高相较于Pair-fed组小鼠（p<0.01）、EtOH组小鼠（p<0.01）和HBV+Pair-fed组小鼠（p<0.05）（图2-3C）。通过Westernblot检测HMGCR在蛋白水平的表达发现其在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中也是明显增加（图2-3D）。这些结果说明慢性饮酒合并HBV复制能够显著增强胆固醇从头生物合成的途径。AB39 华中科技大学博士学位论文CD图2-3.小鼠肝脏SREBP-2和HMGCR的表达情况A图为小鼠肝脏SREBP-1和SREBP-2在mRNA水平的表达；B图为SREBP-2免疫组织化学染色（400×，→表示胞浆SREBP-2的表达，→表示胞核SREBP-2的表达）；C图为小鼠肝脏HMGCR在mRNA水平的表达；D图为小鼠肝脏HMGCR在蛋白水平的表达。Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。4、转染1.3HBV质粒的HepG2细胞在酒精共刺激下对胆固醇合成的影响前面我们已在小鼠体内观察到酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇合成有显著上调的作用，为了进一步验证这一现象，我们模拟体内环境建立了酒精刺激合并HBV复制的体外模型。如图2-4A显示，SREBP-2的mRNA水平同样在酒精刺激合并HBV复制组中显著增高，较其余组均升高约2倍以上，核蛋白中的SREBP-2的表达也明显上调（图2-4B）。进一步我们观察了HepG2细胞在酒精刺激与HBV复制状况下核移位的活化情况。结果显示酒精刺激合并HBV复制能显著活化核SREBP-2，核移位明显增多（图2-4C）。同样，我们也检测了HMGCR的表达水平，跟小鼠体内观察到的结果一致，HMGCR的水平无论在mRNA水平还是在蛋白水平，酒精刺激合并HBV复制组都相40 华中科技大学博士学位论文较于其他组显著升高（p<0.05）（图2-5A，图2-5B）。这些结果表明长期过量饮酒合并HBV持续复制能够协同诱导胆固醇的合成增加，导致胆固醇在肝细胞中的堆积。ABC图2-4.HepG2细胞SREBP-2表达情况A图为HepG2细胞SREBP-2在mRNA水平的表达；B图为HepG2细胞SREBP-2在蛋白水平的表达及相对定量结果；图C为HepG2细胞SREBP-2免疫荧光染色，（200×→表示胞核SREBP-2的表达）；*p<0.0541 华中科技大学博士学位论文AB图2-5.HepG2细胞HMGCR表达情况A图为HepG2细胞HMGCR在mRNA水平的表达；B图为HepG2细胞HMGCR在蛋白水平的表达及相对定量结果，由三次独立重复实验统计而得；*p<0.05。5、酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇摄取途径的影响LDLR广泛分布与肝脏、动脉壁细胞等全身各组织的细胞膜表面，可以与LDL结合，介导LDL被细胞内吞。LDL是血液中胆固醇的主要载体，循环中70%的LDL在肝脏被摄取并被代谢。在本实验中，我们观察到，LDLR的表达水平在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中下降了3-5倍，相较于Pair-fed组小鼠、EtOH组小鼠和HBV+Pair-fed组小鼠其下降有显著统计学差异（图2-6A）。同样，LDLR的蛋白表达水平在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中也是显著减少（图2-6B）。这一现象在体外实验中也得到了进一步的验证（图2-6E）。PCSK9是近几年发现的一种通过转录前机制调控LDLR降解的蛋白酶，在本研究中，我们也分析了小鼠肝脏PCSK9的表达情况。通过mRNA水平的检测，我们发现小鼠肝脏PCSK9的表达在HBV+EtOH组显著增高相较于其他三组（图2-6C），肝脏的免疫组化结果也显示，PCSK9的表达在HBV+EtOH组明显增强（图2-6D）。同样，我们也进行了体外的验证，发现PCSK9的表达同样在HBV+EtOH组中显著增高（图2-6E）。42 华中科技大学博士学位论文ABCDE图2-6.慢性饮酒合并HBV持续复制对LDLR和PCSK9表达影响。A图为小鼠肝脏LDLR在mRNA水平的表达；B图为小鼠肝脏LDLR在蛋白水平的表达水平及相对定量结果；C43 华中科技大学博士学位论文图为小鼠肝脏PCSK9在mRNA水平的表达；D图为小鼠肝脏PCSK9免疫组织化学染色（200×）；Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8；E图为HepG2细胞LDLR和PCSK9在蛋白水平的表达。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。6、酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇降解途径的影响胆固醇降解的重要途径是分解为胆汁酸，CYP-7α是这一途径的关键酶。因此，我们分析了小鼠肝脏中CYP-7α的表达情况。如图2-7A所示，在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中，其CYP-7αmRNA表达较Pair-fed组小鼠、EtOH组小鼠以及HBV+Pair-fed组小鼠下降了3-6倍，具有统计学差异。CYP-7α在蛋白水平也呈现显著下降的水平（图2-7B）。同时我们也检测了CYP-27A1的表达，结果发现慢性饮酒的两组小鼠EtOH组和HBV+EtOH组中，CYP-27A1的表达有下降趋势，但是慢性饮酒和HBV持续复制并没有进一步抑制CYP-27A1的表达（图2-7A）。另外在体外模型中，我们同样观察到CYP-7α的表达在酒精刺激合并HBV复制的HepG2细胞中显著减少（图2-7C）。A44 华中科技大学博士学位论文BC图2-7.小鼠肝脏CYP-7α和CYP-27A1的表达以及HepG2细胞CYP-7α的表达情况A图为小鼠肝脏CYP-7α和CYP-27A1mRNA的表达水平；B图为小鼠肝脏CYP-7α蛋白的表达水平及相对定量结果；Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8；C图为HepG2细胞CYP-7α蛋白的表达水平及相对定量结果，由三次独立重复实验统计而得。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。7、酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇酯化水解途径的影响为了探究酒精性脂肪肝合并HBV持续复制对胆固醇酯化和水解途径的影响，我们检测了酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶2（AcylcoenzymeA-cholesterolacyltransferase-2）、中性胆固醇酯水解酶（Neutralcholesterolesterhydrolase,nCEH）和溶酶体酸性脂肪酶（lysosomalacidlipase,LAL）在小鼠肝脏的表达。结果显示，ACAT2、n45 华中科技大学博士学位论文CEH和LAL的表达在各组之间无明显差异（图2-8），提示慢性饮酒合并HBV持续复制可能对胆固醇酯化水解途径无明显影响。ABC图2-8.小鼠肝脏ACAT2、nCEH和LAL的表达。B图为小鼠肝脏ACAT2在mRNA水平的表达；B图为小鼠肝脏nCEH在mRNA水平的表达；C图为小鼠肝脏LAL在mRNA水平的表达；Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8。8、酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇逆向转运途径的影响胆固醇的逆向转运在胆固醇稳态的维持中也占有重要的作用，涉及多种转运蛋白，其中ATP结合盒转运体家族（ATP-bindingcassettetransporter，ABC）作为重要的跨膜转运蛋白参与其中。本研究中，我们检测了小鼠肝脏ABCA1、ABCG1、ABCG5和ABCG8四种转运蛋白的表达，发现慢性饮酒合并HBV持续复制对转运途径并无协同影响作用（图2-9）。DABC图2-9.慢性饮酒合并HBV持续复制对胆固醇逆向转运途径的影响.46 华中科技大学博士学位论文A图为小鼠肝脏ABCA1在mRNA水平的表达；B图为小鼠肝脏ABCG1在mRNA水平的表达；C图为小鼠肝脏ABCG5在mRNA水平的表达；D图为小鼠肝脏ABCG8在mRNA水平的表达；Pair-fed:n=7；EtOH:n=9；HBV+Pair-fed:n=7；HBV+EtOH:n=8。*p<0.05讨论肝脏在胆固醇代谢中起着至关重要的作用。现有的研究针对HBV感染中胆固醇稳态的改变有一些进展，然而目前对于酒精性脂肪肝合并HBV感染在胆固醇代谢中的影响知之甚少。本研究利用前一部分研究中建立的酒精性脂肪肝合并HBV复制的小鼠模型，观察到小鼠血清及肝脏胆固醇的明显的升高，这说明长期慢性饮酒合并HBV感染可能导致肝脏胆固醇的蓄积，这一蓄积现象可能是通过合成的增加以及降解的减少引起。胆固醇的合成涉及到多种酶的参与，SREBP-2是胆固醇调节中最重要的转录因子，它能调节胆固醇合成途径的多种酶，包括HMG-CoA合成酶、HMGCR、法尼酰焦磷酸合成酶等[19-21]。SREBP-2前体蛋白是分子量约为125KD的膜蛋白，在正常生理状况下锚定于细胞内质网上，当细胞内胆固醇含量降低时，SREBP-2与SREBP裂解活化蛋白（SCAP）结合并转运至高尔基体，SCAP激活高尔基体上的S1P，一种丝氨酸蛋白酶，与S2P共同裂解SREBP-2，裂解成熟的SREBP-2蛋白大小约为67KD，被裂解活化的SREBP-2随后迁移至细胞核，从而发挥核转录因子的功能，从而调节其下游基因，包括HMGCR，胆固醇合成的关键酶[18]。本研究中，我们发现慢性饮酒合并HBV感染显著活化了肝脏SREBP-2，因此导致HMGCR的高表达，说明酒精性脂肪肝合并HBV复制可以协同增强胆固醇的合成途径，可以部分解释肝脏总胆固醇含量的增高。LDLR负责清除血液循环中的LDL，LDL增高是动脉粥样硬化的高危风险因素。慢性饮酒合并HBV持续复制的肝脏疾病引起血清LDL水平增高可能会是导致心血管疾病发病的风险因素。而LDLR水平的降低，可能会影响这一类人群使用他汀类药物的治疗效果[22]。LDLR主要受SREBP-2的调控[23]。之前有研究报道，LDL可以通过抑制SREBP-2途径来抑制LDLR基因的转录[24]。有趣的是，在本研究中，我们观47 华中科技大学博士学位论文察到长期大量饮酒合并HBV感染对于LDLR的表达有显著下调作用，LDLR的减低显著抑制了肝脏对外周循环LDL的摄取，从而导致血清LDL水平的升高，即使SREBP-2处于活化状态。这一结果显示，LDLR可能还受到其他途径的调控。PCSK9是近几年发现的一种通过转录前机制调控LDLR降解的蛋白酶[25]，其抑制剂作为新型降胆固醇药近年来已成为研究热点。在本研究中，我们发现慢性饮酒合并HBV复制能够协同上调PCSK9的表达，从而部分阐释了LDLR的下调机制。胆固醇的一个重要的降解途径是分解为胆汁酸。作为胆汁酸合成的关键酶，CYP-7α负责将胆固醇转化为7α羟基胆甾醇从而进一步转化为胆汁酸[26]。由于肝脏是胆汁酸合成的唯一场所，慢性长期饮酒合并HBV感染极有可能影响胆汁酸的生物合成。本研究中，我们证实了CYP-7α在酒精性脂肪肝合并HBV复制小鼠中显著下降，这一结果说明了慢性长期饮酒合并HBV感染协同抑制肝脏胆固醇的降解途径，从而导致胆固醇在肝细胞的堆积。另外，胆固醇的摄取与降解也可能受到HBV感染不同阶段的影响。最近有研究显示，依泽替米贝可以通过调节肝脏胆固醇摄取从而抑制HBV早期感染,而当HBV基因组进入细胞整合以后则无影响[27]。HBV与其受体NTCP结合，会抑制其转运功能，从而促进胆汁酸合成增多以及胆固醇合成代偿性增加，包括SREBP-2、HMGCR、LDLR和CYP-7α表达上调[16]。在本实验中，我们观察到的LDLR和CYP-7α的下调可能是由于HBV感染的阶段不同以及酒精因素的作用。同时我们也观察到胆固醇的酯化水解以及逆向转运途径在HBV复制合并酒精刺激中无明显改变，说明HBV复制合并酒精性脂肪肝可能对胆固醇的酯化水解及逆向转运途径无影响。本研究证实了在酒精性脂肪肝合并HBV复制中肝脏胆固醇的蓄积，酒精刺激与HBV持续复制在促进胆固醇合成以及抑制胆固醇摄取、降解的过程中共同作用，这一发现使我们对该疾病有了新的认识。48 华中科技大学博士学位论文参考文献1.IncardonaJP,EatonS.Cholesterolinsignaltransduction[J].CurrOpinCellBiol2000;12:193-203.2.BaekAE,NelsonER.Thecontributionofcholesterolanditsmetabolitestothepathophysiologyofbreastcancer[J].HormCancer2016;7:219-228.3.HanukogluI.Steroidogenicenzymes:structure,function,androleinregulationofsteroidhormonebiosynthesis[J].JSteroidBiochemMolBiol1992;43:779-804.4.XianxinH,ChiekoY,JianW,etal.SREBP-2,asecondbasic-helix-loop-helix-leucinezipperproteinthatstimulatestranscriptionbybindingtoasterolregulatoryelement[J].Proc.Natl.Acad.Sci1993;90:11603-11607.5.郭赟婧，曹进.ABCA1和ABCG1在胆固逆转运中作用的研究进展[J].国外医学医学地理分册2012;33:213-217.6.沈振斌，秦新裕，童赛雄等.ABCG5和ABCG8在肝细胞胆固醇转运中的作用[J].中华肝胆外科杂志2005;11:695-697.7.王瑞，罗俊生，关宁等.胆固醇酯水解酶与缺血性脑血管病的关系[J].解剖科学进展2010;16:367-369.8.MundalL,SarancicM,OseL,IversenPO,BorganJK,VeierødMB,LerenTP,RetterstølK.MortalityAmongPatientsWithFamilialHypercholesterolemia:ARegistry-BasedStudyinNorway,1992-2010[J].JAmHeartAssoc2014;3:e001236.9.Paños-MartínezM,Patró-MoncunillE,Santiago-BarragánÁM,etal.Cardiovascularrisk49 华中科技大学博士学位论文factorsanalysisonpatientswithseverementalhealthdisorders[J].EnfermClin2106;22:S1130-8621.10.AllottEH,HowardLE,CooperbergMR,etal.Serumlipidprofileandriskofprostatecancerrecurrence:resultsfromtheSEARCHdatabase[J].CancerEpidemiolBiomakersPrev2104;23:2349-2356.11.NelsonER,WardellSE,JasperJS,etal.27-Hydroxycholesterollinkshypercholesterolemiaandbreastcancerpathophysiology[J].Science2013;342:1094-1098.12.ChushiL,WeiW,KangkangX,etal.HMGCRisup-regulatedingastriccancerandpromotesthegrowthandmigrationofthecancercells[J].Gene2016;587:42-47.13.PeltonK,CoticchiaCM,CuratoloAS,etal.Hypercholesterolemiainducesangiogenesisandacceleratesgrowthofbreasttumorsinvivo[J].AmJPathol2014;184:2099-2110.14.LiYJ,ZhuP,LiangY,etal.HepatitisBvirusinducesexpressionofcholesterolmetabolism-relatedgenesviaTLR2inHepG2cells[J].WorldJGastroenterol2013;19:2262-2269.15.QiW,LingD,JianW,etal.StrongeractivationofSREBP-1abynucleus-localizedHBx[J].BiochemBiophyResCom2015;460:561-565.16.OehlerN,VolzT,BhadraOD,etal.BindingofhepatitisBvirustoitscellularreceptoralterstheexpressionprofileofgenesofbileacidmetabolism[J].Hepatology2014;50 华中科技大学博士学位论文60:1483-1493.17.Delgado-VillaMJ,OjedaML,RubioJM,etal.Beneficialroleofdietaryfolicacidoncholesterolandbileacidmetabolisminethanol-fedrats[J].JStudAlcoholDrugs2009;70:615-622.18.WangZG,YaoT,SongZY.Chronicalcoholconsumptiondisruptedcholesterolhomeostasisinrats:downregulationoflowdensitylipoproteinreceptorandenhancementofcholesterolbiosynthesispathwayintheliver[J].AlcoholClinExpRes2010;34:471-478.19.WeberLW,BollM,StampflA.Maintainingcholesterolhomeostasis:sterolregulatoryelement-bindingproteins[J].WorldJGastroenterol2004;10:3081-3087.20.SchekmanR.Discoveryofthecellularandmolecularbasisofcholesterolcontrol[J].ProcNatlAcadSciUSA2013;10:14833-14836.21.SatoR.Functionsofcholesterolmetabolites[J].JNutrSciVitaminol2015;61:S151-S153.22.Hae-KiMin,AshwaniKapoor,MichaelFuchs,etal.Increasedhepaticsynthesisanddysregulationofcholesterolmetabolismisassociatedwiththeseverityofnon-alcoholicfattyliverdisease[J].CellMetab2012;15:665-674.23.AttieAD,SeidahNG.DualregulationoftheLDLreceptor-someclarifyandnewquestions[J].CellMetab2005;1:290-292.24.GoldsteinJL,BrownMS.TheLDLreceptor[J].ArteriosclerThrombVascBiol2009;29:431-438.51 华中科技大学博士学位论文25.HortonJD，CohenJC，HobbsHH.MolecularbiologyofPCSK9:itsroleinLDLmetabolism[J].TrendsinBiochemicalSciences2007;32:71-77.26.TaokaH,YokoyamaY,MorimotoK,etal.Roleofbileacidsintheregulationofthemetabolicpathways[J].WorldJDiabetes2016;7:260-270.27.LuciforaJ,EsserK,ProtzerU.EzetimibeblockshepatitisBvirusinfectionaftervirusuptakeintohepatocytes[J].AntiviralRes2013;97:195-197.52 华中科技大学博士学位论文第三部分HBV病毒蛋白在酒精性脂肪肝合并HBV复制中对胆固醇代谢的影响研究前言HBV是一种具有嗜肝性的DNA病毒。在HBV感染的肝细胞中，HBV可产生多种类型的病毒颗粒，包括含有外膜和核衣壳的完整病毒颗粒，Dane颗粒、由空心包膜组成的球形颗粒以及少量由空心包膜组成的管状颗粒。目前认为，Dane颗粒是具有感染性的完整病毒颗粒，它具有双层的包膜和一个核心结构，其双层包膜由脂质双层和蛋白质组成，其中镶嵌HBV的表面抗原（HBsAg）。Dane颗粒的核心直径为32-36nm，其主要核心结构蛋白为HBcAg，HBeAg也是核心颗粒中的一种可溶性蛋白，一般埋藏于HBcAg内部。HBV核心内部包含有HBV-DNA以及聚合酶，因此病毒核心与基因组的复制相关。HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA，长度约3200bp。长链为负链，是转录的模板链，短链为正链，其长度约为长链的50%-80%。HBV基因组包含4个开放阅读框（ORF），分别为ORF-P、-S、-C、-X。ORF-P长度为2532bp，为基因组中最长的ORF，它包含全部ORF-S，并与ORF-C和ORF-X部分重叠。ORF-P编码DNA聚合酶/逆转录酶和RnaseH，还编码末端蛋白，末端蛋白具有引发酶（primase）活性。ORF-S由pre-S1、preS2和S序列组成，，分别编码合成长短不一的HBsAg蛋白，即226个氨基酸残基组成的主要蛋白（S蛋白）、108-115个氨基酸残基组成的pre-S1蛋白，以及由55个氨基酸残基组成的pre-S2蛋白。ORF-C长度为639bp,编码合成HBcAg和HBeAg。ORF-X最小，编码合成HBx蛋白，分子量大小约为17KD[1]。HBx蛋白具有反式调控功能，能激活同源或异源基因的增强子和启动子。有研究发现，HBx能够活化SREBP-1[2,3]，从而增强甘油三酯的合成；HBx还能通过活化PPARγ的转录因子活性诱导肝脏脂肪变[4]。另外，HBx能够通过下调HNF4α抑制CYP2E1基因的表达，从而抑制脂肪酸的氧化代谢[5]。同时，HBx可以增强肝脏脂肪酸结合蛋白的表达导致脂肪肝[6]；另有研究报道，HBx可以作为正向调控分子调节53 华中科技大学博士学位论文糖质新生，促进肝糖原的合成[7]；除此之外，HBx的过表达也可以引起NF-E2相关因子2的活化以及核移位，导致6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达上调，从而促进磷酸戊糖途径。该途径信号的增强使核糖合成增多，为HBV在肝细胞内的增殖提供了更多的核苷酸的合成原料[8]。另一方面，HBsAg与肝细胞膜受体NTCP结合能够导致肝细胞胆汁酸代谢的紊乱[9]。由此可见，HBV病毒蛋白在肝脏代谢中起着不容忽视的重要作用，而它们是否能影响胆固醇的代谢目前尚未可知，本实验在前一部分研究中已发现酒精性脂肪肝合并HBV复制对胆固醇代谢有影响的基础下着重探讨病毒蛋白在其中的作用。材料与方法1.材料1.1质粒真核表达载体pGEM-4Z1.3HBV由国立台湾大学医学院陈培哲教授友情赠予并保存于本实验室；载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP购于SystemBiosciences公司。1.2细胞株HepG2细胞购自中科院上海生科院细胞资源中心。1.3主要试剂TrizolReagent(Invitrogen)；DEPC原液（武汉塞维尔生物科技有限公司）；DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)（ThermoFisherScientific）；FastDigestEcoRI、FastDigestBamHI、FastDigestNotI、FastDigestXbalI（ThermoFisherScientific）；TransStbl3ChemicallyCompetentCell（全式金生物技术有限公司）；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(TOYOBO)；彩色预染蛋白Marker（Fermentas）；Tween20（Sigma）；Western一抗二抗去除液（弱碱性）、Western及IP细胞裂解液（碧云天）；蛋白酶抑制剂（南京凯基生物）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）；PVDF膜（Millipore）；试剂盒：去内毒素质粒小量提取试剂盒（OMEGA）；质粒DNA普通小量提取试剂盒（Omega）；GelExtractionKit（QIAGEN），ReverTraAce○RqPCRRTKit(TOYOBOFSQ-101)；Lipofectamine3000转染试剂盒（Invitrogen）；DAPI免疫荧光核染色剂（SantaCruz）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（ThermoScientific）、NE-PERNuclearand54 华中科技大学博士学位论文CytoplasmicExtractionKit(Pierce/ThermoScientific)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天）；ECL化学发光检测试剂盒（联科生物）；DMEMbasic培养基、Opti-MEM（Invitrogen）；胎牛血清（Gibco）；胰酶消化液（碧云天）；抗体：Anti-HBx、Anti-HBcAg（SantaCruz）；Anti-HBsAg（Abcam）；Anti-HMGCR、Anti-SREBP-2、Anti-GAPDH（均为Abcam）；Anti-CYP-7α（SantaCruz）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗（CellSignalingTechnology）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗马IgG（Abcam）；TexasRed标记羊抗兔IgG二抗（SantaCruz）。1.4主要溶液配制（1）PBS缓冲液：成分用量备注NaCl8.0gpH调至7.2-7.4KCl0.2g4℃保存Na2HPO4·12H2O3.58g用于细胞培养时，于高温KH2PO40.24g高压进行灭菌，4℃保存ddH2O定容至1000ml（2）0.1%DEPC灭菌水：成分用量备注DEPC原液100μl充分混匀后，通风橱过夜蒸馏水100ml高温高压灭菌，4度保存注：溶液的配制应在通风橱中进行，因DEPC原液含有剧毒。（3）5×TBEDNA电泳缓冲液成分用量备注Tris-base27g室温下保存，使用时稀释为硼酸13.75g0.5×TBE溶液EDTA（0.5M，pH8.0）10mlddH2O定容至500ml55 华中科技大学博士学位论文（4）LB液体培养基成分用量备注NaCl5gpH调至7.0Yeastextract2.5g高温高压灭菌Peptone5g4℃保存ddH2O定容至500ml（5）LA固体培养基成分用量备注NaCl2.5gpH调至7.0Yeastextract1.25g高温高压灭菌Peptone2.5g55-60℃水浴Agarpowder3.75g无菌条件下制备LA平板ddH2O定容至250ml待凝固后4℃避光防潮保存注：本实验中选用的筛选抗生素为氨苄青霉素，需提前配制，-20℃避光保存，使用时1000倍稀释。（6）1×SDS-PAGE电泳缓冲液：成分用量备注Tris-base3.03gSDS较难溶解，可用磁力搅Glycine18.77g拌器进行溶解，溶解后室温SDS1.0g保存。该溶液可重复回收利ddH2O定容至1000ml用3-5次。（7）10%分离胶的配制：8ml体积（两块胶用量）：ddH2O2.16ml，30%Acr-Bis（29:1）2.64ml，1MTris，pH8.83.04ml，10%SDS80μl，10%过硫酸铵80μl，TEMED3.2μl。注：10%分离胶适合分离分子量为20-80KD的蛋白。30%Acr-Bis（29:1）和TEMED溶液4℃避光保存，其余溶液室温保存，使用前，各溶液需先平衡至室温。（8）12%分离胶的配制：56 华中科技大学博士学位论文8ml体积（两块胶用量）：ddH2O1.6ml，30%Acr-Bis（29:1）3.2ml，1MTris，pH8.83.04ml，10%SDS80μl，10%过硫酸铵80μl，TEMED3.2μl。注：12%分离胶适合分离分子量为12-60KD的蛋白。30%Acr-Bis（29:1）和TEMED溶液4℃避光保存，其余溶液室温保存，使用前，各溶液需先平衡至室温。（9）5%浓缩胶缓冲液4ml体积（两块胶用量）：ddH2O2.7ml，30%Acr-Bis（29:1）670μl，1MTris，pH8.8500μl，10%SDS40μl，10%过硫酸铵40μl，TEMED4μl。（10）1×SDS-PAGE转移缓冲液：成分用量备注Tris-base5.8gGlycine2.9gSDS0.37g甲醇200mlddH2O定容至1000ml（11）10×TBS缓冲液：成分用量备注Tris-base12.1g用浓盐酸调节pH值至7.6，NaCl40g室温下保存。使用时，稀释ddH2O定容至1000ml为1×TBS溶液。（12）1×TBST缓冲液：10×TBS溶液100ml加入900mlddH2O中，充分混匀，再向其中加入500μlTween20溶液，混匀，现配现用，4℃保存。（13）5%BSA封闭液：称取5.0gBSA，加入100mlTBST缓冲液中，充分混匀，4℃保存，可重复使用。1.5主要仪器设备高压灭菌器（日本，Sanyo）；数显鼓风干燥箱（上海博讯GZX-9000）超净工作台（苏净集团安泰公司）；电热恒温培养箱（上海智城公司）；全温震荡培养箱（上海智城公司）；普通水浴箱（北京长源）；生物安全柜（苏净集团安泰公司）；振荡57 华中科技大学博士学位论文摇床（上海智城公司）；-20℃中低温冰箱和-80℃超低温冰箱（日本，Sanyo）；制冰机（宁波GrantFM70）；酶标仪（Bio-Rad）；台式高速离心机（美国，Beckman）；CFX96Real-timePCR仪（Bio-Rad）；微波炉（格兰仕）；磁力搅拌器（德国，IKARH-KT/C）；低温高速离心机（美国，ThermoFisherScientific）；4℃冰箱（海尔，西门子和容声）；核酸蛋白分析仪（美国，BeckmanCoulterDU730）；精密调温水浴箱（杭州博日N-20W）；分析天平（MettlerToledoAG285）；光学显微镜（日本，OlympusOptiealCo.,Ltd）；pH计（MettlerToledo）；CFX96Real-timePCR仪（Bio-Rad）；Westernblot半干转转印系统（Bio-Rad）；ChemDocTMXRS化学发光成像系统（Bio-Rad）；电泳仪电源（北京六一厂）；CO2细胞恒温培养箱（HeraeusBB5060）；模块化低氧培养装置（美国，Billups-Rothenberg）。1.6PCR引物序列GenePrimerforreal-timepolymerasechainreactionhSREBP-2Sense:5’-CGTCCACCACCGACAGATGA-3’Antisense:5’-GAAGGCTGGAGACCAGGAAGA-3’hGAPDHSense:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’Antisense:5’GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’2.方法2.1构建HBx、HBs、HBc重组质粒利用pGEM-4Z1.3HBV质粒作为模板，用普通PCR的方法扩增HBx、HBs、HBc编码区全长。三对引物，X1/X2，S1/S2以及C1/C2(X1，5’-agaGAATTCaccATGGCTGCTAGGCTGTACTGCC-3’，X2，5’-TTCGCGGGCCGCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC-3’；S1，5’-aatGAATTCaccATGGGAGGTTGGTCTTCCAA-3’，S2，5’-gggGGATCCTCAAATGTATACCCAAAGAC-3’；C1，5’-gatTCTAGAaccATGCAACTTTTTCACCTCTG-3’，C2，5’-aagGAATTCCTAACATTGAGATTCCCGAG-3’)被用来扩增HBx、HBs和HBc基因，产物大小分别为466bp、1203bp以及639bp。采用DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)进行PCR反应，反应条件：94℃10min；开始循环，94℃热变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，循环34次，72℃终延伸15min。PCR产物经凝胶电泳进行纯化与酶切之后，与表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接，HBx连于EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点、HBs连于58 华中科技大学博士学位论文EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点、HBc连于XbalⅠ/EcoRⅠ酶切位点。连接产物转化于TransStbl3感受态细胞，12-14小时培养后挑取单克隆菌落，采用双酶切的方法初步鉴定重组体并送武汉擎科生物测序，最终成功建立HBx、HBs、HBc重组质粒。具体流程如下：2.1.1PCR扩增HBx、HBs、HBc基因编码区全长（1）反应体系pGEM-4Z1.3HBV质粒1.0μl上游引物1.0μl下游引物1.0μlDreamTaqGreenPCR12.5μlMasterMix(2×)Nuclease-freewater9.5μl（2）PCR反应条件94℃热启动10min；进入循环，94℃热变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，循环34次，72℃终延伸15min；（3）1%琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖粉，溶于100ml0.5×TBE溶液中，再加入少量蒸馏水，防止水分蒸发，放入微波炉高火加热7min，待液体冷却至70-80℃，加入3μlGoldview，摇匀后均匀倒入制胶槽，放置40min左右，凝胶即可凝固；（4）凝胶电泳：将1kbDNAladder与PCR产物点样与琼脂糖凝胶加样孔内，在0.5×TBE溶液中，80V恒压，电泳30-40min。2.1.2PCR产物回收：采用GelExtractionKit（QIAGEN）（1）电泳完毕后将凝胶置于紫外灯下观察，在预测的条带范围处，迅速切胶，尽量切去多余胶块；（2）加入3体积的BufferQB（100μl：100mg）；（3）50℃水浴10min，直至胶块完全溶解，水浴过程中可每隔2-3min，振荡一次，可观察到溶液变黄；59 华中科技大学博士学位论文（4）将离心柱放入收集管中，将溶液转移至离心柱，13000rpm，离心1min，离心柱最大容量800μl，若溶液体积超过800μl，可重复过柱，直至所有液体过柱完毕，每个离心柱总过胶量不超过400mg）；（5）弃废液，推荐向柱子中再加入500μlBufferQB，13000rpm，离心1min；（6）向柱子中分别加入700μlBufferPE，13000rpm，离心1min；（7）弃废液，13000rpm，空甩1min；（8）将离心柱放入干净的1.5mlEP管，加入20μlElutionBuffer，室温静置2-5min，13000rpm，离心1min，弃去离心柱，标记EP管并检测样品浓度，4℃短期保存。2.1.3PCR产物与表达载体的双酶切（1）反应体系：根据预先设定的酶切位点，各限制性内切酶1μl，FastDigestBuffer（10×）2μl，PCR回收产物10μl/pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体1μl，ddH2O分别补足体积至20μl；（2）反应条件：37℃水浴过夜，不要超过16小时。2.1.4酶切产物的纯化与回收（1）1%琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖粉，溶于100ml0.5×TBE溶液中，再加入少量蒸馏水，防止水分蒸发，放入微波炉高火加热7min，待液体冷却至70-80℃，加入3μlGoldview，摇匀后均匀倒入制胶槽，放置40min左右，凝胶即可凝固；（2）凝胶电泳：将1kbDNAladder与PCR产物点样与琼脂糖凝胶加样孔内，在0.5×TBE溶液中，80V恒压，电泳30-40min。（3）酶切产物回收，使用GelExtractionKit（QIAGEN），步骤同上。2.1.5酶连反应60 华中科技大学博士学位论文成分用量反应条件载体酶切大片段载体酶切大片段与插入PCR控温，22℃插入片段片段按摩尔比1:5加入1h，16℃5h，T4Buffer（10×）1μl4℃保存T4Ligase0.4μlNuclease-freewater补足体积至10μl2.1.6连接产物的转化（1）在超净台中取5μl连接产物加入25μlTransStbl3感受态细胞，轻柔混匀，冰浴30min。（2）提前将水浴锅开启至42℃，冰浴后立即转入42℃水浴中热激45秒，快速转移至冰上静置2min。（3）再向其中加入300μlLB培养基（37℃预热），37℃恒温摇床，180rpm，摇菌40min。（4）超净台中将160μl菌液均匀涂在LA固体琼脂板上，将琼脂板正置于37℃恒温培养箱中，待表面菌液被吸收后，将平板倒置培养过夜（约12-14小时），可见单个菌落形成。2.1.7单克隆菌落挑取及细菌鉴定（1）将琼脂板放入超净台中，挑取单个菌落，加入5mlLB液体培养基，充分混匀，再加入1000×氨苄青霉素，混匀，37℃恒温摇床振摇过夜，250rpm×14小时。（2）无菌台中将浑浊菌液取出，加入50%无菌甘油保种，充分混匀后，-80℃保存。（3）另取300μl菌液，送武汉擎科生物测序；（4）剩余菌液进行质粒的提取，采用双酶切进行鉴定。2.1.8普通小量质粒提取采用OMEGAPlasmidMiniKitI，操作步骤如下：（1）将菌液从摇床取出，常温离心10000g，1min；（2）弃去上清，向离心管内分别加入500μlSolutionⅠ（SolutionⅠ需预先加入RNAse酶），充分吹打混匀，尽量避免吹起泡沫；（3）向离心管内加入500μlSolutionⅡ，轻柔上下颠倒混匀，直至溶液呈清亮粘稠状，61 华中科技大学博士学位论文可看到粘丝形成，室温静置2min；（4）再向EP管内加入500ulSolutionⅢ，迅速上下颠倒混匀，可看到呈乳白色沉淀形成；（5）≥13000g，室温离心10min，吸取上清加入吸附柱中（吸附柱放在收集管中），避免吸取下层沉淀，10000g，离心1min，弃去废液，若吸取的上清超过700μl，可重复过柱。（6）取500ulBufferHB加入吸附柱，10000g，离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管；（7）加入700ulDNAWashBuffer，10000g，离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管；（8）再次加入700ulDNAWashBuffer，10000g，离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管；（9）13000g，离心2min，目的是去除吸附柱内残余的DNAWashBuffer；（10）弃去收集管，将吸附柱放入干净的1.5mlEP管中，加入30ulElutionBuffer，室温静置3-5min，13000g，离心1min，所得溶液即为质粒，做好标记，检测浓度，置于4℃短期保存或者-20℃长期保存。2.1.9双酶切鉴定重组质粒：将提取的质粒进行双酶切反应并通过凝胶电泳进行鉴定。操作步骤同前。2.2菌液摇菌和质粒提取超净台中，取30μl保种菌液加入30mlLB液体培养基中，充分混匀，再向其中加入30μl1000×氨苄青霉素，混匀，放入37℃恒温摇床振摇过夜，250rpm×14小时。去内毒素小提质粒，使用OMEGAEndo-freePlasmidMiniKitⅡ试剂盒，步骤如下：（1）实验准备：SolutionⅠ在使用前先加入RnaseA，混匀，置于2-8℃保存；按照说明书在漂洗液DNAWashBuffer中加入无水乙醇；（2）柱平衡步骤：向吸附柱ColumnⅡ（吸附柱放入收集管）加入150μl平衡液GPS，静置3-5min，12000rpm离心2min，弃掉收集液，再空甩1min备用；62 华中科技大学博士学位论文（3）取摇好的菌液5000g，离心10min，充分弃去上清；（4）每管加入500μlSolutionⅠ/RNaseA，充分吹打混匀；（5）将悬液移入新的2ml离心管中，加入500μlSolutionⅡ，轻柔颠倒混匀数次，室温静置2min；（6）加入250μl冰浴BufferN3，轻柔混匀，直到形成白色沉淀物，4℃离心，12000g，10min；（7）轻轻吸取上清放入新的1.5ml离心管中，加入0.1体积ETR（上清：ETR=10:1），上下颠倒混匀，冰浴10min；（8）42℃水浴5min，此时溶液变浑浊，12000g，室温离心3min，ETR变蓝色沉淀；（9）将上清移入新的2ml离心管中，加入0.5体积无水乙醇，轻柔颠倒混匀；（10）取上步液体700μl到ColumnⅡ，10000g，1min离心，弃去收集液；（11）若液体不止700μl，则重复上一步，直至所有液体全部过柱；（12）用500μlBufferHB洗柱子，10000g，1min离心；（13）加700μlDNAWashBuffer，10000g，1min离心；（14）重复上一步（15）弃去收集液，空甩，13000g，3min；（16）将柱子放入新的EP管中，转入无菌台，向滤膜中心滴加120μlEndo-freeElutionBuffer，静置2min，离心13000g，1min，所得液体即为质粒，将所得质粒作好标记，检测浓度及纯度，于-20℃条件下保存。2.3复苏细胞与传代培养复苏细胞：（1）从液氮罐中将HepG2细胞系取出，置于PE手套中，迅速放入37℃水浴锅中，轻柔快速振摇，使其解冻；（2）移入超净台，将细胞液轻柔吹打，缓慢滴入15ml离心管中（加入时倾斜离心管，枪头沿管壁缓慢滴加）；（3）再向其中加入5ml含10%FBS的DMEM培养基（加培养基时，同样倾斜离心管，枪头沿管壁缓慢滴加），轻柔吹打混匀，600rpm，低速离心5min。63 华中科技大学博士学位论文（4）弃去上清，再加入5mlDMEM培养基（含10%FBS），轻柔吹打混匀，尽量将细胞吹打成单个细胞悬液，将细胞悬液转移至小培养瓶中，置于显微镜下观察，作好标记，用75%酒精将瓶口一圈喷洒消毒，放入5%CO2，37℃恒温培养箱中培养。传代培养：HepG2细胞为贴壁细胞，按照贴壁细胞的传代方法。（1）于复苏1-2天后观察细胞，细胞融合度达到90%左右，可以考虑细胞传代。37℃水浴预热胰酶消化液、PBS以及含10%FBS的DMEM培养基；（2）在超净台中吸弃原培养基，加入3mlPBS，静置1-2min；（3）吸弃PBS，加入1ml胰酶消化液，室温或37℃培养箱静置3-5min，轻拍瓶身，细胞从壁上脱落可加入10ml新鲜培养基终止消化；轻柔吹打混匀，使细胞尽量呈单细胞悬液；（4）吸取5ml细胞悬液转移至新的小细胞培养瓶中，75%酒精喷洒瓶口消毒后，放入含5%CO2，37℃恒温培养箱中培养。传代至4-6代可进行实验。2.4HepG2细胞转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒（1）转染前一天铺板：6孔板，每孔铺1×106个细胞；（2）配制稀释的Lipo3000：120μlOpti-MEM+5μlLipo3000，室温静置5min；（3）配制稀释的DNA：pGEM-4Z1.3HBV或者pGEM-4Z质粒2.0ug+4μlP3000TM+120μlOpti-MEM；（4）将上述稀释的Lipo3000和稀释的DNA混匀，室温静置20min；（5）将铺好的细胞板取出，换新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，将上述混合物加入对应细胞孔中，做好标记，喷洒酒精，放入5%CO2,37℃培养中培养。2.5酒精刺激培养转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒的HepG2细胞（1）转染pGEM-4Z1.3HBV/pGEM-4Z质粒的HepG2细胞培养24小时后，取出对应细胞板，按100mM浓度向其中加入无水乙醇（11.3μl/2ml培养基），对照加入相同体积的PBS。（2）取出模块化低氧培养装置，向培养装置底部放入一个装有200ml蒸馏水的玻璃皿，里面加入相当于细胞培养内液2倍浓度的无水乙醇（200mM），将加入无水乙醇的细胞板放入装置，盖上盖子，固定并夹闭O形夹具。64 华中科技大学博士学位论文（3）向装置内充入5%CO2，控制气流速率为20L/min，4min可充满装置，将放入37℃恒温箱，24小时后收取细胞。2.6细胞总RNA的提取，采用Trizol试剂抽提的方法，操作步骤如下：（1）加入Trizol的细胞解冻后再在室温下孵育3min；（2）向其中加入200μl的氯仿，剧烈震荡混匀30s，冰上放置3min；12000g，4℃离心15min；（3）吸取上层液相500μl，至新的EP管中，注意千万不要吸取中间层，以免影响RNA纯度；（4）加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀数次，室温静置10min，12000g，4℃离心15min，RNA沉于管底；（5）尽量弃去上清，防止RNA沉淀丢失，每管加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），充分吹打，弹起漂洗沉淀；（6）8000g，室温离心10min；（7）小心弃去上清，真空干燥RNA沉淀，用适量的DEPC水溶解RNA。2.7逆转录反应（1）核酸蛋白分析仪检测所提取RNA溶液的浓度与纯度，纯度λ260/λ280在1.8-2.0之间为宜。（2）将RNA于65℃水浴5min，而后置于冰上；3）添加反应体系：成分用量RNAtemplate2ug5×RTBuffer4μlRTEnzymeMix1μlPrimerMix1μlNuclease-freeWaterupto20μl（4）逆转录反应：PCR仪控温，在37℃条件下，进行15min逆转录反应；在98℃条件下，进行5min酶失活反应；反应结束后，于-20℃冰箱保存。65 华中科技大学博士学位论文2.8Real-timePCR反应（1）反应体系成分用量cDNA1μl上游引物1μl下游引物1μlRealtimePCRMasterMix-Plus10μlNuclease-freeWater7μl（2）反应条件：95℃预变性3min，进入循环，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，循环40次；65℃-95℃熔解曲线。（3）采用2-△△t法比较各目的基因的相对含量。2.9Westernblot2.9.1HepG2细胞核及胞浆蛋白的提取采用NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagentsKit（Pierce/ThermoScientific）（（2）弃上清，每管加入200μl含蛋白酶抑制剂的冰CERⅠ，轻柔吹打混匀；（3）使用振荡器高速振动15-20s，充分混匀，冰上放置10min；（4）每管加入11μlCERⅡ；（5）高速振动5s，充分混匀后，冰上放置1min；（6）高速振动5s，16000g，4℃离心10min；（7）将上清胞浆蛋白迅速吸入预先冰浴的EP管中，作好标记，分装好备用或者-80℃保存；（8）离心管中剩余沉淀分别加入100μl冰浴的NER（预先加入Cocktail蛋白酶抑制剂），充分混匀后，高速振动15-20s，然后于冰上静置，10min后再振动一次，共重复4次；（9）将EP管放入低温离心机中，16000g，4℃离心10min，将上清核蛋白迅速吸入新的预先冰浴的EP管中，作好标记，分装备用或者-80℃保存。66 华中科技大学博士学位论文2.9.2蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度检测试剂盒（Piece/ThermoScientific）（1）标准品的配制：按照说明书，配制A-H蛋白浓度检测标准品，分装，取一次用量，其余-80℃保存，避免反复冻融；（2）蛋白样本的稀释：将待测蛋白样本于冰上解冻，振动混匀，每个样本分别取10μl加入50μl0.9%生理盐水中，6倍稀释，充分混匀；（3）工作液的配制：A液：B液=50:1，按比例取适量溶液混合；（4）取平底96孔板，每孔加入200μl工作液，加样时应避免气泡的产生；（5）每孔再依次分别加入25μl的标准品（设置复孔）、25μl待测样本（设置复孔）并设置空白孔，避免产生气泡；（6）37℃，避光孵育30min；（7）590nm波长检测样本吸光度，绘制标准曲线，计算样本的蛋白浓度。2.9.3Westernblot（1）清洗玻璃板：先用自来水清洗干净，再用蒸馏水清洗，烤箱内烘干；（2）玻璃板对齐卡紧后置于架子上夹好，确保夹子夹紧以免造成漏胶；（3）灌胶：配制10%分离胶，充分混匀后吸取分离胶溶液沿玻璃板加入，加至液面升至离绿框上沿5mm处即可；缓慢地在胶面上封一层水压胶，加入时注意要轻柔，避免用力过猛造成冲胶，避免产生气泡导致压线不齐。当看到水与分离胶之间出现明显分界线时，说明胶已凝固，再静置5min，待胶充分凝固将水弃去，用吸水纸将水彻底吸干；配制5%的浓缩胶，充分混匀，沿玻璃板灌胶，填满剩余空间，注意避免产生气泡，灌满后垂直插入梳子，凝胶过程中可补胶；（4）蛋白样本上样：将制备好的凝胶板放入电泳槽，向电泳槽及玻璃板内侧内加入电泳缓冲液，垂直向上轻柔缓慢拔出梳子。向待加样的蛋白样本中加入5×蛋白上样缓冲液，充分混匀后，加热煮沸5-10min。用微量加样器分别向加样孔中加入蛋白Marker和蛋白样品，每孔蛋白上样量为20ug。（5）电泳：一般浓缩胶用80V进行恒压电泳，跑至分离胶时可用100V恒压电泳，总时长约为2小时。67 华中科技大学博士学位论文6）半干转转膜：待测目的蛋白分子量在100KD以内，适于半干转方法转膜。准备14张名片大小中性滤纸以及等大的PVDF膜，将中性滤纸放入转移缓冲液中浸泡湿润，取7张充分擀走气泡，放在半干转转印槽最底层，PVDF膜在甲醇溶液中激活至少15s后，用镊子夹取放于滤纸上，擀走气泡，将凝胶板放在转移缓冲液中轻柔撬开，切去浓缩胶以及多余分离胶，将分离胶小心剥下置于PVDF膜上，擀走气泡，最上层再覆盖7层湿润过的中性滤纸，从上至下形成滤纸-胶-膜-滤纸三明治结构，用吸水纸吸干多余的液体，盖上电极板，充分压紧锁住，放入转印抽屉内，设置半干转条件：25V恒压，30min。（7）完成转膜后，将膜按照预测目的条带的位置剪膜，作好标记，放入5%BSA封闭液中封闭1-2小时；配制一抗稀释液（Anti-HBx1:200；Anti-HBs1:500；Anti-HBc1:200；Anti-GAPDH1:10000；Anti-HMGCR1:5000；Anti-SREBP-21:600；Anti-CYP-7α1:1000；），将封闭好的膜放入含一抗稀释液的抗体盒中，膜完全浸入一抗稀释液，4℃，脱色摇床，轻摇过夜。次日，取出PVDF膜，放入TBST溶液中，室温摇床上洗涤3次，每次10min，按照一抗来源配制二抗稀释液，将PVDF膜放入抗体盒使其完全浸入二抗稀释液，室温摇床孵育45min，用镊子小心取出膜，TBST室温摇床洗涤5次，每次10min；（8）化学发光反应：采用ECL化学发光试剂盒（联科生物），配制工作液，A液：B液=1：1，充分混合，将膜放入ChemiDocTMXRS化学发光成像系统中，将配制好的工作液覆盖于膜上，设置曝光条件，进行曝光并分析结果。若需检测多个蛋白分子的表达情况，且目的蛋白大小接近不便于剪膜分离，可用曝光过的膜蒸馏水洗涤5min，加入蛋白一抗二抗去除液，室温摇床10min，TBST洗涤3次，重新封闭进行免疫反应。2.10荧光共聚焦（1）制作细胞爬片，HepG2细胞转染pCDH-HBc/pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP质粒，并用酒精刺激培养，方法同前。（2）酒精刺激24小时后取出细胞板，弃去培养基，置于摇床上，加入PBS缓冲液，轻摇洗涤细胞爬片3次，每次5min；68 华中科技大学博士学位论文（3）将细胞爬片置于冰浴的4%多聚甲醛中固定30min；（4）PBS振洗，5min×3次，再用0.5%Triton-100溶液室温下通透20min；（5）PBS振洗，5min×3次，5%BSA封闭，37℃孵育30min；（6）加入Anti-SREBP-2（1:100）一抗稀释液，放入湿盒，4℃孵育过夜；（7）次日取出，室温复温45min，PBS振洗，5min×3次；（8）加入TexasRed标记的抗兔IgG荧光二抗稀释液（1:100），37℃孵育1小时，从该步骤起，操作均需在避光条件下进行；（9）PBS振洗，5min×3次，DAPI核染色剂染核5min；（10）PBS振洗，5min×4次，加入抗荧光淬封片剂封片，共聚焦显微镜下观察并拍照。2.11LDL摄取实验采用LDLUptakeAssay试剂盒（CellBased）（Abcam）。实验准备：LDL-DylightTM550工作液配制：用细胞培养基1:100稀释LDL-DylightTM550，用0.45μm滤器抽滤备用（现配现用）。（1）取12孔板，HepG2细胞每孔铺1×105个，转染pCDH-HBc或者pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP质粒，并用酒精刺激培养，方法同前。（2）酒精刺激24小时后取出细胞板，弃去培养基，每孔加入200μlLDL-DylightTM550工作液，37℃，孵育16小时。（3）弃去培养基，TBS洗一遍，更换新鲜培养基。（4）540/570nm波长下检测LDL摄取。2.12统计分析计量资料采用均数±标准误表示，用GraphPadPrism5进行统计分析及绘图，多组间的比较采用One-way方差分析的检验方法，p<0.05认为有统计学差异。69 华中科技大学博士学位论文结果1、成功构建pCDH-HBx、pCDH-HBs、pCDH-HBc表达质粒在本实验中，我们利用Primer5软件设计出相对应的引物，成功扩增出HBx、HBs和HBc三种目的基因的编码区全长，对应产物片段大小分别为466bp、1203bp和639bp，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的分析结果显示，产物片段大小与预期相符（如图3-1A、B）。接着，我们将HBx、HBs与HBc三种目的基因分别与pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP表达载体连接，形成pCDH-HBx、pCDH-HBs和pCDH-HBc重组质粒。pCDH-HBx质粒经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切、pCDH-HBs经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切、pCDH-HBc经XbalⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定显示，插入片段大小与预期相符（图3-1C）。将所构建的三种重组质粒送予武汉擎科生物进行测序，反馈的序列结果经过blast分析比对，与GeneBank提供的参考序列一致。为了证明所构建的重组质粒具有生物学表达活性，我们将三种重组质粒以及vector对照质粒分别转染至HepG2细胞，通过Westernblot检测其相应的蛋白表达，结果如图3-1D，转染了相应重组质粒的HepG2细胞分别可以表达相对应的蛋白，而vector对照质粒表达均为阴性。70 华中科技大学博士学位论文图3-1.HBx、HBs、HBc目的基因的PCR扩增和重组质粒的双酶切鉴定及蛋白表达A为HBx基因PCR扩增；B为HBs和HBc基因PCR扩增，lane1-4为HBs基因，lane5-9为HBc基因；C图lane1-3为pCDH-HBx重组质粒，采用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切电泳，lane4-6为pCDH-HBs重组质粒，采用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切电泳，lane7-9为pCDH-HBc重组质粒，采用XbalⅠ/EcoRⅠ双酶切电泳；D为pCDH-HBx、pCDH-HBs和pCDH-HBc的蛋白表达结果。2、HBx/HBs/HBc病毒蛋白对酒精刺激的HepG2细胞胆固醇合成途径的影响前一部分研究中我们已经发现在酒精性肝病合并HBV复制中胆固醇在肝细胞的严重蓄积，其中的一部分原因可能是胆固醇合成途径的上调，为了进一步探究其上调的机制，我们将HBV的三种重要的病毒蛋白HBx、HBs和HBc分别转入HepG2细胞，在酒精共刺激的条件下观察胆固醇合成相关分子的变化情况。如图3-2A所示，我们将三种病毒蛋白分别转入HepG2细胞后，在酒精共刺激条件下培养，发现转入HBc蛋白的HepG2细胞SREBP-2在mRNA水平明显增加，相较于单独转染HBc组（p<0.05）、单独酒精刺激组（p<0.001）以及vector对照组（p<0.01）。而转入HBx和HBs蛋白的HepG2细胞SREBP-2的表达水平与其他组别并无统计学差异。进一步，我们检测了转入HBc蛋白的HepG2细胞核SREBP-2在蛋白水平的表达，发现HBc蛋白过表达合并酒精共刺激能够显著上调细胞核SREBP-2在蛋白水平的表达（图3-2B）。为了进一步探讨HBc蛋白与酒精共刺激对SREBP-2活化的影响，我们进行了共聚焦实验，结果显示，在HBc蛋白与酒精共刺激的作用下，SREBP-2的入核明显增强（图3-2C）。同时，我们检测了SREBP-2下游分子HMGCR的表达，发现其在合并组同样显著增强（图3-2D），进一步提示HBc蛋白在参与胆71 华中科技大学博士学位论文固醇合成调节中的重要作用。ABC72 华中科技大学博士学位论文DE图3-2.HBx/HBs/HBc病毒蛋白对酒精刺激的HepG2细胞胆固醇代谢的影响A图为分别转染pCDH-HBx、pCDH-HBs和pCDH-HBc质粒至酒精刺激的HepG2细胞各组SREBP-2在mRNA水平的表达情况，由三次独立重复实验统计而得；B图为转染pCDH-HBc质粒至酒精刺激的HepG2细胞核SREBP-2蛋白水平的表达情况；C图为共聚焦检测SREBP-2在细胞核的表达；D图为转染pCDH-HBc质粒至酒精刺激的HepG2细胞HMGCR和CYP-7α的表达；E图为转染pCDH-HBc质粒至酒精刺激的HepG2细胞LDL摄取情况（每组n=6）。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。73 华中科技大学博士学位论文图3-3.酒精性脂肪肝合并HBV肝内复制对胆固醇代谢途径的影响3、HBc蛋白合并酒精刺激协同抑制HepG2细胞胆固醇降解途径导致胆固醇在细胞的蓄积除了胆固醇的合成途径增加之外，其降解途径的减少也是重要的因素之一。因此我们除了对胆固醇的合成途径相关分子进行检测，同时也分析了其降解途径的相关分子。我们将HBc蛋白转入酒精共刺激的HepG2进行培养，检测CYP-7α的表达情况，如图3-2D所示，其蛋白表达明显减少，说明HBc过表达合并酒精刺激能够下调CYP-7α的表达，从而抑制胆固醇的降解途径。4、HBc蛋白对酒精刺激的HepG2细胞胆固醇摄取途径的影响在上一部分中，我们观察到饮酒合并HBV持续复制对LDLR的表达有下调作用从而影响肝脏对LDL的摄取，导致小鼠血清LDL水平增高。因此在本部分我们也观察了HBc蛋白合并酒精刺激对LDL摄取的影响。我们向转染了HBc蛋白合并酒精刺激的HepG2细胞中加入荧光标记的LDL，孵育过后于荧光显微镜下观察，发现HBc蛋白表达合并酒精刺激显著减少HepG2细胞对LDL的摄取（图3-2E）。这一结果提示，HBc蛋白参与了酒精刺激的肝细胞胆固醇摄取的改变。讨论目前，关于核心蛋白对代谢的研究主要热点集中在HCV，许多研究显示，HCV核心蛋白在肝脏脂肪变中起着重要作用。有研究发现，在HCV核心蛋白稳定表达的74 华中科技大学博士学位论文转基因小鼠肝脏中观察到明显的肝细胞脂肪变性，脂肪变性的程度随着小鼠的年龄随之加重，而非转基因小鼠肝脏未观察到这种病理改变，同时两组小鼠血清总甘油三酯及胆固醇水平无差异，提示HCV核心蛋白可能对诱发肝脏脂肪变有直接作用[10]。关于HCV核心蛋白引起肝细胞脂肪变的机制研究者们也进行了许多研究。基因3a型HCV核心蛋白可以通过PI3K-AKt-2途径增强SREBP-1的活性[11,12]，SREBP-1主要调节肝脏甘油三酯的合成；同时还有研究者在HCV核心蛋白转基因小鼠中发现肝细胞PPARα的下调，导致脂肪酸的氧化代谢受到抑制[12]；HCV核心蛋白也能作用于RXRα影响脂肪酸的合成，RXRα是肝脏的一种核转录因子，可以调节细胞的增殖分化以及脂质代谢。HCV通过与RXRα结合，激活该受体，从而诱导甘油三酯的合成增加[13]；另外，HCV核心蛋白还能上调SREBP-2、HMGCR、HMGCS等胆固醇合成相关基因，使肝细胞内胆固醇增多[14,15]，这一改变可能是由于SIRT1-AMPK途径收到抑制[16]；还有研究发现，基因3a型HCV核心蛋白依赖鞘脂类的合成机制可以增加细胞胆固醇酯的含量[17]。在HBV感染中，目前发现HBx蛋白与代谢的关系密切[2-8]，而关于HBc与代谢的关系研究报道相对较少。有研究者发现，将HBc转染HepG2细胞，通过代谢组学分析发现能够上调糖酵解途径以及氨基酸代谢[18]；另外还有报道显示HepG2.2.15细胞ApoA5的表达水平明显减少，并发现是由于HBc基因抑制了ApoA5的启动子活性从而导致其表达下调[19]。本研究在前一部分小鼠模型及体外实验中发现酒精合并HBV导致胆固醇在肝细胞蓄积的基础上进一步探究了其可能的机制，结果发现可能是HBc蛋白而不是HBx或者HBs蛋白在其中起到重要的作用。HBc的过表达可以显著上调酒精刺激的HepG2细胞SREBP-2的表达，使其入核明显增强，进而诱导下游HMGCR的表达上调,同时下调胆固醇降解途径的相关基因水平（CYP-7α）,另外HBc的过表达也能明显抑制酒精刺激的HepG2细胞对LDL的摄取。由此，我们得出的结论是酒精性脂肪肝合并HBV复制能够引起胆固醇在肝脏的蓄积，这一改变是通过SREBP-2/HMGCR途径上调胆固醇的合成同时通过下调CYP-7α减少胆固醇的降解，此外，细胞对LDL摄取受到抑制，HBc蛋白可能对这种改变具有直接的影响作用（图3-3）。75 华中科技大学博士学位论文参考文献1.MichaelN.HBVcccDNA:viralpersistencereservoirandkeyobstacleforacureofchronichepatitisB[J].Gut2015;0:1-13.2.LingQ,QiW,XinyaL,etal.SREBP-1aactivationbyHBxandtheeffectonhepatitisBvirus[J].BiochemBiophyResCom2013;432:643-649.3.KimK,KimKH,KimHH,etal.HepatitisBvirusXproteininduceslipogenictranscriptionfactorSREBP1andfattyacidsynthasethroughtheactivationofnuclearreceptorLXRalpha[J].BiochemJ2008;416:219-230.4.KimKH,ShinHJ,KimK,etal.HepatitisBvirusXproteininduceshepaticsteatosisviatranscriptionalactivationofSREBP1andPPARgamma[J].Gastroenterology2007;132:1955-1967.5.HongmingL,GuiyuL,ChongyiL,etal.HBxinhibitsCYP2E1geneexpressionviadownregulatingHNF-4αinhumanhepatomacells[J].PLoSOne2014;e107913.6.WuYL,PengXE,ZhuYB,etal.HepatitisBVirusXProteinInducesHepaticSteatosisbyEnhancingtheExpressionofLiverFattyAcidBindingProtein[J].JVirol2016;90:1729-1740.7.ShinHJ,ParkYH,KimSU,etal.HepatitisBvirusXproteinregulateshepaticglucosehomeostasisviaactivationofinduciblenitricoxidesynthase[J].JBiolChem2011;286:29872-29881.8．LiuB,FangM,HeZ,etal.HepatitisBvirusstimulatesG6PDexpressionthroughHBx-mediatedNrf2activation[J].CellDeathDis2015;6:e1980.9.OehlerN,VolzT,BhadraOD,etal.BindingofhepatitisBvirustoitscellularreceptoralterstheexpressionprofileofgenesofbileacidmetabolism[J].Hepatology2014;60:1483-1493.10.KoikeK.HepatitisCviruscontributestohepatocarcinogenesisbymodulatingmetabolicandintracellularsignalingpathways[J].JGastroenterolHepatol2007;22Suppl1:S108-111.76 华中科技大学博士学位论文11.Jackel-CramC,QiaoL,XiangZ,etal.HepatitisCvirusgenotype-3acoreproteinenhancessterolregulatoryelement-bindingprotein-1activitythroughthephosphoinositide3-kinase-Akt-2pathway[J].JGenVirol2010;91:1388-1395.12.WarisG,FelmleeDJ,NegroF,etal.HepatitisCvirusinducesproteolyticcleavageofsterolregulatoryelementbindingproteinsandstimulatestheirphosphorylationviaoxidativestress[J].JVirol2007;81:8122-8130.13TsutsumiT,SuzukiT,ShimoikeT,etal.InteractionofhepatitisCviruscoreproteinwithretinoidXreceptoralphamodulatesitstranscriptionactivity[J].Hepatology2002;35:937-946.14.LiM,WangQ,LiuSA,etal.MicroRNA-185-5pmediatesregulationofSREBP-2expressionbyhepatitisCviruscoreprotein[J].WorldJGastroenterol2015;21:4517-4525.15.ChangML,YehCT,ChenJC,etal.AlteredexpressionpatternsoflipidmetabolismgenesinananimalmodelofHCVcore-related,nonbese,modesthepaticsteatosis[J].BMCGenomics2008;9:109.16.YuJW,SunLJ,LiuW,etal.HepatitisCviruscoreproteininduceshepaticmetabolismdisordersthroughdown-regulationoftheSIRT1-AMPKsignalingpathway[J].IntJInfectDis2013;17:e539-545.17.Loizides-MangoldU,ClementS,Alfonso-GarciaA,etal.HCV3acoreproteinincreaseslipiddropletcholesterylestercontentviaamechanismdependentonsphingolipidbiosynthesis[J].PLoSOne2014;9:e115309.18.XieQ,FanF,WeiW,etal.Multi-omicsanalysesrevealmetabolicalterationsregulatedbyhepatitisBviruscoreproteininhepatocellularcarcinomacells[J].SciRep2017;7:41089.19.ZhuC,GaoG,SongH,etal.HepatitisBvirusinhibitsapolipoproteinA5expressionthroughitscoregene[J].LipidsHealthDis2016;15:178.77 华中科技大学博士学位论文综述ALD合并病毒性肝炎的研究进展王亚琦综述宁琴审校摘要：酒精性肝病和病毒性肝炎是慢性肝脏疾病的常见病因，慢性饮酒可能加速病毒性肝炎的疾病进展及预后，目前针对酒精性肝病合并病毒性肝炎的研究已成为肝病领域的热点。本文将对酒精性肝病合并肝炎病毒感染的研究进展进行综述。关键词：酒精；HBV；HCV肝炎病毒感染是全球公认的严重危害公共健康的传染病之一，其中，以乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）和丙型病毒肝炎（HepatitisCVirus，HCV）最为常见。全世界约有20亿人被证明曾经感染过HBV，全球慢性HBV感染患者目前至少有3.5亿[1]；而全球HCV的感染率约为2.8%，大约有1.85亿人感染HCV[2,3]。全球每年由HBV感染导致的死亡病例约为65万人[4]，而死于HCV感染相关疾病的患者每年约有50万[5]。我国是肝炎病毒感染的高发地区，全国约1亿人是HBV携带者，其中有2000万人为慢性乙肝患者[6]，而HCV在我国的流行率约为0.43%[7]。肝炎病毒感染能引起多种肝损害，包括急慢性病毒性肝炎，甚至与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。酒精性肝病（Alcoholicliverdisease，ALD）是由长期过量饮酒所致的一种常见的慢性肝脏疾病，全球死亡率约为0.9%[8]，近年来，随着社会经济的增长，人们生活水平的提高，饮食习惯的改变，酒精饮品的生产与消耗在我国快速增长，由酒精所导致肝损伤的发病率亦逐年攀升，约占我国肝脏疾病的14.8%[9]。由于ALD和肝炎病毒感染的高度流行，病毒性肝炎合并ALD的患者也在不断增多。过量的酒精消耗会加速慢性病毒性肝炎的自然病程，患者更容易发生重症化及引起癌变，因此关于ALD合并病毒性肝炎的相关研究具有十分重要的临床意义。一、饮酒合并病毒性肝炎的流行病学一项来自美国疾病预防控制中心的数据显示，ALD合并HCV约占西方国家肝脏疾病的15%，而ALD合并HBV约占5%左右[10]，这可能是由于西方国家以HCV感染高发，HBV感染的患者相对较少。在我国尚未见关于ALD合并肝炎病毒感染的流行病学调查，但是有地方性散在报道，且存在着一定的地区性差异，沈阳地区ALD78 华中科技大学博士学位论文合并HBV感染约占肝损伤疾病的12.9%，重庆地区为18.45%，而吉林地区则高达28.3%；ALD合并HCV在我国发病率相对较低，沈阳地区约为2.3%，重庆地区为0.12%，吉林地区为3.4%[11]。二、酒精对肝炎病毒复制的影响诸多证据显示，酒精能够显著刺激肝炎病毒的复制与基因表达。早在二十年前就有研究发现酒精暴露能明显上调HBV-DNA稳定表达的细胞的HBsAg水平，且明显的时间-剂量依赖关系，即随着酒精浓度增高，暴露时间延长，细胞表达的HBsAg水平也在增高[12]。LarkinJ等在HBV转基因小鼠中发现慢性饮酒能明显上调小鼠血清中HBV-DNA的病毒载量和HBsAg的滴度，同时还能增加HBV在肝脏的转录[13]。酒精影响HBV病毒复制的机制有多种。有研究发现CYP-2E1和氧化应激（ROS）的增强能够上调HBV的转录水平，导致HBV复制增强，而酒精刺激能诱导CYP2E1的表达增加[14]；Chen等在酒精诱导的脂肪肝小鼠中观察到C/EBP的显著表达[15]，C/EBP是一种核转录因子，对HBV病毒基因的转录有显著的促进作用。同样，在酒精对HCV病毒复制的影响中，Pessione等研究发现HCV患者血清HCV-RNA随着其酒精摄入量的增加也呈现剂量依赖增长[16]。关于其机制，有学者认为HCV的清除依赖机体自身的免疫，HCV进入机体被抗原提成细胞，树突状细胞（Dendriticcells,DCs）识别从而提呈给CD4+和CD8+T细胞，CD4+和CD8+T细胞特异性杀伤被感染的细胞，然而慢性饮酒导致全身免疫反应受到抑制，当合并HCV感染时，酒精对HCV核心和非结构蛋白的免疫反应降低，导致DC成熟障碍[17]，进而使病毒抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的形成受到抑制[18]，使病毒难以清除。三、饮酒合并病毒性肝炎对肝损伤的影响（一）、饮酒对乙型肝炎肝损伤的影响饮酒和病毒性肝炎感染都是引起肝损伤的危险因素。长期过量饮酒本身就能引起肝功能异常，而在慢性病毒性肝炎感染的基础上过量饮酒会对肝脏造成更为严重的肝损伤。Mota[19]等对298例慢乙肝患者进行研究发现，合并饮酒的患者其肝脏Child分级更差，肝功能损伤更为严重。还有一些研究表明，酒精摄入合并HBV感染是进展为肝硬化的风险因素[20]。另外，大量研究显示，过量饮酒使HBV感染患者发生79 华中科技大学博士学位论文肝细胞癌的发病率明显增加[21-23]。而其具体机制尚不明确。（二）、饮酒对丙型肝炎肝损伤的影响有研究显示，在嗜酒患者中，HCV感染阳性率与肝脏疾病的严重程度呈正相关[24]，同时也有证据表明，HCV与过量饮酒能协同加速肝脏疾病的进程，从而导致肝硬化的发生。一项纳入超过2000名HCV患者的研究显示，若患者每天摄入酒精超过50g，那么其肝纤维化的进展显著加快[25]，由Roudot等[26]进行的一项类似研究同样表明，肝硬化的流行率在HCV合并饮酒的患者中显著增高。另外，HCV合并过量饮酒还能使肝癌（HCC）发生的风险显著提升。有研究报道，如果每日酒精摄取量超过80g，那么发生HCC的风险将增长5倍，单因素HCV感染会使HCC发生的风险增加20倍，而HCV感染与过量饮酒合并，发生HCC的风险将会增长100倍[10]。来自印度的一项研究发现HCC发病OR(95％CI)在HCV-RNA（+）组为5.45(2.02-14.71)，重度饮酒组为2.83(1.51-5.28)，而在HCV-RNA（+）合并重度饮酒组OR值为7.33(1.02-61.04)，协同作用指数是1.257，这一结果提示HCV合并大量饮酒对HCC的发病有协同作用[27]。关于酒精加重HCV感染肝损伤的机制，一部分学者认为活性氧（ROS）的产生在其中起到重要作用。活性氧的形成在ALD及HCV的病理过程中均是标志性的物质，尽管两种疾病中活性氧形成的机制不同，但其下游事件几乎是相同的，如羟自由基的产生和脂质过氧化的产生，从而导致肝细胞氧化应激损伤。HCV核心蛋白和NS5A能够直接诱导活性氧的产生，也能间接通过线粒体损伤诱导活性氧的产生[28,29]。慢性饮酒可以使CYP2E1表达增加，从而活化ROS，因此饮酒合并HCV协同增加肝脏ROS的生成，加重肝脏的炎症损伤。也有研究发现TLR4在HCV合并饮酒诱导的肝细胞癌中发挥重要作用。由于长期饮酒，肠道通透性发生改变，大量菌群移位，导致LPS刺激上调TLR4的表达，另一方面，在HVB非结构蛋白NS5A转基因小鼠中也观察到TLR4的表达增加，其与慢性饮酒协同作用导致肝损伤的加重[30]。另外，肝细胞铁超载可能也是酒精加重HCV感染肝损伤的机制之一。铁是一种肝毒性物质，在慢性饮酒的过程中，酒精刺激肝脏转铁蛋白增加，从而诱导肝脏对铁的摄取增多[31]。ALD合并HCV感染时，酒精刺激使感染细胞凋亡的过程中，也会出现铁超载80 华中科技大学博士学位论文的现象[32]导致肝损伤的加重。四、饮酒合并病毒性肝炎对抗病毒治疗的影响饮酒不仅会影响病毒性肝炎的疾病进程，还可能影响病毒感染抗病毒治疗的效果。然而，在酒精对HBV及HCV抗病毒治疗的影响中，研究结果不尽相同。在一项饮酒对慢乙肝初治患者恩替卡韦抗病毒治疗的疗效影响研究中，结果显示饮酒与否对血清HBV-DNA阴转率并无影响[33]。而在HCV的研究中，许多结果显示，饮酒影响了干扰素对HCV的抗病毒应答。Chang等研究发现，每日饮酒量超过30g，可能导致利巴韦林联合长效干扰素抗病毒治疗失败[34]。也有学者研究认为，饮酒对HCV干扰素治疗应答效果降低是由于患者依从性差导致[35]。而在最近的一项DAA药物治疗HCV的研究中，研究者发现，患者饮酒量对DAA药物的持续应答率并没有影响[36]。总之，长期大量饮酒和病毒肝炎感染都是导致慢性肝病的重要因素，临床上常常合并存在。长期大量饮酒不仅促进肝炎病毒的复制，加重肝脏损伤，恶化肝脏疾病的进程甚至导致肝癌发病的风险增加，同时长期饮酒导致病毒性肝炎抗病毒治疗疗效降低。然而，目前仍有很多问题尚未明确，尤其是慢性饮酒合并HBV的研究，亟待研究者们继续努力。81 华中科技大学博士学位论文参考文献1.LiawYF,ChuCM.HepatitisBvirusinfection[J].Lancet2009;373(9663):582-592.2.MohdHanafihaK,GroegerJ,FlaxmanAD,etal.GlobalepidemiologyofhepatitisCvirusinfection:newestimatesofage-specificantibodytoHCVseroprevalence[J].Hepatology2013;57(4):1333-1342.3.LavanchyD.TheglobalburdenofhepatitisC[J].LiverInt2009;29(Suppl):74-81.4.LozanoR,NaghaviM,ForemanK,etal.Globalandregionalmortalityfrom235causesofdeathfor20agegroupsin1990and2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancet2012;380:2095-2128.5.AaronPThrift,HashemBEl-Serag,FasihaKanwal.GlobalepidemiologyandburdenofHCVinfectionandHCV-relateddisease[J].NatResGastroenterolHepatol2017;14:122-132.6.中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[J].中华肝脏病杂志,2015,7（3）：1-18.7.中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.丙型肝炎防治指南（2015年版）[J].中华肝脏病杂志,2015,23（12）：906-923.8.RehmJ,SamokhvalovAV,ShieldKD.Globalburdenofalcoholicliverdisease[J].JHepatol2013;59:160-168.9.WangFS,FanJG,ZhangZ,etal.Theglobalburdenofliverdisease:ThemajorimpactofChina[J].Hepatology2014;60:2099-2108.10.SebastianM,GundaM,HelmutKS.AlcoholicliverdiseaseandhepatitisC:Afrequentlyunderestimatedcombination[J].WorldJGastroenterol2009;15(28):3462-3471.11.孟晓丹,向国卿,贺小虎等.178例肝硬化病因及临床特点分析[J].世界华人消化杂82 华中科技大学博士学位论文志,2008;16:1880-1884.12.NathalieGC,DinaK,FlorianneG,etal.EffectsofethanolonhepatitisBvirusPre-S/SgeneexpressioninthehumanhepatocellularcarcinomaderivedHepG2hepatitisBDNApositivecellline[J].JHepatol1995;23:153-159.13.JonathanL,MarciaMC,JieL.ChronicethanolconsumptionstimulateshepatitisBvirusgeneexpressionandreplicationintransgenicmice[J].Hepatology2001;34:792-797.14.MinBY,KimNY,JangES,etal.EthanolpotentiateshepatitisBvirusreplicationthroughoxidativestress-dependentand-independenttranscriptionalactivation[J].BiochemBiophyResCom2013;431:92-97.15.ChenYH,YangCM,ChangSP,etal.C/EBPbetaandC/EBPdeltaexpressioniselevatedintheearlyphaseofethanol-inducedhepatosteatosisinmice[J].ActaPharmacolSin2009;30:1138-1143.16.PessioneF,DegosF,MarcellinP,etal.EffectofalcoholconsumptiononserumhepatitisCvirusRNAandhistologicallesionsinchronichepatitisC[J].Hepatology1998;27:1717-1722.17.AlomanC,GehringS,WintermeyerP,eta.ChronicalcoholconsumptionimpairscellularimmuneresponsesagainstHCVNS5proteinduetodendriticcelldysfunction[J]．Gastroenterology2007;132(2):698-708．18.SzaboG,WandsJR,EkenAhmet,etal.AlcoholandHepatitisCvirus-Interactionsinimmunedysfunctionsandliverdamage[J].AlcoholClinExpRes2010;34:1675-1686.19.MotaA,GuedesF,AreiasJ,etal.AlcoholconsumptionamongpatientswithhepatitisBinfectioninnorthernPortugalconsideringgenderandhepatitisBvirusgenotypedifferences[J].Alcohol2010;44:149-156.20.StroffoliniT,CottocelliG,MeddaE,etal.Interactionofalcoholintakeandcofactorsontheriskofcirrhosis[J].LiverInt2010;30:867-870.83 华中科技大学博士学位论文21.YotsuyanaqiH,HashidumeK,SuzukiM,etal.RoleofhepatitisBvirusinhepatocarcinogenesisinalcoholics[J].AlcoholClinExpRes2004;28:181S-185S.22.FranceschiS,MontellaM,PoleselJ,etal.Hepatitisviruses,alcohol,andtobaccointheetiologyofhepatocellularcarcinomainItaly[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev2006;15:683-689.23.LinCW,LinCC,MoLR,etal.HeavyalcoholconsumptionincreasestheincidenceofhepatocelluarcarcinomainhepatitisBvirus-relatedcirrhosis[J].JHepatol2013;58:730-735.24.HutchinsonSJ,BirdSM,GoldbergDJ.InfluenceofalcoholontheprogressionofhepatitisCvirusinfection:ameta-analysis[J].ClinGastroenterolHepatol.2005;3:1150–1159.25.PoynardT,BedossaP,OpolonP.NaturalhistoryofliverfibrosisprogressioninpatientswithchronichepatitisC.TheOBSVIRC,METAVIR,CLINIVIR,andDOSVIRCgroups[J].Lancet1997;349:825-832.26.Roudot-ThoravalF,BastieA,PawlotskyJM,etal.EpidemiologicalfactorsaffectingtheseverityofhepatitisCvirus-relatedliverdisease:aFrenchsurveyof6,664patients.TheStudyGroupforthePrevalenceandtheEpidemiologyofHepatitisCVirus[J].Hepatology1997;26:485-490.27.KumarM,KumarR,HissarSS,eta1.Riskfactorsanalysisforhepatocellularcarcinomainpatientswithandwithoutcirrhosis：Acase-controlstudyof213hepatocellularcarcinomapatientsfromIndia[J]．Hepatology2007;22(7):1104-1111.28.OkudaM,LiK,BeardMR,etal.Mitochondrialinjury,oxidativestress,andantioxidantgeneexpressionareinducedbyhepatitisCviruscoreprotein[J].Gastroenterol2002;122:366-375.84 华中科技大学博士学位论文29.GongG,WarisG,TanveerR,etal.HumanhepatitisCvirusNS5Aproteinaltersintracellularcalciumlevels,indecesoxidativestress,andactivatesSTAT-3andNF-κB[J].ProcNatlAcadSci2001;98:9599-9604.30.MachidaK,TsukamotoH,MkrtchyanH,etal.Toll-likereceptor4mediatessynergismbetweenalcoholandHCVinhepaticoncogenesisinvolvingstemcellmarkerNanog[J].ProcNatlAcadSci2009;106:1548-1553.31.KohgoY,OhtakeT,IkutaK,etal.Ironaccumulationinalcoholicliverdiseases[J].AlcoholClinExpRes2005;29:189S-193S.32.PiankoS，PatellaS，SievertW．AlcoholconsumptioninduceshepatocyteapoptosisinpatientswithchronichepatitisCinfection[J].JGastroenterolHepatol2000;15(7):798-805．33.ChungWG,KimHJ,ChoeYG,etal.Clinicalimpactsofhazardousalcoholuseandobesityontheoutcomeofentecavirtherapyintreatment-naïvepatientswithchronichepatitisBinfection[J].ClinMolHepatol2012;18:195-202.34.ChangA,SkoleK,GautamM,eta1.TheimpactofpastalcoholuseontreatmentresponseratesinpatientswithchronichepatitisC[J].AlimentPharmacolTher2005;22(8):701-706.35.AnandBS,CurrieS,DieperinkE,etal.AlcoholuseandtreatmentofhepatitisCvirus:resultsofanationalmulticenterstudy[J].Gastroenterology2006;130:1607-1616.36.TsuJI,WilliamsEC,GreenPK,etal.AlcoholuseandhepatitisCvirustreatmentoutcomesamongpatientsreceivingdirectantiviralagents[J].DrugAlcoholDepand2016;169:101-109.85 华中科技大学博士学位论文主要缩略词中英文对照表英文缩写英文全称中文ALDAlcoholicliverdisease酒精性脂肪肝AHAlcoholicsteatohepatitis酒精性脂肪性肝炎HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒HCVHepatitisCvirus丙型肝炎病毒HCCHepatocellularcarcinoma原发性肝细胞癌HBsAgHepatitisBsurfaceantigen乙肝病毒表面抗原HBcAgHepatitisBcoreantigen乙型肝炎核心抗原HBxHepatitisBvirusXprotein乙型肝炎病毒X蛋白ALTAlanineaminotransferase谷丙转氨酶TGTriglyceride甘油三酯ASTAspartateaminotransferase谷草转氨酶TCTotalcholesterol总胆固醇HDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白LDLLowdensitylipoprotein低密度脂蛋白PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PVDFPolyvinylidenedefluoride聚偏氟乙烯FBSFatalbovineserun胎牛血清BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜TEMEDN,N,N,N-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺SREBP-2Sterolregulatory固醇调节元件结合蛋白2element-bindingprotein2HMGCR3-hydroxy-3-methylglutaryl羟甲基戊二酸还原酶coenzymeAreductase86 华中科技大学博士学位论文LDLRLowdensitylipoproteinreceptor低密度脂蛋白受体CYP-7αCholesterol7alpha-hydroxylase胆固醇7α羟化酶PCSK9Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9枯草溶菌素转化酶9CYP-27ASterol27hydroxylase胆固醇27羟化酶ACAT2AcylcoenzymeA-cholesterol酰基辅酶A-胆固醇酰基转Acyltransferase移酶2LALLysosomalacidlipase溶酶体酸性脂肪酶nCEHNeutralcholesterolesterhydrolase中性胆固醇酯水解酶ABCA1ATP-bindingcassettetransporterA1ATP结合盒转运体A1ABCG1ATP-bindingcassettetransporterG1ATP结合盒转运体G1ABCG5ATP-bindingcassettetransporterG5ATP结合盒转运体G5ABCG8ATP-bindingcassettetransporterG8ATP结合盒转运体G887 华中科技大学博士学位论文附录攻读博士学位期间已发表和拟发表论文1.YaqiWang,TingWu,DanqingHu,XinxinWeng,XiaojingWang,Pei-JerChen,XiaopingLuo,HongwuWangandQinNing.IntracellularhepatitisBvirusincreaseshepaticcholesteroldepositioninalcoholicfattyliverviahepatitis.JLipidRes.2018;59(1):58-68.2.HWang,JQi,LLi,TWu,YWangandQNing.InhibitoryeffectsofChikusetsusaponinIVaonlipopolysaccharide-inducedproinflammatoryresponsesinTHP-1cells.InternationalJournalofImmunopathologyandPharmacology.2015;28(3):308-317.3.WangHW,WuT,QiJY,WangYQ,LuoXP,NingQ.SalidrosideattenuatesLPS-stimulatedactivationofTHP-1cell-derivedmacrophagesthroughdown-regulationofMAPK/NF-kBsignalingpathways.JournalofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,2014；33(4):pp463-469.4.李兰，王亚琦，王洪武，孙颖，黄加权，范翔雪，宁琴.血吸虫病肝纤维化小鼠中肝星状细胞迁移功能改变的实验研究.中华临床医师杂志，2014；10：1894-1899.专利乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法.宁琴，罗小平，王洪武，吴婷，王亚琦，王晓晶，习东，严伟明，陈培哲，黄丽华.CN104721238A.国际会议摘要接收1.HBVreplicationincreasescholesterolsviaup-regulationofSREBP-2/HMGCRanddown-regulationofCYP-7αinalcoholicfattylivermice.AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases（AASLD）,Boston,2016Nov.2.ChronicalcoholconsumptioncombinedwithhepatitisBvirusdisruptscholesterolhomeostasisinmice.TheAsianPacificAssociationfortheStudyoftheLiver(APASL),Shanghai,2017Feb.获奖论文《酒精性脂肪肝合并HBV对肝脏胆固醇代谢的叠加影响》获得中华医学会88 华中科技大学博士学位论文第十八次全国病毒性肝炎及肝病学术会议暨2017年中华医学会感染病学分会年会、中华医学会肝病学分会年会优秀论文二等奖。89 华中科技大学博士学位论文致谢在这春暖花开，落樱缤纷的季节，我终于顺利完成了学业。五年研究路漫漫，这一路上有困难有险阻，有欢笑有泪水，但更多的是积累与收获，成长与感恩。首先，我要衷心感谢的是我的导师宁琴教授，感谢您五年来您对我生活无微不至的关怀，对我的研究工作的悉心指导。您对科学研究的严谨态度，对科技前沿的创新尝试，无不鞭策着我不断向前；您高贵优雅的个人气质，乐观向上，充满激情的生活态度，敏捷的思维，渊博的知识，无不吸引着我不断向您看齐，您不仅我的导师更是我人生之路的榜样！感谢同济医院儿科罗小平教授对本研究的支持与帮助！感谢组长王洪武老师，您总是为我带来好的建议，不遗余力地指导与帮助我的研究工作，为我的研究之路减少许多弯路，并不断鼓励我激励我鞭策我，使我能够顺利完成研究工作，谢谢！感谢感染性疾病研究胡锦裳老师，严伟明老师，习东老师，万小洋老师，王晓晶老师，韩梅芳教授，陈韬老师对我工作的支持与指导！感谢感染科齐俊英教授、赵西平教授、宋建新教授、黄加权教授、郭威老师、马科老师、丁红芳老师等对我临床知识学习给予的指导和帮助！感谢吴婷师姐，余海静师姐，张小平师姐，肖芳，姜群群、杨沐阳、翁鑫鑫、胡丹青、胡军剑、吴文煜等各位师兄师姐师弟师妹对我实验各个阶段提供的建议和帮助。最后感谢我的爸爸妈妈一直以来没有催婚，一直默默支持我的学业！感谢相遇！感恩有你们！90 ＊华中科技大学学位评定委员会办公室印制