菊花抗白色锈病相关基因的表达分析

《菊花抗白色锈病相关基因的表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

人ｉｔ诼龙臂４碛士＃住怜式菊花抗白色锈病相关基因的表达分析研宄生：吕盛金指导教师：毛洪玉专业名称：风景园林学研究方向：园林植物栽培与应用所在学院：林学院２０１８年６月１２日 DissertationforMasterStudyonexpressionanalysisofgenesrelatedtowhiterustresistanceofChrysanthemumCandidate：LvShengjinSupervisor：Prof.MaoHongyuSpeciality：LandscapeArchitectureResearchField：LandscapePlantGermplasmandBreedingShenyangAgriculturalUniversityJune,2018 独创性声明。尽我所知本人声明本论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的成果，除了文中特别标注和致谢提到之处外，本论文不包含其他人的研究成果和己经发表的文字表述，也不包含本人或他人为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位、证书等而使用过的材料。本论文对与我同工作的同志为本研究所做的贡献均已做了说明并达了诚挚的谢意。．．表研究生签名时间：《年＆月访（导师签名、：时间：年月曰表保多／ｉ关于论文知识产权和使用授权的说明本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用本校毕业生学位论文的规定，即本论文知识产权单位为沈阳农业大学；沈阳农业大学有权保留本论文的纸质文本和电磁介质文本，有权允许他人查阅和借阅本论文各种文本、，有权采用影印缩印或扫描等方、、汇编本论文、。式复制保存，有权以不同方式在媒体上发表传播本学位论文的内容（保密的学位论文在解密后遵守此协议）研究生签名时间：＞５你年＾月导师签名：时间：年月＞〇｛／ 沈阳农业大学硕士学位论文目录摘要.....................................................................................................................1Abstract..................................................................................................................3第一章前言..........................................................................................................51.1菊花白色锈病的发生与流行......................................................................................51.2植物热激蛋白的研究进展..........................................................................................61.3lWRKY的研究进展及生物学功能..........................................................................101.4本研究的目的意义与技术路线................................................................................13第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的表达分析..........................152.1试验材料....................................................................................................................152.2试验试剂与仪器........................................................................................................152.2.1试验试剂.........................................................................................................152.2.2溶液的配制.....................................................................................................152.2.3试验仪器.........................................................................................................162.3试验方法....................................................................................................................162.3.1组织特异性表达分析.....................................................................................162.3.2非生物胁迫处理.............................................................................................162.3.3激素处理.........................................................................................................172.3.4菊花白色锈病病原菌处理.............................................................................172.3.5菊花叶片RNA的提取..................................................................................172.3.6RNA质量的检测............................................................................................192.3.7反转录合成cDNA第一链的合成................................................................192.3.8实时荧光定量PCR分析...............................................................................202.4结果与分析................................................................................................................202.4.1菊花叶片总RNA的提取质量检测..............................................................202.4.2CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因组织特异性分析..............................21I 目录2.4.3CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因受非生物胁迫诱导下表达特异性分析...............................................................................................................................222.4.4CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在外源激素诱导下表达特异性分析...................................................................................................................................252.4.5CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在白色锈病病原菌诱导下表达特异性分析.......................................................................................................................272.5小结............................................................................................................................29第三章CmWRKY基因表达载体构建...............................................................303.1试验材料....................................................................................................................303.2试验试剂与仪器........................................................................................................303.2.1试验试剂.........................................................................................................303.2.2菌株与载体.....................................................................................................303.2.3溶液的配制.....................................................................................................303.2.4试验仪器.........................................................................................................313.3试验方法....................................................................................................................313.3.1菊花CmWRKY基因表达载体构建..............................................................313.3.2农杆菌的转化及筛选.....................................................................................323.4结果与分析................................................................................................................343.4.1菊花pBI121-CmWRKY载体构建...............................................................343.4.2菊花pBI121-CmWRKY重组质粒转化农杆菌...........................................353.5小结............................................................................................................................35第四章结论与讨论............................................................................................374.1讨论............................................................................................................................374.2结论............................................................................................................................394.2.1明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受非生物胁迫过程中的表达模式.......................................................................................................394.2.2明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受植物激素诱导II 沈阳农业大学硕士学位论文过程中的表达模式...................................................................................................404.2.3明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受生物胁迫过程中的表达模式...........................................................................................................404.2.4构建CmWRKY基因的植物表达载体并转化农杆菌..................................40参考文献...............................................................................................................41致谢...................................................................................................................47攻读学位论文期间发表文章..............................................................................48III ContentsContentsAbstractinChinese.................................................................................................1AbstractinEnglish.................................................................................................3ChapterⅠForeword..............................................................................................51.1OccurrenceandepidemicofwhiterustofChrysanthemum.........................................51.2Advancesintheheatshockproteinsofplant................................................................61.3ResearchprogressandbiologicalfunctionofWRKY................................................101.4Thepurposeandtechnicalrouteofthisstudy............................................................13ChapterⅡExpressionpatternanalysisofCmHSP、CmHSPLandCmWRKYgenes......................................................................................................................152.1Material.......................................................................................................................152.2Reagentsandinstruments...........................................................................................152.2.1Reagents...........................................................................................................152.2.2Preparationofsolution.....................................................................................152.2.3Instruments.......................................................................................................152.3Method........................................................................................................................162.3.1Tissuespecificityexpressionanalysis..............................................................162.3.2Abioticstresstreatment....................................................................................162.3.3Hormonestresstreatment................................................................................162.3.4Stresstreatmentofchrysanthemumwhiterustpathogen................................172.3.5ExtractionofRNAfromChrysanthemumleaves............................................172.3.6DetectionofRNAquality................................................................................182.3.7SynthesisofthefirstchainofreversetranscriptionalsynthesisofcDNA......192.3.8RealtimefluorescencequantitativePCRanalysis...........................................202.4Resultsandanalysis....................................................................................................202.4.1ExtractionqualityoftotalRNAfromChrysanthemumleaves........................202.4.2TissuespecificityanalysisofheatshockproteinCmHSP,CmHSPLandIV 沈阳农业大学硕士学位论文CmWRKYgene..........................................................................................................212.4.3SpecificexpressionanalysisofCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesundertheabioticstress..............................................................................................222.4.4SpecificexpressionanalysisofCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesundertheexogenoushormones.................................................................................252.4.5SpecificexpressionanalysisofCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesunderthewhiterust...................................................................................................272.5Summary.....................................................................................................................29ChapterⅢThevectorconstructionofCmWRKYgene.......................................303.1Material.......................................................................................................................303.2Reagentsandinstruments...........................................................................................303.2.1Reagents...........................................................................................................303.2.2Strainandvector..............................................................................................303.2.3Preparationofsolution.....................................................................................313.2.4Instruments.......................................................................................................313.3Method........................................................................................................................313.3.1ConstructionofCmWRKYgeneexpressionvectorofChrysanthemum..........313.3.2TransformationandscreeningofAgrobacteriumtumefaciens........................323.4Resultsandanalysis....................................................................................................343.4.1ConstructionofpBI121-CmWRKYvector.....................................................343.4.2TransformationandscreeningofAgrobacteriumtumefaciens........................353.5Summary.....................................................................................................................35ChapterⅣConclusionanddiscussion.................................................................374.1Discussion...................................................................................................................374.2Conclusion..................................................................................................................394.2.1ExplicateCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesexpressionpatternsintheprocessofabioticstressinChrysanthemum.............................................................39V Contents4.2.2ExplicateCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesexpressionpatternsintheprocessofexogenoushormonesinChrysanthemum................................................404.2.3ExplicateCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenesexpressionpatternsintheprocessofwhiterustpathogen..................................................................................404.2.4VectorconstructionandtransformationofCmWRKY.....................................40References.............................................................................................................41Acknowledgement................................................................................................47Articlespublishedduringstudyformaster’sdegree...........................................48VI 沈阳农业大学硕士学位论文摘要菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是我国十大传统名花之一，而菊花白色锈病是危害栽培菊花生产的首要病害之一，并在菊花上广泛传播，已列入世界性检疫病害。课题组前期对抗、感品种进行了转录组测序，获得了差异表达基因，CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因。本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析这三个菊花抗病相关基因在不同胁迫下表达模式；同时构建pBI121-CmWRKY植物表达载体并转化农杆菌，为基因功能验证奠定基础，对菊花抗病或抗逆品种的选育具有指导意义。主要的试验结果如下：1.利用实时荧光定量PCR技术，对菊花在非生物胁迫（高盐、干旱、高温、低温）处理后的基因表达模式进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因的表达受高盐和高温胁迫诱导明显，高盐处理0.5h时，三个基因表达量分别是对照组的1.6倍、2.5倍、6.6倍；高温处理0.5h时，三个基因的表达量分别是对照组的368.7倍、15.1倍、13.2倍。植株受低温胁迫时，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因的表达均呈现下调，说明低温胁迫抑制了菊花这三个基因的表达。干旱胁迫抑制CmHSP和CmHSPL基因表达，而CmWRKY基因受其诱导表达不明显。2.利用实时荧光定量PCR技术，对菊花在植物激素（乙烯利Eth、水杨酸SA、茉莉酸甲酯MeJA）处理后的基因表达模式进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因受SA和MeJA诱导响应明显，而受Eth诱导响应不明显。CmWRKY基因的表达受Eth，SA和MeJA诱导响应迅速，均在处理后1h时CmWRKY基因的表达量达到最高。3.利用实时荧光定量PCR技术，对菊花在生物胁迫（菊花白色锈病病原菌）处理后的基因表达模式进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因受菊花白色锈病菌的生物诱导，表达量较高，响应迅速，均在处理6h内完成高量表达。CmHSP和CmHSPL基因分别于处理4h时和6h时表达量达到最高，为对照组的21.1倍和10.4倍；而CmWRKY基因在1h时表达量即达到最高值，为对照组的426倍。4.成功构建植物重组表达载体pBI121-CmWRKY，用冻融法将构建成功的重组质1 摘要粒pBI121-CmWRKY转化到农杆菌中，为获得转基因植株奠定基础。关键词：菊花；白色锈病；CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因；实时荧光定量PCR；表达分析2 沈阳农业大学硕士学位论文AbstractChrysanthemumisoneofthetentraditionalflowersinChina,butthechrysanthemumwhiterustisoneofthemaindiseasesofcultivatedproductionhazards,andspreadinChrysanthemum,whichhasbeenincludedintheworldwidequarantinedisease.Atranscriptionalgroupwassequencedinthepreviousresearch,andthedifferentiallyexpressedgenes,CmHSP,CmHSPLgeneandCmWRKYgenewereobtained.Inthisstudy,realtimefluorescencequantitativePCRtechniquewasusedtoanalyzetheexpressionpatternsofthethreeresistancerelatedgenesunderdifferentstressesinChrysanthemum.ThevectorpBI121-CmWRKYwasconstructedandwastransformedintoAgrobacterium,whichwillbesignificancetobreedresistantvarietiesChrysanthemum.Themainresultsareasfollows:1.Weanalyzethegeneexpressionpatternsofchrysanthemumafterabioticstress(highsalt,drought,hightemperature,lowtemperature)byreal-timequantitativePCR.TheresultsshowthattheexpressionofCmHSPandCmHSPLgenesandCmWRKYgenesinducedbyhighsaltandhightemperaturestress.Athighsalttreatmentfor0.5h,theexpressionlevelsofthethreegeneswere1.6,2.5and6.6timesthatofthecontrolgroup,respectively.Athightemperaturefor0.5h,theexpressionlevelsofthethreegeneswere368.7,15.1and13.2timesthatofthecontrolgroup,respectively.TheexpressionofCmHSPandCmHSPLgenesandCmWRKYgenesweredown-regulatedwhenplantswereexposedtolowtemperaturestress.Itindicatedthatlowtemperaturestressinhibitedtheexpressionofthreegenesofchrysanthemum.DroughtstressinhibitedtheexpressionofCmHSPandCmHSPLgenes,buttheCmWRKYgenewasnotinducedbyitsexpression.2.WeanalyzethegeneexpressionpatternsofchrysanthemumafterphytohormonetreatmentlikeEthrel(Eth),SalicylicAcid(SA),MethylJasmonate(MeJA)byreal-timequantitativePCR.TheresultsshowthattheresponseofCmHSPandCmHSPLgenesinducedbySAandMeJAwasobvious,whiletheresponseinducedbyEthwasnotobvious.TheexpressionofCmWRKYgenewasrapidlyrespondedtobyEth,SAandMeJA.TheexpressionofCmWRKYgenewashighestat1haftertreatment.3.Weanalyzethegeneexpressionpatternsofchrysanthemumafterbio-stress(chrysanthemumwhiterustpathogen)byreal-timequantitativePCR.TheresultsshowthatCmHSP,CmHSPLgenesandCmWRKYgeneareinvolvedinthediseaseresistanceresponseofChrysanthemumwhiterust,responseandexpressionhighlyandrapidly,inprocessing6htocompletethehighlevelexpression.TheexpressionlevelofCmHSPandCmHSPLgenereachedthehighestlevelat4hand6haftertreatmentrespectively,21.1timesand10.4timesofthatofcontrolgroup,whiletheexpressionlevelofCmWRKYgenereachedthehighestvalueat1haftertreatment,whichwas426timesofthatofcontrolgroup.Thisisconsistentwiththeresultsoftranscriptomesequencinginthepreviousresearch,indicatingthatallthreegenesareinvolvedinthediseaseresistanceofChrysanthemumwhiterustandparticipateintheplantdefense3 Abstractresponse.4.TheplantrecombinantexpressionvectorpBI121-CmWRKYwassuccessfullyconstructed.TheAgrobacteriumwaspreparedintocompetentcellsbyCaCl2,andtherecombinantplasmidpBI121-CmWRKYwastransformedintoAgrobacteriumbyfreezingthawingmethod,whichlaythefoundationforfurtherresearchoftransgenicplantsandfurtherresearchonthefunctionoftranscriptionfactor.Keywords:Chrysanthemum;CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgenes;qPCR;Expressionanalysis4 沈阳农业大学硕士学位论文第一章前言菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是我国十大传统名花之一，是“四大切花”之一，是长期经过人工选择而培育出来的名贵观赏花卉（陈俊愉，2005）。公元八世纪前后，菊花由中国传至日本，17世纪末中国菊花引入欧洲，18世纪传入法国，19世纪中期引入北美。此后中国菊花遍及全球，成为世界商品产值位居花卉之首的观赏花卉（陈俊愉，2005）。1.1菊花白色锈病的发生与流行白色锈病是菊花首要病害之一，在美国、欧洲和地中海等地区已被列为检疫性病害之一（王顺利等，2008）。菊花白色锈病于1895年在日本被首次发现（叶琪明等，2005），1901年Hennings将此病原鉴定为堀氏菊柄锈菌（PucciniahorianaHenn.）（Whipps，1993），随着菊花的出口与交流，检验出现的漏检，现已经扩散到南非、欧洲等各地，对菊花产业产生了巨大影响。1994年我国检疫部门在从日本引进的菊花中检出菊花白色锈病（陶灵珠等，1996；王顺利等，2008），暂时防止了该病在我国的传播和蔓延。1997年在山东潍坊地区（丁世民与席敦芹，2001）、2000年在吉林市（范文忠等，2002）、2013年在北京市延庆地区（卢雪征等，2016）都有该病的严重发生。菊花白色锈病发病率较高，传播速度较快，经常对温室栽培的切花菊造成毁灭性灾难，一方面严重降低了菊花的观赏价值，直接制约了菊花产品的出口与传播（王顺利，2008）；另一方面用于控制该病的人力、物力花费增加，导致菊花生产基地生产成本增加，菊花生产的经济效益受到了严重影响。随着产业生产规模的扩大，菊花白色锈病逐渐成为了菊花鲜切花生产和露地栽培生产的限制因素。我国是菊花的故乡，有着丰富的品种资源，现有品种约4000个（陈俊愉，2001），这对于菊花抗病育种来说是一个巨大的种质资源宝库。同时菊花品种间抗病性差异显著（王顺利等，2008），因此寻找菊花中与抗病相关的基因，进行菊花抗病育种，对于防治该病具有重要意义。白色锈病病原菌在菊花上表现出病害的典型症状，叶背会产生淡黄色疱状突起，即冬孢子堆，鉴定该病原是：堀氏菊柄锈菌（P.horiana）（Whipps，1993；祝朋芳等，2011），该病原菌属于担子菌门冬胞菌纲锈菌目柄锈菌科柄锈菌属。在菊花白锈病的长期防治过程中，化学药剂一直占有不可取代的地位（赵娅玲等，2017）。Torres等（2017）5 第一章前言基于形态学特征和分子分析，鉴定了两种枝孢菌，对白色锈病病原菌有拮抗作用，可用于生物防治。目前，国内外对菊花白色锈病的抗病分子机理研究较少，黄河等（2012）用cDNA-AFLP技术获得了菊花响应白色锈病的差异基因片段，Alaei等（2009）通过核糖体DNA转录间区特异序列，建立了快速测定感染堀氏菊柄锈菌的方法。课题组前期构建了菊花响应白色锈病病原菌侵染的转录组数据库（GenBankAccessionSRP068900）（Dongetal，2018），为进一步挖掘抗病关键基因奠定了基础。1.2植物热激蛋白的研究进展当生物体受到胁迫时，会通过激活热激蛋白转录因子调控基因的表达，从而响应生物、化学、物理等胁迫，几乎在所有生物中都存在热激蛋白（郭会娜，2014；Guptaetal，2010）。热激蛋白既是植物代谢中的必需蛋白，又是植物应激蛋白，在逆境中有助于细胞结构的恢复和机能的重建（栗振义，2015）。1.2.1热激蛋白的分类及特征几乎所有植物在逆境条件和正常生长情况下，都会产生热激蛋白，但分子量从10-200KDa不等。Tissieres等（1974）首次从果蝇幼虫唾液腺中克隆得到热激蛋白。Carper等（1987）根据热激蛋白分子量大小的不同将热激蛋白分为六大家族，分别为：HSP110、HSP90（83-90kDa）、HSP70（66-78kDa）、HSP60（60kDa）和小分子量sHSP（15-42kDa）。表1-1中列了部分热激蛋白家族的成员在细胞器的定位及主要功能（Wangetal，2004）。表1-1HSP蛋白在细胞内定位及功能Table1-1Thelocalizationandfunctionofheatshockproteinincell家族名称代表成员细胞定位主要功能HSP100细胞质、线粒体和叶绿体降解异常蛋白，蛋白折叠AtHsp90-1、AtHsp90-7、细胞质、内质网、线粒体和叶促进信号肽的成熟，植物HSP90AtHsp90-6、AtHsp90-5绿体抗逆防止异常蛋白聚合，蛋白细胞质、内质网、线粒体、叶HSP70Hsp/Hsc70、Hsp70、Bip折叠，蛋白输出与转运，绿体以和核仁信号转导与转录激活HSP60Cpn60、CCT叶绿体、线粒体和细胞质蛋白折叠与再折叠Hsp17.6、Hsp21、Hsp22、细胞质、叶绿体、内质网、线防止蛋白聚集，稳定异常sHSPHsp23、Hsp22.3粒体和质膜蛋白型蛋白定位在细胞质或细胞核中，只在生物体受到热激条件下产生，正常条件下只作为非必要蛋白以质体型定位于叶绿体和线粒体中。HSP90蛋白是真核细胞中较为丰富的结构性表达蛋白之一（Cortesetal，2018），占6 沈阳农业大学硕士学位论文细胞总蛋白数的1%到2%左右，是植物体受到应激条件反应的重要组成部分（鲁琛，2007；刘玲玲等，2012）。在拟南芥胚的发育过程中，在胚发育接近成熟时AtHSP90-3表达量显著上升，其在角果伸长期呈微弱稳定增长趋势，在胚接近成熟时略有下降（Prasinosetal，2005），说明HSP90在植物生长发育过程中起着重要作用（Schopfetal，2008）。HSP90也参与了植物抗逆境相应过程，热激、干旱、氧化、重金属和病虫害等都可激活HSP90的转录并调控HSP90的表达（Songetal，2009）。HSP70在细胞内分布较广，含量大，但相对保守，是最主要的分子伴侣之一（陈文超，2015；栗振义，2015），也是最丰富的热激蛋白之一。HSP70在细胞中组成型表达作为看家蛋白，主要作用是以分子伴侣形式防止蛋白在成熟过程中以不正确的方式聚合或折叠。HSP70在植物生长发育中起着重要作用，参与叶绿体的发育与分化（Kimetal，2013）。HSP70基因受到非生物胁迫时起到调控作用，拟南芥中受到干旱、高盐、高温、低温和伤害等非生物胁迫时反应明显（朱喜荣，2011；郭丽红等，2009；Dongetal，2001）。HSP60分为原核生物GroEL和真核生物HSP60两种，且两者都具有高度保守性（许声涛等，2008）。HSP60参与二磷酸核酮糖羧化酶的组装、并参与蛋白的折叠、聚合、装配、转运过程（周丽，2015）。HSP60蛋白在进入线粒体后可保持线粒体功能的完整，并可以通过维持线粒体的氧化磷酸化推迟细胞凋亡，具有抗凋亡作用（Chowetal，2012；曹智等，2008）。目前对于HSP60的研究较少，Tominaga等（2012）从孔石菇中分离并克隆了UpHSP60基因，分析其表达受日照、温度和重金属影响，推测HSP60可能参与植物重金属、温度和光照的胁迫应激反应。sHSP是一个多样、历史悠久且非常重要的家族，由核基因编码，在细胞各个部位均有分布（Wangetal，2004），是迄今为止在植物中探索到的一组最复杂的蛋白。Horwitz在1992年就提出了sHSP作为分子伴侣的可能性，作为分子伴侣，sHSP促使蛋白进行正确的折叠和运输（Siddiqueetal，2008；Rédei，2008），如果蛋白发生错误折叠及异常聚集等现象，sHSP蛋白作会降解异常蛋白，并将错误折叠的蛋白重新装配，维持蛋白功能稳定。sHSP在植物的生长发育和胁迫反应中起着重要的作用（王国强，2010），在受到高温、干旱、高盐、低温、氧化等非生物胁迫时，sHSP基因大量会达以对抗逆境胁迫（SatoandYokoya，2008；Leeetal，2012）。7 第一章前言1.2.2热激蛋白的功能热激蛋白不仅种类繁多，而且在蛋白质折叠、防止蛋白质错误聚集和抗胁迫等方面均发挥重要作用（郭文丽，2010；王涛等，2014），同时参与植物的生长发育和交叉保护作用。1.2.2.1分子伴侣功能分子伴侣是指一些不参与蛋白质合成，但参与新生肽链折叠、蛋白质的组装与运转的特殊蛋白质分子，起到防止蛋白质错误积累、协助蛋白质跨膜转移、维持蛋白质进行正常折叠、促进错误折叠的蛋白质降解等功能（张青，2016；杨云慧等，2003）。HSP60是最早被发现有分子伴侣功能的热激蛋白（HorwichandWillison，1993；Edenhoferetal，1996），研究表明HSP90、HSP70和小分子量热激蛋白sHSP也都具有分子伴侣等功能（Prodromou，1997；Warricketal，1999；NagataandHosokawa，1996；Gupta，2008）。1.2.2.2参与植物生长发育热激蛋白的转录和翻译在所有营养组织中都有发生。在胚胎发育早期的前鱼雷期和花粉萌发时胚胎内就可合成大量HSP，但还不能激活HSP基因表达，除此之外的所有时期都存在HSP的转录和翻译，说明自胚胎时起就已经存在处于翻译活性状态的HSP的mRNA（丁自立等，2006；Prasinosetal，2005）。HSP90基因在植物生长过程中也起着重要作用，该基因的抑制或缺失会引起植物形态变异和生理特征的改变。Queitsch等（2002）抑制拟南芥中HSP90的表达，发现拟南芥的表型发生变化，其中子叶、圆盘变为偏上性或放射状，根处生长出了不正常的根毛。热激蛋白基因还参与了植物胚的发育及种子萌发过程，参与拟南芥下胚轴的伸长，说明热激蛋白基因可能广泛参与了植物的各项生长发育过程。1.2.2.3交叉保护作用交叉保护作用又称为交叉耐受性，指的是HSP可以受到多种逆境胁迫诱导，几种不同胁迫下的蛋白在某些功能上存在重叠，由几种胁迫下产生的蛋白在某些功能上存在重叠效应，由一种逆境胁迫产生的蛋白也会对其他胁迫有着增强抗性的能力（耿兴敏，2014）。李春子等（2011）发现小分子热激蛋白Nt-HSP17.8基因在烟草中的表达不仅受单一因素高温或干旱胁迫的诱导，而且在干旱和高温同时胁迫下表达量大大增加，说明8 沈阳农业大学硕士学位论文该基因在烟草中起着交叉保护作用。1.2.3热激蛋白在不同逆境下的表达植物在生长发育阶段会受到各种生物及非生物胁迫影响，会通过各种生理变化、胁迫基因响应等方式适应环境变化，其中热激蛋白就是生物及非生物胁迫中最重要的胁迫响应基因之一（阮孟斌与彭明，2011）。植物在遇到高温、低温、干旱、高盐等胁迫时，热激蛋白被诱导并大量表达（潘佳佳，2010），对各种胁迫起着重要作用。在受到逆境胁迫时，热激蛋白主要通过维持蛋白及生物膜结构的稳定、清除生物体内过多的活性氧和ROS维持生物体内的稳定性。在受到高温、高盐及重金属胁迫后，拟南芥HSP90表达量显著增加（Yabeetal，1994；MilioniandHatzopoulos，1997）；在受到高盐、干旱及低温的诱导后，水稻HSP90也出现大量积累，说明热激蛋白基因参与植物对非生物胁迫的相应过程（裴丽丽，2013；Liuetal，2006）。在植物体受到高温胁迫时，植物体内的HSP积累与生物体耐热性呈正相关，说明在高温胁迫下植物体HSP的积累可以提升植株的耐热性。卢承琼等（2014）在川桑基因组中鉴定了29个桑树sHsp基因，并在印度桑品种K2的叶片进行高温、低温、高盐和干旱处理，荧光定量分析10个sHsp基因，结果表明这些sHsp基因都能快速响应高温胁迫，分别有5、9、7个sHsp基因响应低温、高盐和干旱胁迫；其中Mn15.7-CV基因在4种逆境胁迫下表达均被抑制，8个基因在受到高温诱导后表达量上升了100倍以上，6个基因表达量上升了500倍以上，说明热激蛋白基因sHsp基因在桑树抵抗非生物胁迫尤其是高温胁迫时发挥着重要作用。刘玲玲等（2012）在玉米种克隆了一个Hsp90同源基因，并对其进行分析，通过实时荧光定量对其在高温、高盐、ABA、低温、干旱等条件下表达情况进行分析，结果表明ZmHsp90-1基因在根中表达量最高；在高温条件下1h时表达量达到最高，为对照组的170倍；高盐处理2h时表达量达到最高，为对照组的30倍；ABA处理24h时表达量最高，为对照组的30倍；对于干旱和低温胁迫下也有较高表达量，说明热激蛋白基因明显参与植物抗非生物胁迫响应。热激蛋白不但参与植物非生物胁迫的响应，也参与植物抗生物胁迫的过程。安艳秋等（2011）在小麦幼苗中筛选并克隆了一个HSP70基因TaHSP70，将小麦幼苗进行低温、高温、干旱和ABA处理以及接种小麦条锈菌和白粉菌后观察TaHSP70表达量9 第一章前言变化，结果表明TaHSP70基因受高温诱导高度表达，在受到白粉病侵染24h时表达量迅速升高并在24h内保持不变，同时干旱、低温与ABA胁迫处理明显抑制了TaHSP70的表达，三种处理后TaHSP70表达量明显低于对照组。TaHSP70基因表达受到低温、干旱和ABA胁迫抑制，但受高温、条锈菌和白粉菌所诱导，说明热激蛋白基因明显参与植物抗生物胁迫响应。1.3WRKY的研究进展及生物学功能1.3.1植物WRKY的研究进展甜马铃薯中的SPF1基因是高等植物中第一个被鉴定的WRKY基因（IshiguroandNakamura，1994），随后研究者们在野燕麦（Rushtonetal，1995）、欧芹（Rushtonetal，1996）、拟南芥（Pateretal，1996）中鉴定了相关WRKY基因。随着分子生物学研究的不断拓展，研究人员对WRKY基因研究的不断深入，基因组测序技术的不断发展和完成，据不完全统计，现已在166个物种中发现了14,549个WRKY基因，跟随时间的推移及对WRKY功能的研究深入，该数据还会不断发展。现已在双子叶植物拟南芥、大豆、葡萄、番茄、苹果、桃中发现了90、296、59、81、139、85个WRKY基因，在单子叶植物籼稻（Rossetal，2007）、粳稻（Rossetal，2007）、高粱（Rushtonetal，2010）、二穗短柄草（蒋明等，2012）、柳枝稷（Rinersonetal，2015）中分别发现109、128、134、134、275个WRKY基因。WRKY基因受激素、物理伤害、生物以及非生物胁迫诱导表达，在植物防卫反应信号途径和激素信号途径中有着重要作用，对植物的生长发育以及抗逆性有着重要的调节作用。目前对WRKY基因的研究一般集中在其参与植物受生物胁迫应答、非生物胁迫应答及参与植物生长发育及物质代谢过程。1.3.2植物WRKY基因参与植物逆境胁迫应答在植物生长发育过程中，会受到如干旱、高温、低温、盐碱等非生物胁迫与各种生物胁迫影响，而植物WRKY基因在植物抵抗各种逆境胁迫时都有着重要作用（文锋等，2017）。Devaiah等（2007）发现在拟南芥缺少磷元素条件下，AtWRKY75基因高度表达，在抑制其表达后，拟南芥内花青素过早积累，磷胁迫相关基因和磷酸酶、磷转运蛋白相关的蛋白水平都明显下降，说明转录因子AtWRKY75基因是拟南芥生物体内磷相关10 沈阳农业大学硕士学位论文的重要调节因子。Jiang等（2009）在拟南芥中发现经过高盐胁迫后，AtWRKY25、AtWRKY33基因表达量明显上升；转化拟南芥后过表达植株耐盐性明显高于对照组，说明这两个WRKY基因在拟南芥抗盐胁迫时起着重要的作用。Wu等（2009）发现水稻OsWRKY11基因受高温和干旱诱导后高度表达，将OsWRKY11基因与OsHSP101的启动子结合后转入到水稻栽培种中，经过高温胁迫后发现OsWRKY11基因表达量上升，且经过热激后转基因植株的耐热性和耐寒性都明显增强，对比对照组时发现转基因植株叶片枯萎速度减慢、植株受伤部位减少、绿色部分存活率增加、离体叶片的水分丧失缓慢，说明OsWRKY11基因在植株抗高温胁迫时有着重要作用。赵曾强（2015）发现感病品种和抗病品种经过棉花枯萎病菌诱导后，GhWRKY44和GhWRKY22基因在抗病品种中的表达量明显高于感病品种，且对病原菌的响应也更加迅速，说明两基因参与了棉花对枯萎病病原菌的应答响应。薛珍等（2015）发现StWRKY8基因在马铃薯接种青枯菌后表达量明显上调，且在感抗品种中表达存在差异。该基因在感病品种中6h内表达量较低，而在抗病品种中6h内高强度表达，说明该基因受青枯菌的诱导表达，且受寄主植物固有抗性影响，在植物防御反应中发挥作用。1.3.3植物WRKY基因参与植物生长发育及物质代谢过程WRKY基因除了在植物受到生物及非生物胁迫时发挥作用，还在植物种子形成、萌发、胚胎发育、组织器官发育、植株衰老、叶片衰老等各个重要生长发育过程中发挥着重要作用。Alexandrova等（2002）在果园草中发现WRKY基因DEG1在胚状体时期大量表达，在体细胞胚胎产生过程中发挥着重要作用。Luo等（2005）发现AtWRKY10基因在拟南芥花粉、球形胚和胚乳发育的两个阶段大量表达。王芳秀等（2011）发现拟南芥AtWRKY25基因主要在根、叶和茎生叶中表达，过量表达的AtWRKY25转基因植株在长光照条件下开花时间比对照组野生型拟南芥提前，说明AtWRKY25基因参与拟南芥开花过程。Luo等（2013）在大豆中分离研究了GsWRKY20基因，研究发现GsWRKY20基因在大豆的茎尖和花絮分生组织中表达量较高；过表达GsWRKY20基因株系在长日光周期、短日光周期、春化处理和赤霉素处理下的开花时间都比对照组提前，说明GsWRKY20基因在植物开花调控通路中具有重要作用。11 第一章前言WRKY在植物衰老过程，尤其是叶片衰老过程中也起着重要作用。Zhou等（2011）发现AtWRKY22基因过表达的拟南芥植株中，与衰老相关基因的表达水平升高，加速了植株衰老，AtWRKY22基因缺失突变体中，与衰老相关基因的表达水平降低，延缓了植株衰老。Rinerson等（2015）研究发现在柳枝稷中的240个WRKY基因中有23个在旗叶衰老期间表达水平上调，在做进化聚类分析后发现，其中11个WRKY基因与已知衰老相关基因有着较高的同源性。1.3.4植物WRKY基因在不同逆境下的表达WRKY基因在植物抗非生物胁迫的反应过程中起着重要作用。谷彦冰（2016）发现苹果MdWRKY5和MdWRKY54基因受高温、低温和高盐诱导明显，两基因受SA、ABA和MeJA诱导下表达量也出现变化，其中MdWRKY5基因受SA诱导最明显，MdWRKY54基因受ABA诱导最明显，说明WRKY基因参与到植物受非生物胁迫的响应中。栗颖（2015）将9个小麦WRKY基因进行表达模式分析及在干旱、高盐、高温、低温等处理下分析其表达情况，结果表明大部分基因在叶中表达较高；8个基因受高盐诱导表达上调，所有基因均受ABA诱导表达上调，4个基因受低温诱导表达上调，4个基因受GA诱导表达上调，1个基因受干旱诱导表达上调，1个基因受H2O2抑制，表达量下降，说明小麦9个WRKY基因均参与植物响应多种非生物胁迫。WRKY基因在植物抗生物胁迫的反应过程中也起着重要作用。李胜男（2016）对黄瓜CsWRKY30在霜霉威胁迫下的表达模式进行研究，结果表明CsWRKY30在低霜霉威残留品种中表达量显著上调，在高霜霉威残留品种中表达量未发生明显变化；将CsWRKY30基因转入到拟南芥中，并进行霜霉威胁迫，发现经过胁迫处理后CsWRKY30转基因拟南芥萌发率及主根长度明显高于对照组野生型拟南芥，说明黄瓜CsWRKY30基因在霜霉威胁迫下发挥重要作用，该基因的过量表达可显著提高转基因拟南芥对霜霉威胁迫的抵抗能力。周鹏飞等（2017）在在感病品种纽荷尔脐橙和抗病品种四季橘中接种溃疡病菌，研究发现4个WRKY基因在感病品种和抗病品种中的表达情况不同。CsWRKY22基因参与寄主的感病反应，CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应；柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫，且4个WRKY基因在SA和MeJA的处理下表达量均无明显变化，说明4个WRKY基因均不参与柑橘响应SA和MeJA的过程。范青青等（2016）在前期克隆获得菊花CmWRKY15的基12 沈阳农业大学硕士学位论文础上，遗传转化菊花‘神马’品种获得超表达CmWRKY15转基因株系，并接种黑斑病菌后观察表型差异，结果发现两个转基因株系的发病程度比野生型植株严重，转基因菊花植株寄主反应表现为感病，而野生型植株寄主反应表现为抗病，说明CmWRKY15转基因菊花增加了对黑斑病的敏感性，通过测定转基因和野生型植株的内源ABA含量进行研究，推测CmWRKY15通过抑制ABA正调控作用的基因以及相关基因的表达从而降低了植株体内ABA的含量以及抑制ABA参与调控气孔关闭的作用，使转基因植株气孔开放，更易感病。1.4本研究的目的意义与技术路线1.4.1本研究的目的意义菊花是我国十大传统名花之一，而白色锈病是危害栽培菊花生产的首要病害之一，其在菊花上广泛传播，已列入世界性检疫病害。在菊花白色锈病的长期防治过程中，使用化学药剂是主要的防治手段，然而长期使用化学药剂会产生不同程度的抗药性，而不利于白色锈病的防治，因此培育抗白色锈病的转基因菊花新品种对防治菊花白锈病具有重要意义。本研究对菊花进行非生物胁迫（高盐、干旱、高温、低温）、植物激素诱导（乙烯利、水杨酸、茉莉酸甲酯）和生物胁迫（白色锈病病原菌）处理，研究不同胁迫下CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因的表达模式，并构建了CmWRKY基因的超表达载体，为基因功能验证奠定基础，本研究对转基因抗病菊花新品种或抗逆品种的选育具有指导意义。1.4.2本研究的内容和技术路线课题组前期对抗、感品种进行了转录组测序，获得了差异表达基因，CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因，本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析三个菊花抗病相关基因在不同胁迫下表达模式分析，胁迫包括：非生物胁迫（高盐、干旱、高温、低温）、植物激素诱导（乙烯利、水杨酸、茉莉酸甲酯）和生物胁迫（白色锈病病原菌）；同时构建pBI121-CmWRKY植物表达载体并转化农杆菌，为基因功能验证做铺垫，本课题的研究为指导菊花抗病或抗逆新品种的选育奠定基础。本研究的技术路线见图1-1。13 第一章前言菊花叶片进行非生物胁菊花叶片进行植物激素菊花叶片进行生物胁迫迫（不同时间取样）诱导（不同时间取样）（不同时间取样）提取菊花总RNA反转录获得cDNAqPCR分析各处理下CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的表达模式，根据荧光定量结果筛选出CmWRKY基因进行进一步实验PCR扩增菊花CmWRKY的全长基因与载体pBI121同时进行双酶切CmWRKY与载体pBI121进行连接、转化E.coli菌液PCR鉴定阳性克隆、送测序构建成功的pBI121-CmWRKY质粒转化农杆菌图1-1技术路线Fig.1-1Technicalroute14 沈阳农业大学硕士学位论文第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析大量研究表明生物体受到胁迫时，会激活热激蛋白等基因的表达，从而实现自身生长发育和繁殖的需要，以及对各种逆境（包括生物、化学、物理等）的应答，提高植物耐逆性。试验以菊花白色锈病高抗品种‘C029’为试材，采用qRT-PCR方法，对CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因进行表达分析，深入研究该基因在抗白锈病菊花在应对逆境过程，如高温、低温、高盐、干旱、乙烯利、水杨酸、茉莉酸甲酯、白锈病病原菌等过程的表达模式。2.1试验材料试验于2016-2017年在沈阳农业大学林学院进行，菊花白色锈病高抗品种‘C029’由沈阳农业大学林学院花卉基地提供。2.2试验试剂与仪器2.2.1试验试剂（1）天根公司：植物总RNA提取试剂盒（产品货号：DP432）。（2）TAKARA公司：RNA反转录反转录试剂盒PrimeScript™1stStrandcDNASynthesisKit（产品货号：6210A）、DL2000DNAMarker（产品货号：3427A）、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®:PremixExTaqTMII（TliRNaseHPlus）（产品货号：RR820A）。（3）梓熙生物有限公司：10×loadingbufferDNA上样缓冲液（货号：D1020）、GoldViewI（货号：G8140）。（4）生工生物工程（上海）股份有限公司：氯化钠（NaCl）、PEG6000、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯利（Eth）均为分析纯。（5）Invitrogen公司：琼脂糖（货号75510019）、AgarA琼脂粉、β-巯基乙醇。（6）沈阳农业大学：超纯水，无水乙醇。2.2.2溶液的配制5×TBE电泳缓冲液：称取54gTris-base、3.72gNa2EDTA·2H2O、27.5g硼酸充分溶解于ddH2O中后，定容至1L，室温保存。15 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析2.2.3试验仪器主要仪器设备：Steponeplus实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔公司）、BOX:F3型凝胶成像系统（美国SYNGENE）、Biometra070-851PCR仪（北京爱思普仪器有限公司）、Centrifuge5804R多功能高速低温离心机（德国艾本德公司）、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、ALC-210.3型ACCULAB电子天平（北京奥赛多利公司）、DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）、移液枪（生工生物工程公司）、MDF-U32V型超低温冰箱（日本SANYO）、KG-SX-500型高压灭菌锅（日本TOMY）、DL-CJ-1NDⅡ单面普及型洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、Nanodrop2000紫外分光光度计（赛默飞世尔公司）。2.3试验方法2.3.1组织特异性表达分析分别采集生长健壮‘C029’组培苗根、茎、叶，迅速置于液氮速冻后，-80℃超低温冰箱中备用。2.3.2非生物胁迫处理（1）高盐胁迫：配置250mM的NaCl溶液，0.22μm过滤备用。将生长健壮的‘C029’生根组培苗从瓶中取出，放置于配置好的NaCl溶液中，分别于0h、0.5h、2h、4h、6h、12h、24h时，取‘C029’组培苗的第三、四枚叶片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，以未处理组培苗作为对照。（2）干旱胁迫：配置20%的PEG6000溶液，0.22μm过滤备用。将生长健壮的‘C029’生根组培苗从组培瓶中取出，放置于配置好的PEG溶液中，分别于0h、0.5h、2h、4h、6h、12h、24h时取‘C029’组培苗的第三、四枚叶片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，以未处理组培苗作为对照。（3）高温胁迫：将生长健壮的‘C029’生根组培苗放置于42℃培养箱中，分别于0h、0.5h、2h、4h、6h、12h、24h时取‘C029’组培苗的第三、四片枚片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，以未处理组培苗作为对照。（4）低温胁迫：将生长健壮的‘C029’生根组培苗放置于4℃冰箱中，分别于0h、0.5h、2h、4h、6h、12h、24h时取‘C029’组培苗的第三、四片枚片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，以未处理组培苗作为对照。16 沈阳农业大学硕士学位论文2.3.3激素处理（1）乙烯利（Eth）处理：配置0.5g·L-1的Eth溶液，0.22μm过滤备用。取生长健壮的菊花‘C029’组培苗，将配置好的Eth溶液均匀喷洒到菊花‘C029’组培苗叶片上，分别于0h、1h、6h、12h、24h、48h时，取‘C029’组培苗的第三、四枚叶片，迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，喷洒清水的组培苗作为对照。（2）水杨酸（SA）处理：配置0.1mM的SA溶液，0.22μm过滤备用。取生长健壮的菊花‘C029’组培苗，将配置好的SA溶液均匀喷洒到菊花‘C029’组培苗叶片上，分别于0h、1h、6h、12h、24h、48h时，取‘C029’组培苗的第三、四枚叶片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，喷洒清水的组培苗作为对照。（3）茉莉酸甲酯（MeJA）处理：配置50μM的MeJA溶液，0.22μm过滤备用。取生长健壮的菊花‘C029’组培苗，将配置好的MeJA溶液均匀喷洒到菊花‘C029’组培苗叶片上，分别于0h、1h、6h、12h、24h、48h时，取‘C029’组培苗的第三、四枚叶片迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，喷洒清水的组培苗作为对照。2.3.4菊花白色锈病病原菌处理采用手指涂抹法，对抗病品种‘C029’组培苗，进行菊花白色锈病病原菌接种处理，在接菌后0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h时，摘取处理后的叶片，迅速放入液氮中后，-80℃冰箱保存，提取总RNA，未接菌的组培苗作为对照。2.3.5菊花叶片RNA的提取采用植物总RNA提取试剂盒，进行菊花叶片总RNA的提取。2.3.5.1实验前准备（1）RL裂解缓冲液在使用前加入1%β-巯基乙醇。现用现配。（2）在漂洗液RW中加入无水乙醇。（3）配置DNaseⅠ工作液，DNaseⅠ储存液1：1加入RDD溶液，轻柔混匀。现用现配。2.3.5.2RNA提取步骤17 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析（1）取不超过100mg液氮速冻好的菊花叶片（分别经过非生物胁迫处理、激素处理、白色锈病病原菌处理及未处理对照），放入研钵中加入液氮研磨成粉，之后迅速转移到用液氮冷冻过的2mlRNase-Free离心管中，此过程要迅速，且样品不可解冻，不可反复冻融。（2）离心管中加入480μl现配制的裂解缓冲液RL，漩涡剧烈震荡混匀，在56℃水浴锅中孵育2min，有助于菊花叶片组织裂解，然后低温12,000rpm（～13,400×g）离心2min。（3）将离心后的上清液转移至过滤柱CS上（注意不要触碰到收集管底部细胞碎片颗粒），低温12,000rpm（～13,400×g）离心5min。（4）吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，不要碰到收集管底部的细胞碎片沉淀。（5）缓慢滴加0.5倍体积的-20℃冰箱保存的无水乙醇，混匀，此时有可能会出现沉淀，将溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，低温12,000rpm（～13,400×g）离心2min。（6）倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，低温12,000rpm（～13,400×g）离心1min。（7）倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。加入80μl现配制的DNaseⅠ工作液，室温放置15min，充分消化DNA。（8）向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，低温12,000rpm（～13,400×g）离心1min。（9）倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm（～13,400×g）离心1min。（10）倒掉收集管中的废液，将CR3放回收集管中。再漂洗一次，同步骤9。（11）弃掉收集管，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，室温放置5min，以彻底晾干残余漂洗液中的乙醇。（12）向吸附柱的中间部位悬空滴加30μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，得到RNA溶液。（13）将RNA溶液置于-80℃超低温冰箱保存，取2μl总RNA，分别进行琼脂18 沈阳农业大学硕士学位论文糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测RNA提取效果。2.3.6RNA质量的检测（1）RNA的完整性检测1%琼脂糖凝胶的制备：三角瓶中加入0.2g琼脂糖，加入20mlTBE电泳缓冲液，用微波炉中高火加热，沸腾3-4次，每次沸腾后取出混匀液体（不要剧烈摇动，防止爆沸），观察无琼脂糖颗粒即为完全溶解，冷却至60℃左右，加入1μlGoldView，混匀后倒入制胶槽（切勿产生气泡，若有气泡需用枪头轻轻挑出），室温静止放置30min，待其充分凝固后拔出梳子即可使用。取1μl提取的RNA，与1μl10×loadingbuffer混匀后，加入琼脂糖凝胶的胶孔中，设定电压120V，进行20min恒压电泳，凝胶成像仪上打开紫外灯观察凝胶电泳图，拍照保存结果。若图中有28SrRNA与18SrRNA两条带，28S亮度是18S的两倍左右，且后面没有拖带或弥散，说明RNA的完整性较好。（2）RNA的纯度、浓度使用Nanodrop2000分光光度计检测RNA的浓度和纯度，做好空白对照后，取1μlRNA到检测基座上，电脑上的软件读取吸光值OD260、OD280，通过测量OD260值确定RNA浓度，用OD260/OD280比值（在1.8-2.0范围内为合适）确定RNA纯度的高低。2.3.7反转录合成cDNA第一链的合成采用TAKARA宝生物工程（大连）有限公司的RNA反转录试剂盒PrimeScript™1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒进行反转录（1）反应混合液的配置：OligodTPrimer（50μM）或Random6mers（50μM）1μldNTPMixture（10mMeach）1μl模板RNATotalRNA:5μlRNasefreeddH2O至10μl（2）65℃水浴锅保温5min后，冰上迅速冷却。（3）转录反应液配置：上述变性后反应液10μl5×PrimeScriptBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl19 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析PrimeScriptRTase(200U/μl)1μlRNasefreeddH2O至20μl（4）缓慢混匀。（5）在PCR仪中，42℃60min，95℃5min。将反转录产物冰上冷却5min，置于-20℃保存。2.3.8实时荧光定量PCR分析采用实时荧光定量试剂盒SYBR®PremixExTaqTMⅡ（TliRNaseHPlus），对不同处理下基因CmHSP和CmHSPL的表达情况进行实时荧光定量PCR分析，扩增反应体系为20μl，定量PCR管中分别加入：cDNA模板2μlSYBRPremixExTaq10μlForwardPrimer0.8μlReversePrimer0.8μlROXReferenceDye0.4μlddH2O至20μl涡漩震荡混匀后瞬时离心，置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为：95℃30s；95℃5s,60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s时进行荧光信号采集。其中内参基因Actin的实时荧光定量引物序列分别为：ActinF5'CCACTTAATCCAAAAGCCAA3'ActinR5'ACCATCACCAGAATCCAACA3'热激蛋白实时荧光定量引物序列分别为：HSPLF5'TGAGTTCACGGAGGAAAA3'HSPLR5'GCATCAATAACAAATGGC3'HSPF5'GAACAATCCTGATGAAAAGC3'HSPR5'ATTCCAAGCAGAGATAAACC3'WRKY-F5'TCACATGCCTTAGACCTCAATCTT3'WRKY-R5'TATCCGACTTAAATCCCCAACC3'2.4结果与分析2.4.1菊花叶片总RNA的提取质量检测利用RNA提取试剂盒，成功提取出了菊花根、茎、叶片的总RNA，经过1%琼20 沈阳农业大学硕士学位论文脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2-1，提取的菊花总RNA中的28SrRNA和18SrRNA两条带非常清晰，且无拖尾和弥散现象，DNA消化干净。另外利用Nanodrop分光光度计测得OD260/OD280值均在1.8-2.0之间。因此所获得的菊花总RNA符合后续试验核酸质量要求，可以进行反转录等试验。根茎叶28SrRNA18SrRNA图2-1‘C029’根、茎、叶总RNA电泳图Fig.2-1ElectrophoresisoftotalRNAof‘C029’root,stemandleaf2.4.2CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因组织特异性分析图2-2CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的组织特异性分析Fig.2-2TissuespecificexpressionanalysisofCmHSP,CmHSPLandCmWRKYgene提取长势良好的高抗品种‘C029’组培苗根、茎、叶总RNA，以Actin基因为内参基因，进行实时荧光定量PCR检测，分析CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在不同组织中的表达水平。荧光定量结果显示（如图2-2），CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在根、茎、叶中均有表达，但表达量不同。其中，CmHSP基因在根中表达量最高，为茎中表达量的2倍，为叶中表达量的6.25倍。CmHSPL基因在根中表达量最高，为叶中表达量的2倍，为茎中表达量的5倍。菊花CmWRKY基因在叶中表达量最高，21 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析为茎中表达量的4.14倍，为根中表达量的27.3倍。2.4.3CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因受非生物胁迫诱导下表达特异性分析qRT-PCR分析结果表明（如图2-3），在250mMNaCl高盐浓度处理下，CmHSP和CmHSPL基因表达模式相似，但表达量存在差异。CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达量在0-24h呈现先上升后下降的趋势，三个基因的表达量均在2h时达到峰值，分别为对照组的4.0倍、21.9倍和1.5倍。在2h后表达量开始下降，并于4h表达量趋于稳定，说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因明显受高盐诱导。其中CmHSPL基因表达量在高盐处理2h时急剧上升，达到对照组的21.9倍，且在4h到24h表达量均保持对照组的5倍。图2-3CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在高盐（250mMNaCl）胁迫下的表达Fig.2-3CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetohighsalttreatmentqRT-PCR分析结果表明（如图2-4），在浓度为20%的PEG6000模拟干旱处理下，CmHSP和CmHSPL基因表达模式相似。CmHSP和CmHSPL基因在模拟干旱胁迫0-24h的转录水平均未出现高表达，表达量呈现先下降后上升再下降的趋势，两基因均在0.5h时表达量最低，表达量为对照组0.3倍和0.4倍。在0.5h后表达量上升，在4h表达量最高，为对照组的0.6倍和0.8倍，在6h后表达量趋于稳定，说明两热激蛋白基因不受干旱胁迫的诱导表达，且两热激蛋白基因表达量受到干旱胁迫抑制而下调表达。干旱处理后CmWRKY基因转录水平未出现高表达，0-24h表达量呈现先上升22 沈阳农业大学硕士学位论文后下降再上升的趋势，在2h达到最高，为对照组的1.2倍，2h后表达量迅速下降，在4h表达量为对照组的0.22倍，在6-24h内逐渐上升到对照组的0.4倍，说明CmWRKY基因受干旱胁迫的诱导表达不明显。图2-4CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在干旱胁迫下的表达Fig.2-4CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetodroughttreatmentqRT-PCR分析结果表明（如图2-5），在42℃高温处理下，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的表达量均存在显著变化，但响应时间不同。0-24h表达量均呈现先上升后下降的趋势，CmHSP和CmHSPL基因在2h时达到峰值，分别为对照组的408倍和583倍；CmWRKY基因在0.5h时达到峰值，为对照组的13倍。CmHSP和CmWRKY基因在处理0.5h后时表达量显著上升，CmHSPL基因在处理2h时后表达量显著上升，且CmHSP基因在4h后呈现稳步下降趋势；CmHSPL基因在4h后呈现先上升再下降的趋势；CmWRKY基因在4-24h趋于稳定，表达量为对照组的3.9倍。说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因明显受到高温诱导且表达量快速上升，但三个基因表达模式不同，CmHSP和CmWRKY基因响应高温胁迫速度比CmHSPL基因更快，但CmHSPL基因在6-24h稳定维持较高表达量。随着高温处理时间的增加，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因相对表达量下降的原因可能是其长时间表达对菊花不利，适应高温环境后其表达下调。23 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析图2-5CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在高温胁迫下的表达Fig.2-5CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetohightemperaturetreatment图2-6CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在低温胁迫下的表达Fig.2-6CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetolowtemperaturetreatmentqRT-PCR分析结果表明（如图2-6），在4℃低温处理下，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达模式相似，三个基因在0-24h均呈现先下降后上升的趋势，均未出现高表达，在4h时最低，分别为对照组的0.07、0.1倍和0.18倍，在6h后表达量有24 沈阳农业大学硕士学位论文所回升但均低于对照组，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达量受到低温胁迫抑制而下调表达。综上所述，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的表达受高盐和高温胁迫诱导，受高盐胁迫2h时，分别为对照组的4.0倍、21.9倍和1.5倍；受高温胁迫0.5h时，CmWRKY基因达到峰值，为对照组的13倍，高温胁迫2h时CmHSP和CmHSPL基因达到峰值，分别为对照组的408倍和583倍，说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在菊花受到环境胁迫时，特别是高温胁迫时发挥着重要作用。而三基因的表达受低温胁迫时表达下调，说明低温胁迫抑制了三个基因的表达。干旱胁迫抑制CmHSP和CmHSPL基因表达，而CmWRKY基因受其诱导表达不明显。2.4.4CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在外源激素诱导下表达特异性分析qRT-PCR分析结果表明（如图2-7），在乙烯利（Eth）处理下CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达模式相似，但表达量存在差异。三个基因在0-48h表达量均出现先上升后下降的趋势，在处理1h时CmWRKY基因表达量达到最高，为对照组的5.3倍；在处理6h时CmHSP和CmHSPL表达量均达到最高，分别为对照组的1.7倍和3.3倍，说明CmHSPL基因和CmWRKY基因受Eth诱导响应更明显。三个基因表达量均在6h后开始下降，且均在24h时表达量达到最低值，于48h时表达量趋于稳定。图2-7CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对乙烯利响应表达分析Fig.2-7CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetoEthtreatment25 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析qRT-PCR分析结果表明（如图2-8），在水杨酸（SA）处理下CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达模式相似，但表达量存在差异。三个基因在0-48h表达量均出现先上升后下降再上升的趋势，其中CmWRKY基因表达量在处理1h时达到最高，为对照组的4.1倍；CmHSP和CmHSPL基因表达量在6h时均达到峰值，分别为对照组的9.3倍和3.9倍。CmHSP和CmHSPL基因在6h后表达量下降，并分别于12h时和24h时表达量最低，分别为对照组的0.8倍和1.0倍；CmWRKY基因在处理1h后表达量下降并在6h后趋于稳定，为对照组的0.9-1.1倍。说明三个基因明显受SA诱导，而CmHSP基因受SA诱导效果更为明显。图2-8CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对水杨酸响应表达分析Fig.2-8CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetoSAtreatmentqRT-PCR分析结果表明（如图2-9），在茉莉酸甲酯（MeJA）处理下，CmHSP和CmHSPL基因表达模式及表达量均相似，CmWRKY基因表达模式与热激蛋白不同。CmHSP和CmHSPL基因表达量在0-48h均出现先上升后下降再上升再下降的趋势，CmHSP和CmHSPL在6h时表达量为对照组的4.73倍和4.17倍，6h后两基因表达量开始下降，并在12h后表达量再次升高，两基因均在24h时表达量最高，分别为对照组的60倍和52倍，并在48h时表达量下降。0-48hCmWRKY基因表达量呈现先上升后下降的趋势，MeJA处理后表达量迅速升高，在1h时表达量达到峰值，为对照组的7.8倍，之后表达量逐渐降低并在48h时表达量达到最低，为对照组的0.5倍。说明26 沈阳农业大学硕士学位论文CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因明显受MeJA诱导。图2-9CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对茉莉酸甲酯响应表达分析Fig.2-9CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetoMeJAtreatment综上所述，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因受Eth，SA和MeJA诱导表达。CmHSP和CmHSPL基因受SA和MeJA诱导响应明显，在SA处理6h时两基因表达量均达到最高，分别为对照组的9.3倍和3.9倍；在MeJA处理24h时两基因表达量均达到最高，分别为对照组的60倍和52倍。受Eth诱导响应不明显，在处理6h时表达量均达到最高，分别为对照组的1.7倍和3.3倍。CmWRKY基因的表达受Eth，SA和MeJA胁迫诱导响应迅速，均在处理后1h时CmWRKY基因的表达量达到最高，分别为对照组的5.3倍、4.1倍和7.8倍。2.4.5CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在白色锈病病原菌诱导下表达特异性分析为了研究CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对菊花白色锈病病原菌的响应模式，以高抗品种‘C029’作为试材，通过实时荧光定量方法，检测两基因在菊花白色锈病病原菌诱导下的表达水平。qRT-PCR分析结果表明，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在菊花抗病品种中受白色锈病的诱导表达模式相同（如图2-10），在0-96h表达量呈现先上升后下降的趋势。CmHSP基因在接种病原菌后迅速反应，接种1h时表达量就为对照组的2.9倍，27 第二章CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因表达分析并于4h时表达量达到最高，为对照组的21.1倍，至36h时表达量虽呈下降趋势，但是均高于对照组数倍；CmHSPL基因在接种4h前表达量与对照组持平，之后表达量迅速升高，于6h时表达量达到最高，为对照组的10.4倍；CmWRKY基因在接菌后表达量迅速升高，在1h时达到最高值，为对照组的426倍。CmHSP和CmHSPL基因分别在4h和6h后表达量开始下降，并在18h后表达量趋于稳定并逐渐下降，CmHSPL基因受白色锈病病原菌诱导响应稍微滞后；CmWRKY基因在2-6h表达量降低且表达量趋于稳定，为对照组的50倍，在6-18h期间开始下降，在18h为对照组的2.4倍，24h时CmWRKY基因表达量又升高，为对照组的7.6倍；之后表达量逐步下降，至96h时CmWRKY基因的表达量下降至对照组的1.7倍左右。说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因可能与菊花受白色锈病应答反应有关，但响应速度不同。对照组表达量基本无变化，表明正常情况下该基因在植物体内维持低水平表达，以调节基本代谢，当受到病原菌或非生物胁迫时，表达量便会被上调，推测CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因与菊花抗白色病相关免疫应答关系密切。图2-10CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对白色锈病病原菌诱导表达分析Fig.2-10CmHSP,CmHSPLandCmWRKYgeneexpressioninresponsetowhiterustpathogentreatment综上所述，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在菊花抗病品种中存在差异表达，但表达量均较高，分别于处理4h时、6h时和1h时表达量达到最高，分别为对照组的21.1倍、10.4倍和426倍，说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因均参与了菊花白色锈病的抗病反应，参与植株的抗性防卫反应。另外，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对多个逆境因子（高盐、高温、乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸、白色锈病菌）都28 沈阳农业大学硕士学位论文有响应，表明他们可能在植物体内防卫信号转导途径调控网络中起重要作用。2.5小结（1）利用试剂盒成功提取出各处理下菊花叶片的总RNA，且未处理的菊花根茎叶中总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，28SrRNA和18SrRNA两条带非常清晰，且无拖尾和弥散现象，DNA消化干净。利用Nanodrop紫外分光光度计测得OD260/OD280值均在1.8-2.0之间，RNA质量合格可用于后续实时荧光定量分析试验。（2）实时荧光定量分析表明，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因的表达受高盐和高温胁迫诱导，受高盐胁迫2h时，分别为对照组的4.0倍、21.9倍和1.5倍；受高温胁迫0.5h时，CmWRKY基因达到峰值，为对照组的13倍，高温胁迫2h时CmHSP和CmHSPL基因达到峰值，分别为对照组的408倍和583倍，说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在菊花受到环境胁迫时，特别是高温胁迫时发挥着重要作用。而三基因的表达受低温胁迫时表达下调，说明低温胁迫抑制了三个基因的表达。干旱胁迫抑制CmHSP和CmHSPL基因表达，而CmWRKY基因受其诱导表达不明显。（3）实时荧光定量分析表明，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因受Eth，SA和MeJA诱导表达。CmHSP和CmHSPL基因受SA和MeJA诱导响应明显，在SA处理6h时两基因表达量均达到最高，分别为对照组的9.3倍和3.9倍；在MeJA处理24h时两基因表达量均达到最高，分别为对照组的60倍和52倍。受Eth诱导响应不明显，在处理6h时表达量均达到最高，分别为对照组的1.7倍和3.3倍。CmWRKY基因的表达受Eth，SA和MeJA胁迫诱导响应迅速，均在处理后1h时CmWRKY基因的表达量达到最高，分别为对照组的5.3倍、4.1倍和7.8倍。（4）实时荧光定量分析表明，CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因在菊花抗病品种中存在差异表达，但表达量均较高，分别于处理4h时、6h时和1h时表达量达到最高，分别为对照组的21.1倍、10.4倍和426倍，说明CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因均参与了菊花白色锈病的抗病反应，参与植株的抗性防卫反应。（5）CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因对多个逆境因子（高盐、高温、乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸、白色锈病菌）都有响应，表明他们可能在植物体内防卫信号转导途径调控网络中起重要作用。29 第三章CmWRKY基因表达载体构建第三章CmWRKY基因表达载体构建CmWRKY基因受激素、物理伤害、生物以及非生物胁迫诱导表达，在植物防卫反应信号途径和激素信号途径中有着重要参与，对植物的生长发育以及抗逆性有着重要的调节作用。在本研究中CmWRKY基因响应菊花白色锈病病菌诱导表达量高，响应迅速，且多有研究表明WRKY转录因子在参与多种生物胁迫，在多种植物的抗性防卫反应中有着重要作用，因此对CmWRKY基因建立农杆菌表达载体，为基因功能验证奠定基础。3.1试验材料试验于2016-2017年在沈阳农业大学林学院进行，菊花白色锈病高抗品种‘C029’，由沈阳农业大学林学院花卉基地提供。3.2试验试剂与仪器3.2.1试验试剂（1）TAKARA公司：DL2000DNAMarker（产品货号：3427A）、DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶XbaⅠ、SacⅠ，T4DNA连接酶。（2）梓熙生物有限公司：10×DNAloadingbuffer（货号：D1020）、核酸染料GoldViewI（货号：G8140）。（3）Invitrogen公司：琼脂糖（货号75510019）、AgarA琼脂粉、β-巯基乙醇。（4）OXOID公司：胰蛋白胨、酵母提取物。（5）Amresco公司：蔗糖、MgSO4·7H2O、Tris-base、Na2EDTA·2H2O、硼酸。（6）沈阳农业大学：超纯水，无水乙醇。3.2.2菌株与载体植物表达载体PBI121和根癌农杆菌EHA105型菌株由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根公司。3.2.3溶液的配制（1）YEB液体培养基：称取5g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g蔗糖，0.04gMgSO4·7H2O，加入ddH2O充分溶解后定容到1L，pH值调至7.0，121℃灭菌15min后置于4℃冰箱中保存备用。30 沈阳农业大学硕士学位论文（2）YEB固体培养基：在YEB液体培养基的成分基础上，1L加入15g的琼脂粉。（3）5×TBE电泳缓冲液：称取54gTris-base、3.72gNa2EDTA·2H2O、27.5g硼酸加入ddH2O充分溶解后，定容至1L，室温保存。（4）LB液体培养基：称取的1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，1gNaCl加入ddH2O充分溶解后定容至100mL，调pH值至7.0中性，121℃灭菌15min后置于4℃冰箱中保存备用。（5）LB固体培养基：在LB液体培养基成分的基础上，1L加入15g的琼脂粉。3.2.4试验仪器主要仪器设备：Steponeplus实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔公司）、BOX:F3型凝胶成像系统（美国SYNGENE）、Biometra070-851PCR仪（北京爱思普仪器有限公司）、Centrifuge5804R多功能高速低温离心机（德国艾本德公司）、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、ALC-210.3型ACCULAB电子天平（北京奥赛多利公司）、DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）、移液枪（生工生物工程公司）、MDF-U32V型超低温冰箱（日本SANYO）、KG-SX-500型高压灭菌锅（日本TOMY）、DL-CJ-1NDⅡ单面普及型洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、Nanodrop2000紫外分光光度计（赛默飞世尔公司）。3.3试验方法3.3.1菊花CmWRKY基因表达载体构建3.3.1.1CmWRKY基因的引物设计根据课题组前期转录组测序结果，利用Primer5.0软件进行目的基因CmWRKY的特异性引物（含XbaI、SacI酶切位点和保护碱基）设计，用于CmWRKY基因植物表达载体构建的上、下游引物分别记为A1、A2，引物序列如下：A1-F5'CATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGTGGCTGCATCAC3'A2-R5'GTTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAACATACTTTGAATA3'3.3.1.2CmWRKY基因的PCR扩增采用PCR方法以2μlcDNA为模板进行扩增以获取目的条带，PCR反应于20μl反应体系中进行，PCR体系如下：31 第三章CmWRKY基因表达载体构建cDNA模板2μl2×PCRTaqmix10μlA1-FPrimer（10μM）1μlA2-RPrimer（10μM）1μlddH2O至20μlPCR程序为：①94℃预变性5min；②94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；③72℃延伸10min。3.3.1.3pBI121-CmWRKY载体构建按照DNA磁珠法凝胶回收纯化试剂盒说明书进行CmWRKY基因PCR产物的切胶回收与纯化。分别对凝胶回收后的CmWRKY基因和pBI121载体分别进行XbaI、SacI双酶切，酶切体系如下，37℃进行酶切。之后16℃条件下恒温连接16h。然后转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆交由北京梓熙生物科技有限公司测序。3.3.2农杆菌的转化及筛选3.3.2.1pBI121-CmWRKY质粒的提取利用天根质粒小提试剂盒进行重组质粒pBI121-CmWRKY的提取，为转化农杆菌做准备。步骤如下：（1）平衡吸附柱：向吸附柱CP3中加入500μlBL平衡液，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中，备用。（2）收集菌体：取3.3.5.3送测序后剩余的4ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，去除上清收集菌体。再次加入菌液离心至全部收集在一个离心管中。（3）重悬菌体：向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（确认加入RNA酶RNaseA），使用涡旋振荡器彻底重悬细菌沉淀。（4）碱裂解菌体：向离心管中加入250μl溶液P2，温和地（不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断）上下翻转6-8次，进行菌体裂解。（5）酸中和：向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，中和裂解液，此时出现白色絮状沉淀，12,000rpm（~13,400×g）离心10min。（6）离心后的上清液转移到平衡好的吸附柱CP3中，注意不要吸出沉淀。12,00032 沈阳农业大学硕士学位论文rpm（~13,400×g）离心1min。（7）倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。加入600μl漂洗液PW（确认漂洗液PW中加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心1min，（8）重复操作步骤（7）。（9）倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。12,000rpm（~13,400×g）空离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。（10）弃掉收集管，将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μlddH2O进行洗脱，室温放置2min后，12,000rpm（~13,400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。（11）用Nanodrop2000紫外分光光度计测定提取的质粒pBI121-CmWRKY的浓度，并-20℃保存。3.3.2.2农杆菌感受态细胞的制备（1）待菌落长出后，挑取农杆菌的单菌落，将含有单菌落的白色枪头置于含3ml的YEB液体培养基（含50mg/ml的利福平Rif）的15ml无菌离心管中，将离心管置于恒温振荡培养箱中28℃，180rpm/min培养大约24h至OD600值达到0.6-0.8。（2）吸取3μl震荡结束后的菌液加入到50mlYEB液体培养基中（含有50mg/ml的Rif），继续置于恒温振荡培养箱中（条件不变），继续震荡培养18-36h至OD600=0.5。（3）以5,000rpm/min将菌液离心（常温即可）5min，倒掉上清，收集管底菌体沉淀。（4）在以上得到的离心管中（含有沉淀）加入10ml0.15M预冷好的无菌NaCl溶液，稀释农杆菌细胞，随后5000rpm/min再次离心5min（常温即可）。（5）在离心管中加入1ml含15%甘油的、经过预冷的20mMCaCl2悬浮细胞，100μl/管进行分装保存。制好的农杆菌感受态最好当天使用，短期储存可放置于-20℃冰箱中保存，长期储存需经液氮速冻后转-80℃超低温冰箱保存。3.3.2.3农杆菌的转化（1）从-80℃冰箱中取出自制的农杆菌感受态，放于冰上融化。（2）每管农杆菌感受态加入1μg构建好的重组质粒pBI121-CmWRKY混匀，依次在冰上静置10min、液氮冷冻5min、37℃5min、冰浴5min，利用冻融法进行质粒转33 第三章CmWRKY基因表达载体构建化。（3）加入700μl无抗生素的LB液体培养基，28℃振荡培养2-3h。（4）5,000rpm离心1min收取菌体，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬沉淀，将其涂布于含利福平和卡那霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3d。3.3.2.4菌液PCR鉴定农杆菌进行菌液PCR鉴定重组质粒pBI121-CmWRKY是否成功转化农杆菌。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.4结果与分析3.4.1菊花pBI121-CmWRKY载体构建CmHSP基因在接种病原菌后迅速反应，于4h时表达量达到最高，为对照组的21.1倍；CmHSPL基因在接种病原菌后于6h时表达量达到最高，为对照组的10.4倍；CmWRKY基因在接菌后表达量迅速升高，在1h时达到最高值，为对照组的426倍。为了深入研究CmWRKY基因的抗白色锈病功能，进行了载体构建及农杆菌转化。3.4.1.1pBI121-CmWRKY重组质粒鉴定提取pBI121-CmWRKY质粒，进行XbaI-SacI双酶切验证，酶切后在800bp左右，有一条目的带（如图3-1），证明重组质粒上可以双酶切下CmWRKY基因。123bp45003000200012008005002001：质粒DNAplasmidDNA；2：双酶切DigestedwithXbaI/SacI；3：DNAmarker图3-1质粒pBI121-CmWRKY双酶切结果Fig.3-1ThevectorpBI121-CmWRKYwasdigestedwithrestrictionenzymeXbaI/SacI3.4.1.2pBI121-CmWRKY重组质粒的测序结果CmWRKY基因的测序结果与课题组前期获得的转录组数据进行Blast比对，CmWRKY基因序列完全正确，表明重组载体pBI121-CmWRKY构建成功（如图3-2）。34 沈阳农业大学硕士学位论文图3-2pBI121-CmWRKY载体图谱Fig.3-2pBI121-CmWRKYvectormap3.4.2菊花pBI121-CmWRKY重组质粒转化农杆菌挑取3个pBI121-CmWRKY质粒转化农杆菌后的单克隆，过夜震荡摇菌后，进行菌液PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图3-3），在800bp左右出现目的条带，证明pBI121-CmWRKY重组质粒转化农杆菌成功。bpM12320001000750500250100M：DNAmarker；1：1号菌；2：2号菌；3：3号菌图3-3pBI121-CmWRKY转化农杆菌菌液PCR结果Fig.3-3Agrobacteriumtumefaciensliquid-culture-treated-PCRresultofpBI121-CmWRKY3.5小结（1）构建了农杆菌重组表达载体pBI121-CmWRKY，经测序比对完全正确。35 第三章CmWRKY基因表达载体构建（2）利用CaCl2将农杆菌制备成感受态细胞，之后用冻融法将构建成功的重组质粒pBI121-CmWRKY转化到农杆菌中，经菌液PCR验证，成功转化，为后续试验浸染拟南芥获得转基因植株奠定基础，以便于研究该基因的功能。36 沈阳农业大学硕士学位论文第四章结论与讨论4.1讨论目前对于菊花白色锈病的分子机理研究较少。王顺利（2008）等在对菊花抗病品种资源的鉴定和评价基础上，在菊花抗病品种与菊花白色锈病互作中进行了转录谱分析，对差异表达基因进行克隆并分析，结果显示在菊花接种白色锈病后，93个基因受到诱导表达量升高，67个基因表达受抑制表达量降低，在克隆得到的PIF序列中部分序列具有已知同源性，同源序列的功能涉及到抗病基因、大分子蛋白伴侣等，对于了解菊花与白色锈病互作有着重要作用。黄河等（2012）以菊花白色锈病免疫品种‘紫荷’为材料，利用cDNA-AFLP技术分析了接种白色锈病后的差异表达基因，并对其中80个显著差异表达的基因进行测序，Blast比对发现其中18个序列与已报道抗病基因有着较高同源性，其功能涉及到抗病、信号传导以及植物代谢等，有助于菊花抗白色锈病的分子研究。Dong等（2018）对菊花抗（C029）、感（C008）品种进行转录组测序，得到14个差异表达基因，其中13个基因在两比较组中表现出相反的变化趋势。本实验从该14个差异表达基因中根据基因功能筛选出了CmHSP、CmHSPL和CmWRKY基因进行深入研究，为今后的抗病菊花品种培育工作奠定基础。本研究主要利用实时荧光定量PCR技术分析CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受非生物胁迫、植物激素诱导、生物胁迫过程中的表达模式，RNA质量的好坏严重影响该试验的结果。所以在RNA提取过程中为获得高质量的RNA且防止提取过程中RNA的降解，预防RNase污染，对提取所需的试验耗材进行高压灭菌及提前预冷，所使用的仪器设备进行75%乙醇擦拭，整个提取操作在超净工作台上低温环境进行，需要戴一次性口罩和手套操作，试验过程中要勤换手套。尽可能降低RNA酶活性至消除RNA酶的影响，获得较好的提取环境及高质量的RNA。在菊花抗病品种‘C029’中接种菊花白色锈病病原菌后，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因都大量表达，但表达模式不同。CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因受菊花白色锈病菌的生物诱导，且表达量较高，响应迅速，均在处理6h内完成高量表达，CmHSP和CmHSPL基因分别于处理4h时和6h时表达量达到最高，为对照组的21.1倍和10.4倍；而CmWRKY基因在1h时表达量即达到最高值，为对照组的426倍，说明三个基因均参与菊花白色锈病的抗病反应参与植株的抗性防卫反应。37 第四章结论与讨论这可能不仅与病原菌诱导有关，可能还受植物本身的抗性影响。有研究表明，WRKY转录因子是很多植物免疫系统中的核心组成部分。另外CmHSP和CmHSPL基因及CmWRKY基因对多个逆境因子（高盐、高温、茉莉酸甲酯、水杨酸、白色锈病菌）都有响应表明他们可能在植物体内防卫信号转导途径调控网络中起重要作用。由于本研究中CmWRKY基因响应菊花白色锈病病菌诱导表达量高，响应迅速，且多有研究表明WRKY转录因子在参与多种生物胁迫，在多种植物的抗性防卫反应中有着重要作用，因此本实验对于CmWRKY基因进行了转化农杆菌，构建载体等进一步深入研究，对于CmWRKY基因的后续研究奠定基础。本研究中，CmHSPL基因在菊花受高盐胁迫下表达量增加，在2h表达量最高，为对照组的21.9倍，后表达量下降但持续高表达，与董先娟等（2016）在白木香中克隆的热激蛋白基因对盐胁迫的响应相符。在高温胁迫下，CmHSP基因在受胁迫后表达量迅速升高，与罗昌等（2016）在甘菊叶片中的ClHSP90基因在热激处理下的表达相符。在干旱和低温条件下，CmHSP和CmHSPL基因在胁迫下表达量下降后稍有回升，说明CmHSP和CmHSPL基因不受干旱和低温诱导表达，甚至干旱和低温条件抑制CmHSP和CmHSPL基因表达，与栗振义（2015）在紫花苜蓿中对热激蛋白基因MsHSP70在干旱胁迫下的响应、郭会娜（2014）在巴西橡胶树中对小热激蛋白HbsHSP17在低温胁迫下的响应相符。而热激蛋白是家族蛋白质，在细胞中的分布位置不同，对于胁迫的响应不同，如Xiao等（2009）发现干旱胁迫下，杨树中大部分热激蛋白显著上调表达，极少量的热激蛋白下调表达，而这些热激蛋白的下调表达可能是因为其调控信号转导途径中基因下调表达。两热激蛋白基因的表达受干旱和低温胁迫时表达下调，说明干旱和低温胁迫抑制了两热激蛋白基因的表达。其原因可能是：CmHSP和CmHSPL基因调控干旱及低温时相关基因的下调表达，所以表达量下降，而植株适应低温环境时，又逐步上升。CmWRKY基因在高盐胁迫条件下表达量迅速升高，在2h达到最高，为对照组的7.5倍，后表达量下降，在12h时再次升高，与范昕琦（2015）在WRKY基因耐盐性研究结果相符。CmWRKY基因在高温胁迫下表达量迅速升高，在0.5h时达到对照组的13倍，后表达量逐渐降低，与谷彦冰（2016）在苹果WRKY基因受高温诱导高度表达结果相符，说明CmWRKY基因可能参与了菊花对高温、高盐胁迫的反应。而在38 沈阳农业大学硕士学位论文PEG模拟干旱和低温诱导下CmWRKY基因表达量降低，而CmWRKY基因受干旱胁迫的诱导表达不明显，受低温胁迫时表达下调，这与马会（2013）在小麦TaWRKY12基因在逆境胁迫诱导表达结果高度相符，在干旱和低温处理下表达量下调，说明低温胁迫抑制了CmWRKY基因的表达。王晨（2013）在小麦中克隆的TaWRKY1-10基因在高盐胁迫下进行表达分析，结果显示TaWRKY9和TaWRKY10基因可以被高盐，低温和干旱胁迫诱导，而TaWRKY6基因可以被低温和干旱处理诱导，TaWRKY1,4,8只能被一种胁迫诱导表达，说明了同一物种中的不同WRKY基因都相同胁迫的应答模式有着很大差异，而同一WRKY基因对于不同逆境胁迫应答模式也有着较大差异。CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因的表达均受乙烯利，水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫诱导，CmHSP和CmHSPL基因受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导响应明显，而受乙烯利胁迫响应不明显。CmWRKY基因的表达受乙烯利，水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫诱导响应迅速，均在处理后1h时CmWRKY基因的表达量达到最高。这与谷彦冰（2016）在苹果WRKY基因受激素诱导表达结果高度相符，同时与刘震（2016）从番茄中提取出的SpWRKY6基因在受激素诱导后表达模式相同，说明CmHSP和CmHSPL以及CmWRKY基因参与乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯的信号通路，并在其中有着重要作用。孙嘉曼（2013）发现水杨酸、茉莉酸甲酯在浓度高于200μg/ml时显著抑制人参锈腐病菌的生长。袁洁（2014）发现水杨酸处理可以有效抑制杏果实在低温冷藏过程中的呼吸速率、降低乙烯利的生成量和ACC的积累量，从而提高杏果实抗冷性、延缓杏果实冷害的发生。这为提高菊花抗冻性和抗白色锈病病原菌的研究奠定基础。4.2结论4.2.1明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受非生物胁迫过程中的表达模式利用实时荧光定量PCR技术，对菊花在非生物胁迫（高盐、干旱、高温、低温）处理后的基因表达模式进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因的表达受高盐和高温胁迫诱导明显；低温胁迫抑制了菊花这三个基因的表达；干旱胁迫抑制CmHSP和CmHSPL基因表达，而CmWRKY基因受其诱导表达不明显。39 第四章结论与讨论4.2.2明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受植物激素诱导过程中的表达模式利用实时荧光定量PCR技术，对菊花进行植物激素诱导（乙烯利、水杨酸、茉莉酸甲酯）处理后的样品进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因以及CmWRKY基因的表达均受Eth，SA和MeJA胁迫诱导，CmHSP和CmHSPL基因受SA和MeJA诱导响应明显，CmWRKY基因的表达受Eth，SA和MeJA胁迫诱导响应迅速。4.2.3明确CmHSP、CmHSPL基因和CmWRKY基因在菊花受生物胁迫过程中的表达模式利用实时荧光定量PCR技术，对菊花进行生物胁迫（菊花白色锈病病原菌）处理后的抗病品种‘C029’进行分析。结果表明，CmHSP和CmHSPL基因以及转录因子CmWRKY基因受菊花白色锈病菌的生物诱导，且表达量较高，响应迅速，这与前期课题组对菊花抗病品种进行的转录组测序的结果一致，说明三个基因均参与菊花白色锈病的抗病反应参与植株的抗性防卫反应。4.2.4构建CmWRKY基因的植物表达载体并转化农杆菌（1）成功构建植物重组表达载体pBI121-CmWRKY。（2）利用CaCl2将农杆菌制备成感受态细胞，之后用冻融法将构建成功的重组质粒pBI121-CmWRKY转化到农杆菌中，为下一步浸染拟南芥获得转基因植株进一步研究该转录因子功能的奠定基础。40 沈阳农业大学硕士学位论文参考文献1.安艳秋,蔺瑞明,冯晶,王凤涛,徐世昌,许玉凤.2011.小麦热激蛋白基因TaHSP70克隆及其在植物防卫和抗逆反应中的表达分析.分子植物育种,9(4):402-409.2.曹智,马骏,袁文俊,林丽.2008.热休克蛋白60与细胞凋亡.生理科学进展,39(3):267-270.3.陈俊愉.2005.中国菊花过去和今后对世界的贡献.中国园林,21(9):73-75.4.陈俊愉.2001.中国花卉品种分类学.北京中国林业出版社,218-219.5.陈文超.2015.嗜盐古生菌hsp70基因的表达及其功能研究.武汉大学.6.邓家术,段彬江,刘中来.2003.植物热激蛋白的研究进展及其应用.生命的化学,23(3):226-228.7.丁世民,席敦芹.2001.菊花白锈病发生规律与药剂防治.植物保护,27(2):20-22.8.丁自立,杨国正,吴金平.2006.作物热激蛋白研究进展及应用.湖北农业科学,45(4):519-521.9.董璐.2016.菊花响应白色锈病病原菌的转录组和表达谱分析.沈阳农业大学10.董先娟,刘晓,张钟秀,张乐,王娟,屠鹏飞,王晓晖,史社坡.2016.白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析.中草药,47(22):54-61.11.范青青,宋爱萍,辛静静,陈素梅,蒋甲福,王银杰,陈发棣.2016.CmWRKY15增加菊花对黑斑病的敏感性.中国观赏园艺研究进展,(1):603-611.12.范文忠,魏国先,孙艳梅.2002.菊花白锈病在吉林市严重发生.植物保护,28(1):20-21.13.范昕琦.2015.旱地棉(Gossypiumaridum)耐盐相关WRKY转录因子的全基因组鉴定、克隆及功能分析.南京农业大学.14.耿兴敏.2014.植物逆境交叉胁迫适应性研究进展.林业工程学报,28(4):14-18.15.谷彦冰.2016.苹果两个WRKY转录因子的克隆和表达分析.中国农业科学院.16.郭会娜.2014.巴西橡胶树小热激蛋白基因克隆、表达及功能研究.海南大学.17.郭丽红,杨晓虹,刘开庆,袁燕.2009.拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立.昆明学院学报,31(6):46-48.18.郭文丽.2010.热激蛋白在作物抗逆境胁迫中的研究进展.教育教学论坛,(6):142-143.19.黄河,王顺利,戴思兰.2012.利用cDNA-AFLP技术鉴定菊花品种‘紫荷’的抗白锈病相关基因.中国农业科学,45(5):926-935.20.蒋明,尹龙飞,张志仙,余沁欣,罗礼礼.2012.二穗短柄草WRKY基因家族成员的鉴定和分析.麦类作物学报,32(6):1013-1020.21.李春子,成善汉.2011.烟草细胞质小分子热激蛋白基因Nt-Hsp17.8.华北农学报,26(4):202-206.22.李胜男.2016.黄瓜CsWRKY30基因在霜霉威胁迫中功能分析.东北农业大学.23.栗颖.2015.8个小麦WRKY转录因子基因的克隆、表达及转录活性分析.华中科技大学.24.栗振义.2015.紫花苜蓿热激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析.中国农业科学院.25.鲁琛.2007.热休克蛋白90调节HEK293细胞中c-Jun蛋白的稳定性的相关研究.南京师范大41 参考文献学.26.卢承琼,曾其伟,向仲怀,何宁佳.2014.桑树小分子热激蛋白基因的鉴定及在逆境胁迫下的表达.蚕业科学,40(6):965-973.27.刘玲玲,柳思思,翁建峰,王昌涛,李新海,张世煌,石庆华,王丽娟,郝转芳.2012.玉米热激蛋白基因ZmHsp90-1的克隆及表达分析.作物学报,(10):1839-1846.28.刘震.2016.番茄SpWRKY6转录因子的抗病功能研究.大连理工大学.29.卢雪征;吴月霞;古燕翔;刘秀平.2016.切花菊白锈病识别及综合防治技术——以北京市延庆区为例.中国植物保护学会.植保科技创新与农业精准扶贫——中国植物保护学会2016年学术年会论文集.30.罗昌,陈东亮,程曦,黄丛林.2016.甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析.西北植物学报,36(7):1321-1330.31.马会.2013.小麦TaWRKY12基因的克隆、表达分析及其遗传转化研究.华中科技大学32.潘佳佳.2010.百合小热激蛋白的克隆及初步分析.兰州大学.33.裴丽丽,徐兆师,尹丽娟,李连城,陈明,郭玉华,马有志.2013.植物热激蛋白90的分子作用机理及其利用研究进展.植物遗传资源学报,14(1):109-114.34.阮孟斌,彭明.2011.植物响应非生物胁迫相关基因的研究进展.热带生物学报,2(4):364-372.35.孙嘉曼.2013.人参锈腐病化学诱导抗性机制及其病原菌分子检测技术研究.沈阳农业大学.36.陶灵珠,黄习军,何敏.1996.菊花白锈病的检疫与防治.中国进出境动植检,(3):15-16.37.王晨.2013.小麦基因组中WRKY转录因子家族基因鉴定、克隆和TaWRKY10基因的功能分析.华中农业大学38.王芳秀,黎舒佳,余迪求.2011.WRKY25过量表达导致拟南芥在长光照下开花提前.植物分类与资源学报,33(6):653-659.39.王国强.2010.小分子热休克蛋白生物学功能的研究进展.安徽农业科学,38(19):9946-9947.40.王顺利,王红利,雷增普,戴思兰.2008.菊花白锈病研究进展.北方园艺,(1):67-70.41.王顺利,刘红霞,戴思兰.2008.菊花白锈病田间药剂防治试验.西北农业学报,17(1):116-119.42.王顺利.2008.菊花白锈病综合防治及菊花抗病相关基因研究.北京林业大学.43.王涛,唐颂豪,何梅,谢寅峰,张往祥.2014.热激蛋白与植物耐热性关系的研究进展.西北林学院学报,29(6):72-79.44.文锋,吴小祝,廖亮,刘新圣,李鹏.2017.WRKY转录因子在植物抗逆生理中的研究进展.广西植物,37(1):69-79.45.许声涛,孙文香,田进平,王崇英.2008.植物热激蛋白HSP100/ClpB及其在提高植物抗热性和抗寒性中的应用.植物生理学报,44(4):804-810.46.薛珍,李卉,孔超越,段婷婷,郜刚.2015.受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类StWRKY8的克隆与表达分析.中国农业科学,48(21):4219-4226.47.杨金莹,孙颖,孙爱清,伊淑莹,刘箭.2006.番茄LeHsp110/ClpB基因的分子克隆及其对植物耐热性的影响.生物工程学报,22(1):52-57.42 沈阳农业大学硕士学位论文48.杨云慧,唐家乾,冯启云.2003.分子伴侣的研究进展.云南师范大学学报:自然科学版,23(2):38-42.49.叶琪明,梁训义,方华平,吴海峰,江明全.2005.菊花白色锈病的病原菌和综合防治的初步研究.农业网络信息,(9):81-81.50.袁洁.2014.水杨酸和热处理对杏抗冷性及热激蛋白产生影响的研究.新疆农业大学.51.赵娅玲,马千里,程东美.2017.菊花白锈病的药剂防治试验.仲恺农业工程学院学报,30(4):21-25.52.赵妍,杨焕玲,黄金丽,陈明杰,王晨光,任畇霏,马丹丹.2017.热激处理对草菇耐冷性的影响及对hsp100基因的诱导.分子植物育种,15(8):3036-3041.53.赵曾强.2015.棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析.石河子大学.54.张青.2016.温度胁迫对小金蝠蛾幼虫抗氧化酶活性及Hsp70表达量的影响.西南大学.55.祝朋芳,赵妮拉,段玉玺.2011.栽培菊感染菊花白锈病后体内防御酶活性的研究.北方园艺,(6):77-80.56.朱喜荣.2011.菊花CgHSP70基因的克隆与功能鉴定.南京农业大学.57.周丽.2015.水稻叶绿体伴侣蛋白Cpn60超表达株系农艺性状和抗盐性研究.浙江大学.58.周鹏飞,贾瑞瑞,陈善春,许兰珍,彭爱红,雷天刚,李强,陈敏,白晓晶,邹修平,何永睿.2017.柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析.园艺学报,44(3):452-462.59.AdamZ,AdamskaI,NakabayashiK,OstersetzerO,HaussuhlK,ManuellA,ZhengB,VallonO,RodermelSR,ShinozakiK,ClarkeAK.2001.ChloroplastandmitochondrialproteasesinArabidopsis.Aproposednomenclature.PlantPhysiol,125:1912-1918.60.AgarwalM,Katiyar-AgarwalS,SahiC,GallieDR,GroverA.2001.ArabidopsisthalianaHsp100proteins:kithandkin.CellStressChaperones,6:219-224.61.AlaeiH,BaeyenS,MaesM,HöfteM,HeungensK.2009.MoleculardetectionofPucciniahorianainChrysanthemum×morifoliumthroughconventionalandreal-timePCR.JournalofMicrobiologicalMethods,76:136-145.62.AlexandrovaKS,CongerBV.2002.Isolationoftwosomaticembryogenesis-relatedgenesfromorchardgrass(Dactylisglomerata).PlantScience,162(2):301-307.63.CarperSW,DuffyJJ,GernerEW.1987.Heatshockproteininthermotoleranceandothercellularprocesses.CancerRes,47(20):5294-5295.64.ChowAM,BeraudE,TangDW,FerrierpagèsC,BrownIR.2012.Hsp60proteinpatternincoralisalteredbyenvironmentalchangesinlightandtemperature.CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol,161(3):349-353.65.CortesS,BakerwilliamsAJ,MollapourM,BourbouliaD.2018.DetectionandAnalysisofExtracellularHsp90(eHsp90).MethodsMolBiol,1709:321-329.66.DevaiahBN,RaghothamaKG.2007.TranscriptionalRegulationofPiStarvationResponsesby43 参考文献WRKY75.PlantSignaling&Behavior,2(5):424-425.67.DongYS,VierlingE,GuyCL.2001.ComprehensiveExpressionProfileAnalysisoftheArabidopsisHsp70GeneFamily.PlantPhysiology,126(2):789-800.68.DongL,HuangZQ,LiuD,ZhuPF,LvSJ,LiN,MaoHY.2018.Transcriptomeanalysisofchrysanthemuminresponsestowhiterust.ScientiaHorticulturae,233:421-430.69.EdenhoferF,RiegerR,FamulokM,WendlerW,WeissS,WinnackerEL.1996.PrionproteinPrPcinteractswithmolecularchaperonesoftheHsp60family.JournalofVirology,70(7):4724-4728.70.GuoF,MauriziMR,EsserL,DXia.2002.CrystalstructureofClpA,anHsp100chaperoneandregulatorofClpAPprotease.JournalofBiologicalChemistry,277(48):46743-46752.71.GuptaSC,SharmaA,MishraM,MishraRK,ChowdhuriDK.2010.Heatshockproteinsintoxicology:Howcloseandhowfar?LifeSciences,86(11):377-384.72.GuptaRS,RamachandraNB,BowesT,SinghB.2008.UnusualCellularDispositionoftheMitochondrialMolecularChaperonesHsp60,Hsp70andHsp10.NovartisFoundationSymposium,291(291):59.73.HorwichAL,WillisonKR.1993.Proteinfoldinginthecell:functionsoftwofamiliesofmolecularchaperone,hsp60andTF55-TCP1.PhilosTransRSocLondBBiolSci,339(1289):313-325.74.HorwitzJ.1992.Alpha-crystallincanfunctionasamolecularchaperone.ProcNatlAcadSciUSA,89:10449-1045375.IshiguroS,NakamuraK.1994.CharacterizationofacDNAencodinganovelDNA-bindingprotein,SPF1,thatrecognizesSP8sequencesinthe5'upstreamregionsofgenescodingforsporaminandbeta-amylasefromsweetpotato.MolGenGenet,244(6):563-571.76.JiangY,DeyholosMK.2009.FunctionalcharacterizationofArabidopsisNaCl-inducibleWRKY25andWRKY33transcriptionfactorsinabioticstresses.PlantMolecularBiology,69(1-2):91.77.KeelerSJ,BoettgerCM,HaynesJG,KuchesKA,JohnsonMM,ThureenDL,KeelerCLJr,KittoSL.2000.AcquiredthermotoleranceandexpressionoftheHSP100/ClpBgenesofLimabean.PlantPhysiol,123:1121-1132.78.KimSR,AnG.2013.Ricechloroplast-localizedheatshockprotein70,OsHsp70CP1,isessentialforchloroplastdevelopmentunderhigh-temperatureconditions.JournalofPlantPhysiology,170(9):854-863.79.LeeKW,ChaJY,KimKH,KimYG,LeeB-H,LeeS-H.2012.OverexpressionofalfalfamitochondrialHSP23inprokaryoticandeukaryoticmodelsystemsconfersenhancedtolerancetosalinityandarsenicstress.BiotechnologyLetters,34(1):167-174.80.LiuD,ZhangX,ChengY,TakanoT,LiuS.2006.rHsp90geneexpressioninresponsetoseveralenvironmentalstressesinrice(OryzasativaL.).PlantPhysiolBiochem,44(5-6):380-386.81.LuoM,DennisES,BergerF,PeacockWJ,ChaudhuryA.2005.MINISEED3(MINI3),aWRKYfamilygene,andHAIKU2(IKU2),aleucine-richrepeat(LRR)KINASEgene,areregulatorsofseed44 沈阳农业大学硕士学位论文sizeinArabidopsis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,102(48):17531.82.LuoX,SunX,LiuB,ZhuD,BaiX,CaiH,JiW,CaoL,WuJ,WangM,DingX,ZhuY.2013.EctopicexpressionofaWRKYhomologfromGlycinesojaaltersfloweringtimeinArabidopsis.PlosOne,8(8):e73295.83.MilioniD,HatzopoulosP.1997.Genomicorganizationofhsp90genefamilyinArabidopsis.PlantMolBiol,35(6):955-961.84.NagataK,HosokawaN.1996.Regulationandfunctionofcollagen-specificmolecularchaperone,HSP47.CellStructure&Function,21(5):425.85.PrasinosC,KrampisK,SamakovliD,HatzopoulosP.2005.TightregulationofexpressionoftwoArabidopsiscytosolicHsp90genesduringembryodevelopment.JExpBot.Feb,56(412):633-644.86.PaterSD,GrecoV,PhamK,MemelinkJ,KijneJ.1996.Characterizationofazinc-dependenttranscriptionalactivatorfromArabidopsis.NucleicAcidsResearch,24(23):4624-4631.87.ProdromouC.1997.IdentificationandstructuralcharacterizationoftheATP/ADP-bindingsiteintheHsp90molecularchaperone.Cell,90(1):65-75.88.QueitschC,SangsterTA,LindquistS.2002.Hsp90asacapacitorofphenotypicvariation.Nature,417(6889):618.89.RédeiGP.2008.sHsp,(smallheat-shockproteins).SpringerNetherlands.90.RinersonCI,RabaraRC,TripathiP,ShenQJ,RushtonPJ.2015.TheevolutionofWRKYtranscriptionfactors.BmcPlantBiology,15(1):1-18.91.RinersonCI,ScullyED,PalmerNA,Donze-ReinerT,RabaraRC,TripathiP,ShenQJ,SattlerSE,XiaoX,YangF,ZhangS,KorpelainenH,LiC.2009.PhysiologicalandproteomicresponsesoftwocontrastingPopuluscathayanapopulationstodroughtstress.PhysiolPlant,136(2):150-168.92.RohilaJS,SarathG,RushtonPJ.2015.TheWRKYtranscriptionfactorfamilyandsenescenceinswitchgrass.BMCGenomics,16:912.93.RossCA,LiuY,ShenQJ.2007.TheWRKYGeneFamilyinRice(Oryzasativa).植物学报(英文版),49(6):827-842.94.RushtonPJ,MacdonaldH,HuttlyAK,LazarusCM,HooleyR.1995.MembersofanewfamilyofDNA-bindingproteinsbindtoaconservedcis-elementinthepromotersofα-Amy2genes.PlantMolecularBiology,29(4):691-702.95.RushtonPJ,SomssichIE,RinglerP,ShenQJ.2010.WRKYtranscriptionfactors.TrendsPlantSci.TrendsinPlantScience,15(5):247-258.96.RushtonPJ,TorresJT,ParniskeM,WernertP,HahlbrockK,SomssichIE.1996.Interactionofelicitor-inducedDNA-bindingproteinswithelicitorresponseelementsinthepromotersofparsleyPR1genes.EMBOJ,15(20):5690-5700.97.SatoY,YokoyaS.2008.Enhancedtolerancetodroughtstressintransgenicriceplantsoverexpressing45 参考文献asmallheat-shockprotein,sHSP17.7.PlantCellRep,27(2):329-334.98.SchopfFH,BieblMM,BuchnerJ.2008.TheHSP90chaperonemachinery.JournalofBiologicalChemistry,283(27):18473-18477.99.SiddiqueM,GernhardS,VonKP,VierlingE,ScharfKD.2008.TheplantsHSPsuperfamily:fivenewmembersinArabidopsisthalianawithunexpectedproperties.CellStress&Chaperones,13(2):183-197.100.SongHM,ZhaoRM,FanPX,WangX,ChenX,LiY.2009.OverexpressionofAtHsp90.2,AtHsp90.5andAtHsp90.7inArabidopsisthalianaenhancesplantsensitivitytosaltanddroughtstresses.Planta,229(4):955-964.101.TissereA,MitchellHK,andTracyUM.1974.Proteinsynthesisinsalivaryglandsofdrosophilamelanogaster:relationtochromosomepuffs.J.Mol.Biol.,85(3):389-398.102.TominagaH,CouryDA,AmanoH,MikiW,KakinumaM.2012.cDNAcloningandexpressionanalysisoftwoheatshockproteingenes,Hsp90,andHsp60,fromasterileUlvapertusa,(Ulvales,Chlorophyta).FisheriesScience,78(2):415-429.103.TorresDE,Rojas-MartínezRI,Zavaleta-MejíaE,Guevara-FeferP,Márquez-GuzmánGJ,Pérez-MartínezC.2017.CladosporiumcladosporioidesandCladosporiumpseudocladosporioidesaspotentialnewfungalantagonistsofPucciniahorianaHenn.,thecausalagentofchrysanthemumwhiterust.PLoSOne,12(1):e0170782.104.WangW,VinocurB,ShoseyovO,AltmanA.2004.Roleofplantheatshockproteinsandmolecularchaperonesintheabioticstressresponse.TrendsPlantSci,9:244-252.105.WarrickJ,ChanBG,ChaiY,PaulsonH,BoniniN.1999.Suppressionofpolyglutamine-mediatedneurodegenerationinDrosophilabythemolecularchaperoneHSP70.NatureGenetics,23(4):425-428.106.WhippsIM.1993.Areviewofwhiterust(Pucciniahorianahenn.)diseaseonchrysanthemumandthepotentialforitsbiologicalcontrolwithVerticilliumlecanii(zimm.)Viégas.Ann.Appl.Boil,122:173-187.107.WuX,ShirotoY,KishitaniS,ItoY,ToriyamaK.2009.EnhancedheatanddroughttoleranceintransgenicriceseedlingsoverexpressingundertheOsWRKY11controlofHSP101promoter.PlantCellReports,28(1):21-30.108.YabeN,TakahashiT,KomedaY.1994.Analysisoftissue-specificexpressionofArabidopsisthalianaHSP90-familygeneHSP81.Plant&CellPhysiology,35(8):1207.109.ZhouX,JiangY,YuD.2011.WRKY22transcriptionfactormediatesdark-inducedleafsenescenceinArabidopsis.Molecules&Cells,31(4):303-313.46 沈阳农业大学硕士学位论文致谢感谢沈阳农业大学对我的栽培，让我在研究生期间学到很多东西，同时获得了专业的知识和科研能力。感谢林学院提供了良好的学习环境和试验平台，让我的试验能够顺利完成。本论文是在导师毛洪玉的关怀和指导下完成的。从论文的选题、试验设计、试验实施以及试验中问题的解决，无不凝聚着导师的智慧和心血。导师学识渊博，科研思维独到，治学严谨，其实事求是的科学精神以及一丝不苟的工作作风，都是我人生学习的榜样，将永远激励着我前进。值此论文完成之际，谨向毛洪玉老师表示最诚挚的谢意！感谢林学院植物方向的各位老师给予大力指导和帮助，同时他对本论文的具体研究方案提供了许多宝贵的意见和建议，在此表示衷心的感谢！同时感谢本实验室内所有帮助过我的老师和师兄师姐们！感谢师弟师妹帮助我共同管理学科的菊花继代培养，为我提供充足的试验材料。最后要感恩我的父母，深深感谢他们多年来对我学业的支持，是他们的不离不弃和鼓励才让我无论试验失败低落的时候，还是获得奖励开心的时候，都勇敢面对，平常心对待。以后的日子唯有继续努力不断前行，方不负他们对我的养育和期望。吕盛金2018年6月47 攻读学位论文期间发表文章攻读学位论文期间发表文章DongL,HuangZQ,LiuD,ZhuPF,LvSJ,LiN,MaoHY.2018.Transcriptomeanalysisofchrysanthemuminresponsestowhiterust.ScientiaHorticulturae,233:421-430.48 沈阳农业大学硕士学位论文论文图表统计计：学位论文48页表格1个插图14幅