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分类号Q7学校码10590UDC570密级公开深圳大学硕士学位论文抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析学位申请人姓名雷宇专业名称生物学学院（系、所）生命与海洋科学学院指导教师姓名胡章立教授贾彬博士 深圳大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文抗病饵料藻及酵母的构律与活性分析是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写的作品或成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。论文作者签名：日期：加７年＾月日学位论文使用授权说明（必须装订在印刷本首页）本学位论文作者完全了解深圳大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，艮Ｐ：研宄生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属深圳大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其他机构送交论文的电子版和纸质版，允许论文被查阅和借阅。本人授权深圳大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（涉密学位论文在解密后适用本授权书）论文作者签名：＼赏导师签名￥曰期：年￥月６曰曰期年月曰叫辦５／夕 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析摘要水产及畜牧业面临着各类病害频繁发生的难题，抗生素是防治养殖病害的传统方法，但抗生素会导致生物安全性与环境污染问题。抗菌肽由于其独特的抗菌机理，使细菌不易对其产生耐药性，且因代谢速度快而不会在机体中产生有害残留，被认为是潜在的传统抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高，又很难直接从生物体内分离获得大批量抗菌肽，采用基因工程技术重组表达抗菌肽是目前最可行的抗菌肽制备途径。本研究利用抗菌肽NZ2114和pisL9K22WK的基因序列，构建了受FLD1启动子调控的抗菌肽重组表达载体，并分别转入Pichiapink酵母中，获得了能高效表达抗菌肽的基因工程菌株。与此同时，本研究还将经密码子优化的抗菌肽NZ2114转入莱茵衣藻的叶绿体基因组内，构建了利用叶绿体遗传系统表达抗菌肽的基因工程藻。具体研究结果如下：1.以甲醛脱氢酶启动子FLD1替换pPink-LC质粒中的醇氧化酶启动子AOX1，构建了可由氯化胆碱诱导的新质粒。并以此为基础，分别插入密码子优化过的抗菌肽pisL9K22WK基因和NZ2114基因，构建了FPLC和FNLC两个酵母表达载体。此外，还采用串联方式构建了含有α分泌信号肽的pisL9K22WK基因四串联酵母胞外表达载体αFPHLC和含有α分泌信号肽的NZ2114基因四串联酵母胞外表达载体αFNHLC。2.上述表达质粒分别电转化Pichiapink酵母，经PAD平板上筛选、PCR验证和甲醇诱导初筛，最终获得了能在细胞内高效表达抗菌肽基因pisL9K22WK和抗菌肽基因NZ2114的酵母工程菌PH6和NZ6，以及能在胞外高效分泌表达抗菌肽基因pisL9K22WK和NZ2114的酵母工程菌PIS3和NZ2114-9。3.为了避免使用甲醇诱导酵母表达外源重组蛋白时所带来了安全隐患及甲醇残留问题，本研究利用饲料添加剂氯化胆碱代替甲醇作为诱导物，探索酵母工程菌PH6和NZ6的发酵条件。抑菌实验结果均表明，氯化胆碱成功诱导PH6和NZ6表达出了抗菌肽pisL9K22WK及抗菌肽NZ2114，而基因工程酵母的细胞总蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。进一步对氯化胆碱诱导PH6及NZ6发酵产抗菌肽的最佳条件研究发现：氯化胆碱诱导PH6的最佳诱导浓度为1%(w/v)，最佳诱导时间为120h，而氯化胆碱诱导NZ6的最佳诱导浓度为2%I 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析(w/v)，最佳诱导时间为72h。4.根据莱茵衣藻叶绿体基因的密码子偏好性优化了抗菌肽NZ2114的基因，并构建了含有16s/psbA杂合启动子的莱茵衣藻叶绿体表达质粒p322-NZ；通过“基因枪法”将该质粒和表达壮观霉素抗性基因的辅助质粒p228共同转化衣藻叶绿体，经多次同质化筛选最终获得能成功表达抗菌肽NZ2114的基因工程藻株16。抑菌实验结果显示：工程藻16的细胞粗提液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果，在24h内均保留抑菌活性。Tris-TricineSDSPAGE电泳结果表明，工程藻16的细胞粗提液在4kDa处出现蛋白条带，与NZ2114的预期大小基本一致。本研究获得了能表达抗菌肽的Pichiapink酵母工程菌，探索了用氯化胆碱替代有毒甲醇进行重组抗菌肽诱导表达的新途径；构建了能利用衣藻叶绿体遗传系统表达抗菌肽的基因工程藻株，实现了抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻内的有效表达，为抗病饵料藻的开发与应用打下了重要基础。关键词：抗菌肽；pisL9K22WK；NZ2114；莱茵衣藻；Pichiapink表达系统；巴斯德毕赤酵母II Constructionandactivityanalysisofantibacterialbait-algaeandbait-pastorisAbstractDiseaseshavebeenaseriousproblemintheaquacultureandlivestockhusbandryindustry.Theroutinemethodtocontrolthediseasesistousethetraditionalantibiotics,whichmayresultintheproblemsofthefoodsafetyandtheenvironmentalrisk.Theantimicrobialpeptides(AMPs)areconsideredtobethepotentialantibioticalternativesduetotheiruniqueantibacterialmechanismtoavoidevolutionofresistancebymicrobes..Inaddition,AMPsdonotproduceharmfulresiduesinthebodybecausetheycanbedegradedinvivo.ItisexpensiveforchemicalsynthesisofAMPs.Ontheotherhand,itisdifficulttopurifytheAMPsdirectlyfromorganisms.Fortunately,therecombinantproteinexpressiontechnologyprovidesthepossibilitythatAMPscanbeproducedonanindustrialscale.Inthisstudy,theAMPpisL9K22WKandNZ2114genesequenceswereclonedandconstructedrespectivelytheexpressionplasmidregulatedbyFLD1promoter.Thentheconstructsweretransformedintotheyeast(pichiapink)byelectroporationrespectively.GenerecombinantyeaststrainstoexpresspisL9K22WKorNZ2114wereobtained.Ontheotherhand,NZ2114genesequencewasmodifiedaccordingtothecodonbiasofthechloroplastgenomeinChlamydomonasreinhardtii,andwastransformedintoChlamydomonasreinhardtiichloroplast.Thetotalproteinsfromtransformantsshowedverystrongantimicrobialactivityforthefirsttime.Themainworkandresultsareasfollows:1.TheAOX1promoterinthepPink-LCvectorwasreplacedbyFLD1promoter.ThenpisL9K22WKandNZ2114genewereligatedintothevectorforconstructingtheexpressionvectorFPLCandFNLCwhichexpresspisL9K22WKandNZ2114intracellularrespectively.FourrepeatsofthepisL9K22WKandNZ2114genewerefusedintandemandligatedtotheα-factorandinsertedintoasiteaftertheFLD1promoterforgeneratingtheconstructαFPHLCandαFNHLC.2.Theseconstructsweretransformedintotheyeast(pichiapink)byelectroporationrespectively.AlargenumberoftransformantswerescreenedonPADmedia.PCRanalysesonthetransformantsprovedthatthetargetgenehadbeenIII Constructionandactivityanalysisofantibacterialbait-algaeandbait-pastorisintegratedintothegenomeoftheyeast(pichiapink).Finallysomerecombinantyeaststrainswereobtained,PH6andNZ6whichexpressintracellularpisL9K22WKorNZ2114respectively,andPIS3andNZ2114-9whichexpressextracellularpisL9K22WKorNZ2114respectively.3.Inordertoavoidtheuseoftoxicmethanolasaninducertoexpresstherecombinantproteinsintheyeast.Inthisstudymethanolwasreplacedbythecholinechlorideasaninducer,whichcanbeusedasthefoodadditive.Thefermentationconditionsfortransformantswasoptimized.Thetotalproteinfromtransformantswastestedfortheantimicrobialactivity.Theresultsindicatedthatthetotalproteinsfromtransformantsshowedthestrongantimicrobialactivity.Andtheoptimalconcentrationofcholinechloridewas1%(w/v)forPH6and2%(w/v)forNZ6toinducetherecombinantAMPexpression,theoptimalinducingtimewas120hand72hforPH6andNZ6respectively.4.AnAMPNZ2114genewasmodifiedaccordingtothecodonbiasofthechloroplastgenomeinChlamydomonasreinhardtii.Thepromoter16s/psbAwasligatedtoconstructtheexpressionvectorp322-NZwhichwastransformedintoChlamydomonasreinhardtiichloroplastwiththevectorp228withspectinomycinresistancegene.Afterrepeatedscreening,thestrainsnamed16whichexpressedNZ2114withhighefficiencywasobtained.Thetotalproteinfrom16showedaverystrongantimicrobialactivitywithin24hours.TheresultsofTris-TricineSDS-PAGEshowedthatthetotalproteinsfrom16haveaproteinbandsin4kDa.Insummary,thisstudyconstructedtheyeast(pichiapink)strainsthatcanexpressAMPs,andexploredanewwaytoinducetheexpressionoftherecombinantAMPintheyeast(pichiapink)byusingcholinechlorideasaninducertoreplacethemethanol.Thegenetically-engineeredalgaestrainwasconstructed,whichcanusethechloroplastsgeneticsystemofChlamydomonasreinhardtiitoexpressAMPs.TheNZ2114wasprovedtoexpressinthechloroplastsofChlamydomonasreinhardtiiwithhighefficiencytakentogether,thepresentstudyprovidedanewapproachforproductionandutilizationofantibacterialbait-algae.IV Constructionandactivityanalysisofantibacterialbait-algaeandbait-pastorisKeyword：antimicrobialpeptide；pisL9K22WK；NZ2114；Chlamydomonasreinhardtii；pichiapinksystem；PichiapastorisV 目录摘要.........................................................................................................................IAbstract............................................................................................................III第一章文献综述..................................................................................................11.1抗菌肽概述..............................................................................................11.1.1抗菌肽plectasin及其改造肽NZ2114的研究进展...................21.1.2抗菌肽piscidin及其改良肽pisL9K22WK的研究进展...........41.2抗菌肽基因工程研究..............................................................................51.2.1抗菌肽在大肠杆菌中的表达.......................................................51.2.2抗菌肽在昆虫杆状病毒的表达...................................................51.2.3抗菌肽在酿酒酵母中的表达.......................................................61.2.4抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体中的表达...........................................61.2.5抗菌肽在Pichiapink中的表达....................................................71.3毕赤酵母高效表达策略.........................................................................91.3.1毕赤酵母启动子概述..................................................................91.3.2毕赤酵母分泌信号肽................................................................101.3.3温度............................................................................................111.4研究目的、意义及技术路线.............................................................11第二章抗菌肽在Pichiapink酵母中的表达.....................................................122.1实验材料...............................................................................................132.1.1实验仪器与试剂........................................................................132.1.2质粒与菌株................................................................................142.1.3培养基与常用溶液....................................................................152.2实验方法...............................................................................................162.2.1FLD1序列的克隆......................................................................162.2.2pisL9K22WK基因的克隆及连接启动子FLD1.........................42.2.3NZ2114基因的优化、体外合成及连接启动子FLD1..............52.2.4表达载体的构建及转化Pichiapink............................................72.2.5重组酵母转化子的筛选及PCR鉴定........................................32.2.6重组酵母转化子的抑菌活性分析..............................................4 2.2.7酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳...................62.2.8质谱鉴定目的片段......................................................................62.3结果与分析.............................................................................................72.3.1FLD1序列的克隆........................................................................72.3.2pisL9K22WK基因的克隆及连接启动子FLD1.........................82.3.3NZ2114基因的克隆及连接启动子FLD1..................................92.3.4表达载体的构建及转化Pichiapink..........................................102.3.5重组酵母转化子的筛选及PCR鉴定......................................122.3.6重组酵母转化子的抑菌活性分析............................................162.3.7酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳...................212.3.8质谱鉴定目的片段....................................................................222.4讨论.......................................................................................................22第三章氯化胆碱诱导酵母工程菌的条件优化................................................243.1实验材料...............................................................................................253.1.1实验仪器与试剂........................................................................253.1.2菌株............................................................................................253.1.3培养基与常用溶液....................................................................253.2实验方法...............................................................................................253.2.1菌株的培养................................................................................253.2.2氯化胆碱诱导酵母工程菌PH6的条件优化...........................253.2.3氯化胆碱诱导酵母工程菌NZ6的条件优化...........................263.2.4氯化胆碱和甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的比较..................................................................................273.2.5酵母工程菌PH6蛋白纯化条件优化.......................................273.3实验结果...............................................................................................273.3.1氯化胆碱诱导酵母工程菌PH6的条件优化...........................273.3.2氯化胆碱诱导酵母工程菌NZ6的条件优化...........................293.3.3氯化胆碱和甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的比较..................................................................................313.3.4酵母工程菌PH6蛋白纯化条件优化.......................................32 3.4讨论.......................................................................................................33第四章抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体的表达........................................................354.1实验材料...............................................................................................364.1.1菌种与质粒................................................................................364.1.2培养基及相关试剂....................................................................364.2实验方法...............................................................................................374.2.1NZ2114基因的密码子优化及合成...........................................374.2.2抗菌肽NZ2114莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建.................374.2.3“基因枪法”转化莱茵衣藻.........................................................384.2.4转基因衣藻的筛选....................................................................404.2.5转基因衣藻基因组DNA的PCR检测....................................404.2.6转基因衣藻的培养....................................................................414.2.7转基因衣藻总蛋白的提取........................................................414.2.8转基因衣藻总蛋白的抑菌活性分析........................................424.2.9转基因衣藻总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳分析...........424.3结果与分析...........................................................................................424.3.1NZ2114基因的密码子优化及合成...........................................424.3.2抗菌肽NZ2114莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建.................444.3.3转基因衣藻的筛选....................................................................454.3.4转基因衣藻基因组DNA的PCR检测....................................464.3.5转基因衣藻总蛋白的抑菌活性分析........................................474.3.6转基因衣藻总蛋白的Tris-TricineSDSPAGE电泳分析.......484.4讨论.......................................................................................................49第五章结论及展望............................................................................................505.1主要结论...............................................................................................515.2创新点...................................................................................................525.3研究展望...............................................................................................52附录....................................................................................................................59致谢....................................................................................................................59攻读硕士学位期间的研究成果..........................................................................60 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析第一章文献综述1.1抗菌肽概述抗菌肽(AntimicrobialPeptide,AMP)是一类内源性的具有广谱抗菌活性的天然生物小分子肽，通常是由12~60个氨基酸组成，广泛存在于生物界中，并成为非特异性免疫进化过程中的重要组成。抗菌肽被称为“第二防御体系”，对生物有天然免疫作用。世界上最早发现的抗菌肽是天蚕素(cecropins)，是于1972年由瑞典科学家Boman在惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)中发现的[1]。此后人们相继从细菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得了多种具有活性多肽[2]。大多数的抗菌肽都具有广谱抗菌活性，既可以杀革兰氏阳性菌，又可以杀革兰氏阴性菌，并且杀菌活性极强，针对许多病原体（包括多重耐药细菌）都有抗菌活性。当然也有一些抗菌谱较窄的抗菌肽，如Mygind等[3]2005年从腐生子囊菌(Pseudoplectanianigrella)的分泌蛋白中分离的首例真菌防御素——plectasin。plectasin只对革兰氏阳性菌有效，特别是肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌，甚至可以杀死一些临床耐药型金黄色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA），抗菌谱较窄的抗菌肽更有利于有针对性的治疗临床上的一些疾病，比如有针对性的杀死导致疾病的菌，而不会杀死其他有益菌。抗菌肽还具有免疫调节的功能，比如趋药性、伤口愈合、抗内毒素等[4]。关于抗菌肽的抗菌作用机制，人们针对不同的抗菌肽提出了不同的假说，目前还没有一个能够涵盖所有种类抗菌肽杀菌机制的假说。常见的几种抗菌作用机制类型有：桶-板模型(barrelstavemodel)、毯式模型(carpetmodel)、环状孔模型(toroidalporemodel)、凝聚模型(aggregatemodel)及其他作用机制[5]。前四种模型的主要原理都是抗菌肽通过静电作用与细胞膜结合，导致细胞膜表面产生孔洞，从而细胞内容物外渗，造成菌体的死亡。另外，还有研究学者发现了抗菌肽的其他作用机制，比如有研究表明，抗菌肽还可以与细胞内的DNA、RNA或者细胞器相互作用，从而导致菌体死亡。如来源于蛙的抗菌肽buforinⅡ可以结合到细胞内的DNA和RNA上，抑制细胞的功能，导致菌体死亡[6]。Apidaecin型抗菌肽是通过抑制蛋白质的合成，降解核酸复制所需蛋白质，从而实现杀菌的目的[7]。而另一种抗菌肽MUC7被发现可以使线粒体出现肿胀、空泡化和嵴脱落的现象1 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析[8]。已有研究指出抗菌肽对真菌、病毒、寄生虫甚至肿瘤都具有杀伤作用[9,10]，再加上其独特的杀菌机制，使得其对细菌不易产生耐药性，并且进入机体后代谢速度非常快，不会在机体中产生有害残留，抗菌肽有望替代抗生素成为新一代抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物，应用于生物医药、食品工业、农业、畜牧业和水产养殖业等领域。美国FDA(FoodandDrugAdministration)批准了多种多肽类药物。例如，人工合成的indolicidin的类似物——奥米加南(omiganan)，它具有广谱抗菌活性，既可以抗革兰氏阳性菌又可以抗革兰氏阴性菌，已有研究表明它可以用于治疗痤疮和血管局部感染引起的疾病如酒渣鼻[11]，目前在美国已进入了III期临床试验[12]。培西加南(pexiganan)是爪蟾蛙皮素类似物。培西加南可以同时抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌感染，研究表明它可以用于治疗初期糖尿病人表现出的糖尿病足感染的症状。目前，培西加南用于治疗糖尿病足坏疽的III期临床试验已经完成，实验说明轻度糖尿病足坏疽的患者局部使用培西加南软膏和口服氧氟沙星没有明显差异，但是使用培西加南后的不良反应却比使用氧氟沙星少[13]。2014年Kulkarni等[14]对培西加南进行了改造，将其序列中的赖氨酸全部用精氨酸替换，明显降低了其对蛋白酶的敏感性，且增强了其对利什曼原虫的体外抑菌活性。1.1.1抗菌肽plectasin及其改造肽NZ2114的研究进展plectasin是2005年Mygind等[3]从腐生子囊菌(Pseudoplectanianigrella)的分泌蛋白中分离的首例真菌防御素。它的一级、二级和三级结构与蜘蛛、蝎子、蜻蜓、贻贝防御素的结构相似，如图1-1所示。plectasin不像许多防御素具有广谱抗菌活性，其只对革兰氏阳性菌有效，特别是肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，包括临床分离的90种不同血清型的S.pneumonia和临床耐药菌株，例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA被称为超级细菌，从发现至今感染几乎遍及全球，是重要病原菌之一。Schneider等[15]研究表明plectasin的作用机理是其可以抑制肽聚糖的合成，而肽聚糖是革兰氏阳性菌的细胞壁的主要成分，所以可以导致菌体死亡。另外，研究表明plectasin在生理离子强度下也具有杀菌作用，而大多数脊椎动物防御素只有在体外非常低的离2 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析子强度下才会发挥作用，因此plectasin在临床上的开发应用具有重要意义。2011年plectasin首次在毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达，重组酵母经过120h的诱导分泌出的总蛋白质达到748.63μg/mL，其中重组plectasin的百分比约占胞外总蛋白的71.79％[16]。NZ2114是plectasin的改造肽，它在plectasin的基础上改变了三个氨基酸（D9N，M13L，和Q14R）[17]。研究表明，NZ2114对葡萄球菌(Staphylococcus)、S.pneumonia、溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus)的体外抗菌活性优于plectasin。对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA和MRSA，NZ2114的活性是plectasin两到三倍。与传统的抗生素相比，NZ2114的活性(0.028~0.9μmol/L)比氨苄青霉素(1.35~172.50μmol/L)和万古霉素(0.71~5.67μmol/L)强，同时还拥有很长的抗生素后效应(postantibioticeffect,PAE)[18]。此外，NZ2114有协同作用，它与青霉素Ｇ、头孢曲松在对抗金黄色葡萄球菌时有协同作用[3]。NZ2114有效的抑制了金黄色葡萄球菌引起的兔脑膜炎和鼠腹膜炎[18]。NZ2114还显示出极低甚至没有细胞毒性、较好的血清稳定性和较长的体内半衰期[15,19]。综上所述，NZ2114被认为是最可能替代抗生素来治疗金黄色葡萄球菌感染的替代物。2014年NZ2114首次在P.pastoris中表达，Yong等[20]通过pPICZα载体在毕赤酵母X-33中表达，在5L发酵罐中诱导96h后发酵上清液的总分泌蛋白达到2390mg/L(29℃)和2310mg/L(25℃)，并且重组NZ2114(rNZ2114)分别达到860mg/L(29°C)和1309mg/L(25℃)，通过阳离子交换层析纯化后，rNZ2114的产率达到583mg/L，94.8％纯度。3 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图1-1plectasin与无脊椎动物防御素的结构相似性（Mygind[3]）1.1.2抗菌肽piscidin及其改良肽pisL9K22WK的研究进展piscidin是一类线性的、α螺旋、带正电荷、具有两亲性的多肽。piscidin抗菌肽最早是从杂交斑纹鲈鱼的肥大细胞中分离出来的[21]。piscidin是抗菌肽家族中的重要成员之一，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌都具有强烈的抗菌活性，甚至能够抗真菌[22]，原生动物[23]及病毒[24]。此外，Andrews等[25,26]发现piscidin还与宿主抵御原生动物的感染相关。目前公认的piscidin家族成员主要包括四个类型：piscidin1、piscidin2、piscidin3和piscidin4。其中，piscidin1含22个氨基酸残基，是一种具有广泛抗菌活性的多肽，研究表明，它是开发抗HIV-1病毒最具潜力的药物之一[27,28]。另外，piscidin1还具有抗癌作用，已有研究表明，它对Hela细胞及HT1080细胞均有抑制作用，能够引起HT1080细胞的凋亡甚至坏死[29]。piscidin家族的其他成员长度都不超过26个氨基酸残基，piscidin2与piscidin1基本相同，只是第18个氨基酸是赖氨酸，抗菌活性与piscidin1也基本相同[30]。piscidin3也是22个氨基酸，但其的杀菌活性及溶血活性等方面均低于piscidin1与piscidin2[31]。Piscidin4含有44个氨基酸残基，分子量为5329Da,其大小是其他所有已知piscidin的两倍[32]，与piscidin家族的其他成员一样同样具有广谱杀菌活性。免疫组化证据表明抗菌肽piscidin广泛存在于高等硬骨鱼—鲈形目鱼类中，包括8个家族中的11个品种，如狼鲈科(moronidae),石首鱼科(Sciaenidae),4 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析鲷科(Sparidae)，篮子鱼科(Siganidae)，丽鱼科(Cichlidae)以及真鲈科(Percichthyidae)[33,34]。pisL9K22WK是以马拉石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)多肽piscidin氨基酸序列为基础，结合生物信息学软件，在不破坏α螺旋结构前提下，减弱多肽疏水性，增加其等电点而得到，它具有α螺旋结构，亲水性、疏水性两亲性，是一个带正电荷的阳离子多肽，分子量为2801.5Da，等电点为11.26。pisL9K22WK具有抗菌活性与改造前相似，溶血性和细胞毒性降低的特点，研究表明pisL9K22WK在跨膜测试中均未表现出有跨膜的迹象，即pisL9K22WK的作用机理可能是未跨膜实现，就像毯式模型一样。1.2抗菌肽基因工程研究1.2.1抗菌肽在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，应用最为广泛，是目前掌握最为成熟的表达系统，它具有生长繁殖迅速、遗传背景清楚、生产成本低、操作简单、基因表达水平高等优点。但是也有如下缺点：大部分抗菌肽容易以包涵体的形式表达，因此不利于后期分离纯化；翻译后加工修饰体系不完善，可能导致所表达的产物生物活性较低；抗菌肽不能直接在大肠杆菌表达系统中进行表达，因为抗菌肽对原核表达菌株有杀伤作用，因此抗菌肽一般通过融合表达的方式在大肠杆菌中进行表达，融合表达之后再通过酶解法进行切割，从而分离纯化得到抗菌肽，此过程无疑增加了生产成本，不利于实现规模化生产。1.2.2抗菌肽在昆虫杆状病毒的表达昆虫杆状病毒表达系统它是利用杆状病毒的结构基因来构建表达载体，将目的基因转入昆虫细胞中进行表达。此表达系统因其独特的生物学特性，也受到了国内外较为广泛的关注，比如杆状病毒只能在无脊椎动物中复制，不能感染脊椎动物，因此安全性较高。另外，它还具有与真核表达系统相似的特点，可以对获得的抗菌肽进行翻译后的加工修饰。此外，杆状病毒表达系统还具有蛋白表达水平高的特点，Kim等将来自冈比亚按蚊的天蚕素A的cDNA克隆到piggyBac载体，并成功感染入埃及伊蚊，血液喂养24h获得了稳定性强的转基因抗菌肽[35]。但是该表达系统对于外源蛋白的修饰加工相对简单，因为其糖基化的方式与脊椎5 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析动物的还是有一定的差别。1.2.3抗菌肽在酿酒酵母中的表达酿酒酵母（Saccharaomycescerevsiae）最早应用于酿造业，已有数千年的应用历史，被美国FDA确认为是一种安全生物(GRAS：generallyrecognizedassafe)。应用酿酒酵母表达系统生产外源产物已有近30年的历史，该表达系统用于表达外源基因有很多优点[36]：生长繁殖迅速适用于大规模发酵生产；不会产生内毒素，且对表达的外源蛋白能进行翻译后的修饰和加工；可以使用强启动子如GAP（三磷酸甘油醛脱氢酶）启动子，从而使得外源蛋白在酿酒酵母中实现稳定高效表达。目前不少抗菌肽已经在酿酒酵母表达系统中成功表达。张捷等在酿酒酵母中成功表达抗菌肤Pa-AMP05，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用[37]。2013年Xia等[38]在酿酒酵母中成功表达了来源于Bombyxmori的抗菌肽cecropin。但是，酿酒酵母表达系统也存在一些不足之处[39]：容易出现过度糖基化、信号肽加工不完全、对于大分子蛋白不能高效表达、重组蛋白的表达量普遍比较低等缺点。1.2.4抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体中的表达莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)隶属于绿藻门团藻目衣藻属(Chlamydomonas)，呈椭圆形且带有两根鞭毛，是一种单细胞真核生物。与其他的表达系统相比，在莱茵衣藻叶绿体中表达抗菌肽具有一下几个优势：（1）莱茵衣藻培养条件简单，生长周期短；（2）莱茵衣藻叶绿体占细胞总体积近40%的，这样的特点更利于外源基因的转化及稳定；（3）已有研究表明莱茵衣藻叶绿体能够正确地折叠和组装复杂的哺乳动物的蛋白[40]；（4）外源基因能实现定点整合。在表达载体上设计叶绿体基因组的同源片段，载体转化进入叶绿体之后，可以通过与叶绿体基因组的同源重组实现外源基因定点插入，保证了外源基因的稳定表达；（5）外源基因在后代中可稳定表达。叶绿体的基因在遗传时属于母系遗传，一旦筛选得到了稳定的叶绿体转化株，一般不会存在外源基因在后代中丢失的问题；（6）莱茵衣藻叶绿体外源蛋白表达量高于莱茵衣藻核表达；（7）其自身是安全无毒的，可以直接食用，省去了大量的后续加工纯化过程。1989年和1990年首次尝试在莱茵衣藻叶绿体表达外源蛋白是细菌新霉素磷酸转移酶[41]和β-葡萄糖醛酸酶基[42]，研究结果显示，稳定积累了mRNAs，但没6 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析有检测到蛋白质的积累。1991年第一次报道了在莱茵衣藻叶绿体中稳定表达出外源蛋白，该研究是利用叶绿体的启动子和5’UTR来表达细菌aadA基因，成功检测到AAD活性[43]。但是，早期在莱茵衣藻叶绿体中表达的外源蛋白往往是表达量很低甚至没有[41,42]，原因是没有根据莱茵衣藻叶绿体的密码子偏爱性进行目的基因的优化。莱茵衣藻叶绿体密码子偏爱性表现为：叶绿体密码子第三位偏好利用腺嘌呤和尿嘧啶[44]。Franklin等[45]为了直接检测密码子优化是否可以影响重组蛋白在莱茵衣藻叶绿体的表达，经过密码子优化的绿色荧光蛋白(gfp)报告基因和未经过密码子优化的绿色荧光蛋白(gfp)分别转化进入莱茵衣藻叶绿体，经过密码子优化的绿色荧光蛋白表达量是未经过密码子优化的80倍。图1-2工程莱茵衣藻叶绿体示意图(StephenPMayfield[46])1.2.5抗菌肽在Pichiapink中的表达毕赤酵母表达系统是一个被广泛应用的异源蛋白表达系统，普遍应用于学术研究和工业生产上。它具有以下优点：毕赤酵母表达外源蛋白具有高稳定性，构建的重组子十分稳定，该系统的载体能与酵母基因组发生同源重组，所以一般不会出现外源基因在后代中丢失的问题；外源蛋白表达量高，许多蛋白可达到每升克级或以上水平；作为一种真核细胞生物，具有糖基化、脂肪酰化和蛋白憐酸化等翻译后修饰的功能，使外源蛋白能正确的折叠和修饰；毕赤酵母与酿酒酵母相比，不产生过度的糖基化，故抗原性相对较弱，更利于临床应用；可以进行胞内表达或胞外分泌表达，其胞外自身分泌的蛋白很少，利于目的蛋白的纯化；培养7 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析成本低，繁殖速度快，可以使用基础盐培养基，而且基础盐培养基中不含蛋白，更有利于目的蛋白的分离纯化。目前，已有上千种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中成功表达，表达出的重组蛋白在基础性研究、食品和医药上都有广泛应用[47]，在所有外源蛋白表达系统中，它是最具有发展前景的一个表达系统。但仍有不少在医药、食品、农业等领域有重要价值的蛋白或多肽等无法实现高效表达[48-51]。Pichiapink表达系统是一个基于毕赤酵母的真核蛋白表达系统，该系统共含4个菌株，包括：Pichiapink1、Pichiapink2、Pichiapink3和Pichiapink4，其中Pichiapink1为蛋白酶野生型，Pichiapink2为蛋白酶A缺陷株，Pichiapink3为蛋白酶B缺陷株，Pichiapink4为蛋白酶A和蛋白酶B双缺陷株，可以减少目的蛋白降解。另外，这四个菌株均为ADE2基因缺失型菌株，只有整合ADE2基因标记的多克隆拷贝的菌株才能在缺乏腺嘌呤的培养基中生长，转化子的颜色与目的基因的表达量直接相关，在进行纯培养时，ADE2缺陷的菌株在外观上表现为粉红色，而整合ADE2基因标记的多克隆拷贝的菌株外观上表现为白色。该表达系统对应两个表达质粒pPink-HC载体（高拷贝数表达载体）和pPink-LC载体（低拷贝数表达载体），质粒上均含有ADE2基因。因此若这两个质粒转化进入Pichiapink菌株，在多拷贝基因整合下，转化子呈白色；在无基因整合或者低拷贝基因整合下，转化子呈粉红色。因此，通过转化子外观上的颜色区别可以对高拷贝转化子进行快速筛选，简化了筛选方法。另外有研究表明Pichiapink系统几乎所有的转化子都可以表达目的蛋白，而毕赤酵母GS115菌株只有60％的转化子能表达目的蛋白[52]。Li等[53]分别采用Pichiapink菌株和毕赤酵母GS115表达灵芝免疫调节蛋白LZ-8，得到转化子后分别从中随机挑出17个转化子进行灵芝免疫调节蛋白LZ-8的表达，最后分别检测两种转化子灵芝免疫调节蛋白LZ-8的表达量，结果发现毕赤酵母GS115的平均表达量为15mg/L，而Pichiapink有15个转化子的平均表达量为378mg/L，剩下的2个转化子表达量高达500mg/L以上，因此Pichiapink菌株的外源蛋白表达水平优于毕赤酵母GS115菌株。研究显示Pichiapink表达系统中的不同蛋白酶缺陷株对同一蛋白表达水平是有显著差异的。Li等[53]在用Pichiapink表达系统的四种菌株分别表达HEVORF2的截短片段时发现，不同蛋白酶缺陷株所表达出的蛋白含量有明显的差别。其中Pichiapink2的HEVORF2表达水平最高。然而任敏等分别采用不同的Pichiapink菌株和不同的载体来分别表达重组人血清白蛋白－干扰素α2b融合蛋白(HSA－8 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析IFN－α2b)，结果目的蛋白在Pichiapink系统不同菌株中的表达量高低依次为Pichiapink1(HC)＞Pichiapink1(LC)＞Pichiapink2(HC)＞Pichiapink2(LC)＞Pichiapink3(HC)＞Pichiapink3(LC)＞Pichiapink4(HC)＞Pichiapink4(LC)[52]。因此，要想获得目的蛋白在Pichiapink菌株中的高水平表达还需要根据目的蛋白的特性选择合适的Pichiapink蛋白酶缺陷株。2016年王棚在Pichiapink表达系统成功分泌表达出来源于牛蛙的抗菌肽Catesbeianin-1，并且研究了抗菌肽Catesbeianin-1对蛋鸡产蛋率的影响。结果饲喂了抗菌肽Catesbeianin-1粗提物的蛋鸡产蛋率提高了约3.0%，蛋壳的厚度也有所增加，在一定程度上提高了蛋的品质，同时蛋鸡的免疫能力也得到了一定程度的提高[54]。另外，pPink-HC载体和pPink-LC载体上的启动子均是醇氧化物酶Ⅰ型启动子(AOX1)，需要用甲醇来作为诱导物，然而由于甲醇诱导有诸多缺点，因此在某些方面也限制了该系统的使用。1.3毕赤酵母高效表达策略1.3.1毕赤酵母启动子概述醇氧化酶AOX1启动子(AOX1)是目前在毕赤酵母中应用最广泛的启动子。它在酵母生长过程中受甲醇诱导，但是也被常见碳源抑制，如葡萄糖，甘油和乙醇[50]。尽管AOX1启动子是一个高效的强启动子，但是它存在着诸多问题，毕赤酵母AOX1启动子的高效转录离不开甲醇，而甲醇发酵强耗氧，一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求，从而影响异源蛋白的表达。另外甲醇有毒且易燃易爆易挥发，在工业化生产中存在巨大的安全隐患，因此车间需进行防暴设计，导致生产成本增大。所以，可以由非甲醇诱导毕赤酵母表达外源蛋白的启动子引起了人们的关注。1997年，Waterham等[55]发现了一个新的启动子，即甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子，它可以代替AOX1启动子。GAP启动子可以不用甲醇诱导，它可以在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白[56,57]。Hohenblum等[58]和Menendez等[59]研究发现GAP启动子所诱导表达的外源蛋白的量与AOX1启动子接近。然而，使用GAP启动组成型表达表达外源蛋白可能造成酵母细胞中毒，因此该启动子9 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析并未被广泛应用。1998年，Shen等[60]发现了一个毕赤酵母中的新的诱导型启动子，即谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶启动子(glutathione-dependentformaldehydedehydrogenasepromoter,FLD1)。FLD1启动子是外源基因在毕赤酵母中高效表达的一个重要启动子[61-63]。该启动子的优势在于既可以被甲醇诱导，又可以被甲胺诱导[64]。另外，FLD1启动子可以实现与甲醇诱导的AOX1启动子相似的蛋白表达水平[65]。最初研究表明FLD1启动子可以独立地被甲醇作为唯一碳源或甲胺作为唯一氮源强烈诱导。Resina等[66]在生物反应器中利用FLD1启动子在毕赤酵母中表达米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶，使用山梨醇和甲胺分别作为碳源和氮源，结果表明分泌到胞外培养基的脂肪酶水平与使用传统的AOX1启动子调控的脂肪酶水平相媲美，这表明使用山梨醇作为碳源结合甲胺作为氮源可以是非甲醇诱导FLD启动子在毕赤酵母中表达异源蛋白的基础。同时也表明该启动子是AOX1的一个不错替代品。有研究发现甘油和葡萄糖也可以诱导FLD1启动子表达外源蛋白，但是甘油和葡萄糖必须控制在低浓度下，甘油浓度需要控制在0.5-1.5%(v/v)，葡萄糖浓度需要控制在1-1.5%(w/v)[67]。1.3.2毕赤酵母分泌信号肽在毕赤酵母中，外源蛋白质的表达有两种方式常见的方式：细胞内表达和细胞外分泌表达，可以根据所要表达的蛋白质选择不同的表达方式[68]。两种方式各有优缺点。胞外表达外源蛋白可能存在分泌不出来或者过度糖基化、缺乏翻译后修饰等。在某些情况下，胞内的表达被证明是一个更可取的方法，因为它通常不会导致糖基化，但是细胞内表达蛋白的纯化可能更加困难，因为酵母细胞内含有大量自身的蛋白，不利于纯化。目前，外源蛋白在毕赤酵母中的表达普遍为胞外分泌表达，因为毕赤酵母自身分泌出的蛋白质很少，非常有利于外源蛋白分泌表达后的提取和纯化，特别是在大规模发酵生产重组蛋白时，分泌表达的方式更为有利。另外，将外源蛋白分泌出细胞外也可以避免因为外源蛋白对细胞造成毒害。常见的毕赤酵母分泌信号肽主要有以下几种：（1）酿酒酵母的α交配因子前导肽(α-MF)，（2）毕赤酵母酸性磷酸酶信号序列(PHO)，（3）酿酒酵母转化酶信号肽(SUC2)，（4）一些蛋白自身信号肽。其中使用最多的是酿酒酵母的α-MF。它含有一个前信号序列及一个亲水性前序列，分别由19和60个氨基酸组成[69]。10 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析前信号序列在将修饰蛋白质转移到内质网的过程中会被肽链内切酶切掉。亲水性前序列在将蛋白质转运到高尔基体后，高尔基体中存在的Kex2基因编码的二价氨基肽酶会识别并切割α-MF和目的蛋白质之间的Lys-Arg。有研究表明，信号肽Kex2酶切位点附近的序列对切割效率影响很大，从而会影响外源蛋白的分泌效率，因此，这也是外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的策略之一[70]。Garcia等[71]在载体Kex2切割位点和目的基因间插入了EAEA间隔序列，结果有效的提高了目的蛋白产量。大量研究表明使用不同的信号肽对毕赤酵母分泌表达外源蛋白有不同的结果，GhosaLkar等[72]分别使用IFN-a2b自身信号肽及α信号肽在毕赤酵母GS115中分泌表达，结果表明，使用α信号肽的毕赤酵母GS115高效分泌表达了目的蛋白，产量达200mg/L，而使用自身信号肽的毕赤酵母GS115没有分泌表达目的蛋白。但是Sygmund等[73]采用α-信号肽分泌表达的吡喃糖脱氢酶(Pyranosedehydrogenases，PDH)无明显的生物活性，而使用其自身信号肽却可以分泌表达出有酶活性的PDH。由此可见，不同信号肽对同一蛋白的引导效率是不同的，要想实现蛋白的高效表达还必须选择恰当的信号肽。另外，也有研究表明，改造信号肽可以提高外源蛋白的分泌效率，如改变信号肽的疏水性，改变信号肽的序列，进行位点突变，使用偏爱密码子或增强子[74]。1.3.3温度毕赤酵母培养基的温度影响着外源蛋白的生物活性、稳定性和蛋白的表达量。毕赤酵母的最适生长温度为28～30℃。有研究表明，低温诱导利于提高外源蛋白表达量(如25℃)，白桦木聚糖内糖基转移酶(Xyloglucanendotransglycosylase，XET)采用22℃诱导时的活性为465U/L，而采用18℃诱导时活性最高达到了1582U/L，活性提高了2.4倍[75]。在表达乙酰胆碱酯酶时，培养温度由30℃降到25℃，活性蛋白表达水平提高32.8倍[76]。Yong等[77]在毕赤酵母X33中表达抗菌肽NZ2114，诱导96h后发现，29℃条件下诱导表达的抗菌肽NZ2114达到860mg/L，25℃条件下诱导表达的抗菌肽NZ2114达到1309mg/L。可能是因为外源蛋白在低温条件下更稳定，且低温死亡的酵母细胞减少，从而释放的蛋白酶减少且活力降低，有利于目的蛋白的积累。因此低温诱导是一个重要使外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的策略。11 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析1.4研究目的、意义及技术路线当前，在海洋水产动物及家禽家畜业的养殖病害防治中使用的主要方法是大量使用抗生素和化学药物。为了得到较好的收益，不少养殖都存在抗生素滥用现象，从而直接导致越来越多的耐药性菌的出现，危害着人类的健康。随着生物安全性和环境污染问题日益突出，抗菌肽由于其代谢快、热稳定性好和对细菌不易产生耐药性等特点被认为是传统抗生素的替代品，受到了全世界学者的高度重视。抗菌肽pisL9K22WK是以马拉石斑鱼多肽piscidin为基础改良出的抗菌肽，与改造前相比，维持了与piscidin相似的抗菌活性，同时溶血性和细胞毒性降低。目前尚未有抗菌肽pisL9K22WK在酵母中表达的研究。抗菌肽NZ2114是plectasin的改造肽，抗菌活性是改造前的两到三倍，且溶血性和细胞毒性极低，目前尚未有抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻叶绿体及Pichiapink酵母中表达的研究报道。本论文以抗菌肽NZ2114和pisL9K22WK的基因为对象，构建了构建了可由氯化胆碱诱导的FLD1启动子调控的表达质粒，并分别转入Pichiapink酵母中，获得能表达抗菌肽的基因工程菌，实现了抗菌肽基因在酵母中的有效表达。与此同时，本论文还进一步将经密码子优化的抗菌肽NZ2114转入莱茵衣藻的叶绿体内，构建了基因工程藻，首次实现了抗菌肽在衣藻叶绿体中的活性表达。为抗病饵料藻的开发和研制奠定基础。本实验技术路线如图1-3所示。图1-3本研究技术路线12 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析第二章抗菌肽在Pichiapink酵母中的表达水产及畜牧业长期大量使用抗生素，会导致生物安全性与环境污染问题。抗菌肽由于其独特的抗菌机理，使细菌不易对其产生耐药性，且代谢速度快不会在机体中产生有害残留，因此被认为是潜在的抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高，生物体内含量极微，从生物体内直接分离抗菌肽面临着产量低、成本高的问题，采用基因工程技术大规模表达抗菌肽是目前最可行的抗菌肽制备途径。Pichiapink酵母表达系统不仅具有毕赤酵母真核表达系统的优势，可以直接表达抗菌肽，而不需要与其他蛋白融合表达来避免对宿主的毒害，还具有ADE2基因缺失型标记，利于转化子的筛选。本章节以甲醛脱氢酶启动子FLD1替换pPink-LC质粒中的醇氧化酶启动子AOX1，构建了可由氯化胆碱诱导的新质粒。并以此为基础，分别插入密码子优化过的抗菌肽pisL9K22WK基因和NZ2114基因，构建了FPLC和FNLC两个酵母表达载体。采用串联方式构建了含有α分泌信号肽的pisL9K22WK基因四串联酵母胞外表达载体αFPHLC和含有α分泌信号肽的NZ2114基因四串联酵母胞外表达载体αFNHLC。表达质粒分别电转化Pichiapink酵母，以达到在Pichiapink酵母胞内及胞外表达抗菌肽pisL9K22WK和NZ2114的目的。2.1实验材料2.1.1实验仪器与试剂（1）实验用到的仪器见表2-1。表2-1实验仪器仪器名称型号生产厂商高压均质机AH-2010ATSEngineeringLimited电热恒温水箱DKB-600B上海精宏实验设备有限公司超净工作台SW-CT-2FD苏州净化设备有限公司细菌培养箱IGS100ThermoSCIENTIFICPH计Delta320-S梅特勒-托利多仪器有限公司电泳仪DYY-5北京六一13 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析凝胶成像系统Ellogic200KodakcompanyinUSA离心机5804REppendorf公司超低温冰箱ULT1786-3-V39美国REVCO大容量冷冻离心机J-26XPIThermoscientific摇床WY211B上海智城PCR仪5333-41301Eppendorf台式钙流检测工作站FlexStation3MolecularDevices电转仪617BR1-06510Biorad（2）实验用到的试剂见表2-2，其余试剂为国内外分析纯。表2-2实验试剂药品名称生产厂商Dr.GenTLE(fromYeast)HighRecoveryTakaraDNA聚合酶、dNTPMixtureFermentsPrimeSTARTMHSDNAPolymeraseTakara质粒小提试剂盒Omega胶回收试剂盒OmegapMDTM18-T连接试剂盒TakaraDNA连接试剂盒TakaraDNA分子量标准(MarkerDL2000，TakaraMarkerDL5000，Marker1kbLadder)LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCRTakaraSpectraTMMulticolorLowRangeProteinLadderFermentas限制性内切酶Takara2.1.2质粒与菌株实验中使用的菌株和质粒见表2-3。表2-3菌株和质粒14 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析菌株或质粒名称用途来源pPink-LCInvitrogen公司E.coliDH5α质粒克隆宿主北京全式金生物技术有限公司Pichiapink酵母重组质粒外源表达宿主Invitrogen公司FPLC表达载体本实验构造FNLC表达载体本实验构造抗菌肽pisL9K22WK工程菌携带表达载体本实验构造抗菌肽NZ2114工程菌携带表达载体本实验构造αFPHLC表达载体本实验构造αFNHLC表达载体本实验构造抗菌肽pisL9K22WK胞外工程菌携带表达载体本实验构造抗菌肽NZ2114胞外工程菌携带表达载体本实验构造金黄色葡萄球菌深圳大学海洋生物资源与生态环境重点实验室E.coliTOP10深圳大学海洋生物资源与生态环境重点实验室质粒载体pPink-LC（图2-1），该载体具有腺嘌呤筛选用特性，购于Invitrogen公司。图2-1质粒载体pPink-LC结构示意图2.1.3培养基与常用溶液（1）LB培养基(%，w/v)：酵母提取物0.5，NaCL1.0，蛋白胨1.0，固体培养基另加1.5-2.0琼脂。15 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析（2）PAD培养基（/L）：8g粉状PAD培养基，950mL去离子水，用NaOH调PH至6.0-6.5左右，加入20g琼脂粉，高压灭菌后再加入50mL40%无菌葡萄糖。（3）YPD培养基(%，w/v)：酵母提取物1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，固体培养基另加1.5-2.0琼脂。（4）500×B培养基(0.02%生物素)：20mg生物素溶于100mL双蒸水中，过滤除菌，4℃避光保存。（5）10×YNB培养基：13.4g无氨基酸氮源溶于100mL双蒸水中，过滤除菌，4℃保存。（6）发酵培养基：1%(w/v)酵母提取物，2%(w/v)蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%(w/v)YNB，4×10-5生物素，1%(w/v)山梨醇。（7）PBS缓冲液(/L)：NaH2PO4.2H2O5928g，Na2HPO4.12H2O58g，NaCL160g。（8）50×TAE电泳缓冲液用于核酸电泳：Tris碱242g，冰醋酸57.1mL，Na2EDTA·2H2O37.2g，加ddH2O至1L，调pH至8.5。（9）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：10%(w/v)SDS10mL，Tris碱3.1g，甘氨酸18.8g，加ddH2O至1L。（10）考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(w/w)的磷酸，用水稀释到1L，放置24h抽滤除掉沉淀物后使用。（11）脱色液：冰醋酸100mL，甲醇300mL，加ddH2O至1L。2.2实验方法2.2.1FLD1序列的克隆2.2.1.1菌株的培养将Pichiapink菌接入YPD液体培养基中，28℃摇床培养24h；2.2.1.2Pichiapink酵母基因组DNA的提取使用大连宝生物(Takara)公司Dr.GenTLE(fromYeast)HighRecovery试剂提取Pichiapink酵母基因组DNA。具体步骤如下：（1）取Pichiapink菌的培养液至microtube中，12,000rpm离心1min。（2）用微量移液器除去上清（应尽量除净液体）。（3）向沉淀中加入500μL的GenTLEYeastSolutionA，轻微振荡并充分悬浮沉16 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析淀，于37℃温浴1h，期间轻轻振荡离心管数次。（4）加入100μL的GenTLEYeastSolutionB，轻微振荡混匀后于70℃加热10min。（5）加入200μL的GenTLEYeastSolutionC，轻微振荡混匀后，冰上冷却5min。（6）12,000rpm，4℃离心5min。（7）小心将上清移入新的microtube中（切勿吸取沉淀）。加入上清液1/2体积的异丙醇（约400μL），上下颠倒离心管充分混匀。（8）12,000rpm，4℃离心5min，弃上清。（9）向沉淀中加入500μL预冷的70%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀，12,000rpm，4℃离心5min。（10）用微量移液器移弃上清（应尽量除净上清液）。室温下自然干燥DNA沉淀至无乙醇气味。（11）加入适量的TEBuffer溶解基因组DNA。2.2.1.3扩增FLD1序列扩增FLD1序列引物：FLD5BZ：5′-GCGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGG-3′FLD3R：5′-GCGAGGCCTTGTGAATATCAAGAATTGTATGAACAAGC-3′（下划线部分AGATCT、AGGCCT分别为BglII、StuI酶切位点)以酵母基因组为模板，FLD5BZ和FLD3R为引物进行PCR扩增，反应体系如下表2-4所示。表2-4PCR反应体系试剂用量dNTPMixture4μL10×EXTaqBuffer5μLEXTaq0.5μLPCRForwardPrimer（10μM）1μLPCRReversePrimer（10μM）1μL模板1μLddH2O（灭菌蒸馏水）37.5μLTotal50μL17 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，反应产物-20℃保存。2.2.1.4FLD1目的片段的回收用Omega胶回收试剂盒回收目的片段。具体实验流程如下：（1）将PCR产物加入1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶观察仪中切下目的条带，放入1.5mL离心管中；（2）加入适量的BindingBuffer（XP2），55℃温育7min使胶溶解。注：期间每隔2min混匀一次；（3）把HiBind®DNA柱放入一个2mL离心管；（4）加入700μLDNA/凝胶溶液到HiBind®DNA柱中，1,000xg离心1min。弃滤液，将HiBind®DNA柱放回收集管中；（5）加入300μLXP2到HiBind®DNA柱中，1,000xg离心1min，弃滤液；（6）加入700μLSPW（已加无水乙醇）洗脱，1,000xg离心1min，重复步骤；（7）空管离心2min；（8）将HiBind®DNA柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入适量的灭菌H2O。室温静置1min；1,000xg离心1min，得到目的片段；（9）取5μL回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余的-20℃保存备用。2.2.1.5FLD1的TA克隆将回收所得的FLD1目的片段与T载体连接后，转入大肠杆菌感受态细胞中。具体实验流程如下：（1）FLD1与T载体连接在PCR管中按表2-5所述加入所需试剂成分，25℃处理20min；表2-5步骤（1）反应体系试剂用量pEASY-BluntZeroCloningKit1μL胶回收DNA目的片段2μLddH2O2μLTotal5μL18 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析（2）将上述反应体系加入100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；（3）42℃热激30s；（4）加入500μLLB培养基，37℃，200rpm复苏1h；（5）3,000xg离心2min，弃去部分上清；（6）将剩下的菌液涂布于加有氨苄青霉素AMP（100mg/mL）的LB平板培养基上，倒置平板，37℃培养过夜。2.2.1.6质粒提取分别随机挑若干个单克隆到加有AMP的LB液体培养12h。使用QIAGEN®PlasmidPurificationKit提取重组载体的质粒。具体实验流程如下：（1）收集3mL过夜培养的菌液，4℃离心，6,000×g，15min，弃上清液；（2）加入300μLP1Buffer，并进行充分重悬，重悬时避免有块状物残留；（3）加入300μLP2Buffer，轻柔颠倒4-6次，颠倒要充分，室温（15-25℃）放置5min（此步骤尽量在5min内完成。装有P2Buffer的瓶子用完后要盖紧，避免空气中的CO2将其酸化以致不能使用。加有LyseBlue的BufferP1在加入BufferP2后，细胞悬浮液会呈现出蓝色。继续混匀后的悬浮液的颜色较为均一。如果悬浮液仍有无颜色或者褐色沉淀，继续混匀直到颜色变为均一）；（4）加入300μL在冰上预冷的P3Buffer，轻轻的颠倒4次，充分颠倒。冰浴5min；（5）将样品缓缓颠倒3-4次，13,000rpm，4℃离心10min；（6）将（5）步骤中的上清液倒入到QIAGEN-tip20中，13,000rpm，4℃离心1min；（7）加入1mLQCBuffer到QIAGEN-tip20，13,000rpm，4℃离心1min；重复此步骤；（8）加入800mLQFBuffer以洗脱DNA，并用一个新的1.5mLEP管收集洗脱下的DNA；（9）加入560μL常温异丙醇以沉淀DNA，混匀后，4℃，13,000rpm离心30min，小心弃去上清液；（10）加入1mL70％乙醇以清洗DNA，10,000rpm，离心10min，小心弃去上清；（11）在空气中干燥10min，用50μLddH20溶解质粒，10,000rpm离心1min。19 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析2.2.1.7FLD-T阳性克隆的筛选鉴定以上述重组载体的质粒后为模板进行PCR检测，反应体系和条件参照本章节2.2.1.3，并将验证正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序正确的片段命名为FLD1。2.2.2pisL9K22WK基因的克隆及连接启动子FLD12.2.2.1扩增pisL9K22WK基因扩增pisL9K22WK基因引物：pis3R：5′-CCAGCGTGGAATTTGCCTTTGATTATATGAAAGAAGAACATAGGCCTTGTGAATATCAA-3′pis3R-pis：5′-AATAGTGGTACCTCATTATTTCCAGACCAAACCATGAATCATCCTACCAGCGTGGAATTTGCCT-3′（下划线部分AGGCCT、GGTACC分别为StuI、KpnI酶切位点）以FLD-T为模板，以FLD5BZ和pis3R为引物进行PCR扩增，反应体系如下表2-6所示。表2-6PCR反应体系试剂用量PremixTaq（2×）10μLPCRForwardPrimer（10μM）1μLPCRReversePrimer（10μM）1μL模板0.5μLddH2O（灭菌蒸馏水）7.5μLTotal20μL扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，反应产物-20℃保存。将得到的PCR产物为模板，以FLD5BZ和pis3R-pis为引物再次进行PCR20 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析扩增。PCR反应体系及反应条件参照本章节2.2.2.1。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR结果，然后将PCR产物置于-20℃保存。2.2.2.2PCR产物连接T载体将2.2.2.1的最终PCR产物经切胶回收试剂盒进行回收，得到FLD1启动子和pisL9K22WK基因表达框。连接T-Vector，得到FLDPis-T，并转化大肠杆菌。连接体系和条件参照2.2.1.5。2.2.3NZ2114基因的优化、体外合成及连接启动子FLD12.2.3.1NZ2114基因的优化使用电脑软件设计目的基因片段的引物（http://software.kosan.com/GeMS）。扩增NZ2114序列的引物如下：NZ2114F：5′-TGTACAGGCCTATGGGCTTCGGTTGTAACGGTCCA-3′R17：5′-TCAAATCATCTTCGTTCCATGGACCGTTACAACCG-3′F33：5′-TGGAACGAAGATGATTTGAGATGTCATAACCATTGTAAGT-3′R52：5′-ACCCTTGTAACCCTTAATAGACTTACAATGGTTATGACATC-3′F73：5′-CTATTAAGGGTTACAAGGGTGGTTACTGTGCTAAGGG-3′R93：5′-ACTTACAAACGAAGCCACCCTTAGCACAGTAACC-3′F110：5′-TGGCTTCGTTTGTAAGTGTTACGGTACCGCCGG-3′R127：5′-ACAAAACTCACATCCACACCGGCGGTACCGTAAC-3′2.2.3.2NZ2114基因的体外合成（1）引物R17、F33、R52、F73、R93、F110分别取1μL（20μM）至一个500μL的管中，然后加入0.667μLddH2O，轻柔混匀，置于低速离心机离心片刻。（2）取0.5μL第（1）步的混合物至一个500μL的管中。（3）分别取1μL（30μM）引物NZ2114F和R127至第（2）步的500μL的管中，得到引物混合物。随后进行PCR。表2-7PCR反应体系试剂用量2.5mMHighPuredNTPS4μL10×PyrobestBuffer5μLPyrobestDNApolymerase1μL21 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析引物混合物2.5μLddH2O（灭菌蒸馏水）37.5μLTotal50μL反应条件如下：94℃预变性5min，90℃变性30s，60℃复性45s，72℃延伸50s，26个循环后，72℃延伸5min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，反应产物-20℃保存。2.2.3.3PCR产物的酶切及连接T载体酶切体系与条件：NZ2114的PCR产物4μL，StuI1μL，KpnI1μL，10×FDBuffer2μL，用灭菌的ddH2O补足20μL，37℃酶切30min，80℃热失活10min。对酶切产物进行回收，DNA凝胶回收操作按照试剂盒说明书进行。随后进行TA克隆及转化大肠杆菌感受态细胞，参见2.2.1.5。2.2.3.4FLD-T和NZ2114-T的酶切及连接用StuI酶切质粒FLD-T和NZ2114-T，酶切体系与条件如下表。表2-8酶切体系试剂用量StuI1μLPlasmid1μg10×fastdegistenzymebuffer2μLddH2OUpto20μL酶切条件：37℃，10min，80℃，10min。连接反应体系与条件如下：表2-9连接体系试剂用量目的片段110μL目的片段27μLT4DNALigase1μL50%PEG2μLddH2OUpto20μL22 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析连接条件：4℃，过夜。2.2.3.5PCR扩增FLD-NZ2114基因片段以2.2.3.3的酶连产物为模板，以FLD5BZ和R127为引物进行PCR扩增，反应体系如下表2-10所示。表2-10PCR反应体系试剂用量dNTPmix4μLPCRForwardPrimer（10μM）1μLPCRReversePrimer（10μM）1μL酶连产物2μLPyrobest0.5μL10×PyrobestBuffer5μLddH2O（灭菌蒸馏水）36.5μLTotal50μL反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，反应产物-20℃保存。2.2.4表达载体的构建及转化Pichiapink2.2.4.1FPLC、FNLC表达载体的构建将FLDPis-T、FLDNZ2114的PCR产物和pPink-LC载体（购自Invitrogen）分别用BglII和KpnI核酸内切酶双酶切。双酶切体系与条件如下：表2-11酶切体系试剂用量BglII2μLKpnI2μLPlasmid/PCR产物10μL10×fastdegistenzymebuffer5μLddH2OUpto50μL23 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析酶切条件：37℃水浴1h，80℃热失活10min。酶切产物用切胶回收试剂盒回收（购自TAKARA），用T4连接酶分别将FLDPis和FLDNZ2114连结到pPink-LC载体对应的酶切位点上分别获得酵母胞内表达载体FPLC和FNLC。连接体系与条件如下：表2-12连接体系试剂用量LinearvectorDNA20~100ngInsertDNA300ng10×T4ligasebuffer2μLT4DNAligase0.3μLddH2OUpto20μL连接条件：22℃，1h，16℃，1h，4℃过夜。将连接好的产物转入大肠杆菌感受细胞中，然后随机挑选单克隆，提取质粒后进行PCR检测（实验步骤同本章节2.2.3.4）和双酶切验证（实验步骤同本章节2.2.4.1），并将验证正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。24 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-2酵母重组表达载体构建示意图2.2.4.2αFPHLC、αFNHLC表达载体的构建设计胞外表达抗菌肽pisL9K22WK和抗菌肽NZ2114的基因表达框，将胞外分泌信号肽α-factor以及抗菌肽pisL9K22WK、抗菌肽NZ2114的基因表达框序列送由通用生物系统（安徽）有限公司合成。结构如图2-3。基因被合成到通用生物标准载体pUC57-simple（去掉NdeⅠ酶切位点）中。图2-3四个串联肽构造示意图用StuI和KpnI双酶切载体FPLC，切胶回收载体大片段，分别将目的基因25 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析连接到载体上，得到两个酵母胞外表达载体αFPHLC和αFNHLC。经过PCR验证后，将验证正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，进行核苷酸测序验证。2.2.4.3Pichiapink酵母的转化（1）Pichiapink酵母感受态制备挑取Pichiapink酵母（购自Invitrogen）单菌落接种至10mLYPD培养基中，28℃，250rmp，摇床培养过夜，1%(v/v)的接种量接种Pichiapink酵母过夜培养物至50mLYPD培养基中，28℃，250rmp，摇床培养至OD600nm=1.2-1.5，4℃，5,000xg，离心5min，去上清液，50mL冰预冷的无菌水洗2次，10mL冰预冷的1M山梨醇洗一次，4℃，5,000xg，离心5min，去上清液，加200-400μL冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，分装80μL/管用于电转化。（2）表达载体的线性化将表达载体FPLC、FNLC、αFPHLC、αFNHLC及空载体pPink-LC分别用SpeI酶切线性化，体系及条件如下：线性化体系与条件：质粒15μL，SpeI1.5μL，10×MBuffer5μL，ddH2O28.5μL。37℃过夜。线性化产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后，通过DNA凝胶回收。（3）Pichiapink酵母的电转化向80μLPichiapink酵母感受态细胞中加入10μg线性化的质粒，轻轻混匀，转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min，电转化，电转仪的参数为1500V，5ms。电转后立即加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后转入1.5mL离心管中，30℃，温育2-4h，4,000xg，离心1min，去掉部分上清，留下约100μL上清重悬菌体，将重悬后的菌液涂布在PAD筛选平板上，30℃倒置培养，直至长出单菌落。2.2.5重组酵母转化子的筛选及PCR鉴定筛选出PAD平板上呈现白色的FPLC、FNLC、αFPHLC及αFNHLC重组酵母转化子，以白色的重组酵母转化子基因组作为模板，以引物FLD5BZ和引物CYC13RRR进行PCR鉴定，引物序列如下：FLD5BZ：5′-GCGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGG-3′26 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析CYC13RRR：5′-GCATAGGCTAGTGAAGAGTCAAGTCGC-3′使用Takara的LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR裂解重组酵母转化子，具体方法如下：（1）取50μLLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR于灭菌的Microtube中。（2）用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，置于Microtube中搅动几下后取出。注：牙签置于Microtube中的时间不要过长，否则会影响裂解液的体积，并会影响PCR扩增效果。（3）80℃热变性15min后，低速离心，取1～5μL裂解后的上清液作为PCR反应的模板。PCR反应体系如下：表2-13PCR反应体系试剂用量酵母细胞裂解液3μL2×HifiPcrStarMix25μL10×PyrobestBuffer5μLPCRForwardPrimer（10μM）1μLPCRReversePrimer（10μM）1μLddH2O（灭菌蒸馏水）Upto50μL反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，将验证正确的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2.2.6重组酵母转化子的抑菌活性分析2.2.6.1重组酵母转化子胞内总蛋白的提取挑取测序鉴定正确的FPLC和FNLC重组酵母阳性转化子，分别接种于10mLYPD液体培养基中，28℃，250rpm培养18-24h，筛选出在摇瓶中呈现白色的重组酵母阳性转化子，以1%(v/v)接种量接种于100mL发酵培养基中，25℃，250rpm，摇床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后，每24h加27 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析甲醇至终浓度1%，诱导96h，12,000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，1×PBS洗2次，50mLPBS重悬沉淀，经高压均质机破碎，1200bar，3min，收集破碎液，12,000rpm离心10min收集破碎液上清。2.2.6.2重组酵母转化子胞外分泌蛋白的获得挑取测序鉴定正确的αFPHLC及αFNHLC重组酵母阳性转化子，分别接种于10mLYPD液体培养基中，28℃，250rpm培养18-24h，筛选出在摇瓶中呈现白色的重组酵母阳性转化子，以1%(v/v)接种量接种于100mL发酵培养基中，25℃，250rpm，摇床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后，每24h加甲醇至终浓度1%，诱导96h，12,000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清。2.2.6.3总蛋白OD法抑菌实验（1）接菌种于20mLLB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜，副溶血弧菌则置于25℃，200rpm摇床培养过夜。（2）取200μL过夜培养物接至20mLLB液体培养基中，37℃，200rpm（副溶血弧菌则置于25℃，200rpm）培养0.5-1h，使OD600nm在0.3左右，此时，菌体细胞浓度达到大约5×107cfu/mL。（3）取此时的菌液30μL菌液加入1.5mLLB液体培养基此时的菌体细胞浓度达到大约1×106cfu/mL；（4）取步骤3中菌液150μL菌液加入1.5mLLB液体培养基此时的菌体细胞浓度达到大约1×105cfu/mL；（5）取100μL（100μL=1×104cfu）步骤四中稀释好的菌液加于已经加待测蛋白100μL的孔中，阴性为转入空载体的酵母破碎液；（6）加样结束后经OD600nm（副溶血弧菌测定OD540nm）测定记录（测定的是存活细菌的吸光值，OD值越高表示细菌存活数越多），然后分别在0h、2h、4h、8h、12h、20h、24h测定记录，并统计分析结果。该实验设3次重复。对照组吸光度-实验组吸光度抑菌率100%对照组吸光度2.2.6.4总蛋白抑菌圈法抑菌实验金黄色葡萄球菌作为受试菌，挑取金黄色葡萄球菌单菌落接种于10mLLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB28 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600nm=0.6，取培养液按1:1000的比例加入到未凝固的含1%琼脂的培养基中（大约5×105cfu/mL），摇匀，倾倒至空平板上。待平板凝固后，用无菌枪头在平板中央打孔。向平板中央上样孔内加入总量约为150μg重组酵母总蛋白，对照组则加入2.5μg氨苄青霉素。上样后，平板于4℃水平放置30min，随后置于37℃培养箱中培养9-12h。2.2.7酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳(1)制配Tris-TricineSDSPAGE胶，如表所示。表2-14Tris-TricineSDSPAGE组分5%浓缩胶18%分离胶乙二醇--3.6mL3MTris-HCLbuffer,pH8.451.5mL3mLAcryl/Bissolution（40%）0.75mL（29:1）5.4mL（19:1）去离子水3.75mL--40%APS6μL12μLTEMED(100%)24μL18μLTotal～6mL～12mL(2)样品制备：将蛋白液与同体积的上样缓冲液混匀，沸水浴处5min。(3)电泳：点好样后进行电泳，浓缩凝胶时用80V/cm电压，待溴酚蓝染料跑至分离胶后用200V/cm继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。(4)水洗：取出Tris-TricineSDSPAGE胶放置于5倍体积的去离子水中，摇床低转速摇30min(5)固定：取出Tris-TricineSDSPAGE胶放置于5倍体积的5%戊二醛摇床低转速摇30min(6)染色，脱色：取出Tris-TricineSDSPAGE胶放置于5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中，摇床低转速染色25min后，将PAGE胶转至脱色液中，脱色1h，其间更换脱色液直至可以观察到明显条带。2.2.8质谱鉴定目的片段将蛋白胶上目的片段出现的位置切胶回收，并做胰酶切反应然后做质谱鉴定。其中胰酶切的步骤如下：29 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析1.准备溶液:（1）脱色液：50%ACN；（2）酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul覆盖液充分混和溶解；（3）萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；2.操作步骤：（1）ddH2O洗胶块2次，吸走液体；（2）胶块脱色：加50%ACN100uL（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色过夜，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；ddH2O洗胶块2次，至胶块变得完全无色透明；（3）胶块脱水：加50%ACN溶液，让胶块脱水，吸走液体；再加100%ACN，让胶块变白完全脱水，吸走液体；（4）还原烷基化（SDS一维电泳，需做此步；2D电泳不需要此步）1)加入50uL10mMDTT溶液（溶于0.5mMNH4HCO3），56℃水浴1h；离心，吸走液体；2)加入50uL55mMIAA溶液（溶于25mMNH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3)加入100uLddH2O洗胶块，将反应剩余液体吸走；4)胶块脱水，同步骤（3），尽量洗净以上残留液体；（5）加入胰酶5-15uL（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min；（6）加40uL覆盖液，37℃水浴16h；（7）萃取胶内的多肽，加100uL萃取液，超声10min，离心转移，浓缩4h；（8）浓缩干燥的粉末中加入20uL上样液（LCIMSBuffer），溶解粉末，涡流2min，13,000rpm离心15min，取15uL做质谱鉴定。（9）质谱鉴定的结果经Proteinpilot软件分析获取结果。2.3结果与分析2.3.1FLD1序列的克隆提取Pichiapink酵母全基因组DNA，以全基因组DNA为模板扩增FLD1启动子基因，电泳见图2-4，FLD1片段大小约为597bp，条带大小与预期一致。30 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析将FLD1连接T载体，得到FLD-T，转化大肠杆菌感受态细胞，进行菌落PCR验证，电泳见图2-5，测序结果正确，可用于后续实验。图2-4FLD1启动子的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000bp;1:FLD1图2-5FLD-T菌落PCR验证琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000bp;1,2:FLD-T的PCR产物31 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析2.3.2pisL9K22WK基因的克隆及连接启动子FLD1以FLD-T为模板，以FLD5BZ和pis3R为引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物做为模板，以FLD5BZ和pis3R-pis为引物再次进行PCR扩增，获得FLDPIS,电泳见图2-6，FLDPIS大小约为690bp，条带大小与预期一致，测序结果正确，可用于后续实验。图2-6FLDPIS的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000;1:FLDPIS的PCR产物2.3.3NZ2114基因的克隆及连接启动子FLD1采用基于PCR的长片段序列克隆方法获得了NZ2114基因，NZ2114基因大小约为120bp，如图2-7所示，条带大小与预期一致。测序结果正确，无基因突变。可用于后续实验。FLDNZ2114的PCR产物分别用BglII和KpnI快切酶对其进行双酶切，如图2-8所示FLDNZ2114经双酶切后，电泳图中出现的条带与目的片段大小一致，约738bp左右。32 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-7NZ2114的扩增琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000bp;1,2:NZ2114图2-8FLDNZ2114双酶切琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000;1:FLDNZ2114双酶切产物2.3.4表达载体的构建及转化Pichiapink2.3.4.1FPLC、FNLC表达载体的构建将Pichiapink酵母表达载体pPink-LC采用BglII和KpnI双酶切去除醇氧化酶启动子，酶切出的片段大小与预期一致，如图2-9所示，切胶回收载体大片段。将FLDPis-T采用BglII和KpnI双酶切后得到FLDPis，将其连接载体大片段，获得表达载体FPLC。然后转化大肠杆菌，挑出单菌落进行PCR验证，结果如图2-10所示，得到了得到一条690bp左右的带，与预期一致，说明目的基因已成功插入到载体上。测序结果证明插入位点正确且无突变。33 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析将FLDNZ2114基因片段与载体大片段连接，获得表达载体FNLC。然后转化大肠杆菌，挑出单菌落进行PCR验证，结果如图2-11所示，得到了得到一条约738bp的带，与预期一致，说明目的基因已成功插入到载体上。测序结果证明插入位点正确且无突变。图2-9pPink-LC双酶切琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000;1:pPink-LC双酶切产物图2-10FPLC表达载体菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000;1-4:FPLC表达载体的PCR产物34 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-11FNLC表达载体菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-5000;1-3:FNLC表达载体的PCR产物2.3.4.2FPLC、FNLC、αFPHLC和αFNHLC表达载体转化Pichiapink将表达载体FPLC、FNLC、αFPHLC、αFNHLC和载体pPink-LC分别采用SpeI酶切线性化，使用电转化法分别转化进入Pichiapink酵母，均匀涂布在PAD筛选平板上，30℃倒置培养，3~7天后PAD平板上长出转化子。2.3.5重组酵母转化子的筛选及PCR鉴定2.3.5.1重组酵母转化子的筛选PAD平板上长出转化子后，观察转化子颜色，转化子于PAD(PichiaAdenineDropout)平板颜色微微不同，由于在多拷贝基因整合下，转化子呈白色，在无基因整合或者低拷贝基因整合下，转化子呈粉红色。因此初步筛选出了13个表型上呈现白色的pisL9K22WK酵母胞内表达转化子、54个表型上呈现白色的NZ2114酵母胞内表达转化子和38个表型上呈现白色的pPink-LC酵母转化子。总共得到了72个表型上呈现白色的pisL9K22WK酵母胞外表达转化子、45个表型上呈现白色的NZ2114酵母胞外表达转化子。35 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-12FPLC酵母转化子筛选图2-13FNLC酵母转化子筛选36 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-14αFPHLC转化子的平板筛选图2-15αFNHLC转化子的平板筛选2.3.5.2重组酵母转化子PCR鉴定对FPLC、FNLC、αFPHLC及αFNHLC的重组酵母转化子的基因组DNA进行PCR检测，使用引物FLD5BZ和CYC13RRR进行PCR验证，PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图2-16所示，pisL9K22WK酵母转化子的基因组DNA扩增出约1000bp的片段，与预期大小一致，进一步测序表明该片段确为pisL9K22WK基因，表明抗菌肽基因pisL9K22WK已经整合到转化子的基因组中。对NZ2114酵母转化子的基因组PCR检测结果如图2-17所示，NZ2114酵母转化子的基因组DNA同样也扩增出约1000bp左右的片段，测序后显示该片段含有完整的NZ2114基因，证实抗菌肽基因NZ2114已经整合到转化子的基因组中。αFPHLC转化子的基因组DNA扩增出约2000bp左右的片段，αFNHLC转化子的基因组DNA扩增出约2000bp左右的片段，与预期一致，初步认为抗菌37 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析肽pisL9K22WK及抗菌肽NZ2114已经整合到Pichiapink酵母基因组中。图2-16FPLC转化子的PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000;1-14:FPLC转化子基因组的PCR产物图2-17FNLC转化子的PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000;1-24:FNLC转化子基因组的PCR产物图2-18αFPHLC转化子的PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000;1-24:αFPHLC转化子基因组的PCR产物图2-19αFNHLC转化子的PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000;1-24:αFNHLC转化子基因组的PCR产物38 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析2.3.6重组酵母转化子的抑菌活性分析2.3.6.1OD法检测FPLC和FNLC酵母转化子的抑菌活性图2-20抗菌肽pisL9K22WK酵母转化子对金黄色葡萄球菌的抑菌效果酵母转化子发酵后经高压均质机破碎后收集总蛋白，进行抑菌活性分析，如图2-20所示，抗菌肽pisL9K22WK酵母转化子对金黄色葡萄球菌都具有一定的抑菌活性，且不同转化子抑菌活性有明显差别，转化子PH2和PH6具有极强的抑菌效果。PH2对金黄色葡萄球菌作用10h时，其抑菌率达到80.06%，PH6对金黄色葡萄球菌作用10h时，其抑菌率高达88.05%。而转化子PH2和PH6对金黄色葡萄球菌作用24h时，其抑菌率分别高达84.80%和91.64%。这些结果表明抗菌肽pisL9K22WK基因在酵母转化子中被成功表达，表达出的抗菌肽具有明显的抑菌活性，并且抑菌效果可持续24h以上。39 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-21PH6对大肠杆菌的抑菌效果图2-22PH6对副溶血弧菌的抑菌效果如图2-21和图2-22所示，转化子PH6对大肠杆菌和副溶血弧菌也表现出明显抑菌效果，对大肠杆菌作用2h时，其抑菌率达到86.81%，作用24h时抑菌率达到72.72%。而对副溶血弧菌作用2h时抑菌率达到94.61%，作用24h时抑菌率达到16.79%。此外，从以上抑菌结果还可看出，抗菌肽pisL9K22WK具有广谱抗菌效果，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌以及副溶血弧菌）都具有抑菌效果。40 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-23抗菌肽NZ2114酵母转化子对金黄色葡萄球菌的抑菌效果注：采用t检验比较分析，*表示与Control相比产生显著性差异（p<0.05），**表示与Control相比产生极显著性差异（p<0.01）如图2-23所示，对金黄色葡萄球菌作用20h后，多数抗菌肽NZ2114酵母转化子对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性，每个转化子之间差异较大可能与NZ2114基因在不同转化子中的表达量不一样，转化子NZ22对金黄色葡萄球菌作用20h后抑菌率达到20.08%，与对照相比具有显著性差异（p<0.05），转化子NZ6与对照相比具有极显著性差异（p<0.01），对金黄色葡萄球菌作用20h后抑菌率达到89.00%，有极强的抑菌效果。本实验也对NZ6进行了单独的活性分析，结果表明对金黄色葡萄球菌作用2h时，其抑菌率达到80.09%，作用24h时抑菌率达到93.83%。因此，这说明抗菌肽NZ2114基因已经成功转入Pichiapink酵母中，并且成功进行了表达，且表达出的NZ2114抗菌肽有抑菌活性。2.3.6.2抑菌圈法检测重组酵母转化子的抑菌活性41 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-24重组工程菌琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果注：1:空载对照;2-7:P1，PH2，PH6，NZ6，NZ22，NZ16；8:AMP如图2-24所示，从重组酵母工程菌琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果可以看出，初步筛选出的抗菌肽pisL9K22WK的工程菌和抗菌肽NZ2114的工程菌对金黄色葡萄球菌都具有一定的抑菌活性，特别是转化子NZ6和PH6具有极强的抑菌效果，抑菌圈非常明显。空载对照由于没有导入抗菌肽基因，不能表达具有抗菌活性的蛋白，所以没有出现抑菌圈。2.3.6.3αFPHLC酵母转化子的抑菌活性初步研究αFPHLC酵母转化子发酵96h后，离心收集胞外分泌上清，进行抑菌活性初步研究。αFPHLC酵母转化子表达的pisL9K22WK对金黄色葡萄球菌作用20h后抑菌效果如图2-25，结果表明转化子PIS3、PIS4、PIS18和PIS19具有较好的的抑菌效果，与对照相比产生极显著性差异（p<0.01），抑菌率分别为43.88%、44.05%、49.11%和46.09%。因此，这说明α信号肽和抗菌肽pisL9K22WK基因已经成功转入Pichiapink酵母中，并且成功进行了胞外分泌表达，且表达出的pisL9K22WK抗菌肽有抑菌活性。42 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-25αFPHLC酵母工程菌的抗菌活性分析注：采用t检验比较分析，*表示与Control相比产生显著性差异（p<0.05），**表示与Control相比产生极显著性差异（p<0.01）2.3.6.4αFNHLC酵母转化子的抑菌活性初步研究αFNHLC酵母转化子发酵96h后，离心收集胞外分泌上清，进行抑菌活性初步研究。αFNHLC酵母转化子表达的NZ2114对金黄色葡萄球菌作用20h后抑菌效果如图2-26，结果表明转化子NZ2114-6、NZ2114-9、NZ2114-19和NZ2114-21具有较好的的抑菌效果，与对照相比产生极显著性差异（p<0.01），抑菌率分别为43.74%、89.18%、36.57%和39.32%。因此，这说明α信号肽和抗菌肽NZ2114基因已经成功转入Pichiapink酵母中，并且成功进行了胞外分泌表达，且表达出的NZ2114抗菌肽有抑菌活性。43 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图2-26αFNHLC酵母工程菌的抗菌活性分析注：采用t检验比较分析，*表示与Control相比产生显著性差异（p<0.05），**表示与Control相比产生极显著性差异（p<0.01）2.3.7酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳2.3.7.1PH6和NZ6酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳PH6和NZ6酵母工程菌经高压均质破碎后，经过70℃处理25min后，离心收集上清，取30μL跑Tris-TricineSDSPAGE蛋白胶，电泳结果如图2-27所示，可见泳道1和泳道2分别为PH6和NZ6，在1.7kDa与4.2kDa间均有明显的目的条带出现，理论值PH6约为2.8kDa，NZ6约为4.4kDa，从图中可以看到PH6的条带大小比NZ6小，这与预期一致。图2-27PH6和NZ6酵母工程菌总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳结果注:M:Marker;1:PH6总蛋白;2:NZ6总蛋白44 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析2.3.8质谱鉴定目的片段通过将胶内酶切出来的pisL9K22WK多肽送去深圳大学质谱室李水明老师处做LC-MS结果显示，有“MIHGLVWK”氨基酸序列出现，与pisL9K22WK多肽的大部分序列匹配，覆盖率为65.2%，二级质谱鉴定的峰图结果如图2-28，结果显示，确实有pisL9K22WK多肽的序列出现。图2-28表达多肽pisL9K22WK质谱鉴定二级谱图峰图与其序列的匹配图注：峰图上b、y标注峰表示与多肽序列的匹配值，同时标注的峰数值是连续依次递增的顺序，则说明匹配越好2.4讨论Pichiapink表达系统作为一种基于毕赤酵母的真核蛋白表达系统，具有毕赤酵母表达系统的优点，既有原核细胞的特性，如繁殖快、易于培养、操作简单，又有真核细胞的特性如具有外源蛋白表达量高、具有翻译后修饰功能、不会过度糖基化，可以直接表达抗菌肽而不需要与其他蛋白一起融合表达等。此外Pichiapink表达系统又具有它自己特有的优势，如对于外源基因的转化效率较高、ADE2基因缺失型标记利于表达克隆的筛选、蛋白酶缺陷株减少了对外源蛋白的降解。本实验选择在Pichiapink细胞内表达抗菌肽还有一个重要的原因，即酵母本身营养丰富，是天然的饵料，因此在酵母细胞内表达出抗菌肽后，可以直接离心收集菌体，作为抗病饵料酵母投喂水产动物等，整个操作过程简单、快速、成本低，不需要后期的蛋白纯化过程。有研究采用溶藻弧菌腹腔注射大黄鱼建立致病菌侵染模型，将病鱼分成三组，分别喂食生理盐水、表达了抗菌肽LEAP-2C的毕赤酵母破碎干粉(1mg/g体重)和空载体毕赤酵母破碎干粉(1mg/g体重)，结果三45 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析组大黄鱼48h总存活率分别为12.5%，68.8%，25.0%[78]。这不仅说明未经纯化的酵母总蛋白直接投喂水产动物可以达到很好的抑菌效果，还说明酵母胞内自身的蛋白可以给水产动物提供丰富的营养物质，从而导致喂食了空载体毕赤酵母的大黄鱼存活率高于喂食生理盐水。本章通过PCR扩增得到了大小分别为597bp和69bp的FLD1启动子基因及抗菌肽pisL9K22WK基因，通过基于PCR的长序列克隆方法获得了大小为120bp的抗菌肽NZ2114基因。PCR扩增得到了FLDPIS和FLDNZ2114后采用限制性内切酶BglⅡ和KpnI双酶切，同时也用BglⅡ和KpnI双酶切载体pPink-LC，随后分别将FLDPIS和FLDNZ2114连接到载体上，成功构建两个表达载体FPLC和FNLC，这两个表达载体失去了AOX1，取而代之的是FLD1。分别将表达载体FPLC和FNLC电转化进入Pichiapink，得到抗菌肽pisL9K22WK酵母转化子和抗菌肽NZ2114酵母转化子。使用1%的甲醇诱导pisL9K22WK酵母转化子和抗菌肽NZ2114酵母转化子，筛选出具有明显抑菌活性的工程菌PH6和NZ6，同时也说明抗菌肽pisL9K22WK及抗菌肽NZ2114基因成功在Pichiapink表达系统实现了功能性的表达。酵母工程菌总蛋白在Tris-TricineSDSPAGE电泳中分别检测出抗菌肽pisL9K22WK和NZ2114分子量大小的片段，但是蛋白质质谱鉴定只鉴定出了抗菌肽pisL9K22WK的大部分片段，本实验经过多次质谱鉴定抗菌肽pisL9K22WK和NZ2114，结果均不太理想，没有出现百分之百匹配上，只鉴定出了抗菌肽pisL9K22WK的后半部分多肽序列，可能是由于目的蛋白分子量非常小，质谱鉴定前期样品处理过程繁琐，需要经多次水洗换液，可能会导致部分多肽片段丢失，由于抗菌肽自身很容易被蛋白酶降解，因此也可能是在操作过程中有蛋白酶的降解，另外，质谱本身鉴定条件也有限，从而无法鉴定出完整的多肽序列。本实验遗憾的是未能纯化出单一目的蛋白，一方面是因为Pichiapink酵母胞内自身的蛋白非常多，另一方面是因为目的蛋白分子量非常小，因此对于后续的蛋白纯化非常不利。常用的蛋白纯化方法为使用不同截留蛋白分子量大小的超滤管过滤，市面上出售的超滤管有3kDa、10kDa、30kDa、50kDa和100kDa几种类型。由于酵母胞内自身蛋白非常多，在进行超滤管过滤时出现蛋白堵住超滤管导致蛋白液滤不下去的情况。目的蛋白pisL9K22WK大小仅为2.8kDa，超滤管最小的截留蛋白分子量大小为3kDa，两者大小非常接近，理论上使用3kDa46 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析的超滤管超滤后，抗菌肽pisL9K22WK应该存在于下清中，因此将3kDa的超滤管超滤后的下清取出跑Tris-TricineSDSPAGE蛋白胶，结果并未出现目的条带，考虑到可能是蛋白浓度不够，又将3kDa超滤管的超滤下清进行了真空冷冻干燥浓缩，Tris-TricineSDSPAGE蛋白胶中也未跑出目的大小的条带，将3kDa超滤管的超滤上清取出跑Tris-TricineSDSPAGE蛋白胶，结果只在10kDa处出现条带，并未在目的大小的位置出现条带，可能是因为抗菌肽pisL9K22WK太小且与超滤管能截留的蛋白分子量大小接近，因此不能很好的分离。笔者也尝试将总蛋白用30kDa超滤管超滤，超滤下清装于8kDa的透析袋中，试图让抗菌肽pisL9K22WK透析出来，4℃透析过夜，收集透析外液，真空冷冻干燥浓缩后，跑Tris-TricineSDSPAGE蛋白胶，结果并未出现目的条带，可能是蛋白不能很好的在自然压力下通过透析袋扩散出来，但是又没有很好的对透析袋加压的方法，因此这种方法达不到分离蛋白的目的。NZ2114大小为4.4kDa，理论上使用3kDa的超滤管超滤后，抗菌肽NZ2114应该存在于上清中，但是分别取超滤上清下清去做抑菌实验，结果发现超滤上清没有抑菌效果，反而超滤下清有抑菌效果，可能是与抗菌肽的分子结构有关或者超滤管的滤膜大小只是一个理论值，与实际值有一定偏差，因此蛋白超滤管对于这种超小分子量的多肽不仅起不到浓缩和脱盐的作用，且起不到很好的分离作用，并不是一个很好的纯化方法。但是本实验的目的是做抗病饵料酵母，诱导表达抗菌肽后直接收集菌体作为抗病饵料酵母投喂水产动物，本来就不需要进行蛋白纯化，本实验表达的目的蛋白已经通过抑菌实验检测其活性，有明显的抑菌活性，因此说明抗病饵料酵母已经构建成功。本章也对胞外表达抗菌肽pisL9K22WK和NZ2114做了初步研究，设计胞外表达抗菌肽pisL9K22WK和NZ2114的基因表达框，得到了表达载体αFPHLC和αFNHLC，用限制性内切酶SpeI酶切表达载体，胶回收得到线性化的表达载体，分别电转化进入Pichiapink酵母，得到抗菌肽pisL9K22WK胞外工程菌和抗菌肽NZ2114胞外工程菌。使用1%的甲醇诱导pisL9K22WK胞外工程菌，筛选出具有明显抑菌活性的转化子PIS3，使用1%的甲醇诱导NZ2114胞外工程菌，筛选出具有明显抑菌活性的转化子NZ2114-9，说明抗菌肽pisL9K22WK和抗菌肽NZ2114也可以在Pichiapink表达系统实现功能性的胞外分泌表达。但是遗憾的是在进行抑菌圈实验时抑菌效果不明显，可能是酵母胞外存在丰富的蛋白酶，而小分子抗菌肽又易降解，所以可能需要进一步优化纯化方案。47 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析第三章氯化胆碱诱导酵母工程菌的条件优化甲醇不仅有毒且易燃易爆易挥发，在生产中存在巨大的安全隐患，利用甲醇诱导表达的抗菌肽产品中也会存在甲醇残留的问题。甲醇的毒性使得这种抗菌肽产品无法安全的应用于饲料中。因此，开发一种安全无毒害的诱导物来诱导酵母表达抗菌肽具有重要的应用价值。氯化胆碱是一种饲料添加剂，可以刺激卵巢多产蛋、产仔及禽畜、鱼类等增重。本章节通过饲料添加剂氯化胆碱代替有毒甲醇作为诱导物，探索酵母工程菌PH6和NZ6的发酵条件。3.1实验材料3.1.1实验仪器与试剂氯化胆碱，购于麦克林公司。其他试剂及溶液在2.1.1节已描述。3.1.2菌株酵母工程菌PH6及NZ6为本实验构建。3.1.3培养基与常用溶液参见2.1.3。3.2实验方法3.2.1菌株的培养种子活化：从-80℃冰箱中取出保存的菌种10μL，接入5mLYPD液体培养基中，250rpm，28℃摇床培养18-24h；3.2.2氯化胆碱诱导酵母工程菌PH6的条件优化3.2.2.1酵母工程菌PH6的诱导浓度优化考察氯化胆碱不同补加量对酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的影响。氯化胆碱作为诱导物，山梨醇作为碳源。挑取抗菌肽pisL9K22WK工程菌接种于10mLYPD液体培养基中，28℃，250rpm培养18-24h，以1%(v/v）的接种量将活化的PH6种子液接种于100mL发酵培养基中，25℃，250rpm，摇48 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后从24h开始每24h补加氯化胆碱和山梨醇，山梨醇补加量为1.89%(w/v)，氯化胆碱补加量分别为1%(w/v)、2%(w/v)、3%(w/v)、4%(w/v)、5%(w/v)，诱导96h。随后收集发酵液，12,000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，1×PBS洗2次，50mLPBS重悬沉淀，经高压均质机破碎，12,000rpm离心10min收集破碎液上清，70℃处理25min，在冰上放置10min。12,000rpm，4℃，离心20min，收集上清。均将总蛋白稀释至200μg/mL，使用OD抑菌法检测酵母工程菌PH6的总蛋白抑菌活性。S.aureus作为受试菌。具体操作参照2.2.5.3。3.2.2.2酵母工程菌PH6的诱导时间优化考察氯化胆碱不同诱导时间对酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的影响。氯化胆碱作为诱导物，山梨醇作为碳源。挑取抗菌肽pisL9K22WK工程菌接种于10mLYPD液体培养基中，28℃，250rpm培养18-24h，以1%(v/v）接种量接种于100mL发酵培养基中，25℃，250rpm，摇床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后从24h开始每24h补加氯化胆碱和山梨醇，山梨醇补加量为1.89%(w/v)，氯化胆碱补加量为2%(w/v)，诱导时间分别为0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h。随后收集发酵液12,000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，1×PBS洗2次，50mLPBS重悬沉淀，经高压均质机破碎，12,000rpm离心10min收集破碎液上清，70℃处理25min，在冰上放置10min。12,000rpm，4℃，离心20min，收集上清。均将总蛋白稀释至50μg/mL，使用OD抑菌法检测酵母工程菌PH6的总蛋白抑菌活性。S.aureus作为受试菌。具体操作参照2.2.5.3。3.2.3氯化胆碱诱导酵母工程菌NZ6的条件优化3.2.3.1酵母工程菌NZ6的诱导浓度优化考察氯化胆碱不同补加量对酵母工程菌NZ6表达抗菌肽NZ2114的影响。氯化胆碱作为诱导物，山梨醇作为碳源。优化及处理方法参照3.2.2.1。均将总蛋白稀释至200μg/mL。使用OD抑菌法检测酵母工程菌PH6的总蛋白抑菌活性。S.aureus作为受试菌。具体操作参照2.2.5.3。3.2.3.2酵母工程菌NZ6的诱导时间优化考察氯化胆碱不同诱导时间对酵母工程菌NZ6表达抗菌肽NZ2114的影响。49 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析氯化胆碱作为诱导物，山梨醇作为碳源。优化及处理方法参照3.2.2.2。均将总蛋白稀释至150μg/mL，使用OD抑菌法检测酵母工程菌NZ6的总蛋白抑菌活性。S.aureus作为受试菌。具体操作参照2.2.5.3。3.2.4氯化胆碱和甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的比较挑取酵母工程菌PH6接种于10mLYPD液体培养基中，28℃，250rpm培养18-24h，以1%(v/v)的接种量将活化的PH6种子液接种于100mL发酵培养基中，25℃，250rpm，摇床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后从24h开始每24h补加诱导物，分为两组，一组补加诱导物2%(w/v)氯化胆碱和1.89%(w/v)山梨醇，另一组补加诱导物为1%(v/v)甲醇，均诱导96h。随后收集发酵液，12,000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，1×PBS洗2次，50mL1×PBS重悬沉淀，经高压均质机破碎，12,000rpm离心10min收集破碎液上清。用OD抑菌法检测酵母工程菌PH6的总蛋白抑菌活性。副溶血弧菌作为受试菌。具体操作参照2.2.5.3。3.2.5酵母工程菌PH6蛋白纯化条件优化分别采用70℃和100℃处理用2%(w/v)的氯化胆碱诱导酵母转化子PH6发酵96h后的总蛋白5min、25min和45min。在冰上放置10min。12,000rpm，4℃，离心20min，收集上清，采用OD抑菌法检测上清抑制金黄色葡萄球菌的活性。3.3实验结果3.3.1氯化胆碱诱导酵母工程菌PH6的条件优化3.3.1.1酵母工程菌PH6的诱导浓度优化用不同浓度的氯化胆碱作为诱导物，1.89%(w/v)山梨醇作为碳源，诱导酵母工程菌PH6发酵96h。经高压均质机破碎后收集总蛋白，70℃处理25min后，均将总蛋白稀释至200μg/mL，进行抑菌实验，探索最佳诱导浓度，实验结果如图3-1所示，对金黄色葡萄球菌作用24h后，氯化胆碱补加量为1%(w/v)和2%(w/v)与对照相比具有显著性差异（p<0.05），均有良好的抑菌效果，抑菌率分别为33.53%和32.79%，故氯化胆碱诱导PH6转化子表达pisL9K22WK的最佳诱导浓度为1%(w/v)。50 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-1氯化胆碱补加量对酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的影响注：采用t检验比较分析，*表示与0%(w/v)相比产生显著性差异（p<0.05）3.3.1.2酵母工程菌PH6的诱导时间优化使用2%(w/v)氯化胆碱作为诱导物，1.89%(w/v)山梨醇作为碳源，探索诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的最佳时间，分别诱导0h~144h。经高压均质机破碎后收集总蛋白，70℃处理25min后，均将总蛋白稀释至50μg/mL，进行抑菌实验，总蛋白对金黄色葡萄球菌作用4h后，实验结果如图3-2所示，诱导144h与诱导0h的抑菌效果没有显著性差异（p>0.05），诱导24h和诱导48h的抑菌效果与0h相比有极显著性差异（p<0.01），抑菌率分别为33.66%和32.23%，诱导时间为72h、96h和120h时抑菌效果与0h相比也有极显著性差异（p<0.01），抑菌率分别为50.25%、61.13%和69.70%，诱导120h时抑菌率最高，故氯化胆碱诱导PH6转化子表达抗菌肽pisL9K22WK的最佳诱导时间为120h，但是诱导时间为72h、96h和120h时相互之间抑菌率没有显著性差异（p>0.05），若要从成本方面考虑，也可以选择72h。51 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-2氯化胆碱诱导时间对酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的影响注:柱状图上方字母指单因素方差分析(ANOVA)-TukeyHSDa多重比较分析结果，字母不同表示有极显著性差异（p<0.01），a-与b-之间没有显著性差异（p>0.05）3.3.2氯化胆碱诱导酵母工程菌NZ6的条件优化3.3.2.1酵母工程菌NZ6的诱导浓度优化用不同浓度的氯化胆碱作为诱导物，诱导酵母工程菌NZ6发酵96h。经高压均质机破碎后收集总蛋白，70℃处理25min后，均将总蛋白稀释至200μg/mL，进行抑菌实验，探索最佳诱导浓度，实验结果如图3-3所示，对金黄色葡萄球菌作用24h时氯化胆碱补加量为2%(w/v)时抑菌效果最好，抑菌率为28.02%，与对照相比具有显著性差异（p<0.05），故氯化胆碱诱导NZ6转化子表达抗菌肽NZ2114的最佳浓度为2%(w/v)。52 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-3氯化胆碱补加量对酵母工程菌NZ6表达抗菌肽NZ2114的影响注：采用t检验比较分析，*表示与0%(w/v)相比产生显著性差异（p<0.05）2.3.8.4酵母工程菌NZ6的诱导时间优化以筛选到的NZ6转化子为出发菌株，发酵培养基为基础，诱导期山梨醇补加量为1.89%(w/v)，氯化胆碱补加量为2%(w/v)，诱导0h~144h。经高压均质机破碎后收集总蛋白，70℃处理25min后，均将总蛋白稀释至150μg/mL，进行最佳诱导时间的探索，对金黄色葡萄球菌作用8h后，实验结果如图3-4所示，诱导时间为72h时抑菌效果最好，抑菌率为18.24%，与诱导0h相比有显著性差异（p<0.05），故氯化胆碱诱导抗菌肽NZ2114的最佳诱导时间为72h。53 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-4氯化胆碱诱导时间对酵母工程菌NZ6表达抗菌肽NZ2114的影响注：采用t检验比较分析，*表示与0h相比产生显著性差异（p<0.05），**表示与0h相比产生极显著性差异（p<0.01）3.3.3氯化胆碱和甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的比较使用2%(w/v)氯化胆碱作为诱导物，1.89%(w/v)山梨醇作为碳源，诱导酵母工程菌PH6发酵96h。使用1%(v/v)甲醇作为诱导物，诱导酵母工程菌PH6发酵96h。比较两种诱导物对酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的影响。采用OD抑菌法检测总蛋白抑制副溶血弧菌的活性。结果如图3-5所示，OD值越高表明存活的细菌数越多，采用2%(w/v)氯化胆碱作为诱导物诱导出的酵母工程菌PH6的总蛋白抑菌活性优于采用1%(v/v)甲醇作为诱导物。对副溶血弧菌作用24h后，采用1%(v/v)甲醇作为诱导物的总蛋白抑菌率为28.34%，而采用2%(w/v)氯化胆碱作为诱导物的总蛋白抑菌率为42.44%，故氯化胆碱作为诱导物优于甲醇作为诱导物。54 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-5氯化胆碱与甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK的比较3.3.4酵母工程菌PH6蛋白纯化条件优化分别采用70℃和100℃处理氯化胆碱诱导PH6酵母转化子发酵96h后的总蛋白5min、25min和45min。采用OD抑菌法检测上清抑制金黄色葡萄球菌的活性。如图3-6和图3-7所示，对金黄色葡萄球菌作用8h结果表明，70℃和100℃处理5min、25min和45min后的抑菌效果均比未处理前强，且70℃处理25min和45min后的蛋白液上清抑菌效果明显优于70℃处理5min，70℃处理25min与对照相比有显著性差异（p<0.05），抑菌率高达96.65%。图3-7显示100℃处理后的蛋白液上清依旧有抑菌活性，且100℃处理5min与100℃处理25min与对照相比具有极显著性差异（p<0.01），抑菌率分别为83.44%和28.13%，随着100℃处理时间的增加，抑菌活性相对减弱，表明抗菌肽pisL9K22WK已经受到了损失。对比发现70℃处理25min抑菌效果是100℃处理5min的1.16倍，故70℃处理25min为最佳处理条件。55 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图3-670℃处理PH6总蛋白的抑菌效果注：采用t检验比较分析，*表示与Control相比产生显著性差异（p<0.05）图3-7100℃处理PH6总蛋白的抑菌效果注：采用t检验比较分析，**表示与Control相比产生极显著性差异（p<0.01）3.4讨论毕赤酵母中有很多启动子，AOX1是常见的毕赤酵母中的启动子，它诱导效56 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析率高且稳定，但它的高效转录离不开甲醇，由于甲醇有毒性且易燃易爆易挥发，因此使用甲醇来诱导表达的产物不适合作为食品或着饲料的添加剂。Shen等[60]发现了的毕赤酵母中的新的诱导型启动子FLD1，它既可以通过甲醇来诱导，又可以通过甲胺来诱导，从而避免了使用不安全的甲醇作为诱导物，且使用FLD1启动子与使用AOX1启动子的蛋白表达水平差不多，因此FLD1启动子是一个不错的AOX1启动子的替代品。目前已有研究报道FLD1启动子可以被山梨醇和甲胺[60]，低浓度的甘油（0.5-1.5%(v/v)）和低浓度葡萄糖（1-1.5%(w/v)）来诱导表达外源蛋白。Resina等[66]使用山梨醇和甲胺分别作为碳源和氮源，利用FLD1启动子在毕赤酵母中成功表达出米根霉脂肪酶(Rhizopusoryzae)，结果表明分泌到胞外培养基的脂肪酶水平与使用传统的AOX启动子调控的脂肪酶水平相媲美，用山梨醇和甲胺盐酸盐诱导表达的酶活为14U/mL，而用甲醇和硫酸铵诱导表达的酶活为8U/mL，这说明FLD1启动子是AOX1的一个不错替代品，同时也表明使用山梨醇作为碳源结合甲胺作为氮源可以作为非甲醇诱导FLD启动子在毕赤酵母中表达异源蛋白的基础。Zhan等[67]利用甘油和葡萄糖成功诱导FLD1启动子在毕赤酵母中表达出菊粉果糖转移酶。尚未有氯化胆碱诱导FLD1启动子表达外源蛋白的报道。本章首次实现了氯化胆碱诱导FLD1启动子表达抗菌肽，且表达出的抗菌肽具有明显活性，可应用于食品或着饲料的添加剂，探索出氯化胆碱诱导PH6的最佳诱导浓度为1%，最佳诱导时间为120h，而氯化胆碱诱导NZ6的最佳诱导浓度为2%，最佳诱导时间为72h。对氯化胆碱和甲醇诱导酵母工程菌PH6表达抗菌肽pisL9K22WK进行了比较，结果发现采用氯化胆碱作为诱导物的PH6总蛋白抑菌率为42.44%，采用甲醇作为诱导物的抑菌率为28.34%，这说明采用作为饲料添加剂的氯化胆碱替代有毒甲醇作为诱导物，不仅解决了采用有毒甲醇诱导的诸多问题，诱导后可以安全的直接添加于饲料中，抗菌肽pisL9K22WK的表达效率还高于采用有毒甲醇诱导，因此氯化胆碱是一个不错的替代甲醇的诱导物。本实验首次尝试用高温处理的方法纯化蛋白。分别采用70℃和100℃处理氯化胆碱诱导抗菌肽pisL9K22WK工程菌发酵96h后的总蛋白，不耐高温的蛋白发生变性，而抗菌肽pisL9K22WK是耐高温蛋白，因此不耐高温的蛋白变性后被离心下来，抗菌肽pisL9K22WK还存在于上清中。抑菌实验表明，将总蛋白57 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析置于70℃处理25min后，其蛋白活性远远高于未经温度处理的总蛋白，可能是因为酵母胞内的杂蛋白阻碍了抗菌肽发挥杀菌作用，而高温处理除掉了部分杂蛋白，从而使得抗菌肽能更好的发挥杀菌作用。此方法操作简单，成本低，为蛋白纯化提供了的新思路。58 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析第四章抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体的表达莱茵衣藻培养条件简单，生长周期短，并且莱茵衣藻自身是安全无毒的，是一种重要的活体饵料藻，能提供丰富的营养物质。莱茵衣藻叶绿体外源蛋白表达量高于核表达，并且外源基因可以通过与叶绿体基因组的同源重组实现定点插入，保证了外源基因的稳定表达。本章节根据莱茵衣藻叶绿体基因的密码子偏好性优化了抗菌肽NZ2114的基因，并构建了含有16s/psbA杂合启动子的莱茵衣藻叶绿体表达质粒p322-NZ，通过“基因枪法”将该质粒和表达壮观霉素抗性基因的辅助质粒p228共同转化衣藻叶绿体，以达到在莱茵衣藻叶绿体中稳定表达抗菌肽NZ2114的目的。4.1实验材料4.1.1菌种与质粒金黄色葡萄球菌为本实验室冻存。莱茵衣藻cc4147、质粒p322和p228（带有壮观霉素筛选标记）为本实验室保存。4.1.2培养基及相关试剂4.1.2.1细菌培养基LB培养基，参见2.1.3。4.1.2.2TAP培养基的配制表4-1TAP培养基试剂用量H2O970mLTris-Ace100×10mL10×Beijerincksalts10mLPhosphateBuffer100×10mLTraceelements(微量元素)1mL4.1.2.3主要实验试剂限制性内切酶BamHI、NdeⅠ购自Fremantas中晶生物技术（深圳）有限公59 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析司。T4DNA连接酶、DL2000、EsTaqmix（dNTP、Taq酶、缓冲液）、TakaraMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0等均购自宝生物工程（大连）有限公司。4.2实验方法4.2.1NZ2114基因的密码子优化及合成密码子统计及偏好性分析：用GCUA2.0软件在线分析(http://gcua.schoedl.de/)莱茵衣藻和腐生子囊菌密码子使用情况以及NZ2114基因的密码子偏好性。使用eachcodonvs.usagetable模式统计2种物种密码子使用频率差异;使用eachtripletpositionvs.usagetable分析NZ2114基因的密码子偏好性，并根据莱茵衣藻密码子优先性对NZ2114基因进行改造。将16s/psba启动子和NZ2114叶绿体优化基因序列送由通用生物系统(安徽)有限公司合成。上述基因被合成到通用生物标准载体pUC57-simple（去掉NdeⅠ酶切位点）中。4.2.2抗菌肽NZ2114莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建用限制性内切酶BamHI酶切质粒p322和16s/psbANZ21143’UTR片段，将片段16s/psbANZ21143’UTR插入载体p322，得到表达载体p322-NZ。载体构建如图4-1所示。随后将表达载体p322-NZ转化大肠杆菌，挑出单菌落进行PCR验证。引物序列如下：p16sF：CTGCGGAGCAGCTTGTTATTGp16sR：GTCCTGCCAACTGCCTATGGPCR反应体系如下：表4-2PCR反应体系试剂用量2×ESTaqMix10μLPCRForwardPrimer（10μM）0.3μLPCRReversePrimer（10μM）0.3μL莱茵衣藻cc4147基因组4.3μL60 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析ddH2O（灭菌蒸馏水）5.1μLTotal20μL反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸7min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，将PCR条带大小鉴定正确的产物送去生工进行核苷酸测序验证。图4-1p322-NZ载体构建示意图4.2.3“基因枪法”转化莱茵衣藻4.2.3.1感受态细胞准备（1）连续光照培养衣藻cc4147，至细胞密度达到1×106cells/mL。5,000rpm,3min离心收集细胞并用新鲜TAP浓缩至1×108cells/mL。（2）100μL细胞浓缩液在TAP平板上平铺成直径3cm的圆斑（约有1-2×107cells）。4.2.3.2金粉的准备（1）称取10mg，放入1.5mL无菌离心管中，加入1mL无水乙醇，剧烈震荡10min，静置5min，短暂离心，去上清。（2）重复上步2次（3）加入0.25mL无菌的50%甘油，重新悬浮，平均分配至5支离心管中（每管50μL，4枪用），可以在室温保存2周（≈40mg/mL）（每个平板打两枪）4.2.3.3DNA的包被（1）取准备好的金粉，50μL，加入5μLDNA（≈1mg/mL)保证DNA含量在6μg左右），在高强度下震荡5min。61 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析（2）加入5μL2.5MCaCl2震荡5min（3）.加入20μL0.1M亚精胺（现配现用），震荡5min后冰上静置10min（4）离心去掉上清，加入250μL无水乙醇，震荡至重新悬浮，短暂离心，小心去掉上清，重复一次（5）加入70μL无水乙醇，低速震荡，保持悬浮状态（共4枪，防止其挥发）4.2.3.4基因枪操作（1）轰击前准备，放在超净工作台的基因枪，紫外充分灭菌40min，并用70%酒精擦拭基因枪的真空小室及各元件。（2）将已灭菌的macrocarrier（载体膜），放在对应的Macrocarrierhoder上，取10μL包被有DNA的金粉无水乙醇混合液，点在Macrocarrier中心位置，无菌吹干。（3）将电源、真空泵和氦气瓶依次打开。取出macrocarrierlauchassembly，打开盖子，将灭菌的stoppingscreen放在凹槽中，使macrocarrierhoder倒扣在凹槽上方，盖紧盖子。（4）Repturedisk（可裂膜，1500psi）安装在固定盖中拧紧。在基因枪真空室上数第二格子里放入组装好的macrocarrierlauchassembly。（5）将含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体培养基置于targetshelf中心，并将target置于真空室的上数第四个格子中，使轰击距离为9cm，关紧真空室小门。（6）抽真空：按VAC键，当真空度达到25-29inchesHg时，将VAC键直接锁定在HOLD位置；（7）轰击：按住FIRE键，直至rupturedisk爆裂：再按VENT键，使真空表指针回零。打开真空室小门，取出样品。通常每个样品轰击2次。62 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图4-2表达载体p322-NZ与抗性质粒p228共转化示意图注：sp:壮观霉素标记4.2.4转基因衣藻的筛选将基因枪法转化后的平板置于弱光光照培养箱中，培养3-4周。从平板上挑单藻落于一个新鲜的含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体培养基中，3500Lux光照培养两周，光照：黑暗（12h:12h），随后将平板上长出的单藻落再次挑于一个新鲜的含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体培养基中继续培养。如此连续转板三次，使得莱茵衣藻转化子达到同质化。4.2.5转基因衣藻基因组DNA的PCR检测提转基因莱茵衣藻基因组（TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0）。以转基因莱茵衣藻基因组为模板，用引物p16sF和psbA3UTRR进行PCR扩增检测。引物序列如下：p16sF：CTGCGGAGCAGCTTGTTATTGpsbA3UTRR：ATACTAGGCAGTGGCGGTACGGATCCCACGTGPCR反应体系如下：63 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析表4-3PCR反应体系试剂用量2×ESTaqMix10μLPCRForwardPrimer（10μM）0.3μLPCRReversePrimer（10μM）0.3μL莱茵衣藻cc4147基因组4.3μLddH2O（灭菌蒸馏水）5.1μLTotal20μL反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸7min。反应程序结束后，分别取5μL反应物进行电泳检测，将PCR条带大小鉴定正确的产物送去生工进行核苷酸测序验证。4.2.6转基因衣藻的培养由于衣藻表达载体的启动子为16s/psbA，此启动子具有强光诱导的特性。分别将莱茵衣藻cc4147和转基因衣藻从平板上挑出接种于3mL新鲜的TAP培养基中培养，在3500Lux光照条件下，光照：黑暗（12h:12h），150rpm，培养3天，至对数中后期，随后将3mL藻液接种至100mL新鲜的TAP培养基中，同时按照1:750的比例加入100mg/mL壮观霉素，连续3500Lux光照条件下，150rpm，培养3天。随后从中取50mL藻液转移至1000mL的新鲜TAP培养基中，同时按照1:1000的比例加入100μL的100mg/mL壮观霉素，连续3500Lux光照条件下，150rpm，培养7天，促使外源蛋白的表达。4.2.7转基因衣藻总蛋白的提取使用高压均质机提取衣藻总蛋白。具体方法如下：（1）取3500Lux光照条件下培养7天的藻细胞培养液1000mL，4℃，5,000rpm离心5min，收集细胞；（2）将收集到的衣藻细胞转移到50mL离心管中，用去离子水洗两次，1×PBS洗一次；（3）用1×PBS按照1g/10mL的比例重悬藻细胞；（4）将重悬后的藻液倒入高压均质机中1200bar，3min；64 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析（5）将破碎后藻细胞液4℃，12,000rpm，离心20min，收集上清即为藻细胞的总蛋白。4.2.8转基因衣藻总蛋白的抑菌活性分析4.2.8.1抑菌圈法检测转基因衣藻总蛋白的抑菌活性使用抑菌圈法来测试转基因衣藻总蛋白的抑菌活性，具体方法参见2.2.5.3。将总蛋白采用70℃，25min处理后，均稀释为150μg/mL，向平板中央上样孔内加入总量为100μL转基因衣藻蛋白，对照组则加入100μLcc4147藻株的总蛋白。上样后，平板水平置于37℃培养箱中培养12h，中间可以分不同时间段观察是否有抑菌圈形成。根据抑菌圈的大小来挑选出抑菌活性最好的转化子，作为转基因工程藻。4.2.8.2OD抑菌法检测转基因衣藻总蛋白的抑菌活性使用OD抑菌法检测抗菌肽NZ2114的转基因工程藻总蛋白抑菌活性。S.aureus作为受试菌。具体方法参见2.2.5.4。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h测量OD600nm。4.2.9转基因衣藻总蛋白Tris-TricineSDSPAGE电泳分析对筛选出的活性最强的转基因衣藻转化子16和对照cc4147进行TAP培养，并将收集所得到的总蛋白每个泳道30μL进行Tris-TricineSDSPAGE凝胶电泳。4.3结果与分析4.3.1NZ2114基因的密码子优化及合成来源于腐生子囊菌的NZ2114基因长度为120bp。用GCUA2.0软件对莱茵衣藻和腐生子囊菌密码子使用情况以及NZ2114基因的密码子使用情况的部分统计结果见图4-3。图中红色代表腐生子囊菌，而黑色代表莱茵衣藻，结果表明两者之间的平均差异为37.63%。有些密码子的使用情况相差很大。未经优化的NZ2114基因按照莱茵衣藻密码子偏好性分析后的部分结果见图4-4。其中密码子使用频率低于20的用灰色表示，低于10的用红色表示，整个NZ2114基因中65 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析共有18个低于10的密码子。因此，在不改变氨基酸残基的基础上，根据莱茵衣藻密码子偏好性对NZ2114基因的碱基进行改造。图4-3莱茵衣藻和腐生子囊菌密码子使用频率比较注：红色标记为腐生子囊菌；黑色标记为莱茵衣藻图4-4未经优化的NZ2114基因在莱茵衣藻叶绿体中的使用频率分析抗菌肽NZ2114的基因序列按照莱茵衣藻叶绿体的密码子偏好性优化后的基因序列如下：ATGGGCTTCGGTTGTAATGGTCCATGGAATGAAGATGATTTACGTTGTCATAATCATTGTAAATCAATTAAAGGTTATAAAGGTGGTTATTGTGCTAAAGGTGGCTTCGTTTGTAAATGTTATTAATGA合成的16s/psba启动子和优化的NZ2114序列如下：ggatccGGCAGGCAACAAATTTATTTATTGTCCCGTAAGGGGAAGGGGAAAACAATTATTATTTTACTGCGGAGCAGCTTGTTATTGAAATTTTATTAAAAAAAAAATAAAAATTTGACAAAAAAAAATAAAAAAGTTAAATTAAAAACACTGGGAATGTTCTACATCATAAAAATCAAAAGGGTTTAAAATCCCGACAAAATTTAAACTTTAAAGAGTGGCGCCGTACCATGCTTTTAATAGAAGCTTGAATTTAT66 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析AAATTAAAATATTTTTACAATATTTTACGGAGAAATTAAAACTTTAAAAAAATTAACATATGGGCTTCGGTTGTAATGGTCCATGGAATGAAGATGATTTACGTTGTCATAATCATTGTAAATCAATTAAAGGTTATAAAGGTGGTTATTGTGCTAAAGGTGGCTTCGTTTGTAAATGTTATtgataagaattcggtacccacgtg4.3.2抗菌肽NZ2114莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建用限制性内切酶BamHI酶切质粒P322和16s/psbANZ21143’UTR片段，将片段16s/psbANZ21143’UTR插入载体P322，得到表达载体p322-NZ。将表达载体p322-NZ转化大肠杆菌后挑取单菌落进行PCR验证，结果如图4-5所示，得到了得到一条600bp左右的带，与预期一致，同时也对p322-NZ表达载体进行了酶切验证，电泳图如图4-6所示，图中出现的条带与目的片段大小一致，说明目的基因已成功插入到载体上。PCR产物的测序结果正确，并且插入位点正确且无突变。图4-5p322-NZ表达载体菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-2000;1-14:p322-NZ表达载体的PCR产物67 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图4-6p322-NZ表达载体双酶切琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL-500;1,2:p322-NZ表达载体的双酶切产物4.3.3转基因衣藻的筛选表达载体p322-NZ与壮观霉素抗性质粒p228通过“基因枪法”共转化后，均匀铺在含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体平板上，平板置于弱光光照培养箱中倒置培养，连续光照培养3-4周，直至长出绿色的单克隆。从平板上挑单克隆藻于一个新鲜的含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体培养基中，3500Lux连续光照培养两周，随后将平板上长出的单藻落再次挑于一个新鲜的含有100mg/mL壮观霉素的TAP固体培养基中继续培养。如此连续转板三次，使得莱茵衣藻转化子达到同质化，如图4-7、4-8、4-9和4-10所示。图4-7转基因衣藻的抗性平板筛选68 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图4-8转基因衣藻的抗性平板一次筛选图4-9转基因衣藻的抗性平板二次筛选图4-10转基因衣藻的抗性平板三次筛选69 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析4.3.4转基因衣藻基因组DNA的PCR检测对转基因衣藻的基因组DNA进行PCR检测，使用p16sF和psbA3UTRR进行PCR扩增检测，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离。结果如图4-11所示，转基因衣藻基因组DNA的PCR产物条带大小与阳性对照一样约750bp，与预期一致。进一步测序表明该片段确实为目的片段，包括了NZ2114基因，表明抗菌肽基因NZ2114已经整合到转基因衣藻的基因组中。图4-11转基因衣藻基因组DNAPCR鉴定注:M:DL-2000;1:阳性对照2:转基因衣藻基因组DNAPCR产物4.3.5转基因衣藻总蛋白的抑菌活性分析4.3.5.1抑菌圈法检测转基因藻总蛋白的抑菌活性对构建成功的转基因衣藻16和c7转化子及对照cc4147藻株进行液体培养并收集藻细胞，机械破碎后将所得转基因衣藻16和c7细胞总蛋白进行抑菌活性分析。如图4-12所示，抑菌圈法结果显示，转基因衣藻16和c7转化子对金黄色葡萄球菌均有明显抑菌效果，且转基因衣藻16抑菌效果更显著，由此可以初步判断，经过优先密码子改造后的抗菌肽基因NZ2114在莱茵衣藻中进行了表达。并且抑菌圈24h后仍然没有金黄色葡萄球菌在圈内长出，即转基因衣藻表达的抗菌肽NZ2114的抑菌活性24h都没有下降。如图4-13所示，采用了OD法验证转化子16的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌作用24h后的抑菌结果表明，转化子16的抑菌效果与对照cc4147相比具有极显著性差异（p<0.01）。70 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图4-12转基因藻琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果注:A:16;B:c7;C:cc4147图4-13转基因衣藻16总蛋白的OD法抑菌结果注：采用t检验比较分析，**表示与对照相比产生极显著性差异（p<0.01）4.3.6转基因衣藻总蛋白的Tris-TricineSDSPAGE电泳分析对构建成功的转基因衣藻转化子16进行TAP液体培养，并收集藻细胞，机械破碎后将收集所得转基因衣藻16细胞总蛋白每个泳道30μL进行Tris-TricineSDSPAGE凝胶电泳。由图4-14可以看出，16总蛋白在4kDa处出现蛋白条带，与NZ2114的预期大小基本一致。71 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析图4-14转基因衣藻16总蛋白的Tris-TricineSDSPAGE电泳结果注:M:Marker;1:转基因衣藻16的总蛋白4.4讨论莱茵衣藻培养条件简单，可以自养生长，相比于大肠杆菌表达系统以及酵母表达系统，在莱茵衣藻中表达外源蛋白并不需要加入诱导物，因此操作上更为简单，也减少了相关的成本。而在莱茵衣藻叶绿体表达系统除了外源蛋白表达量高于核表达，还具有特有的优势，在表达载体上设计叶绿体基因组的同源片段，载体转化进入叶绿体之后，可以通过与叶绿体基因组的同源重组实现外源基因定点插入，使得外源基因能稳定表达，并且由于叶绿体的基因在遗传时属于母系遗传，一旦筛选得到了稳定的叶绿体转化株，一般不会存在外源基因在后代中丢失的问题。已有研究表明莱茵衣藻叶绿体能够正确地折叠和组装复杂的哺乳动物的蛋白[40]。另外，由于莱茵衣藻自身是安全无毒的，不会产生内毒素，其本身就是重要的活体饵料藻，可以直接食用，因此在莱茵衣藻叶绿体中表达抗菌肽后，可以直接离心收集莱茵衣藻，作为抗病饵料藻投喂水产动物等，整个操作过程简单、快速、成本低，不需要后期的蛋白纯化过程，省去了大量时间及精力。而且目前没有抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体表达的相关报道。因此本实验选择在莱茵衣藻叶绿体表达抗菌肽是具有重大意义的。本章根据莱茵衣藻叶绿体密码子的偏爱性，设计优化了抗菌肽NZ2114基因，连接16s/psba启动子，构建了莱茵衣藻叶绿体表达载体p322-NZ，使用基因枪法将p322-NZ与p228质粒共转进入莱茵衣藻叶绿体，得到转基因衣藻。琼脂糖孔穴扩散法及OD法抑菌结果均表明抗菌肽NZ2114已成功进行了表达，转基因衣72 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析藻有明显抑菌圈出现。首次实现了抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻叶绿体内的活性表达。Tris-TricineSDSPAGE电泳结果也表明，工程藻16的细胞粗提液在4kDa处出现蛋白条带，与NZ2114的预期大小基本一致。当前关于抗菌肽在微藻中表达的报道很少，有报道在拟微绿球藻中成功表达出抗菌肽bovinelactoferricin(LFB)，LFB是一种能杀死或灭活多种病原体的抗菌肽，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫，拟微绿球藻也是一种重要的活体饵料藻，实验者用经过副溶血弧菌感染后的青鱼来测试的抗菌肽LFB的功效，结果投喂了转基因拟微绿球藻的青鱼存活率显著高于投喂了野生型拟微绿球藻的青鱼[79]。这说明通过直接投喂表达了抗菌肽基因的饵料藻，依旧可以实现抗菌肽的抗菌效果。目前没有抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体中表达的相关报道，本实验室前期有做在莱茵衣藻核表达抗菌肽CecropinB的相关研究，采用串联表达的方式在莱茵衣藻cc-849中成功表达出抗菌肽CecropinB，表达产物对革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）都具有抑菌效果[80]。本章遗憾的是未能纯化出单一目的蛋白，抗菌肽NZ2114的分子量非常小，因此对于后续的蛋白纯化非常不利，但是本章的目的是做抗病饵料藻，诱导表达抗菌肽后直接收集藻细胞作为抗病饵料藻投喂水产动物，不需要进行蛋白纯化，藻体自身安全无毒，可以直接食用，还能提供丰富的营养物质，本实验表达的目的蛋白已经通过抑菌实验检测其活性，有明显的抑菌活性，因此说明抗病饵料藻已经构建成功。73 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析第五章结论及展望5.1主要结论本研究首次实现了抗菌肽NZ2114及抗菌肽pisL9K22WK在Pichiapink酵母中的胞内及胞外分泌表达、抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻叶绿体的表达、氯化胆碱诱导Pichiapink酵母表达外源蛋白。本实验的主要研究结论如下：（1）成功克隆出了甲醛脱氢酶启动子FLD1的序列，其大小为597bp，并用FLD1启动子替换了pPink-LC质粒中的醇氧化酶启动子AOX1，构建了可以由氯化胆碱诱导的新质粒。根据Pichiapink酵母密码子偏爱性，优化及克隆出适用于Pichiapink酵母表达的抗菌肽pisL9K22WK基因和抗菌肽NZ2114基因，其大小分别为72bp和120bp。（2）构建Pichiapink酵母胞内表达载体FPLC和FNLC，此外，还采用串联方式构建了含有α分泌信号肽的pisL9K22WK基因四串联酵母胞外表达载体αFPHLC和含有α分泌信号肽的NZ2114基因四串联酵母胞外表达载体αFNHL。（3）通过电转化法将表达载体FPLC、FNLC、αFPHLC和αFNHLC分别转入Pichiapink酵母中。转化子在PAD平板上筛选，并且经过PCR验证和甲醇诱导初筛，采用OD抑菌法及琼脂糖孔穴法检测工程酵母的抑菌活性，结果显示均成功表达抗菌肽，且有明显抑菌效果，最终获得了能在细胞内高效表达抗菌肽基因pisL9K22WK和抗菌肽基因NZ2114的酵母工程菌PH6和NZ6，以及能在胞外高效分泌表达抗菌肽基因pisL9K22WK和NZ2114的酵母工程菌PIS3和NZ2114-9。（4）探索了用氯化胆碱替代有毒甲醇进行重组抗菌肽诱导表达的新途径，使用身为饲料添加剂的氯化胆碱代替有毒的甲醇作为诱导物，优化酵母工程菌PH6和NZ6的发酵条件，PH6和NZ6的总蛋白OD抑菌法及琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果均表明，氯化胆碱成功诱导PH6和NZ6表达出了抗菌肽pisL9K22WK和抗菌肽NZ2114，总蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用，并且氯化胆碱的诱导效果还高于甲醇诱导，成功避免了使用甲醇诱导酵母表达抗病饵料酵母时所带来了安全隐患及甲醇残留造成的安全问题。（5）探索出了氯化胆碱诱导PH6及NZ6发酵的最佳条件，氯化胆碱补加量分别为1%(w/v)、2%(w/v)、3%(w/v)、4%(w/v)、5%(w/v)，诱导时间分别为0h、74 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析24h、48h、72h、96h、120h、144h。结果显示氯化胆碱诱导PH6的最佳诱导浓度为1%(w/v)，最佳诱导时间为120h，而氯化胆碱诱导NZ6的最佳诱导浓度为2%(w/v)，最佳诱导时间为72h。（6）使用温度处理法初步纯化抗菌肽pisL9K22WK，分别采用70℃和100℃处理使用氯化胆碱诱导的PH6发酵96h后的总蛋白5min、25min和45min，结果显示70℃处理25min时处理后的抗菌肽抑菌活性显著高于处理前，因此认为70℃，25min为最佳处理条件。（7）根据莱茵衣藻叶绿体基因的密码子偏好性优化了抗菌肽NZ2114的基因，构建了含有16s/psbA杂合启动子的莱茵衣藻叶绿体表达质粒p322-NZ；通过“基因枪法”将该质粒和表达壮观霉素抗性基因的辅助质粒p228共同转化衣藻叶绿体，经多次同质化筛选最终获得能成功表达抗菌肽NZ2114的基因工程藻株16。抑菌实验结果显示：工程藻16的细胞粗提液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果，并且在24h内均保留抑菌活性。Tris-TricineSDSPAGE电泳结果表明，工程藻16的细胞粗提液在4kDa处出现蛋白条带，与NZ2114的预期大小基本一致。成功实现了抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻叶绿体内的有效表达。5.2创新点一方面构建了能表达抗菌肽的Pichiapink酵母工程菌，探索了用饲料添加剂氯化胆碱替代有毒甲醇进行诱导的新方法。另一方面，构建了能在叶绿体内表达抗菌肽的基因工程藻，首次实现了抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻内的活性表达，为抗病饵料藻的开发和研制奠定基础。5.3研究展望水产及畜牧业长期滥用抗生素来防治病害，势必会导致生物安全性与环境污染问题。当前抗菌肽的研究成为一大热点，由于其独特的抗菌机理，使细菌不易对其产生耐药性，并且抗菌肽的代谢速度很快，所以不会在机体中产生有害残留，被认为是潜在的传统抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高，又很难直接从生物体内分离获得大批量抗菌肽，因此众多学者致力于研究基因工程技术重组表达抗菌肽。毕赤酵母真核表达系统的外源蛋白表达量高且稳定性好，相较于原核表达系统而言毕赤酵母真核表达系统可以直接表达抗菌肽可以直接表达抗75 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析菌肽，而不需要与其他蛋白融合表达来避免对自身的毒害。因此很多研究报道了利用毕赤酵母真核表达系统表达抗菌肽，但几乎都是采用毕赤酵母分泌表达抗菌肽，很少有毕赤酵母胞内表达抗菌肽的报道。Pichiapink酵母表达系统不仅具有毕赤酵母真核表达系统的优势，还具有ADE2基因缺失型标记，利于转化子的筛选。莱茵衣藻叶绿体表达系统。目前没有抗菌肽在莱茵衣藻叶绿体表达的研究报道。本研究采用Pichiapink酵母和莱茵衣藻叶绿体胞内表达抗菌肽，构建饵料藻和饵料酵母，由于Pichiapink酵母和莱茵衣藻自身是安全无毒的，可以直接食用，因此直接投喂表达了抗菌肽的酵母和莱茵衣藻不仅省去了大量的后续加工纯化抗菌肽的过程，还能提供丰富的营养物质。有学者在拟微绿球藻中成功表达出抗菌肽bovinelactoferricin(LFB)，用经过副溶血弧菌感染后的青鱼来测试的抗菌肽LFB的功效，结果投喂了转基因拟微绿球藻的青鱼存活率显著高于投喂了野生型拟微绿球藻的青鱼[79]。这说明通过直接投喂表达了抗菌肽基因的饵料藻，仍然可以实现抗菌肽的抗菌效果，并且还能提供丰富的营养物质。因此，本实验后续可以做动物活体实验研究，采用转基因衣藻和酵母直接投喂水产动物。另外，由于不同抗菌肽对同一种菌的抑菌能力不同，抑菌机制不同，所高效抑制的菌也不同。因此未来可以尝试在同一个宿主细胞中同时表达两个或者多个抗菌肽，以期可以实现显著提高抑菌效果。76 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抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析致谢本课题是在深圳大学生命与海洋科学学院海洋生物资源与生态环境重点实验室完成的，非常感谢深圳大学生命与海洋科学学院给我提供学习深造的平台。感谢胡章立老师三年来对我的信任与支持，对我的实验给予悉心的指导，老师严谨的教学态度跟乐观积极的心态使我受益良多，特向胡章立老师表示崇高的敬意和衷心的感谢。感谢贾彬老师和黄瑛老师在实验细节上提供的宝贵经验，提高了我的专业知识和科学素养，使得本课题能更加顺利完成，在此，对贾彬老师和黄瑛老师表示由衷的感谢！感谢学院的其他老师尤其是海洋课题组的老师三年来对我实验方面提供的宝贵经验及便利，借此机会对王潮岗老师、邓利老师、陈辉蓉老师、雷安平老师、李辉老师、黎双飞老师、王江新老师、张煜老师、郑怡红老师、蒋永光博士、肖鹏博士及胡浪博士等表示感谢。感谢师兄师姐师弟师妹们对我实验的帮助，感谢同学们在学习与生活上的共勉，感谢课题组的其他同学的帮助与支持。最后感谢我的家人与朋友，非常感谢你们一直以来对我的关心与支持，是你们让我拥有了前进的勇气与动力！83 抗病饵料藻及酵母的构建与活性分析攻读硕士学位期间的研究成果发明专利，《一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法》申请号：201710196043.584
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