西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病病原鉴定及种质资源抗性筛选

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分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病病原鉴定及种质资源抗性筛选StudiesonPathogensandResistancetoCommonRootRotandCrownRotonWinterWheatinNorthwest,China郭炜指导教师姓名李敏权研究员（甘肃省农业科学院兰州730070）学科专业名称植物病理学研究方向植物病害及其综合防治论文答辩日期2018年5月18日学位授予日期2018年6月答辩委员会主席李春杰教授评阅人刘淑艳教授邢小萍副教授2018年5月 本项目由公益性行业（农业）科研专项“西北地区麦类及蔬菜根腐类病害综合治理技术”资助完成。项目编号：201503112-4。 甘肃农业大学2018届硕士学位论文摘要普通根腐病（CommonRootrot）和茎基腐病（Crownrot）是小麦生产上一种很多见的病害，以小麦为主要粮食的生产种植区均有关于这两种病害的报道。这两种病害在世界广泛分布，凡是种植小麦的地区均有不同程度的发生，导致小麦产量减少及品质下降，对经济效益与生态安全构成了严重的威胁。近年来，普通根腐病和茎基腐病在我国西北冬麦区的发生日益加重，对其防治迫在眉睫。本研究以西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病病原鉴定为研究基础，结合病原菌的致病能力、种质资源抗性筛选、室内药剂筛选及毒力测定等几个方面的试验对冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行研究。以期为冬小麦普通根腐病和茎基腐病的深入研究、对其抗病育种工作的开展及科学防治该病害等方面奠定坚实的理论基础。本研究主要研究结果如下：1.完善了西北地区冬小麦普通根腐病（commonrootrot）和茎基腐病（crownrot）的病害症状描述：（1）普通根腐病在冬小麦生长的整个生育期均可发生。苗期形成苗枯，成株期形成根腐、叶枯、籽粒黑胚、丛状白穗等症状。症状表现常因气候条件而不同，在干旱及半干旱地区常出现根腐症状。在潮湿地区，除根腐症状外，还可发生叶枯、穗枯、黑胚等症状。（2）茎基腐病在冬小麦上发生时症状也比较复杂，主要包括烂种、死苗、茎基部褐变和单株白穗症状。苗期症状在田间表现为点片状发病，幼苗生长势弱，叶片发黄，成株期在田间表现为零星白穗，在茎基部叶鞘上甚至茎秆上形成不规则病斑，潮湿时在叶鞘上可见白色或粉红色霉层。2.采用常规的组织分离法分离真菌，通过真菌纯化将菌株进行单孢分离，随后按柯赫氏法则进行小烧杯法致病性测定。结合形态特征、显微特征及3种分子生物学鉴定（LSU分子鉴定、ITS分子鉴定、TEF分子鉴定）结果对病原菌进行鉴定。结果显示，引起西北地区冬小麦普通根腐病的优势病原为麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）。引起西北地区冬小麦茎基腐病的病原菌有9种，分别为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、木贼镰刀菌（F.equisteti）、三线镰刀菌（F.tricinctum）、芳香镰刀菌（F.redolens）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、层出镰刀菌（F.proliferatum）、乳酸镰刀菌（F.nygamai）、亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）。其中，假禾谷镰刀菌、芳香镰刀菌、乳酸镰刀菌和亚黏I 甘肃农业大学2018届硕士学位论文团镰刀菌作为冬小麦茎基腐病的病原为西北地区首次报道。3.采用小烧杯法对西北地区推广种植的38份小麦种质资源进行抗性鉴定。结果显示，在供试的38个小麦品种中，未发现对普通根腐病和茎基腐病免疫的小麦品种。在对普通根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢的抗性试验中，没有发现对此病原菌有抗性的品种，所有品种均表现为感病品种或高感品种。对茎基腐病病原菌的接种结果显示，兰15、兰天131、兰天132这3个品种对供试镰刀菌病原菌均表现抗性，且抗性较强。兰选68、兰航选121、中梁34、陇鉴101、陇鉴107、冬育4号等品种对大部分供试病原菌感病或易感病甚至高感。4.本研究进行的室内药剂筛选试验结果显示，98%多菌灵对2种镰刀菌属的菌株抑制效果好抑菌率达100%，但对平脐蠕孢的生长抑制率不佳。96%王铜对镰刀菌的抑菌率均很低，为20.00%左右，但对麦根腐平脐蠕孢的抑菌率将近70.00%。98%苯醚甲环唑对3种菌株的抑菌效果也均较好。98%多菌灵的EC50值最小，为7.03µg/ml，对镰刀菌的生长速率抑制作用最大。关键词：冬小麦，普通根腐病，茎基腐病，镰刀菌，平脐蠕孢，致病性，抗病性鉴定，毒力测定II 甘肃农业大学2018届硕士学位论文SummaryCommonrootrotandcrownrotarecommondiseasesinwheatproduction.Therearereportsonthesetwodiseasesintheproductionandplantingareaswherewheatisthemaingrain.Thesetwodiseasesarewidelydistributedintheworld,andallareaswherewheatisgrownhaveoccurredtovaryingdegrees,resultinginreducedwheatyieldandquality,posingaseriousthreattoeconomicefficiencyandecologicalsecurity.Inrecentyears,theoccurrenceofcommonrootrotandcrownrothasbeenaggravatedinthewinterwheatregionofnorthwesternChina,anditspreventionisimminent.ThisstudywasbasedontheidentificationofthepathogensofcommonrootrotandcrownrotinwinterwheatinNorthwestChina,combinedwiththepathogenicabilityofpathogenicbacteria,screeningofgermplasmresources,screeningofindoorchemicals,andtoxicitytesting.Commonrootrotandcrownrotwerestudied.Itwilllayasolidtheoreticalfoundationforthein-depthstudyofcommonrootrotandcrownrotofwinterwheat,itsdevelopmentofresistancebreeding,andscientificpreventionandcontrolofthedisease.Themainresearchresultsofthisstudyareasfollows:1.Improvethediseasesymptomsofcommonrootrotandcrownrotinthenorthwesternregion:(1)Commonrootrotcanoccurduringthewholegrowthperiodofwinterwheat.Seedlingstageseedlingsdry,adultstageformationofrootrot,leafdry,blackembryo,plexiformwhiteearandothersymptoms.Symptomsoftenvaryduetoclimaticconditions,androotrotsymptomsoftenappearinaridandsemi-aridregions.Inmoistareas,inadditiontothesymptomsofrootrot,leafblight,eardryness,blackembryosandothersymptomscanalsooccur.(2)Crownrotiscomplicatedwhenitoccursonwinterwheat.Itmainlyincludesrottenseed,deadseedlings,browningofthestembaseandsymptomsofsingleplantwhitespikes.Thesymptomsofseedlingstageshowedpatchydiseaseinthefield.Thegrowthofseedlingswasweakandtheleaveswereyellow.Theadultplantsshowedsporadicwhitespikesinthefield,andirregularlesionsformedonthestemsandeventhestemsofstems.Awhiteorpinkmoldlayercanbeseenontheleafsheath.2.Thefunguswasisolatedbyconventionaltissueisolationmethod.ThestrainswereIII 甘肃农业大学2018届硕士学位论文isolatedbysinglefunguspurificationbyfungalpurification,followedbyKoch'sruleforthedeterminationofpathogenicitybythesmallbeakermethod.Combinedwithmorphologicalfeatures,microscopicfeaturesandthreekindsofmolecularbiologicalidentification(LSUmolecularidentification,ITSmolecularidentification,TEFmolecularidentification)thepathogenswereidentified.TheresultsshowedthatthedominantpathogeniccauseofcommonrootrotofwinterwheatinNorthwestChinawasBipolarissorokiniana.Thereare9pathogenscausingcrownrotinwinterwheatinNorthwestChina,includingFusariumpseudograminearum,F.culmorum,F.equisteti,F.tricinctum,F.redolens,F.oxysporum,F.proliferatum,F.nygamai,F.subglutinans.Amongthem,F.pseudograminearum,F.redolens,F.nygamai,F.subglutinansasthepathogensofcrownrotofwinterwheatwerefirstreportedinNorthwestChina.3.Usingasmallbeakermethodtoidentifytheresistanceof38wheatgermplasmresourcesthatwerepopularizedinNorthwestChina.Theresultsshowedthatamongthe38wheatvarietiestested,nowheatvarietiesimmunizedagainstcommonrootrotandcrownrotwerefound.Intheresistancetesttothepathogenofcommonrootrot,noresistantvarietieswerefound,andallthevarietiesshowedasusceptiblevarietyorahigh-sensitivevariety.TheresultsoftheinoculationofstemrotpathogensshowedthatthethreevarietiesofLan15,Lantian131andLantian132showedresistancetothepathogenicfungiofthetestedFusarium,andtheresistancewasstrong.Lanxuan68,LanHangxuan121,Zhongliang34,Longjian101,Longjian107,Dongyu4andothervarietiesweresusceptibleorsusceptibletomostpathogenstested.4.Theresultsofscreeningofindoorchemicalstestcarriedoutinthisstudyshowedthat98%carbendazimhadgoodinhibitoryeffecton2strainsofFusariumstrains,buttheinhibitionratewas100%,butthegrowthinhibitionrateofH.umbellatuswasnotgood.Theantibacterialrateof96%KingCoppertoFusariumwasverylow,about20.00%,buttheantibacterialrateofHelminthosporiummelilotiwasnearly70.00%.98%difenoconazolehadgoodantibacterialeffectsonthethreestrains.98%carbendazimhadthesmallestEC50valueof7.03μg/ml,whichhadthegreatestinhibitoryeffectonthegrowthrateofFusarium.IV 甘肃农业大学2018届硕士学位论文Keywords:WinterWheat,CommonRootRot,Crownrot,Fusarium,Biplaris,PathogenicityTest,ResistantGermplasm,ToxicityV 甘肃农业大学2018届硕士学位论文目录摘要....................................................................................................................................ISummary..........................................................................................................................III第一章文献综述...............................................................................................................11.1小麦生产现状.......................................................................................................11.1.1小麦产量.....................................................................................................11.1.2小麦品质.....................................................................................................11.1.3我国小麦生产效益及市场竞争力.............................................................21.2小麦主要土传真菌病害发生概况.......................................................................21.2.1小麦全蚀病的为害症状、发生分布及防治.............................................31.2.2小麦纹枯病的为害症状、发生分布及防治.............................................41.3小麦普通根腐病的研究概况...............................................................................51.3.1发生与危害.................................................................................................61.3.2症状特点.....................................................................................................61.3.3病原菌种类.................................................................................................71.3.4发病规律及流行因素.................................................................................71.3.5防治措施.....................................................................................................71.4小麦茎基腐病的研究概况...................................................................................81.4.1发生与危害.................................................................................................81.4.2症状特点.....................................................................................................91.4.3病原菌种类.................................................................................................91.4.4发病规律及流行因素.................................................................................91.4.5防治措施...................................................................................................101.5小麦土传病害致病性测定方法的研究..............................................................111.6小麦普通根腐病和茎基腐病抗病品种研究现状..............................................111.7研究目的及意义.................................................................................................12第二章西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病的采样、病原菌分离及鉴定.........142.1材料与方法.........................................................................................................142.1.1材料...........................................................................................................142.1.2方法...........................................................................................................162.2结果与分析.........................................................................................................202.2.1病株真菌分离及纯化...............................................................................202.2.2冬小麦普通根腐病...................................................................................262.2.3冬小麦茎基腐病.......................................................................................31VI 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2.3结论与讨论.........................................................................................................39第三章冬小麦普通根腐病和茎基腐病的种质资源抗性筛选.....................................423.1材料与方法.........................................................................................................423.1.1材料...........................................................................................................423.1.2方法...........................................................................................................433.1.3数据处理与分析.......................................................................................433.1.4抗性分级标准...........................................................................................433.2结果与分析.........................................................................................................433.2.1接种麦根腐平脐蠕孢2B2.5a菌株的抗性筛选.....................................433.2.3接种三线镰刀菌J4.2c菌株的抗性筛选................................................463.2.4小结...........................................................................................................483.3结论与讨论.........................................................................................................49第四章冬小麦普通根腐病和茎基腐病原菌的药剂筛选及室内毒力测定.................514.1材料与方法.........................................................................................................514.1.1材料...........................................................................................................514.1.2方法...........................................................................................................514.1.3数据处理与分析.......................................................................................524.2结果与分析.........................................................................................................524.2.1药剂筛选结果............................................................................................524.2.2室内毒力测定结果...................................................................................534.3结论与讨论.........................................................................................................54第五章结论与创新点.....................................................................................................565.1结论.....................................................................................................................565.2创新点.................................................................................................................57参考文献...........................................................................................................................58致谢...................................................................................................................................65导师简介...........................................................................................................................66作者简介...........................................................................................................................67原创性声明.......................................................................................................................68学位论文版权认定和使用授权书...................................................................................68VII 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第一章文献综述小麦是三大谷物之一，在世界各地的种植极为广泛，其颖果是人类的主食之一，磨成面粉后经加工制成食物食用；也可以经发酵后制成饮品饮用。小麦含有丰富的碳水化合物、约占小麦总成分的55%，蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、烟酸、维生素等也是小麦的组成成分。小麦几乎全作食用，全球有四成以上的人口以小麦为主食[1]，有时也作为饲料使用。中国是世界最早种植小麦的国家之一。1.1小麦生产现状1.1.1小麦产量据统计，上世纪90年代末至本世纪初，世界小麦年均总产量约占谷物总产量的30%。中国、印度、土耳其、巴基斯坦、美国、加拿大、澳大利亚及俄罗斯，是世界小麦生产的主要集中地。其中，中国的小麦的种植面积及产量均居世界首位。法国小麦的种植面积不在世界小麦种植面积较大国家的前八位，但其小麦的总产量占世界小麦总产量的第四[2]。在澳大利亚，小麦正常年产量占作物生产总量的60%[3,4]。在中国，小麦播种面积在粮食作物播种总面积中的排名已持续位列第三。自1991年代以来，我国小麦种植面积呈下降的趋势，但自2004年开始，我国小麦的种植面积又有了小幅提升。我国冬小麦种植面积约占小麦总种植面积的93%，而春小麦只占7%。1997年，我国小麦总产量达到峰值，为12328.68万吨。自1997年以后，小麦的总产量逐年降低，2003年低至8648.8万吨，较1997年减少了3679.88万吨，减幅高达29.8%。此后，小麦总产量总体水平呈现回升趋势[5]，2006年全国小麦总产量重新上升到1亿吨以上，2012年全国小麦总产量达到12058万吨[6]。1.1.2小麦品质随着人民生活水平的飞速提高，对物质的需求不只是停留在量的水平上，更多的是注重其内在品质，对食物的需求也是如此，不单单是要吃饱，更要吃好、吃健康。中国是全球人口最多的国家，小麦又是我国主要的粮食作物，对小麦需求不仅仅是其产量的要求，品质的要求亦是越来越高。自改革开放以来，通过遗传改良及栽培改良等途径，我国小麦产量有了大幅的提升，跻身小麦总产量世界排名前列，1 甘肃农业大学2018届硕士学位论文1983年居世界水平首位。由此可以看出，我国自那时开始已基本解决了小麦产量不高的问题[7]。但即使是这样，我国每年还需向发达国家进口小麦，我国进口小麦的总量排世界第二，大部分的进口小麦都用来弥补我国优质小麦的需求缺口，可见我国优质小麦的产量还存在很大的缺口，在小麦的品质方面还是与发达国家有很大的差距。针对这样的问题，通过推广优质专用小麦品种等措施，使得近几年来我国在优质专用小麦的种植面积增加、品质提升及优质率提高这几个方面有了很大的突破，也取得了一定的成果[8]。1.1.3我国小麦生产效益及市场竞争力据统计，自上世纪九十年代末至本世纪初，我国平均每hm2小麦生产的成本提高了1.25倍，平均每吨小麦生产成本也提高了1.07倍[9]。与美国相比，我国小麦呈现一种成本高、效益低的态势，从以下数据即可看出：我国小麦100元产值的成本就高达98.45元，但我国小麦平均单产仅比美国高65%[10]。从小麦的种植面积及总产量看，无论是种植面积还是年均总产量我国小麦均居于世界前列，相比其他国家有很大的优势。但是我国小麦的品质与其他发达国家相比还是有很大的欠缺，不过近几年来在小麦品质方面已有很大的改观，普通中筋小麦（品质一般或较差）的总量所占比例下降，优质小麦（制面包专用）及软质小麦（生产饼干、糕点等专用）的生产量大大增加。2002年，我国首次成为了小麦净出口国，首次实现了制粉用小麦出口，首次进入路透社全球小麦报价体系，首次成功推出了优质强筋小麦期货和现货规范化交易，在很大程度上提升了我国小麦在国际上的市场竞争能力[11]。1.2小麦主要土传真菌病害发生概况近年来，由于小麦联合收割机的跨区作业发展迅速，小麦良种的调运更加频繁，以及根部病害不易察觉而不被农民重视其预防等原因，造成了以全蚀病、纹枯病、普通根腐病、茎基腐病为代表的土传病害的发生与危害呈加重趋势[12,13]，已成为提升小麦品质、提高小麦产量、增加小麦生产效率的重要限制因素，对我国小麦的生产安全构成了极大的威胁[14]。到目前为止，世界上已经被报道的小麦土传病害有：由禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomycesgraminis(Sacc.)Arx&Oliviervar.triticiJ.Walker）引起的全蚀病2 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（Take-all）；由立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）（AG4和AG5融合群）及禾谷丝核菌（R.cerealis）（CAG-1、CAG-3、CAG-6和AGC1等4个菌丝融合群）的菌丝群引起的纹枯病（Sharpeyespot）[15-17]；由麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）引起的普通根腐病（Commonrootrot）[18]；由镰刀菌（Fusariumspp.）如：禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、茄病镰刀菌（F.solani）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）等所引起的茎基腐病（Crownrot）或称镰刀菌根腐病[19]。1.2.1小麦全蚀病的为害症状、发生分布及防治小麦全蚀病（WheatTake-all），俗称黑脚病，属于土传真菌病害，在小麦的整个生育期均可被病原菌侵染不同的部位导致发病，被称为“小麦的癌症”[20,21]。此病害在成株期的症状最为明显，一般其症状是植株分蘖减少，出现黄叶甚至植株矮化的情况，主要原因是病菌菌丝侵染小麦根部，并在根部迅速大量的繁殖，导致根部导管组织的堵塞，使得水分及营养物质不能及时在小麦体正常运输，从而影响小麦的正常生长发育[22]。苗期症状：小麦出苗3d时，其根毛就可以被病原菌侵染，5-10d达到侵染高峰[23]。幼苗发病后，其症状似干旱缺肥状，病株的初生根及根茎呈灰黑色，湿度大时可在其表面看见菌丝层，严重时可导致苗枯。成株期症状：由于根系受损，使水分和养分不能及时在小麦体内运输，使得病株枯死，抽穗期典型的症状为“白穗”。在湿润的土壤中，全蚀病病原菌菌丝在小麦茎基部形成黑色的菌丝鞘，形成“黑脚”的症状。所谓“白穗”和“黑脚”均为成株期表现的症状[24,25]，发病重时可造成绝收。小麦全蚀病于19世界80年代中期在南澳大利亚首次被发现，随后在世界各地均有关于全蚀病的报道出现。目前，全蚀病已在世界上30多个国家及地区发生[26]。1931年，在我国浙江省最早发现了小麦全蚀病，随后在我国其它各麦区均有此病害报道[27]。小麦全蚀病在我国河南省、山东省等地均为检疫性病害，且在河南省的各麦区屡屡发生、发病情况逐年加重，植株一旦发病，将造成无法估量的经济损失[28,29]。因此，急需开展对小麦全蚀病的防治工作。小麦全蚀病是土传性病害，其分布与寄主范围广泛，一旦发病，难以根除。利用抗病品种对全蚀病进行预防是最经济有效的方式，但是由于全蚀病的病原菌为非3 甘肃农业大学2018届硕士学位论文专化性弱寄生菌，对小麦品种没有严格的选择性，很难筛选出其抗病品种，目前国内还没有筛选到有高抗性的品种[22]。下面从以下几个方面阐述小麦全蚀病的防治途径：（1）加强小麦种子检查。要想从源头上防止全蚀病病区的扩大，就要加强检查措施。严禁从发病区调入或调出种子；已发生全蚀病病害的地块坚决杜绝作为种子繁育田；带有小麦全蚀病病菌的种子不作为种植的种子[30]。（2）农业防治。轮作倒茬：与大豆、甘薯等全蚀病病菌非寄主作物轮作；加强田间管理：合理的使用配方肥及有机肥，增强小麦的抗性，减轻病害发生[31]。（3）化学防治。用20%粉锈宁按种子重量的0.1%-0.2%拌种，或用12%三唑醇按种子重量的0.02%-0.03%拌种；用50%多菌灵500g加水200kg，或12.5%禾果利400g加水3t，沿地垄喷茎基部[32,33]。（4）使用拮抗菌。研究发现，荧光假单胞杆菌（Pseudomonasspp.）及芽孢杆菌（Bacillusspp.）均对全蚀病病原菌有较强的抑制作用[34,35]。由河南省农业科学院植物保护研究所薛保国研究员带头的团队研制出了YB系列生防菌剂，对全蚀病病原菌的抑菌率达到90%以上，在大田试验中，也有大于85%的防治效果。目前该制剂已得到了农业部农药大田试验批准证书，可以利用该菌剂进行复配使用，达到控制病虫害及改善生态环境的作用[36]。1.2.2小麦纹枯病的为害症状、发生分布及防治小麦纹枯病（WheatSharpeyespot），又称小麦尖眼点病或小麦尖眼斑病，俗称烂杆、沤根，属于土传真菌病害，纹枯病在小麦的整个生育期有两个发病高峰，分别是苗期及拔节孕穗期[37]。纹枯病菌侵染小麦的根、叶鞘、茎秆和叶片。一般在小麦三叶期后出现发病症状，首先在基部第一叶鞘出现浅黄褐色的小病斑，后殃及整个叶鞘直至渗透到叶鞘内部，浅褐色小病斑也扩大为中央灰色边缘褐色的病斑。发病轻的植株可继续生长，发病重的植株会导致枯苗、死亡[38]。拔节返青后，随着气温的升高及侵染植株的菌量不断积累，病斑继续扩大形成云纹状病斑，可形成“花杆”症状，进而造成根系腐烂、叶鞘及茎秆枯死。花杆烂茎的植株不能抽穗，因而形成枯孕穗，即使可以抽穗的，由于茎部受损，营养物质不能正常运输，后形成孕穗或枯白穗[39]，造成小麦大面积倒伏，使千粒重下降影响收获。早在1934年就有关于小麦纹枯病的报道[40]，目前在世界各地的小麦种植区均有纹枯病的发生，是一种分布较广的世界性病害[41,42]。在澳洲、欧洲的东部及南部4 甘肃农业大学2018届硕士学位论文等地区都有纹枯病危害小麦造成经济损失的报道[43-45]，小麦纹枯病在部分国家及地区已造成了极大的危害，为生产安全及经济带来了极大的损害[46,47]。中国于上世纪70年代初发现此病[37]，其实早在1955年于我国江阴县的一处麦田就发生了麦苗大面积枯死的现象，当时把此病害称为小麦立枯病，并未受到很大关注。直到1975年，小麦纹枯病才被重新认识并重视[48]。近年来，由于小麦纹枯病病菌在田中的日益积累及感病品种的大面积种植，导致小麦纹枯病的发生呈日益加重的趋势，威胁着小麦的产量、品质及生产安全，必须采取措施遏制纹枯病的继续发生。一般认为，“以农业防治为基础，化学防治为辅助”是防治小麦纹枯病最有效、最经济、最安全的方法。本研究从以下几个方面阐述小麦纹枯病的防治途径：（1）使用抗病品种。虽然目前我国还没有发现对纹枯病表现免疫的小麦品种，但经过若干抗病品种选育试验且对供试小麦品种进行综合评价后，发现“百农3217”、“西安8号”[49]、“郑州315”[50]、“兰选1号”[51]、“豫麦26号”[52]等小麦品种对纹枯病有较好的抗性，推荐在发病重的地区使用。（2）农业防治。合理的增施有机肥及氮、磷、钾肥；加强田间管理；及时清除田间杂草；开沟排水、避免大水漫灌；增加田间通风透光度；稻秆还田等措施均可在一定程度上抑制纹枯病病原菌的积累及繁殖，从而减轻病害的发生[53,54]。（3）化学防治。可亩用5%井冈霉素水剂150-200ml或20%粉锈宁乳油50ml抑或12.5%烯唑醇你5-30g，三种药剂任选一种加水75kg，向项目茎基部进行喷洒，应注意轮换用药[55]。（4）生物防治。南京农业大学植物保护学院经多年的研究，筛选出了生防菌株——解淀粉芽孢杆菌B3，此菌株对小麦纹枯病有很好的防治效果[56]。经全基因组测序，发现B3菌株中含有一种新发现的生物活性物质——环状双肽，它具有抗细菌、真菌以及促进植物生长的功能[57]。可利用B3菌粉拌种再播种，防止或减轻纹枯病的发生、增加小麦出苗率及产量。1.3小麦普通根腐病的研究概况许多研究者在之前对小麦根腐类病害的研究中都将普通根腐病及茎基腐病相互混淆，将普通根腐病和茎基腐病统称为小麦根腐病，认为小麦根腐病是一种由多种病原菌复合侵染导致的病害。但最近几年经过多地区多名专家的研究，发现小麦普通根腐病与茎基腐病虽同为根腐类病害，但在地理分布、发病症状、病原菌种类、病害循环、发病条件、病害控制等方面都存在很大差别，故将小麦普通根腐病和茎5 甘肃农业大学2018届硕士学位论文基腐病分为两种病害研究。将由平脐蠕孢（Bipolarisspp.）引起的病害统称为普通根腐病（Commonrootrot），由镰刀菌（Fusariumspp.）引起的病害统称为茎基腐病（Crownrot）。1.3.1发生与危害小麦普通根腐病是重要的世界性病害之一，在世界各地广泛分布。在我国各小麦产区普遍发生，多雨年份和潮湿地区发生较重。1977年在前苏联，由小麦普通根腐病导致的小麦减产比其它所有小麦病害导致的小麦减产的总和还要多；1984年在加拿大，即使是种植中抗小麦品种的地区都会因小麦普通根腐病而减产15.7%；1990年新疆奇台县因小麦普通根腐病大面积发生造成小麦死亡达4620亩；1980年在我国黑龙江省，在对10个县麦田的调查显示，有50%以上的小麦植株在苗期均发病；1990年后在我国甘肃省有68个县均有小麦普通根腐病发生，平均发病率高达58.6%，发病面积为29432亩，占小麦播种面积的39%；1991年宁夏小麦普通根腐病发生面积达40多万亩，损失小麦近1500吨[58]。1.3.2症状特点小麦普通根腐病（commonrootrot）自苗期至成株期均可发生[59]，症状表现常因气候条件而不同，在干旱及半干旱地区常出现根腐症状。在潮湿地区，除根腐症状外，还可发生叶枯、穗枯、黑胚等症状，因此还有叶枯病、黑胚病等名称。病原菌侵染小麦后，其种子、幼苗、茎秆、叶部及穗部均可受害，以根部受到的危害最为严重[60]。可引起种子萌发前腐烂或苗期枯萎[61]，亦可导致茎基部变褐的症状。此病害苗期受到侵染后，首先基部变为褐色，在胚芽鞘上产生黄褐色至黑褐色的病斑，随着病斑的逐渐扩大，颜色也愈加变深，后扩展至根茎及叶鞘。成株期被侵染后，首先在叶片上出现梭形褐色小病斑，后扩展为长椭圆形或不规则形浅褐色病斑，病斑两面均产生灰黑色霉，病斑融合后成大斑后枯死[62]。如果根冠受到侵染，可导致根部腐烂[63]，有的植株甚至在根部表面生出黑色霉层。穗部麦粒受害后可形成有毒的黑胚小麦。此病发展到后期，可形成不孕穗，有典型的丛状白穗症状（若湿度大，则会在穗部表面长出黑色霉状物），使小麦颖壳内无籽粒或出现不同程度的秕籽，发病严重的则整株枯死。6 甘肃农业大学2018届硕士学位论文1.3.3病原菌种类在上世纪70年代之前，国外的研究认为小麦根腐病的病原菌是单一的，是由麦根腐平脐蠕孢侵染而发生病害。随着对其研究的不断深入，80年代后，认为小麦根腐病并不是单一的病原菌侵染发生，而是由多种病原菌复合侵染而发生的，且不同地区的致病菌差异较大，国内外对于小麦根腐病的病原研究步调几乎一致[64,65]。近几年，将根腐类病害详细地分为普通根腐病（Commonrootrot）和茎基腐病（Crownrot），本项目组根据最新病害分类进行研究。由麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）引起的普通根腐病，发病小麦植株的病部颜色较深，在我国东北及华北地区，分离频率最高的病原菌就是麦根腐平脐蠕孢[64,66]。另外，还有报道称交链孢（Alternariaspp.）、弯孢（Curvulariaspp.）、丝核菌（Rhizoctoniaspp.）等也是小麦根腐病的病原菌，只是分离频率较低而已。1.3.4发病规律及流行因素据国外报道，小麦普通根腐病的初侵染源主要是带菌种子及土壤中的病残体，如果土壤中的根腐病病原菌孢子量越大，则普通根腐病的发病率就越高，发病程度就越严重[64]。国内报道，普通根腐病的初侵染源主要是土壤中积累的病原菌，种子带菌是次要的侵染源，这是土传病害所具有的共性（全蚀病除外）[67]，但也有报道称种子带菌为主要的侵染源[68]。由此可见，导致普通根腐病最主要的两个初侵染源就是带菌种子及土壤中的病残体。残存在土壤中的病原菌从植株的根部及地下茎侵入小麦使植株染病。在冬麦区，普通根腐病分别在冬前及冬后有两次侵染高峰，首次出现在出苗期，另一次出现在拔节期。田间环境对根腐病流行有极大的影响，如播种时期（适当晚播有利于减轻病害）、土壤类型（粘土中发病较重）、环境温度及湿度等。1.3.5防治措施在小麦根腐类病害的防治工作中，应遵循“预防为主、综合防治”及“以农业防治为主、化学防治为辅”的原则。有此原则的支撑，可以在控制并减轻病害的基础上，最大程度的保护生态环境，更好地做到粮食的高产、高效，保证生产及生态安全。目前，主要从农业防治、生物防治及化学防治三个方面进行防治工作。7 甘肃农业大学2018届硕士学位论文1.3.5.1农业防治（1）使用抗病品种。这是控制病害最有效的方式之一。（2）加强种子管理。严格使用不带菌的种子，并在播种前将种子晾晒3d左右，再进行播种。（3）实行轮作倒茬。发病重的地区可以与不是病原菌寄主的作物，如玉米、甜菜、向日葵等轮作，减少土壤中病原菌的残留量。（4）伏翻及秋翻。在播种前，可以对田地进行深耕，以改善土壤环境，降低发病率。（5）合理施肥。以施腐熟的农家肥为主，控制氮肥，、适量施磷肥、钾肥及钙肥[69]。1.3.5.2生物防治我国有研究人员从绿色木霉菌（Trichodermaviride）LTR-2中分离到了α-吡喃酮并研制出了该抗生素的0.2%WP。经试验表明，α-吡喃酮对小麦等作物的多种真菌病害都有显著的防效，其对麦根腐平脐蠕孢的抑制率达到60%以上，可利用该生物制剂防治由麦根腐平脐蠕孢引起的普通根腐病[70]。1.3.5.3化学防治在化学防治中，通常使用拌种、包衣或药剂喷施的方法的来防治小麦普通根腐病。刘惕若[71]指出应尽量采用湿拌种（用少量水将种子喷湿后进行拌种）的方法进行拌种，防止出现药剂在种子表面附着不均匀的情况影响防病效果。可用20%百坦粉剂、50%扑海因可湿性粉剂或50%代森锌锰可湿性粉剂等进行拌种，用药量均为种子重量的0.2%。用此方法拌种可取得良好的防止种子腐烂的效果，可保证出苗率。李洪连等[72]研究发现，用扑力猛、立克秀等药剂处理小麦种子，使田间发病率减少了60%左右。康天芳等[73]研究发现，敌力脱、扑海因、多菌灵也是防治小麦茎基腐病的有效药剂。1.4小麦茎基腐病的研究概况1.4.1发生与危害目前，已报道小麦茎基腐病的地区包括土耳其[1,74]、澳大利亚[75-77]、太平洋西北部[78-80]、加拿大[81]、美国[82]、南非[64]、意大利、中国等地。其中，英国、法国、8 甘肃农业大学2018届硕士学位论文德国、加拿大及美国等地的发生最为严重。由此可见，对小麦茎基腐病的发生不容忽视，它早就成为小麦安全高效高产的限制因素。1.4.2症状特点小麦茎基腐病（crownrot）在冬小麦上发生时症状也比较复杂，主要包括烂种、死苗、茎基部褐变和白穗症状。播种后如条件适宜，病害可导致烂种或死苗。苗期受到侵染后，茎基部叶鞘和茎秆变褐，有时可引起根部变褐腐烂，严重时引起麦苗发黄死亡。成株期植株发病后，一般植株茎基部的1-2个茎节变为褐色或巧克力色，严重时可扩展至茎秆中部。潮湿条件下，发病茎节处可见红色或白色霉层。灌浆期随着病害发展，发病严重的植株可形成零星白穗症状，籽粒干瘪或甚至没有籽粒。如果小麦生长后期多雨潮湿，由于腐生菌的作用，病穗多由枯白色变为暗黑色。1.4.3病原菌种类最早在1951年于澳大利亚的昆士兰州发现了由假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病[83]，随后遍及至澳洲[84]、北美、南美、非洲、欧洲及亚洲等地的小麦主产区。据国内外研究显示，能引起小麦茎基腐的镰刀菌有多种，除了上述的假禾谷镰刀菌，还有禾谷镰刀菌（F.graminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）、锐顶镰刀菌（F.acuminatum）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）等[85,86]。其中，黄色镰刀菌多为湿冷小麦种植区的优势病原菌；假禾谷镰刀菌及禾谷镰刀菌多为温带及亚热带较温暖地区小麦种植区的优势病原菌，我国黄淮麦区的主要病原菌就是这两种镰刀菌。1.4.4发病规律及流行因素小麦茎基腐病也是一种典型的土传病害，假禾谷镰刀菌和禾谷镰刀菌主要以菌丝体的形式存活于土壤中及病株残体上，尤其在干旱或者半干旱气候条件下；而黄色镰刀菌则以厚垣孢子和分生孢子的形式存活于土壤中或者病残体组织中。病原菌在田间主要靠耕作措施进行传播，禾谷镰刀菌也可随种子传播。病原菌寄主主要包括小麦、大麦、玉米等多种禾本科作物及杂草，但一般不侵染双子叶植物。病原菌9 甘肃农业大学2018届硕士学位论文一般从根部或茎部侵入，其具体侵染点取决于菌源在土壤中的分布情况，侵入后引起茎基腐症状。田间环境是影响小麦茎基腐病发展和流行的重要因素，另外，品种的抗性也在一定程度上影响病害的发生程度。1.4.5防治措施1.4.5.1农业防治使用抗病品种是控制病害最有效的方式，同时加强种子管理，严格选种后再播种；播种前应对田地进行深耕，以改善土壤环境；实行轮作倒茬也可在一定程度上降低土壤中病原菌的残存率；合理施肥，除了农家肥及氮磷钾肥外，还可适量使用微生物肥料。1.4.5.2生物防治据Huang和Wong研究报道，无论是在室内试验、温室试验还是大田试验中，洋葱伯克氏菌（Burkholderiacepacia）都对假禾谷镰刀菌有很明显的抑制作用。可利用此菌对由假禾谷镰刀菌引起的茎基腐病进行防治[87]。1.4.5.3化学防治薛应钰等[88]经试验发现，40%福星乳油对镰刀菌的抑制作用最佳，对镰刀菌高效的最佳配方为40%福星乳油∶10%世高可分散粒剂（3∶1）。喷药防治方面，尤月芹[89]、孟云[90]研究表明，应在不同的发病期进行不同药剂的喷药处理。发病初期，可用12.5%禾果利可湿性粉剂2500-3000倍液喷雾，或每亩用5%井冈霉素水剂10g加水40kg进行喷雾，喷药时，应对准小麦根茎部均匀喷施，以确保防治效果；发病后期，可用每亩烯唑醇等高效杀菌剂50ml加水40kg进行喷雾，发病严重时，每隔7-10d喷药1次，连续喷2-3次，也可用多菌灵等药剂代替使用，轮换使用药剂可防止作物抗药性的产生，更利于病害控制。使用化学防治虽然见效快，但是也有其缺点。化学防治有可能导致农药残留及作物抗药性的问题出现，也不利于生态环境的保护，在杀死病原菌的同时也有可能杀死有益菌和天敌。且化学防治的药效易受到环境因素的影响，如刮风、下雨等天气都可制约药效发挥。10 甘肃农业大学2018届硕士学位论文1.5小麦土传病害致病性测定方法的研究目前，用于研究小麦土传病害致病性的方法有很多，如孢子悬浮液浸泡法、幼苗培养皿直接接种法、浸菌棉球接种法、小米培养基扩繁法等。李敏权[91]于2003年报道了试管苗接种法：挑选良种育苗，待子叶展开后将幼苗移入盛有营养液的试管中，至真叶期时接种，培养7d后观察发病情况并统计。为了体现不同种镰刀菌侵染小麦而表现出的症状有所差异，Akinsanmi等[92]于2004年报道了单株麦苗棉球浸液包根接种法：将单株小麦幼苗种植于已灭菌的盆中，在昼夜交替（光照及黑暗各12h，白昼25℃、黑夜15℃）、环境湿度为65%的条件下培养，用浸有700µL孢子悬浮液的棉球包裹植株根茎部，培养35d后观察统计。2年后，Mitter等[93]对Akinsanmi的研究方法加以创新，对其接种时间、孢子悬浮液浓度、培养条件及接种方式等因子加以优化，提出了单株麦苗液滴接种法，且该方法已在大田试验中得以验证。2014年，周海峰[66]用小米培养基扩繁法进行了致病性测定：用小米培养基对病原菌进行培养，后依次将无菌土、种子、无菌土、接种物、无菌土放入花盆中，并加水，在昼夜交替（光照及黑暗各12h，白昼25℃湿度60%、黑夜15℃湿度80%）的条件下培养，待出苗后45d后观察统计。2016年，赵杏利等[94]用盆栽人工接种法进行致病性测定试验：将小麦种子以盆栽法种于盆中，在室温（25℃左右）下培养，待长出2-4片真叶时，将制好的孢子悬浮液喷洒于幼苗上，接种7d后观察发病情况。1.6小麦普通根腐病和茎基腐病抗病品种研究现状国外在抗病品种选育工作方面的研究较国内而言，无论在研究方法还是研究结果上，都有更多的成果。但是，到目前为止国内外均没有发现对普通根腐病和茎基腐病免疫的小麦品种，而且即使是表现出抗性较强的品种也只是对小麦生长的某一时期抗性强，没有在全生育期都表现高抗的品种。在国内，关于小麦普通根腐病抗病种质资源筛选的研究主要集中在东北及黄淮麦区。1977-1986年，张荣昌[95]对2108份小麦品种进行了抗普通根腐病人工接种鉴定试验，在发现的156份抗病材料中，绝大多数为中抗材料。2001年，陈厚德等[96]发现豫麦18的抗性较强，对小麦产量的影响最小。2009年，张鹏[97]研究发现，在82份供试材料中，仅有16%的品种表现为中抗，无高抗品种，其余均为感病品种。11 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2016年，胡艳峰[98]对黄淮麦区89个小麦品种进行了抗性鉴定试验，在室内盆栽鉴定中仅发现1.12%的抗病品种及2.25%的中抗品种，在田间试验中仅发现2.25%的抗病品种和21.35%的中抗品种。1966年，经Puss[63]研究发现Gala及Mengavi小麦品种对由镰刀菌引起的小麦茎基腐病表现中抗，McKnight等[60]及Wildermuth等[99]经试验后也得到了同样的结论。1978年，Burgess等[100]通过田间试验，筛选出Timgalen，Gatcher，hortim及Eagle小麦品种表现为中抗。Mitter等[93]对澳大利亚1400多份小麦品种进行筛选后，发现22397、Rowan、Baxter、Sunvale、Giles、Strzelecki及27009等共14个品种表现为中抗，且田间试验结果比较稳定。自2000年以后，发现2-49[101]及Kukri[102]等小麦品种的抗性较其它小麦品种有很大优势，可用作抗病种质资源。1.7研究目的及意义中国幅员辽阔，是小麦种植大国，西北地区的冬麦区更是起到了举足轻重的作用。西北地区包括陕西、甘肃、青海、宁夏及新疆（简称“西北五省”）。该区域深居内陆且距海遥远，再加上其地形可对湿润气流有阻挡作用，此区域冬季严寒而干燥，夏季高温，降水量自东向西递减。该区大部属温带大陆性气候，适宜冬小麦及春小麦的生长。在西北地区的许多地方，农民的主要经济来源就是农作物的种植收益，农作物的产量、品质及生产安全就显得尤为重要。近几年，冬小麦普通根腐病和茎基腐病的发生在西北地区逐渐加重，且这两种病害防治起来比较困难，再加上没有好的抗病品种，使得普通根腐病和茎基腐病成为限制西北地区冬小麦产量及品质的主要因素。因此，明确西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病的病原菌种类及优势致病菌、筛选出对普通根腐病和茎基腐病抗性良好的小麦品种及防治效果较好的药剂对这两种病害的预防及控制减轻、增加农民收入使他们脱贫致富、保护生态环境等方面有积极的作用及重要的意义。本试验对西北地区，包括陕西、宁夏、新疆及甘肃四省的冬小麦种植区普通根腐病和茎基腐病病株进行采样，通过组织分离、单孢纯化、形态鉴定、分子鉴定及经致病性测定，明确了导致该地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病的优势病原菌；后以3种优势病原菌为接种物，对38个小麦种质资源进行了抗性鉴定及评价，筛选出了抗性相对较好的小麦品种，充实了西北地区抗病种植资源库的内容，为该地区小麦普通根腐病和茎基腐病的抗病育种工作奠定了坚实的基础；随后继续以上述3种12 甘肃农业大学2018届硕士学位论文优势病原菌为受体，对5种药剂进行了室内药剂筛选及毒力测定，为小麦普通根腐病和茎基腐病的化学防治提供了扎实的理论依据。13 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第二章西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病的采样、病原菌分离及鉴定小麦普通根腐病和茎基腐病是一种世界性病害，凡是种植小麦的地区均有不同程度的发生，导致小麦减产及品质下降，对经济效益与生态安全构成了严重威胁。近年来，冬小麦普通根腐病和茎基腐病在我国西北麦区的发生日益加重，对其防治迫在眉睫。为明确西北冬小麦种植区的普通根腐病和茎基腐病的病原菌种类及优势致病菌，本研究于2015年及2016年在西北地区，包括陕西、宁夏、新疆和甘肃四个省份对疑似冬小麦普通根腐病和茎基腐病的病株进行采样，经分离、鉴定及致病性测定，明确了西北冬小麦种植区这两种病害的发生情况、病原菌种类及优势病原菌。为后期对西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行的抗病品种的选育、化学防治等一切研究工作奠定坚实的理论基础。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1样品采集2015年及2016年，在西北地区，包括陕西、宁夏、新疆及甘肃冬小麦主要种植区采集典型发病植株，共采集样品121份，观察记录病害情况并编号，将样品装入自封袋，后装入放有冰袋的保温盒中，带回实验室进行下一步研究。2.1.1.1.12015年样品采集2015年主要在甘肃省对苗期冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行样品采集。（1）第一次冬小麦苗期病株的采样（4月8日-4月9日）赴定西、白银对苗期冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行调查采样。调查采样地点主要在定西市陇西县、安定区、漳县，白银市会宁县等冬小麦主要分布区，共包括6个乡镇8个村。调查发现，甘肃省定西市、白银市苗期冬小麦的发病率较高，在40%-50%左右。共采集得到27份样品。（2）第二次冬小麦苗期病株的采样（4月14日）14 甘肃农业大学2018届硕士学位论文赴庆阳对苗期冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行调查采样。主要包括庆阳市镇原县的2个村，其发病率约为30%。共采集到8份样品。（3）第三次冬小麦苗期病株的采样（4月23日-4月24日）赴天水对苗期冬小麦普通根腐病和茎基腐病进行调查采样。主要包括甘谷县、清水县、麦积区的5个村镇。调查发现，天水苗期冬小麦根腐病的发病率在20%-35%左右。共采集到15份样品。2.1.1.1.22016年样品采集（1）第一次冬小麦苗期病株的采样（4月9日-4月11日）赴宁夏回族自治区、陕西省及甘肃省进行调查采样。采样地点主要在宁夏回族自治区吴忠市利通区、宁夏回族自治区固原市原州区、陕西省咸阳市长武县、陕西省咸阳市彬县、甘肃省平凉市崆峒区、甘肃省平凉市泾川县及甘肃省庆阳市宁县，共包括8个乡镇10个村。共采集得到34份样品。（2）第二次冬小麦苗期病株的采样（4月20日-4月23日）赴新疆维吾尔自治区进行样品采集。采样地点主要在新疆维吾尔自治区昌吉市奇台县、塔城市额敏县、塔城市阿西尔乡进行，共包括4个乡镇8个村。共采集得到24份样品。（3）冬小麦成株期病株的采样（6月25日-6月26日）赴新疆维吾尔自治区及甘肃省进行样品采集。采样地点主要在新疆维吾尔自治区昌吉市奇台县、新疆维吾尔自治区昌吉市呼图壁县及甘肃省武威市黄羊镇，共包括3个乡镇4个村。共采集得到13份样品。2.1.1.2试验仪器耗材仪器：高压灭菌锅、25℃恒温培养箱、超净工作台、显微镜、离心机、电泳槽、PCR仪。试剂耗材：剪刀、镊子、培养皿、封口膜、1.5ml离心管、孔板、各规格移液枪、蓝枪头、黄枪头、白枪头、接种针、酒精灯、打火机、1ml无菌注射器、200次FungalDNAKit试剂盒（OMEGA）、载玻片、盖玻片、滤纸、铝箔纸；马铃薯、葡萄糖、琼脂（进口）；分子检测：琼脂糖、dNTP、TaqDNA聚合酶、loadingBuffer、DNAMarker。试验所用药品均为分析纯。15 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2.1.1.3试验所用培养基葡萄糖马铃薯琼脂培养基（PotatoDextroseAgar,PDA）：马铃薯200g，葡萄糖18g，琼脂粉（进口）9g，自来水1000mL。水琼脂培养基（WaterAgar,WA）：琼脂粉（进口）9g，自来水1000mL。康乃馨叶片培养基：琼脂粉（进口）9g，自来水1000mL，康乃馨叶片适量。2.1.2方法2.1.2.1调查与采样方法发病率计算：避开地边5米，观察长势弱及有枯黄或白穗的症状的地块，目测估算其面积占种植地总面积的比例，而后估算本村所有地块的平均发病率即为该村的病害发生率。本研究采用多点采样法采集病株样品。在不伤害目标样品的前提下，小心地用铲子将样品从地块中挖出，注意样品根部要尽可能多的带上根际土壤，起到保护根部的作用，然后将每个村的样品混匀放入同一自封袋中，记录病害情况并编号，后装入放有冰袋的保温盒中，带回实验室进行分离。2.1.2.2病株的真菌分离和纯化按常规组织分离法[103]对所采样品进行分离：用流水将病株样品根部冲洗干净，待其自然风干，在超净工作台中将发病根部的病健交界处剪下，将剪下约2cm的根段放入75%酒精中浸泡3-5s，再放入0.1%升汞溶液中消毒10s，后用无菌水冲洗3次，后将根段用已灭菌的滤纸吸干水分，根段两端各剪去约0.5cm，最后剩下约1cm根段。将此1cm根段接于PDA培养基平板上，每皿3段。后将其放入25℃培养箱中恒温培养约2-4d，及时挑取根段周围长出的菌落于新的PDA培养基平板上，置于25℃培养箱中恒温培养。待纯化的菌落生长10-15d，用无菌水冲洗菌丝表面，收集孢子或菌丝悬浮液，然后在水琼脂培养基上划线，于25℃培养箱中恒温培养1d后，待孢子刚刚萌发，即孢子周围刚长出很短的菌丝时，在解剖镜（MoticSMZ.140）下找到已萌发的孢子（四周呈辐射状），且与其它孢子距离较远。用无菌1ml注射器针头挑取单孢或单16 甘肃农业大学2018届硕士学位论文菌丝至PDA培养基平板上，即获得单孢或单菌丝分离物。置于25℃培养箱中恒温培养3-5d后，置于4℃冰箱冷藏备用。2.1.2.3纯化菌株的形态鉴定将病原菌在PDA培养基平板上活化后用直径为5mm的打孔器打取菌饼，分别接于PDA培养基平板和CLA培养基平板上，每种病原菌各接3重复，后置于25℃恒温培养箱中黑暗条件下培养。3d后，观察记录培养于PDA培养基平板上的病原菌菌落形态特征及培养皿背面着色情况，用十字交叉法测量菌落直径，后取平均值，计算其生长速率；15d后，待接于CLA培养基平板的菌落产孢，在光学显微镜下观察其分生孢子形态特征，并拍照。参照《真菌鉴定手册》、《SoilandSeedFungi》、《FUSARIUM》对病原菌进行鉴定[104]。2.1.2.4分子鉴定2.1.2.4.1纯化菌株的LSU分子鉴定根据纯化后菌落形态及显微形态区别归类，选择具有代表性的152个菌株进行核糖体大亚基（ribosomallargesubunit,LSU）rDNA序列的测定，刮取在PDA上培养7d的菌丝体和孢子，依据试剂盒说明书方法提取基因组DNA，方法如下：（1）挑取菌丝团（米粒大小）；（2）将所挑取的菌丝团放入盛有200µLBufferCPL的离心管一中，并在冰上研磨（防止温度升高导致菌失活）；（3）向研磨后的离心管一中加入400µLBufferCPL和10µLβ-巯基乙醇，后涡旋振荡混匀；（4）65℃水浴30min，期间振荡离心管一2次；（5）加入600µL氯仿：异戊醇（24:1）混合液，继续涡旋振荡混匀；（6）12000rpm，4℃，离心5min；（7）离心后，吸取上清液300µL于另一新离心管二中，弃离心管一；（8）向离心管二中加入150µLBufferCXD和300µL无水乙醇，后涡旋振荡混匀；（9）上柱子（将试剂盒中蓝色柱子放入收集管一，加入离心管二中的混合液），17 甘肃农业大学2018届硕士学位论文12000rpm，4℃，离心1min后，连同收集管一一同弃液体；（10）洗脱：将蓝色柱子放入收集管二，柱中加入650µLSPW洗脱液，4℃，12000rpm离心1min；（11）重复洗脱1次（同步骤十，弃步骤十后收集管二中的液体，收集管二继续使用）；（12）空甩，4℃，12000rpm离心2min（弃步骤十一后收集管二中的液体，收集管二继续使用）；（13）弃收集管二，用一新离心管三装蓝柱子，向柱中加入已事先65℃水浴好的80µLElutionBuffer或双蒸水，4℃，12000rpm离心2min（离心管三中收集的物质即为所提取的DNA）；（14）重复溶解（此步骤可省略）。对LSU基因序列进行扩增，所用引物对为LROR和LR5[105]。LROR：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’；LR5：5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’。PCR反应采用25µL体系：模板DNA1µL，终浓度为1×的5×buffer（Mg2+）用量5µL，终浓度为0.2mM的2.5mMdNTPs用量2µL，终浓度为0.2µM的P1（10µM）及P2（10µM）各0.5µL，终浓度为1U的2.5U/µLTaqU用量0.4µL，ddH2O15.6µL。PCR扩增程序为：94℃预变性95s；94℃变性35s，49℃复性60s，72℃延伸2min为一个循环，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测（1×TAE电泳缓冲液，5V/cm电压），上样2L。在UVIDBT-08凝胶成像系统下观察并拍照。序列测定：PCR扩增产物中目的片段的回收和双向测序由西安擎科生物技术有限公司进行。所得序列经校对拼接后在NCBI数据库中通过BLAST功能搜索相似度较高的LSU序列，再从GenBank中下载相关序列，比对后使用PAUP软件采用最大简约法构建系统发育树。2.1.2.4.2冬小麦普通根腐病病原平脐蠕孢的ITS分子鉴定根据形态鉴定、显微鉴定及致病性测定结果，选择具有代表性的25个平脐蠕孢菌株进行ITS序列的测定。DNA提取方法同1.2.3所述方法。18 甘肃农业大学2018届硕士学位论文对ITS基因序列进行扩增，所用引物对为ITS1-F和ITS4[105]。ITS1-F：（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）；ITS4：（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反应体系同1.2.3所述方法。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s为一个循环，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。序列测定同1.2.3。所得序列经校对拼接后在NCBI数据库中通过BLAST功能搜索相似度较高的ITS序列，再从GenBank中下载相关序列，比对后使用PAUP软件采用最大简约法构建系统发育树。2.1.2.4.3冬小麦茎基腐病原镰刀菌的TEF分子鉴定根据形态鉴定、显微鉴定及致病性测定结果，选择具有代表性的40个镰刀菌菌株进行TEF序列的测定。DNA提取方法同1.2.3所述方法。对TEF基因序列进行扩增，所用引物对为EF-1和EF-2[106]。EF-1：（5’-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3’）；EF-2：（5’-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3’）。PCR反应体系同1.2.3所述方法。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s为一个循环，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。序列测定同1.2.3。所得序列校对、拼接后在FusariumID（http://isolate.fusariumdb.org/）数据库中通过BLAST功能搜索相似度较高的TEF序列，再从GenBank中下载相关序列，比对后使用PAUP软件采用最大简约法构建系统发育树。2.1.2.5致病性测定2.1.2.5.1供试菌株及小麦品种2015年及2016年在西北地区所采集的冬小麦根腐病病株的全部样品所分离纯化得到的450个菌株。菌株均保存于甘肃省农业科学院植物病害实验室。19 甘肃农业大学2018届硕士学位论文供试小麦品种：陇鉴107。由甘肃省农业科学院小麦研究所提供。2.1.2.5.2致病性测定方法用上述分离到的450株真菌作为接种物，用小烧杯法[107]进行接种，步骤如下：（1）种子催芽：将55℃温水倒入盛有种子的烧杯中，恒温连续搅拌10min，将烧杯中温水倒掉，连续用清水冲洗种子两遍，而后浸种8h。浸种完毕后将种子均匀铺放于已灭菌的平铺有两层滤纸的培养皿中，将皿盖盖上，置于25℃光照培养箱中催芽，期间保持滤纸湿润，以滤纸湿润且培养皿中无积水为佳（2d左右出芽）；（2）制备WA（水琼脂）培养基：琼脂9g（进口），水1000mL，分装入1L的锥形瓶中，121℃高压灭菌30min，后倒入25ml烧杯中，以倒入烧杯体积的3/4位置处为佳，待培养基凝固后用已灭菌的锡箔纸封口；（3）接种：将接于PDA培养基上25℃培养7d的菌株在菌落边缘打直径为0.5cm的菌饼，将菌面朝下接于WA培养基小烧杯中；（4）将发芽种子围绕病原菌菌饼朝下均匀插入WA中，用已灭菌的锡箔纸封口，置于25℃光照培养箱中，以不接菌的WA培养基为对照。试验设3重复，每重复15株。8d后观察并统计发病情况。病害分级标准：0级：无病变；1级：根系稍有变色；2级：根系明显变褐，变色根系占总根系10%-30%；3级：植株变黄，变色根系占总根系30%-50%；4级：种子腐烂不能发芽。2.1.2.5.3计算公式及数据分析公式一：发病率=100%公式二：病情指数=本研究数据分析采用Excel软件按公式计算发病率与病情指数。2.2结果与分析2.2.1病株真菌分离及纯化2.2.1.1样品分离结果20 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2015年4月，在甘肃省4市8县（区）共采集冬小麦普通根腐病和茎基腐病株50份。经组织分离及纯化，共得到151株真菌菌株。2016年4月-7月，在陕西、宁夏、新疆和甘肃，共4省8市（州）12县（区）共采集冬小麦普通根腐病和茎基腐病株71份。经组织分离及纯化，共得到299株真菌菌株，分离结果见表2-1。由表可知，2015年在甘肃省定西市及天水市分离到的真菌菌株数较多，相对于发病率来看，这两个市的发病率也较高；2016年在新疆分离到的真菌菌株数最多，分离到了139株真菌，其次是甘肃省，分离菌株数为94株，再次为宁夏省，分离到了37株真菌，陕西省分离到的菌株数最少，仅分离到了29株。表2-1冬小麦普通根腐病和茎基腐病采集病样及真菌分离结果Table2-1SamplecollectionandisolationoffungiinWinterwheatcommonrootrotandcrownrot2015年2016年病株份数分离菌株数病株份数分离菌数采集地CollectionsitesNumberofNumberNumberofNumberofcollectedrootsofisolatescollectedrootsisolates定西市2094––白银市77––天水市1744––甘肃省庆阳市661453平凉市––639武威市––22陕西省咸阳市––729吴忠市––59宁夏省固原市––1328昌吉州––1291新疆省塔城市––1248合计50151712992.2.1.2纯化菌株的LSU分子鉴定本研究共选择60个代表性菌株进行LSU基因序列分析，所得到的系统发育树如图2-1所示。由图2-1可知，菌株QT3.5与GenBank数据库中KM249100、HQ231994等Sarocladium的菌株以100%的支持率聚为一个分支。QT6.6b等菌株与HQ232131、KF993388等枝顶孢属（Acremoniumspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。A1.1a1、HYZ1.3b等菌株与KJ126461、KF181211等镰刀菌属（Fusariumspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株LT5.6与NG055746、JN938870等葡萄穗霉属（Stachybotrysspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株QT6.2与21 甘肃农业大学2018届硕士学位论文JX034566、HM364311等Neonectria的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株QT4.5与JN939837、KC809921等木霉属（Trichodermaspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株HTB4.3与KY662258、KF181213等Plectosphaerella的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株QT18.2a与JX280676、JX280679等毛壳菌属（Chaetomiumspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株QT2.3与KM401652、KF689633等Magaporthiopsis的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株AXE3.5、L2.6与HM216199、KP858946等微座孢属（Microdochiumspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株JC2.8与KC311516、GU214410等枝孢属（Cladosporiumspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株2H1.1a1与HG779043、JN600991等弯孢属（Curvulariaspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株NX11.4a与HF934876、HF934885等平脐蠕孢属（Bipolarisspp.）的菌株以89%的支持率聚为一个分支。菌株EM6.10b与KY000656、KC584354等链格孢属（Alternariaspp.）的菌株以85%的支持率聚为一个分支。菌株NX6.3与KP765681、KX910089等Allophaeosphaeria的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株YZ4.3与EU754190、KY979813等异茎点霉属（Paraphomaspp.）的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株JC2.7a与GU238184、KY100875等Stagonosporopsis的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株N1.1与AB807564、KY794707等黑团孢霉属（Periconiaspp.）的菌株以100%的支持率聚在一起。菌株H3.2e1与DQ220330、DQ470966等Lasiobolus的菌株以100%的支持率聚为一个分支。菌株HTB3.3与KC176340、AY885164等Waitea的菌株以100%的支持率聚在一起。22 甘肃农业大学2018届硕士学位论文QT3.5KM249100Sarocladiumstrictum100HQ231994SarocladiumbactrocephalumHQ232052SarocladiumkilienseQT6.6b100HQ232131AcremoniumsclerotigenumKF993388AcremoniumalternatumKU554613AcremoniumsclerotigenumA1.1a1HYZ1.3b100KJ126461FusariumincarnatumKM249102FusariumtricinctumKF181211FusariumacuminatumLT5.6100NG055746StachybotryschartarumJN938870StachybotryschlorohalonataKU846836StachybotryschlorohalonataQT6.275100JX034566NeonectriaramulariaeHM042435NeonectriaramulariaeHM364311NeonectriaditissimaQT4.5JN939837Trichodermaaggressivum89100JN939814TrichodermaamazonicumKC809921TrichodermaharzianumKY662258PlectosphaerellacucumerinaKF181213Plectosphaerellacucumerina10099HTB4.3KY662261PlectosphaerellaalismatisQT18.2a100JX280679ChaetomiumfunicolaJX280676Chaetomiumerectum87KC425287Chaetomiumindicum100QT2.3KM401652Magnaporthiopsispoae100KF689633MagnaporthiopsispanicorumKM009148MagnaporthiopsismaydisAXE3.553HM216199Microdochiumbolleyi100L2.6KP858946MicrodochiumbolleyiKP858934MicrodochiumtrichocladiopsisJC2.8KC311516Cladosporiumperangustum100JF499857CladosporiumphaenocomaeGU214410CladosporiumherbarumNX11.4a89HF934876BipolarissorokinianaHF934885Bipolarissorokiniana85KY047120Bipolarisbicolor2H1.1a1HG779043Curvulariaprasadii6799100HF934902CurvulariaaeriaJN600991CurvulariahomomorphaEM6.10bKY000656AlternariaalternataKC584354Alternariacantlous5985FJ839651AlternariaobclavataNX6.3100KP765681AllophaeosphaeriamuriformiaKX910089Allophaeosphaeriamuriformia95KT314183Allophaeosphaeriasubcylindrospora100YZ4.3100KY979813Paraphomarhaphiolepidis100EU754190ParaphomaradicinaGQ387582ParaphomachrysanthemicolaJC2.7a100GU238184Stagonosporopsisdorenboschii100KY742278StagonosporopsisbomiensisKY100875StagonosporopsisailanthicolaJN859484Periconiamacrospinosa100KY794707PericoniaminutissimaN1.1AB807564PericoniapseudodigitataDQ168334EleutherascuslectardiiDQ470966Eleutherascuslectardii100DQ220330Eleutherascusperuvianus100H3.2e1100DQ168338LasioboluscuniculiDQ167411LasiobolusciliatusHTB3.3100KC176340Waiteacircinata100AY885164Waiteacircinata100KF824713LaetisariafuciformisKF824696LaetisariafuciformisKU612685Hydnumcrocidens10图2-1LSU序列的最大简约系统发育树Fig.2-1ThemaximumparsimonytreeobtainedfromLSUsequences2.2.1.3真菌分离结果结合菌落形态鉴定、显微形态鉴定及LSU分子鉴定，将2015年及2016年所分离纯化后的菌株进行归类（表2-2）。将2015年分离纯化后的151个株菌归为12个属，分别是镰刀菌属（Fusarium）、平脐蠕孢属（Bipolaris）、链格孢属（Alternaria）、23 甘肃农业大学2018届硕士学位论文微座孢属（Microdochium）、弯孢属（Curvularia）、毛壳菌属（Chaetomium）、黑团孢霉属（Periconia）、Stagonosporopsis、Allophaeosphaeria、Magnaporthiopsis、Plectosphaerella及Lasiobolus。其中，镰刀菌属（Fusarium）的分离频率最高，为36.42%；其次为链格孢属（Alternaria），分离频率为21.19%；平脐蠕孢属（Bipolaris）也相对较高，为15.23%。将2016年分离纯化后的299个株菌归为18个属，分别是镰刀菌属（Fusarium）、平脐蠕孢属（Bipolaris）、链格孢属（Alternaria）、及微座孢属（Microdochium）、弯孢属（Curvularia）、毛壳菌属（Chaetomium）、枝顶孢属（Acremonium）、枝孢属（Cladosporium）、葡萄穗霉属（Stachybotrys）、异茎点霉属（Paraphoma）、木霉（Trichoderma）、Stagonosporopsis、Sarocladium、Allophaeosphaeria、Magnaporthiopsis、Plectosphaerella、Lasiobolus、Waitea。其中镰刀菌属（Fusarium）、平脐蠕孢属（Bipolaris）和链格孢属（Alternaria）这3个属的分离频率相对较高，镰刀菌属的最高，高达46.15%，其次为24.76%的平脐蠕孢属，链格孢属的分离频率也在10.00%以上。其余大部分属的分离频率均在2.00%以下。综合来看，无论2015年还是2016年，镰刀菌属（Fusarium）、平脐蠕孢属（Bipolaris）及链格孢属（Alternaria）的分离频率都相对较高，均高于10.00%，其余真菌分离频率都较低。24 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表2-2冬小麦普通根腐病和茎基腐病样中真菌的分离频率Table2-2IsolationfrequencyoffungiinWinterwheatcommonrootrotandcrownrot2015年2016年真菌Fungi分离株数分离频率(%)分离株数Number分离频率(%)NumberofisolateIsolationfrequence(%)ofisolateIsolationfrequence(%)镰刀菌属（Fusarium）5536.4213846.15平脐蠕孢属（Biplaris）2315.237424.76链格孢属（Alternaria）3221.193010.3微座孢属（Microdochium）159.93268.71弯孢属（Curvularia）95.9610.33毛壳菌属（Chaetomium）10.6631.00Stagonosporopsis42.6510.33Allophaeosphaeria10.6641.34Magnaporthiopsis42.6531.00Plectosphaerella21.3320.67Lasiobolus31.9910.33黑团孢霉属（Periconia）21.33--枝顶孢属（Acremonium）--20.67葡萄穗霉属（Stachybotrys）--10.33枝孢属（Cladosporium）--41.34异茎点霉属（Paraphoma）--20.67木霉（Trichoderma）--10.33Sarocladium--41.34Waitea--20.67合计1511002991002.2.1.4分离真菌的致病性测定本研究对表2-2所示分离到的450株真菌全部进行了小烧杯法致病性测定。各属代表性菌株的致病性测定结果如表2-3所示。由表可知，分离到的平脐蠕孢属（Bipolaris）代表性菌株的致病力最强，植株发病率均达到100%。镰刀菌属（Fusarium）的代表性菌株致病力次之，但也较高，植株发病率均达到65%以上，但不同菌株的致病性有差异。链格孢属（Alternaria）分离频率位居第三，但从其致病性测定结果来看，其致病性不是很强，植株发病率为15%左右。微座孢属（Microdochium）及弯孢属（Curvularia）的致病性与链格孢属的致病力大体相当，植株发病率在20%左右。其余属真菌的致病力均很弱，植株发病率均低于15%，且其分离频率也很低，不作为冬小麦根腐病的致病菌考虑。最终确定镰刀菌属（Fusarium）和平脐蠕孢属（Bipolaris）真菌为导致西北地区冬小麦根腐病的优势病原菌属。25 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表2-3真菌致病性测定结果Table2-3Pathogenicdeterminationresultsoffungi菌株号Numberof接种株数Numberof发病株数Numberof发病率(%)真菌属名FungalgenerastrainsinoculatedplantsinfectedplantsIncidence(%)镰刀菌属（Fusarium）2C3.2a454395.56H1.1a454088.89BX2.4b4545100.00LT3.1c4545100.002M1.3454088.892L3.1b2453168.89平脐蠕孢属（Biplaris）LT1.64545100.00NX1.14545100.00JC2.64545100.00QT1.14545100.00链格孢属（Alternaria）JC1.4b45715.56微座孢属（Microdochium）JC2.5b451022.22弯孢属（Curvularia）2H1.1a1451022.22毛壳菌属（Chaetomium）A3.145613.33StagonosporopsisJC2.7a4524.44AllophaeosphaeriaNX6.34536.67MagnaporthiopsisQT2.34536.67PlectosphaerellaHTB4.34536.67LasiobolusH3.2c24536.67黑团孢霉属（Periconia）N1.145613.33枝顶孢属（Acremonium）LT5.74536.67葡萄穗霉属（Stachybotrys）LT5.645613.33异茎点霉属（Paraphoma）YZ1.845613.33木霉（Trichoderma）QT4.54536.67SarocladiumQT7.2a4536.67WaiteaHTB3.345511.11CK-4524.442.2.2冬小麦普通根腐病2.2.2.1发生分布与为害根据2015年和2016年的调查结果，西北地区冬小麦种植区普通根腐病发生普遍，在新疆、甘肃、宁夏、陕西等省均有发生。但在新疆塔城市额敏县，甘肃定西市漳县及陇西县，甘肃白银市会宁县，甘肃武威市凉州区，甘肃天水市清水县和麦积区均未发现普通根腐病的冬小麦病株。当地的地理位置与气候环境是导致病原菌种类差异的原因。普通根腐病（commonrootrot）在冬小麦生长的整个生育期均可发生。苗期形成苗枯，成株期形成根腐、叶枯、丛状白穗、籽粒黑胚等症状。症状表现常因气候26 甘肃农业大学2018届硕士学位论文条件而不同，在干旱及半干旱地区常出现根腐症状。在潮湿地区，除根腐症状外，还可发生叶枯、穗枯、黑胚等症状。（1）苗枯：病重的种子不能发芽，或发芽后未及出土胚芽鞘即变褐腐烂。轻者幼苗虽可出土，但茎基部、叶鞘以及根部产生褐色病斑，幼苗生长不良。（2）叶枯：叶片上的病斑常呈长纺锤形或不规则黄褐色大斑，上生黑色霉状物（分生孢子梗及分生孢子），严重时叶片提早枯死。（3）根腐烂及丛状白穗：从灌浆期开始出现此症状，根部变褐腐烂，潮湿情况下根部长出黑色霉状物。严重时整株枯死并形成丛状白穗，不结籽粒或籽粒干瘪皱缩。（4）黑胚：籽粒受害后在种皮上形成病斑，边缘黑褐色、中部浅褐色的长条形病斑较多。严重时籽粒胚部变黑。（图2-2）图2-2田间和植株发病症状A:苗期整株枯死B、C、D:单株根系变黑E:苗期田间症状Fig.2-2FieldandplantdiseasesymptomsA:Thediedplantintheseedlingstage;B,C,D:Blackrootsperplant;E:Seedlingfieldsymptoms2.2.2.2病原菌分离频率由表2-4可知，在采集病样的四个省份中，从甘肃省病株样品上分离到的冬小麦普通根腐病菌株数最多，共有53株病原菌，分离频率高达54.64%；其次为陕西省，分离到17株病原菌，分离频率为17.53%；再次为宁夏省，分离到14株病原菌，27 甘肃农业大学2018届硕士学位论文分离频率为14.43%；最后为新疆省，分离到13株病原菌，分离频率为13.40%。表2-4冬小麦普通根腐病菌株数和分离频率Table2-4NumberoffungiandfrequencyinWinterwheatcommonrootrot省份分离菌株数Numberoffungi分离频率(%)Isolatefrequence(%)陕西1717.53甘肃5354.64宁夏1414.43新疆1313.40合计97100.002.2.2.3病原菌形态鉴定麦根腐平脐蠕孢（B.sorokiniana）：在PDA培养基上菌落呈深墨绿至灰黑色，菌落边缘不规则，气生菌丝为白色，较发达，为绒状。在PDA培养基上易产生大量的分生孢子及孢子梗，孢子呈椭圆形或纺锤形，多数孢子为直棒状，少数孢子可弯曲生长，孢子顶端较平，无凸起。分生孢子一般有5个左右的隔膜，孢子平均大小为48.89-87.75×15.33-28.49µm。图2-3麦根腐平脐蠕孢A:菌落B:分生孢子C:产孢梗标尺=10μmFig.2-3BipolarissorokinianaA:Thecolonymorphology;B:Conidia;C:Spore-makingstemsscalebar=10μm2.2.2.4ITS分子鉴定本研究共选择25个代表性平脐蠕孢属（Bipolarisspp.）菌株进行ITS基因序列分析，所得到的系统发育树见图2-4。由图2-4可知，KX452453等13个序列与NR147491等4个序列以100%的支持率聚在一起。其中，2B2.5a、HTB4.6、CW3.4、LT1.6等所有菌株均与GenBank数据库中的KJ909776、HF934937、MF490812菌株以78%的支持率聚为一个子分支，说明这些菌株均与麦根腐平脐蠕孢（B.sorokiniana）的亲缘关系最近。KX452453等4个序列与KU571466等2个序列以28 甘肃农业大学2018届硕士学位论文78%的支持率聚在一起。其中，KX452453与KX452452两个菌株以100%的支持率聚为一个子分支，MF490805与MF490804两个菌株以100%的支持率聚为一个子分支，KU571466与KU571465两个菌株以87%的支持率聚为一个子分支。NR147491与KX452442两个菌株以100%的支持率聚为一个子分支，KX831507与KX831506两个菌株以100%的支持率聚为一个子分支。KY114902与KY950237两个菌株以100%的支持率聚在一起。29 甘肃农业大学2018届硕士学位论文KX452453Bipolarisshoemakeri100KX452452Bipolarisshoemakeri75MF490805Bipolarisbicolor10078MF490804BipolarisbicolorKU571466Bipolariszeae87KU571464Bipolariszeae2B2.5aKJ909776Bipolarissorokiniana78HF934937BipolarissorokinianaMF490812BipolarissorokinianaHTB4.6100CW3.4LT1.6NR147491Bipolarisaustrostipae100KX452442Bipolarisaustrostipae76KX831507Bipolarisperegianensis100KX831506BipolarisperegianensisKY114902Bipolarisprieskaensis100KY950237BipolarisprieskaensisKC584232Alternariadennisii10图2-4ITS序列最大简约系统发育树Fig.2-4ThemaximumparsimonytreeobtainedfromITSsequences2.2.2.5致病性测定各省代表性麦根腐平脐蠕孢（B.sorokiniana）菌株的致病性测定结果如表2-5所示。由表可知，分离到的代表性菌株的致病力均很强，植株发病率几乎均达到30 甘肃农业大学2018届硕士学位论文100%。虽然导致普通根腐病的病原菌目前只分离到了这一种，但其致病性强，接种植株几乎全部发病，可见该病原为优势病原菌。表2-5麦根腐平脐蠕孢致病性测定结果Table2-5PathogenicdeterminationresultsofBipolarissorokiniana菌株号Numberof接种株数Numberof发病株数Numberofinfected发病率省份strainsinoculatedplantsplants(%)Incidence(%)陕西BX2.114545100BX2.5a4545100CW3.44545100CW3.6a4545100甘肃JC1.2a45451002L1.1a14545100NX7.6b45451002B5.4b4545100宁夏YZ1.5a4545100YZ1.7a4545100YZ3.5b4545100LT1.64545100新疆AXE2.3a4545100AXE3.3454497.78QT13.3a4545100QT8.3a4545100CK-4524.442.2.3冬小麦茎基腐病2.2.3.1发生分布与为害根据2015年和2016年的调查结果，西北地区冬小麦种植区茎基腐病发生普遍，在新疆、甘肃、宁夏、陕西等省均有发生。除在甘肃天水市麦积区没有发现茎基腐病病株外，在其它所有的病样采集地均采集到了茎基腐病的冬小麦病株。甘肃省一些地区冬小麦苗期茎基腐病发病率较高，天水市的发病率达20%-35%，庆阳市发病率约为30%，定西市和白银市发病率达40%-50%。茎基腐病（crownrot）在冬小麦上发生时症状也比较复杂，主要包括烂种、死苗、茎基部褐变和零星白穗症状。（1）烂种、死苗：播种后如条件适宜，病害可导致烂种或死苗。苗期受到侵染后，茎基部叶鞘和茎秆变褐，有时可引起根部变褐腐烂，严重时引起麦苗发黄死亡。（2）茎基部变褐：成株期植株发病后，一般植株茎基部的1-2个茎节变为褐色或巧克力色，严重时可扩展至茎秆中部。潮湿条件下，31 甘肃农业大学2018届硕士学位论文发病茎节处可见红色或白色霉层。（3）白穗：灌浆期随着病害发展，发病严重的植株可形成白穗症状，籽粒干瘪或甚至没有籽粒。如果小麦生长后期多雨潮湿，由于腐生菌的作用，病穗多由枯白色变为暗黑色。（图2-5）图2-5田间和植株发病症状A:苗期田间症状B:成株期茎秆上水渍状病斑C、E:成株期田间症状D：成株期茎秆上粉红色霉层Fig.2-5FieldandplantdiseasesymptomsA:Seedlingfieldsymptoms;B:Adultwaterstainedspotonstem;C,E:Adultstagefieldsymptoms;D:Onthestalkofadultplant,pinkmoldlayer2.2.3.2病原菌分离频率由表2-6和表2-7可知，甘肃省分离到的镰刀菌（Fusariumspp.）株数最多，分离到了95株，分离频率达50%，其次为新疆省分离到镰刀菌67株，分离频率达35%，再次为宁夏省分离到镰刀菌16株，分离频率为8%，最后为陕西省分离到镰刀菌15株，分离频率为7%。在所有镰刀菌中，分离到株数所占比例最大的为三线镰刀菌（F.tricinctum），占全部菌株的58%，共有113株；其次为木贼镰刀菌（F.equisteti），分离到21株；再次为假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），分离到16株。除此之外，还分离到了7株芳香镰刀菌（F.redolens）、13株尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、5株层出镰刀菌（F.proliferatum）、9株乳酸镰刀菌（F.nygamai）、7株黄色镰孢（F.culmorum）、2株亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）。32 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表2-6冬小麦茎基腐病病原菌株数Table2-6NumberoffungiinWinterwheatcrownrot甘肃新疆陕西宁夏合计镰刀菌（Fusarium）株数株数株数株数株数（Isolates）（Isolates）（Isolates）（Isolates）（Isolates）芳香镰刀菌（F.redolens）42107尖孢镰刀菌（F.oxysporum）740213层出镰刀菌（F.proliferatum）23005乳酸镰刀菌(F.nygamai)54009木贼镰刀菌(F.equiseti)4104321假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)842216黄色镰孢(F.culmorum)16007三线镰刀菌(F.tricinctum)623489113亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）20002共计95671516193表2-7冬小麦茎基腐病各病原菌分离频率Table2-7IsolatefrequencyinWinterwheatcrownrot甘肃新疆陕西宁夏合计镰刀菌（Fusarium）频率频率频率频率频率（Frequence）（Frequence）（Frequence）（Frequence）（Frequence）芳香镰刀菌（F.redolens）0.020.010.010.000.04尖孢镰刀菌（F.oxysporum）0.040.020.000.010.07层出镰刀菌（F.proliferatum）0.010.020.000.000.03乳酸镰刀菌(F.nygamai)0.030.020.000.000.05木贼镰刀菌(F.equiseti)0.020.050.020.010.10假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)0.040.020.010.010.08黄色镰孢(F.culmorum)0.010.030.000.000.04三线镰刀菌(F.tricinctum)0.320.180.030.050.58亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）0.010.000.000.000.01共计0.500.350.070.081.002.2.3.3病原菌形态鉴定（1）假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d，菌落直径为4.2-5.5cm。菌丝为发达的气生菌丝，白色或粉红色，绒状，能产生深红色的色素。从培养皿背面观察，可见桃红色至深红色的着色，有时可见不规则纹路。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，显微镜下可见大量大分生孢子，不产生小孢子。典型的大分生孢子相对较直，通常有5-7个隔膜，孢子大小为43-90×2.7-5.4µm，孢子中间隔膜处最宽，顶细胞弯曲。随着培33 甘肃农业大学2018届硕士学位论文养时间的增加有厚垣孢子产生，但由于菌株、培养条件等因素变异较大，不作为鉴别依据。（图2-6）图2-6假禾谷镰刀菌A:菌落B:大型分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-6FusariumpseudograminearumA:Thecolonymorphology;B:Macroconidia;C:Chlamydosporesscalebar=10μm（2）三线镰刀菌（F.tricinctum）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d，菌落直径为3.0-4.0cm。气生菌丝较浓密，生长初期为白色，后期可逐渐变为深红色。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，该真菌产生的分生大孢子一般有2-4个隔膜，孢子大小为25.68-52.84×2.97-4.72µm。小孢子较常见，多为肾形或椭圆形，无隔膜或仅有1个隔膜。可产生厚垣孢子，但数量极少。（图2-7）图2-7三线镰刀菌A:菌落B:分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-7FusariumtricinctumA:Thecolonymorphology;B:Conidia;C:Chlamydosporesscalebar=10μm（3）木贼镰刀菌（F.equisteti）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d时菌落直径为3.4-4.7cm。在菌株生长初期菌丝为白色，至生长后期变为焦黄色，菌丝较浓密，且在培养基表面出现棕色点状物。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，该真菌的大分生孢子一般分为6-8隔，孢子大小约为26-130µm。该菌也多有厚垣孢子产生，很少见小分生孢子出现。（图2-8）34 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图2-8木贼镰刀菌A:菌落B:大型分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-8FusariumequistetiA:Thecolonymorphology;B:Macroconidia;C:Chlamydosporesscalebar=10μm（4）尖孢镰刀菌（F.oxysporum）：PDA培养基上25℃恒温培养3d菌落直径为4.0-4.7cm。菌落平坦，边缘齐整，白色、淡黄色或桃色；菌丝体纤细，白色或桃红色，通常带有紫色，呈卷毛状，背面有或无色素。在CLA培养基上大型分生孢子产生于大量的淡橘黄色分生孢子座上，薄壁，通常3-5隔膜，纺锤形或锥形，两端尖；有时呈纺锤形或镰型，具有钩状的顶端，基部有小柄；小型分生孢子椭圆形、卵形或肾形，直或弯曲，单孢或一隔，以假头状着生在短瓶梗上。（图2-9）图2-9尖孢镰刀菌A:菌落B:分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-9FusariumoxysporumA:Thecolonymorphology;B:Conidia;C:Chlamydosporesscalebar=10μm（5）层出镰刀菌（F.proliferatum）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d时菌落直径为5.5-6.0cm。菌落为圆形，边缘规则，菌丝体为白色呈毛絮状且生长较旺盛，菌落最外围的菌丝较中间的菌丝稀疏，菌落背面可见淡紫色。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，大型分生孢子呈镰刀型或纺锤形，通常不易产生，小型分生孢子为肾形或卵圆形，无色透明，丛生于孢子梗上。（图2-10）35 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图2-10层出镰刀菌A:菌落B:产孢方式C:产孢梗及小孢子标尺=10μmFig.2-10FusariumproliferatumA:Thecolonymorphology;B:Sporulation;C:Spore-makingandmicrosporesscalebar=10μm（6）亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d时菌落直径为3.8-4.2cm。菌落为圆形，边缘规则，菌丝体乳白色中间凸起、边缘平坦，菌落中心的菌丝生长旺盛较茂密，边缘菌丝比较稀疏，菌落背面可见浅黄色色素产生。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，小型分生孢子为肾形或卵圆形，形态较一致。可产生厚垣孢子，厚垣孢子呈串状。（图2-11）图2-11亚黏团镰刀菌A:菌落B:小型分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-11FusariumsubglutinansA:Thecolonymorphology;B:microspores;C:Chlamydosporesscalebar=10μm（7）芳香镰刀菌（F.redolens）：菌株在PDA培养基上置于25℃黑暗条件下培养3d时菌落直径为3.5-4.4cm。菌落为平坦的圆形，边缘规则，菌丝体白色，毛绒状且生长较旺盛，菌落背面从菌落中心至边缘依次可见浅紫色、深紫色和淡红色晕圈。CLA培养基生长7d，挑取康乃馨叶片周围菌落观察，大型分生孢子呈镰刀型36 甘肃农业大学2018届硕士学位论文或纺锤形，有2-4个隔膜，在CLA培养基上培养15d可产生厚垣孢子。（图2-12）图2-12芳香镰刀菌A:菌落B:大型分生孢子C:厚垣孢子标尺=10μmFig.2-12FusariumredolensA:Thecolonymorphology;B:Macroconidia;C:Chlamydosporesscalebar=10μm2.2.3.4TEF分子鉴定本研究共选择40个代表性镰刀菌属菌株进行TEF基因序列分析，所得到的系统发育树见图2-15。由图2-15可知，经序列分析的菌株聚在8个不同的分支中。分离的EM5.4、QT7.1、EM6.11等菌株与GenBank数据库中菌株号为KR108316、JF496571、KR108321等的木贼镰刀菌（F.equisteti）以100%的支持率聚为一个分支。分离的EM5.5菌株与GU250559、JF740860、KT855186等6个序列的黄色镰刀菌（F.culmorum）以86%的支持率聚为一个分支。分离的HTB1.3b菌株与菌株号为AF212471、DQ382163、DQ382139的假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）以100%的支持率聚为一个分支。分离的F3.1b、N1.3b等菌株与菌株号为HM067691、HM347131等的亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）以99%的支持率聚为一个分支。分离的A1.1a1、YZ4.1菌株与菌株号为FJ985436、FJ985410等的尖孢镰刀菌（F.oxysporum）以100%的支持率聚为一个分支。分离的QT20.1菌株与菌株号为HM347121、KP985056的乳酸镰刀菌（F.nygamai）以99%的支持率聚为一个分支。分离的KT3.4、YZ1.9菌株与菌株号为KT213361、KJ623252、HQ214681等的三线镰刀菌（F.tricinctum）以98%的支持率聚为一个分支；分离的QT19.6菌株与菌株号为AF324320、GU250584的芳香镰刀菌（F.redolens）以100%的支持率聚为一个分支。37 甘肃农业大学2018届硕士学位论文KT21330FusariumequisetiEM5.461KR108316FusariumequisetiQT7.1JF496571Fusariumequiseti100KP267263FusariumequisetiEM6.1199KR108748Fusariumequiseti93KP881271FusariumequisetiKX663677FusariumequisetiKR108321FusariumequisetiGQ505592Fusariumequiseti100KT213278FusariumequisetiBX2.4a80KY081591FusariumequisetiKP267226Fusariumequiseti53KM679358FusariumlacertarumGQ505593Fusariumlacertarum90JF740828FusariumlacertarumEM5.5100GU250559FusariumculmorumGU370478FusariumculmorumJF740860Fusariumculmorum63KP267286Fusariumculmorum86KU198297Fusariumculmorum94KT855186FusariumculmorumAF212465Fusariumcerealis94AF212467FusariumcerealisAF212442Fusariummesoamericanum99AF212441Fusariummesoamericanum100EF428645FusariumboothiiKM437633FusariumboothiiAF212471Fusariumpseudograminearum100HYZ1.3bDQ382163FusariumpseudograminearumDQ382139Fusariumpseudograminearum100F3.1bHM067691Fusariumsubglutinans99N1.3bHM347131Fusariumsubglutinans100KR909375Fusariumbulbicola9492KF466415FusariumbulbicolaAY329036Fusariumbegoniae82KC514054Fusariumbegoniae99QT20.1HM347121Fusariumnygamai89KP985056Fusariumnygamai100100FR870290FusariumlactisAF160272FusariumlactisFJ985410Fusariumoxysporum99A1.1a188100FJ985425FusariumoxysporumFJ985436Fusariumoxysporum100YZ4.1100QT19.6AF324320FusariumredolensGU250584FusariumredolensKT213361FusariumtricinctumNX2.6AXE2.1QT15.51002H1.4KJ623252Fusariumtricinctum95KT3.4YZ1.998K3.5HQ214681FusariumtricinctumJX397851FusariumtricinctumKX611146Fusariumtricinctum97KX215088FusariumtricinctumGQ505433Fusariumflocciferum10图2-13镰刀菌属TEF序列最大简约系统发育树Fig.2-13ThemaximumparsimonytreeobtainedfromTEFsequencesofFusariumspp.2.2.3.5致病性变异结合TEF分子鉴定和形态鉴定，引起西北地区冬小麦茎基腐病的镰刀菌有9种，但各个种的致病性不尽一致。镰刀菌各种代表性菌株的致病性结果如表2-8所示。由表可知，在镰刀菌属（Fusariumspp.）中，分离到株数所占比例最大的为三线镰38 甘肃农业大学2018届硕士学位论文刀菌（F.tricinctum），占全部菌株的58.55%，共有113株；其次为木贼镰刀菌（F.equisteti），分离到21株，占所有镰刀菌的10.88%；再次为假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），分离到16株，占总株数的8.30%。就致病性测定结果而言，假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）的致病性最强，植株发病率均达到100%；其次为木贼镰刀菌（F.equisteti），发病率约为90%；三线镰刀菌（F.tricinctum）的致病能力最弱，发病率为40%-70%；其余镰刀菌使植株的发病率大体为75%。表2-8镰刀菌分离株数及致病性测定Table2-8IsolationandPathogenicdeterminationresultsofFusarium分离株数接种株数发病株数菌株号Number发病率镰刀菌（Fusarium）NumberofNumberofNumberofofstrainIncidence(%)isolatesnoculatedinfected三线镰刀菌（F.tricinctum）113KT3.1452248.89YZ1.9453271.112L3.1b2453168.892B4.1b452862.22K3.1b452964.44J4.2a452657.78木贼镰刀菌（F.equiseti）21EM5.4454191.11QT21.3a453884.44BX1.3a4545100假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）16HYZ1.3b4545100LT3.1d4545100EM5.1a4545100尖孢镰刀菌（F.oxysporum）13H1.5a453577.78A1.1a1453168.89乳酸镰刀菌（F.nygamai）9A1.1b453475.56QT21.7a453986.67黄色镰孢（F.culmorum）7EM5.54545100EM5.6a4545100芳香镰刀菌（F.redolens）7QT19.5453986.672G3.4b2454395.56层出镰刀菌（F.proliferatum）5HTB3.1453066.67亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）2N1.3b454497.78合计193CK4536.672.3结论与讨论本项目组于2015年和2016年的在西北地区的陕西、宁夏、新疆、甘肃四省冬小麦种植区对普通根腐病（Commonrootrot）和茎基腐病（Crownrot）进行调查采样，共采集典型发病植株样品121份。调查结果显示，冬小麦普通根腐病和茎基腐病发生普遍，在新疆、甘肃、宁夏、陕西四省均有发生。采样时发现，在同一田地39 甘肃农业大学2018届硕士学位论文的冬小麦植株上普通根腐病和茎基腐病往往会同时发生。从地理位置分布分析来看，茎基腐病的分布比普通根腐病的分布广，除在甘肃天水市麦积区未发现茎基腐病病株外，在其它所有的病样采集地均采集到了茎基腐病的冬小麦病株。而在新疆塔城市额敏县，甘肃定西市漳县及陇西县，甘肃白银市会宁县，甘肃武威市凉州区，甘肃天水市清水县和麦积区均未发现普通根腐病的冬小麦病株。当地的地理位置与气候环境是导致病原菌种类差异的原因。将采集的121份样品经常规组织分离及真菌纯化后共得到450个纯菌株。将这450个菌株进行形态鉴定、显微鉴定、分子鉴定后，发现所分离菌株具有丰富的多样性，将其归类整理后，共归于近20个属，但有些菌株的分离频率并不高，只分离到了几株，如葡萄穗霉属（Stachybotrys）、异茎点霉属（Paraphoma）、木霉（Trichoderma）、Stagonosporopsis、Sarocladium、Allophaeosphaeria、Magnaporthiopsis、Plectosphaerella、Lasiobolus、Waitea等。其中，平脐蠕孢属（Bipolarisspp.）为普通根腐病的病原属，镰刀菌属（Fusariumspp.）为茎基腐病的优势病原菌属，在平脐蠕孢属中只分离到一个种，即麦根腐平脐蠕孢（B.sorokiniana），共有97株。测定其致病性，发现97株菌的致病性均很强，植株发病率几乎均达到100%。共分离到193株镰刀菌，共有9种，分别是假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、木贼镰刀菌（F.equisteti）、三线镰刀菌（F.tricinctum）、芳香镰刀菌（F.redolens）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、层出镰刀菌（F.proliferatum）、乳酸镰刀菌（F.nygamai）、亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）。其中，三线镰刀菌（F.tricinctum）所占比例最高为58.55%，其次为木贼镰刀菌（F.tricinctum）和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）。致病性最强的为假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）。本研究报道的冬小麦茎基腐病原假禾谷镰刀菌、芳香镰刀菌、乳酸镰刀菌、亚黏团镰刀菌均为西北地区的首次报道。本研究发现平脐蠕孢属（Bipolarisspp.）和镰刀菌属（Fusariumspp.）是冬小麦普通根腐病和茎基腐病的优势病原属，周海峰[66]经研究也认为这两个属是导致小麦根腐类病害的最主要病原。何苏琴等[108]研究发现，雪腐镰刀菌（F.nivale）和燕麦镰刀菌（F.avenaceum）也是甘肃省小麦根腐类病害的病原菌，但本项目组未分离到这两种镰刀菌。樊少华等[59]报道了茄病镰刀菌（F.solani）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、木贼镰刀菌（F.equisteti）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、黄色镰刀菌40 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（F.culmorum）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）都是甘肃省小麦根腐类病害的病原，本研究分离得到了尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀菌，但未分离到茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌。引起澳大利亚小麦茎基腐病的主要病原为假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），引起美国小麦茎基腐病的主要病原为黄色镰刀菌（F.culmorum）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）[109]。黄淮地区也报道假禾谷镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌为优势种[66]，但是本研究分离到的黄色镰刀菌株数较少，还未分离到禾谷镰刀菌。这可能与地理位置与气候环境有关。41 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第三章冬小麦普通根腐病和茎基腐病的种质资源抗性筛选筛选出抗性良好的抗病品种进行育种、大面积种植是控制冬小麦普通根腐病和茎基腐病最经济、高效、安全的方法和途径。但是，目前关于冬小麦普通根腐病和茎基腐病的抗病品种在国内报道的较少，对抗病种质资源的筛选及利用研究还处于初步阶段。本研究将导致冬小麦普通根腐病的病原菌麦根腐平脐蠕孢和导致冬小麦茎基腐病的病原菌假禾谷镰刀菌、三线镰刀菌作为接种物，对甘肃省种植的38个小麦品种资源进行了接种抗性鉴定，并对其进行了病情指数法抗性评价。以期丰富我国冬小麦根腐病抗病种质资源的筛选及利用的内容，为生产实践提供一定的理论依据。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1供试菌株冬小麦普通根腐病病原菌：麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokinianum）菌株2B2.5a。冬小麦茎基腐病病原菌：假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）菌株HYZ1.3b；三线镰刀菌（Fusariumtricinctum）菌株J4.2c。菌株均保存于甘肃省农业科学院植物保护研究所植物病害实验室。3.1.1.2供试小麦品种供试小麦品种共38种，包括兰选64；兰选68；兰航选121；兰航选122；中梁34；兰天653；兰天132；兰天131；兰天26；兰天575；兰天134；兰天538；兰大211；兰15；铜麦6号；太1305；陇鉴9288；陇鉴111；陇鉴112；陇鉴113；陇鉴301；陇鉴110；陇鉴109；陇鉴108；陇鉴107；陇鉴103；陇鉴101；陇中1号；陇中2号；陇中3号；冬育4号；冬育5号；宁冬10号；宁冬11号；陇春13J6；陇春23号；陇春27号；陇春13J103。所有品种均由甘肃省农业科学院小麦研究所42 甘肃农业大学2018届硕士学位论文提供。3.1.2方法以上述3种病原菌作为接种物，步骤同第二章1.2方法所述小烧杯法。3.1.3数据处理与分析3.1.3.1计算公式计算公式同第二章1.2方法所述中公式。3.1.3.2数据分析采用Excel软件按公式计算发病率与病情指数，并采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。3.1.4抗性分级标准利用平均病情指数，用以下标准[110]进行抗性评价：免疫（I），平均病情指数为0；高抗（HR），均病情指数为0.01-10.00；中抗（MR），均病情指数为10.01-20.00；感病（S），平均病情指数为20.01-30.00；高感（HS），均病情指数大于30.01。3.2结果与分析3.2.1接种麦根腐平脐蠕孢2B2.5a菌株的抗性筛选麦根腐平脐蠕孢2B2.5a菌株对38个小麦品种的发病情况见表3-1。由表可知，兰选64、兰选68、兰航选121、兰航选122及兰天131等29个小麦品种的发病率均为100%；兰天26、兰天653、太1305及宁冬11号品种的发病率也均在90%以上；兰15品种的发病率在本组试验中最低，但也高达80%。就病情指数而言，陇鉴107品种的发病程度最高，高达95.00左右；兰选68、陇中3号品种的发病程度也较高，分别为82.36和74.94；兰天538等4个小麦品种的发病程度较低，介于20.00-30.00之间；其余大部分品种在30.00-50.00这一区间。依据抗性分级标准，兰15、兰大211、兰天538和铜麦6号4个品种为感病品种，占供试品种总数的10.53%；43 甘肃农业大学2018届硕士学位论文其余89.47%的小麦品种均表现为高感。表3-1麦根腐平脐蠕孢2B2.5a菌株对小麦38个品种的发病率、病情指数及抗性评价Table3-1Theincidenceanddiseaseindexabout38wheatvarietiesofBipolarissorokinianum2B2.5a品种发病率病情指数抗性分级CultivarIncidence（%）DiseaseindexResistanceclassification兰选68100.00±0.00a82.36±1.09bHS兰航选121100.00±0.00a56.17±0.33fgHS兰航选122100.00±0.00a44.05±2.05jkHS兰1580.09±1.82g24.70±2.19stS兰大21188.72±0.22e26.28±0.37sS兰天2692.82±1.35d38.31±0.82mnopqHS兰天131100.00±0.00a37.17±1.52nopqrHS兰天13286.42±0.91f38.59±0.85lmnopqHS兰天134100.00±0.00a39.74±2.11lmnopHS兰天53880.13±1.30g22.36±0.90tS兰天57588.79±0.37e34.74±1.31qrHS兰天65394.98±1.31c38.56±0.93lmnopqHS中梁34100.00±0.00a60.43±1.78eHS太130595.62±1.23c33.41±1.63rHS铜麦6号100.00±0.00a27.93±1.02sS陇鉴101100.00±0.00a47.91±0.84iHS陇鉴103100.00±0.00a42.68±1.36klHS陇鉴107100.00±0.00a94.84±0.91aHS陇鉴108100.00±0.00a47.34±1.06ijHS陇鉴109100.00±0.00a37.38±1.15nopqrHS陇鉴110100.00±0.00a39.99±2.05klmnopHS陇鉴111100.00±0.00a35.78±1.53pqrHS陇鉴112100.00±0.00a36.76±0.34opqrHS陇鉴113100.00±0.00a35.77±1.82pqrHS陇鉴301100.00±0.00a36.35±1.43pqrHS陇鉴9288100.00±0.00a34.90±0.95qrHS陇中1号100.00±0.00a55.37±1.54fgHS陇中2号100.00±0.00a48.45±0.47iHS陇中3号100.00±0.00a74.94±1.43cHS冬育4号100.00±0.00a48.41±0.62iHS冬育5号100.00±0.00a58.20±1.07efHS宁冬10号100.00±0.00a41.08±1.61klmnHS宁冬11号97.78±0.13b40.70±0.96klmnoHS陇春23号100.00±0.00a52.80±1.47ghHS陇春27号100.00±0.00a65.41±0.61dHS陇春13J6100.00±0.00a64.97±1.52dHS陇春13J103100.00±0.00a42.15±1.09klmHS兰选64100.00±0.00a50.00±0.64hiHS注：表中数据为平均值±标准误，小写字母为不同小麦品种间发病率及病情指数差异显著性分析（新复极差法Duncan’s，p<0.05），（下同）。Note:thedataintableareMean±SE,lowercasesinthetablestandforsignificanceofincidenceanddiseaseindexofdifferentwheatvarietiesinDuncan’smethod(p<0.05),(thesameasbelow).3.2.2接种假禾谷镰刀菌HYZ1.3b菌株的抗性筛选44 甘肃农业大学2018届硕士学位论文假禾谷镰刀菌HYZ1.3b菌株对38个小麦品种的发病情况见表3-2。由表可知，兰航选121、中梁34、陇鉴107和陇中2号品种的发病率最高，均为100%；兰天134及陇鉴101品种的发病率也较高，均在90%以上；兰大211、兰天131及兰天132品种的发病率较低，在50%-55%之间；其余品种发病率均在70%-89%之间。就病情指数而言，兰航选121品种的发病程度最高，高达85.00左右；陇鉴107品种的发病程度也较高，达到75.00左右；而兰15、兰大211、兰天131、兰天132、兰天575及兰天653品种的发病程度较低，均低于20.00，兰天132品种最低，为13.52；其余大部分品种在20.00-30.00这一区间。依据抗性分级标准，兰15、兰大211、兰天131等6个品种为中抗品种，占供试品种总数的15.79%；兰航选122、兰天26等23个小麦品种表现为感病，占供试品种总数的60.53%；其余23.68%的小麦品种均表现为高感。在此次试验的38个供试品种中没有发现抗病品种。45 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表3-2假禾谷镰刀菌HYZ1.3b菌株对小麦38个品种的发病率、病情指数及抗性评价Table3-2Theincidenceanddiseaseindexabout38wheatvarietiesofFusariumpseudograminearumHYZ1.3b品种发病率病情指数抗性分级CultivarIncidence（%）DiseaseindexResistanceclassification兰选6886.47±1.67bcde59.22±0.65cHS兰航选121100.00±0.00a85.45±0.36aHS兰航选12278.98±1.54fghi26.61±0.34fgS兰1577.10±1.92ghij19.88±1.57ijMR兰大21154.36±1.58l13.72±0.38kMR兰天2672.72±1.31ijk20.26±2.13ijS兰天13153.70±1.51l14.45±0.27kMR兰天13252.94±0.32l13.52±0.57kMR兰天13491.16±0.47bc26.73±0.88fgS兰天53875.06±2.56hijk20.32±1.78ijS兰天57570.61±1.03jk18.83±0.12jMR兰天65374.48±2.21hijk19.95±0.29ijMR中梁34100.00±0.00a54.96±1.74dHS太130587.83±0.75bcd26.07±2.07ghS铜麦6号86.78±1.67bcde23.59±2.26ghijS陇鉴10191.30±0.42bc30.83±1.96fHS陇鉴10387.79±1.80bcd23.43±1.67ghijS陇鉴107100.00±0.00a75.25±2.09bHS陇鉴10883.75±1.66defg21.85±1.37ghijS陇鉴10985.71±2.24bcdef22.97±1.56ghijS陇鉴11085.07±2.53cdef23.54±0.61ghijS陇鉴11184.60±0.41cdef21.17±0.59hijS陇鉴11288.43±0.57bcd24.24±1.41ghiS陇鉴11383.23±1.42bcd22.94±1.68ghijS陇鉴30183.23±2.01defg21.97±1.28ghijS陇鉴928883.77±3.51defg24.44±1.53ghiS陇中1号82.61±3.18defg22.70±1.71ghijS陇中2号100.00±0.00a39.42±1.75eHS陇中3号70.00±1.84k20.59±2.39ijS冬育4号87.07±1.85bcde36.78±0.70eHS冬育5号77.18±4.91ghij21.72±1.59ghijS宁冬10号80.11±2.76efgh24.86±1.27ghiS宁冬11号85.72±2.95bcdef24.78±1.31ghiS陇春23号79.28±0.95fghi22.18±2.51ghijS陇春27号77.15±4.89ghij23.82±0.85ghijS陇春13J692.51±0.41b30.70±1.58fHS陇春13J10385.53±2.93cdef23.86±0.66ghiS兰选6470.82±1.49jk40.40±1.53eHS3.2.3接种三线镰刀菌J4.2c菌株的抗性筛选三线镰刀菌J4.2c菌株对38个小麦品种的发病情况见表3-3。由表可知，兰选68、兰天134、中梁34、铜麦6号、陇鉴107、冬育4号、陇春27号、陇春13J6品种的发病率最高，均为100%；兰航选121、兰大211、兰天131等17个品种的46 甘肃农业大学2018届硕士学位论文发病率也较高，均在80%以上；兰天26、陇鉴103、陇鉴111及陇鉴113品种的发病率较低，在40%-50%之间；其余品种发病率均在50%-80%之间。就病情指数而言，陇鉴107、中梁34、冬育4号、陇春13J6品种的发病程度最高，达40.00以上；兰选68、兰航选121、兰天134等11个品种的发病程度也较高，均高于30.00；而兰15、兰航选122、兰天26等8个品种的发病程度较低，均低于20.00；其余品种在20.00-30.00这一区间。依据抗性分级标准，兰选68、兰航选121、兰天132等15个品种为高感品种，占供试品种总数的39.47%；兰大211、兰天131等14个小麦品种表现为感病，占供试品种总数的36.84%；其余23.69%的小麦品种均表现为中抗。在此次试验的38个供试品种中没有发现抗病品种。47 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表3-3三线镰刀菌J4.2c菌株对小麦38个品种的发病率、病情指数及抗性评价Table3-3Theincidenceanddiseaseindexabout38wheatvarietiesofFusariumtricinctumJ4.2c品种发病率病情指数抗性分级CultivarIncidence（%）DiseaseindexResistanceclassification兰选68100.00±0.00a32.12±1.09hHS兰航选12197.73±0.50a34.64±0.41fgHS兰航选12262.42±0.98k19.04±0.66pqrMR兰1566.80±0.87j18.41±0.34pqrMR兰大21182.52±0.76ef24.96±0.77klmS兰天2648.81±0.69l13.60±0.74stMR兰天13180.00±0.00f25.66±0.44jklS兰天13290.88±1.26c33.42±1.45ghHS兰天134100.00±0.00a37.48±0.73deHS兰天53868.68±1.02ij18.34±0.74qrMR兰天57571.53±0.91hi21.45±0.46noS兰天65397.78±0.00a38.57±0.52dHS中梁34100.00±0.00a42.66±0.58cHS太130596.65±0.96ab32.79±0.63ghHS铜麦6号100.00±0.00a35.81±0.43efHS陇鉴10197.76±1.30a28.37±0.40iS陇鉴10342.13±1.83m11.88±0.66tMR陇鉴107100.00±0.00a47.62±0.69aHS陇鉴10893.68±2.27bc26.31±0.41ijkS陇鉴10975.56±0.95g23.09±0.39mnS陇鉴11093.33±1.92bc27.96±0.21iS陇鉴11149.65±1.25l13.55±0.71stMR陇鉴11285.53±0.55de26.52±0.48ijkS陇鉴11350.90±1.45l14.25±0.15sMR陇鉴30186.63±1.35d32.25±0.86hHS陇鉴928884.56±0.77de23.84±0.76lmS陇中1号73.33±1.92gh20.41±0.62opS陇中2号82.52±1.90ef26.30±0.38ijkS陇中3号68.88±0.61ij19.39±0.41pqrMR冬育4号100.00±0.00a41.35±0.60cHS冬育5号84.56±0.97de33.48±0.63ghHS宁冬10号91.41±0.35c27.55±0.53ijS宁冬11号69.34±1.53ij20.00±0.00opqS陇春23号61.80±2.18k17.85±0.36rMR陇春27号100.00±0.00a33.56±0.71ghHS陇春13J6100.00±0.00a45.00±0.00bHS陇春13J10393.33±1.92bc37.01±0.53deHS兰选6484.49±0.41de24.46±1.43klmS3.2.4小结综上所述，在供试的38份材料中，未发现免疫品种。在对麦根腐平脐蠕孢的抗性试验中，没有发现对此病原菌有抗性的品种，所有品种均表现为感病品种或高感品种。兰15、兰大211等6个品种对假禾谷镰刀菌表现出抗性，但抗性不同，没有48 甘肃农业大学2018届硕士学位论文发现高抗品种，其余均为感病品种或高感品种。兰15、兰航选122等9个品种对三线镰刀菌表现出抗性，抗性也不尽相同，没有发现高抗品种，其余均为感病品种或高感品种。兰15、兰天131、兰天132这3个品种对大部分供试病原菌均表现抗性，且抗性较强；兰选68、兰航选121、中梁34、陇鉴101、陇鉴107、冬育4号等品种对大部分供试病原菌感病或易感病甚至高感，其余供试品种对于不同种病原菌的抗性不尽相同。3.3结论与讨论近年来，小麦普通根腐病和茎基腐病已逐渐发展为世界性病害，且有逐年加重的趋势。本研究对甘肃省38个小麦种质资源进行了抗病性评价，筛选出了部分抗病材料，为小麦抗普通根腐病和茎基腐病育种奠定了基础。从当前生产状况可以看出，目前主要种植的冬小麦品种的抗普通根腐病能力普遍很弱，所有品种均表现为感病或高感；抗茎基腐病能力普遍不是很强，只有极少数的品种为抗病品种，长此以往种植不抗病的品种不利于对该病害的控制，易造成病害流行及大发生，并且这也是冬小麦产量减少、品质下降的主要原因。目前，国外关于小麦抗普通根腐病和茎基腐病的品种筛选及利用做了不少研究[93]，并建立了相关鉴定方法及标准，已筛选出了如2-49、Gala、SUNCO等抗性品种及种质资源，在生产上发挥了一定的作用。但现阶段国内对小麦普通根腐病和茎基腐病的研究报道相对较少，其抗病品种的筛选和利用还处于初步研究的阶段，对生产实践的指导作用甚少[65]。2006年，宋凤英[111]对黑龙江省719份小麦种质资源进行了普通根腐病抗性鉴定，试验发现种质资源间有明显差异性，抗病材料也会发病，但一般比感病材料发病晚6d左右，未发现免疫品种。2015年，杨云[65,112]对88个黄淮麦区主推小麦品种及21个国外种质资源进行了茎基腐病抗性鉴定，经温室盆栽接种抗性鉴定试验和田间病圃苗期接种鉴定试验发现：供试品种及种质资源对假禾谷镰刀菌Wz2-8A菌株在两次测定中均未发现免疫或高抗品种，所有品种均表现为感病或高度感病，大多数品种均表现为感病或高感。筛选并利用抗病品种是控制小麦根部病害行之有效的方法，不同的小麦品种对根部病害的抗性鉴定研究是审定新的小麦品种及筛选和育种的基础。本研究将小麦的抗病性表现分为以下5个等级，分别为免疫（I），平均病情指数为0；高抗（HR），49 甘肃农业大学2018届硕士学位论文均病情指数为0.01-10.00；中抗（MR），均病情指数为10.01-20.00；感病（S），平均病情指数为20.01-30.00；高感（HS），均病情指数大于30.01，根据不同等级对小麦品种进行苗期抗病性测定，以期对小麦不同品种对普通根腐病和茎基腐病的抗性评价更为精准。从研究结果看，对于同一品种，对不同的病原菌抗性不同，甚至差异较大；对于同一病原菌，不同品种的发病率及病情指数存在显著的差异。本研究以冬小麦普通根腐病的优势病原菌麦根腐平脐蠕孢，冬小麦茎基腐病的优势病原菌假禾谷镰刀菌和三线镰刀菌作为接种物，对38个小麦品种进行了抗性筛选试验。发现这些小麦品种对普通根腐病的病原菌的抗性整体较差，需加强其抗病资源筛选和抗病育种工作。相对来说，兰15、兰天131、兰天132这3个品种对大部分供试病原菌均表现抗性，且抗性较强，可以在小麦根腐病多发的地区种植这几种小麦品种。本次试验研究丰富了我国对小麦普通根腐病和茎基腐病抗病种质资源的筛选和利用的内容，为生产实践提供了理论依据。同时，由于目前大多数品种表现感病，故还需加强该病的综合防治研究工作。50 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第四章冬小麦普通根腐病和茎基腐病原菌的药剂筛选及室内毒力测定化学防治是防治病害最行之有效的方法之一。由于小麦普通根腐病和茎基腐病往往在同一植株上均有发生，防治起来比较困难，单纯地靠农业防治或物理防治很难达到预期的防治效果。现阶段，国内比较缺乏防治该病的抗病品种及高效防治药剂。本研究通过对冬小麦普通根腐病的优势病原菌麦根腐平脐蠕孢和冬小麦茎基腐病的优势病原菌假禾谷镰刀菌、三线镰刀菌进行室内药剂筛选和毒力测定，以期筛选出对该病有效的防治药剂，为西北地区冬小麦种植区的冬小麦产量提高、品质提升及生产安全保驾护航。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1供试菌株同第三章1.1.1所述供试菌株。4.1.1.2供试药剂95%噻呋酰胺；98%多菌灵；98%嘧菌酯；96%王铜；98%苯醚甲环唑。所有供试药剂均购于青岛瀚森农药股份有限公司。4.1.2方法4.1.2.1制备含毒PDA培养基采用生长速率法[113]对5种供试药剂进行室内药剂筛选，筛选出对3种供试菌株生长速率有明显抑制作用的药剂进行毒力测定。本次试验每种菌株各筛选出2种药剂进行室内毒力测定。将筛选出的药剂用无菌水稀释成一定系列浓度，后将稀释的药剂溶液注入PDA培养中（稀释浓度时需考虑所注入培养基的体积）基制成含毒培养基，以加入与稀释药剂溶液等量无菌水的PDA培养基为对照。将活化好的菌株菌51 甘肃农业大学2018届硕士学位论文饼（d=5mm）接于培养基上，25℃恒温培养4d后观察并记录菌落直径。4.1.2.2药剂浓度梯度每种菌株对应2种药剂进行室内毒力测定，不同菌株药剂浓度梯度设置均不同。本试验药剂浓度梯度设置为：（1）麦根腐平脐蠕孢2B2.5a：①98%苯醚甲环唑（2000倍液，3000倍液，4000倍液，5000倍液，6000倍液）；②96%王铜（500倍液，1000倍液，1500倍液，2000倍液，2500倍液）。（2）假禾谷镰刀菌HYZ1.3b：①98%多菌灵（10万倍液，12万倍液，14万倍液，16万倍液，18万倍液）；②98%苯醚甲环唑（6000倍液，7000倍液，8000倍液，9000倍液，10000倍液）。（3）三线镰刀菌J4.2c：①98%多菌灵（2万倍液，3万倍液，4万倍液，5万倍液，6万倍液）；②98%苯醚甲环唑（6000倍液，7000倍液，8000倍液，9000倍液，10000倍液）。4.1.3数据处理与分析4.1.3.1计算公式对照组直径(mm-)处理组直径(mm)抑菌率%100对照组直径(mm-)(5mm)4.1.3.2数据分析采用Spss19.0软件及Excel软件按1.3.1公式计算抑菌率、毒力回归方程及相关系数，采用DPS数据处理统计软件计算EC50值。4.2结果与分析4.2.1药剂筛选结果5种供试药剂对导致冬小麦普通根腐病的1种病原菌和导致冬小麦茎基腐病的2种病原菌均有不同程度的抑制作用（表4-1）。对导致冬小麦普通根腐病的病原菌麦52 甘肃农业大学2018届硕士学位论文根腐平脐蠕孢2B2.5a菌株来说，王铜、苯醚甲环唑对其生长抑制作用较强，98%苯醚甲环唑2000倍液抑制作用液是达到了100%，但对镰刀菌表现抑菌作用良好的多菌灵，对麦根腐平脐蠕孢的抑制效果不佳。对导致冬小麦茎基腐病的病原菌假禾谷镰刀菌HYZ1.3b菌株来说，多菌灵、苯醚甲环唑对其的生长抑制率都较高，均达到70%以上，王铜对其抑制作用较差，只有25%左右；对三线镰刀菌J4.2c菌株来说，多菌灵、苯醚甲环唑对其生长抑制作用都较强，均达到80%以上，98%多菌灵的20000倍液抑制作用更是达到了100%，与假禾谷镰刀菌一样，王铜对三线镰刀菌的抑制作用也不明显。综合来看，在供试的5种药剂中，只有苯醚甲环唑对3种病原菌均有良好的抑制效果。后续选择选择96%王铜及98%苯醚甲环唑对麦根腐平脐蠕孢2B2.5a进行室内毒力测定，选择98%多菌灵及98%苯醚甲环唑对假禾谷镰刀菌HYZ1.3b菌株及三线镰刀菌J4.2c菌株进行室内毒力测定。表4-1冬小麦普通根腐病和茎基腐病室内药剂筛选Table4-1Indoorpharmaceuticalscreeningofwinterwheatcommonrootrotandcrownrot麦根腐平脐蠕孢2B2.5a假禾谷镰刀菌HYZ1.3b三线镰刀菌J4.2c药剂稀释药剂菌落直径抑菌率菌落直径抑菌率菌落直径抑菌率倍数（mm）（%）（mm）（%）（mm）（%）95%噻呋酰胺10000倍25.00±2.75b31.81±9.39c31.00±0.50a3.13±1.56e45.33±0.17a0.83±0.41e98%多菌灵20000倍25.00±0.29b31.81±0.98c5.00±0.00d100.00±0.00a5.00±0.00e100.00±0.00a98%嘧菌酯8000倍23.33±1.67b37.49±5.68c21.50±0.58b32.81±1.80c19.67±1.09c63.94±2.69c96%王铜1500倍14.17±0.33c68.75±1.14b23.83±0.93b25.52±2.90d29.50±0.76b39.76±1.88d98%苯醚甲环唑2000倍5.00±0.00d100.00±0.00a9.33±1.30c70.83±4.07b5.67±0.44e98.36±1.08aCK–34.33±1.67a0.00±0.00d32.00±0.76a0.00±0.00e45.67±0.17a0.00±0.00e4.2.2室内毒力测定结果由表4-2可知，3种药剂对不同的供试菌株均有抑制作用，药剂的稀释倍数越大，药剂的抑菌作用就越小。对于冬小麦普通根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢菌株2B2.5a而言，96%王铜500倍液对其生长抑制效果最好，抑菌率达到了88.28%，其次为98%苯醚甲环唑2000倍液，抑菌率为86.14%，96%王铜2500倍液对菌丝生长抑制作用最弱，仅为53.47%；98%苯醚甲环唑及96%王铜的EC50值分别为72.41µg/ml和279.68µg/ml。对于冬小麦茎基腐病原菌假禾谷镰刀菌菌株HYZ1.3b而言，98%多菌灵10万倍液对其生长抑制效果最好，抑菌率达到了100%，其次为98%苯醚甲环唑6000倍液，抑菌率为65.45%，98%多菌灵18万倍液对菌丝生长抑制作用最弱，仅为13.20%；98%多菌灵及98%苯醚甲环唑的EC50值分别为7.03µg/ml和53 甘肃农业大学2018届硕士学位论文93.88µg/ml。对于三线镰刀菌菌株J4.2c而言，98%多菌灵20000倍液对其生长抑制效果最好，抑菌率达到了100%，其次为98%苯醚甲环唑6000倍液，抑菌率为94.66%，98%多菌灵60000倍液对菌丝生长抑制作用最弱，仅为61.75%；98%多菌灵及98%苯醚甲环唑的EC50值分别为18.96µg/ml和42.97µg/ml。表4-2药剂的毒力回归方程和抑制中浓度Table4-2VirulenceregressionandEC50offungicides药剂稀释倍数抑菌率（%）毒力回归方程相关系数菌株号EC50(µg/ml)FungicideDilutionInhibitionRegressionequation(r)Regression2000倍86.143000倍77.3398%苯醚甲4000倍73.36y=1.2248x+2.72672.41r=0.9768环唑5000倍71.396000倍68.352B2.5a500倍88.281000倍77.896%王铜1500倍74.98y=1.4332x+1.4942279.68r=0.96762000倍66.562500倍53.4710万倍10012万倍30.2298%多菌灵14万倍25.43y=21.1989x-12.95647.03r=0.816116万倍15.718万倍13.2HYZ1.3b6000倍65.457000倍65.0398%苯醚甲8000倍59.21y=1.7790x+1.490793.88r=0.9683环唑9000倍54.7310000倍51.32万倍1003万倍85.7198%多菌灵4万倍66.41y=6.9862x-3.815618.96r=0.89975万倍62.266万倍61.75J4.2c6000倍94.667000倍92.9798%苯醚甲8000倍88.74y=2.7428x+0.520542.97r=0.9873环唑9000倍86.9810000倍84.894.3结论与讨论众所周知，自小麦普通根腐病和茎基腐病被发现并报道以来，已有70多年的历史。这两种病害病为害小麦的生长发育，导致小麦的产量下降、品质变劣，严重威胁着世界各地小麦主产区小麦的生产安全。简单的农业防治、生物防治及物理防治54 甘肃农业大学2018届硕士学位论文的方法已不能达到良好的控制病害发生与减轻为害的作用，必须将农业防治等措施与化学防治结合起来，才可以达到早期预防及后期治理的效果。本研究进行的室内药剂筛选试验结果显示，供试的5种药剂均对受试的3种不同菌株的生长速率有不同程度的抑制作用，且随着药剂浓度的减小（稀释倍数的增大），抑菌率也随之减小。由于不同属的菌株生理特性有很大差别，其抗药性也有很大的不同。从表4-1可看出95%噻呋酰胺对供试的3种菌株生长速率抑制情况都不好，抑菌率在5种药剂中最低。98%多菌灵对三线镰刀菌J4.2c及假禾谷镰刀菌HYZ1.3b的抑制效果奇佳，抑菌率均为100%，这与申琼[114]的研究结果一致，与方晓翠[115]的研究结果大体一致，但却对麦根腐平脐蠕孢2B2.5a的抑菌率仅有31.81%，说明多菌灵对镰刀菌属的菌株抑制效果好，可用该药剂防治由镰刀菌引起的茎基腐病。虽有杨振华等[116]报道嘧菌酯在土壤中的残留量较小，残留量在规定范围之内，但本研究试验发现98%嘧菌酯对3种供试菌株的生长速率抑制效果平平，潘龙其等[117]研究也有相同结果。加大药剂浓度也许会有更好的防效，但需要进一步试验验证。96%王铜对2种镰刀菌的抑菌率均很低，为20.00%左右，但其对麦根腐平脐蠕孢的生长有很好的抑制作用，抑菌率将近70.00%，且黄雅丽等[118]经试验证明王铜对人体的毒性不大，在试验中对人体伤害较小。98%苯醚甲环唑对3种菌株的抑菌效果也均较好，可以考虑用该药剂防治冬小麦普通根腐病和茎基腐病。98%多菌灵的EC50值最小，为7.03µg/ml，对镰刀菌的生长速率抑制作用最大。本研究没有进行药剂复配试验，合理的药剂复配会使药剂对冬小麦普通根腐病和茎基腐病的防治效果更好。本试验只是室内试验，对药剂的筛选及毒力测定结果还应有大田试验数据的支撑，后期应注意这两方面的问题。55 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第五章结论与创新点5.1结论1.将普通根腐病和茎基腐病分开研究，而不是相互混淆、统称为根腐病。完善了西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病的病害症状描述，普通根腐病（Commonrootrot）：（1）苗枯：病重的种子不能发芽，或发芽后未及出土胚芽鞘即变褐腐烂。轻者幼苗虽可出土，但茎基部、叶鞘以及根部产生褐色病斑，幼苗生长不良。（2）叶枯：叶片上的病斑常呈纺锤形或不规则黄褐色病斑，上生黑色霉状物（分生孢子梗及分生孢子），严重时叶片提早枯死。（3）根腐及丛状白穗：从灌浆期开始出现此症状，根部变褐腐烂，潮湿情况下根部长出黑色霉状物。严重时整株枯死并形成丛状白穗，不结籽粒或籽粒干瘪皱缩。（4）黑胚：籽粒受害后在种皮上形成不定形病斑，尤其边缘黑褐色、中部浅褐色的长条形或梭形病斑较多。严重时籽粒胚部变黑固有黑胚病之称。茎基腐病（Crownrot）：（1）烂种、死苗：播种后如条件适宜，病害可导致烂种或死苗。苗期受到侵染后，茎基部叶鞘和茎秆变褐，有时可引起根部变褐腐烂，严重时引起麦苗发黄死亡。（2）茎基部变褐：成株期植株发病后，一般植株茎基部的1-2个茎节变为褐色或巧克力色，严重时可扩展至茎秆中部。潮湿条件下，发病茎节处可见红色或白色霉层。（3）零星白穗：灌浆期随着病害发展，发病严重的植株可形成零星白穗，籽粒干瘪或甚至没有籽粒。2.采用常规的组织分离法分离真菌，通过真菌纯化将菌株进行单孢分离，随后按柯赫氏法则进行小烧杯法致病性测定。结合形态特征、显微特征及3种分子生物学鉴定（LSU分子鉴定、ITS分子鉴定、TEF分子鉴定）结果对病原菌进行鉴定。结果显示，引起西北地区冬小麦普通根腐病的优势病原为麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）。引起西北地区冬小麦茎基腐病的病原菌有9种，分别为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、木贼镰刀菌（F.equisteti）、三线镰刀菌（F.tricinctum）、芳香镰刀菌（F.redolens）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、层出镰刀菌（F.proliferatum）、乳酸镰刀菌（F.nygamai）、亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）。其中，假禾谷镰刀菌、芳香镰刀菌、乳酸镰刀菌、亚黏团镰刀菌作为冬小麦茎基腐病的病原为西北地区首次报道。3.采用小烧杯法对西北地区推广种植的38份小麦种质资源进行抗性鉴定。结果56 甘肃农业大学2018届硕士学位论文显示，在供试的38个小麦品种中，未发现对普通根腐病和茎基腐病免疫的小麦品种。在对普通根腐病病原菌麦根腐平脐蠕孢的抗性试验中，未发现对此病原菌有抗性的品种，所有品种均表现为感病品种或高感品种。对茎基腐病病原菌的接种结果显示，兰15、兰大211等6个品种对假禾谷镰刀菌表现出抗性，但抗性不同，没有发现高抗品种，其余均为感病品种或高感品种；兰15、兰航选122等9个品种对三线镰刀菌表现出抗性，抗性也不尽相同，没有发现高抗品种，其余均为感病品种或高感品种。兰15、兰天131、兰天132这3个品种对大部分供试病原菌均表现抗性，且抗性较强；兰选68、兰航选121、中梁34、陇鉴101、陇鉴107、冬育4号等品种对大部分供试病原菌感病或易感病甚至高感，其余供试品种对于不同种病原菌的抗性不尽相同。可在茎基腐病发生严重的地块种植抗性较好的品种。4.本研究进行的室内药剂筛选试验结果显示，95%噻呋酰胺及98%嘧菌酯对供试的麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana）、假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）、三线镰刀菌（F.tricinctum）的生长速率抑制情况都不好。98%多菌灵对镰刀菌属的菌株抑制效果好抑菌率达100%，但对平脐蠕孢的生长抑制率不佳。96%王铜对镰刀菌的抑菌率均很低，为20.00%左右，但对麦根腐平脐蠕孢的抑菌率将近70.00%。98%苯醚甲环唑对3种菌株的抑菌效果也均较好。98%多菌灵的EC50值最小，为7.03µg/ml，对镰刀菌的生长速率抑制作用最大。5.2创新点1.报道了引起西北地区冬小麦茎基腐病的病原有9种镰刀菌，分别为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）、黄色镰刀菌（F.culmorum）、木贼镰刀菌（F.equisteti）、三线镰刀菌（F.tricinctum）、芳香镰刀菌（F.redolens）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、层出镰刀菌（F.proliferatum）、乳酸镰刀菌（F.nygamai）、亚黏团镰刀菌（F.subglutinans）。其中，假禾谷镰刀菌、芳香镰刀菌、乳酸镰刀菌、亚黏团镰刀菌作为冬小麦茎基腐病的病原为西北地区首次报道。2.对西北地区38个小麦种质资源进行了抗病鉴定，筛选出6个冬小麦茎基腐病的中抗品种。3.冬小麦对普通根腐病和茎基腐病的病原菌进行了药剂筛选及毒力测定，筛选出了3种有良好抑菌效果的药剂。57 甘肃农业大学2018届硕士学位论文参考文献[1]E.ShikurGebremariam,D.Sharma-Poudyal,T.C.Paulitz,etal.IdentityandpathogenicityofFusariumspeciesassociatedwithcrownrotonwheat(Triticumspp.)inTurkey[J].EurJPlantPathol,2017.[2]崔桂霞,甄润英.国内外小麦生产现状及发展趋势[J].食品研究与开发,2005(02):13-17.[3]张琼,王芳,王钊英,马建荣,胡启平.澳大利亚棉花、小麦生产和研究概况[J].世界农业,2013(10):52-54.[4]王春玉,蔡容,祁春节.澳大利亚小麦生产及贸易现状研究[J].世界农业,2007(04):33-35.[5]王志敏.关于我国小麦生产现状与未来发展的思考[A].中国作物学会栽培专业委员会小麦学组.第十五次中国小麦栽培科学学术研讨会论文集[C].中国作物学会栽培专业委员会小麦学组:2012:12.[6]我国小麦生产与加工业的现状[J].中国粮食经济,2013(04):72.[7]纪军,钟冠昌,李俊明,王彦梅,安调过.我国优质麦生产现状及品质育种方法[J].安徽农业科学,2001(06):729-730.[8]李哲清,高翔.优质专用小麦生产现状与产业化前景分析[J].陕西农业科学,2009,55(03):74-77+105.[9]国家发展和改革委员会价格司编.全国农产品成本收益资料汇编2004[M].北京:中国统计出版社,2004:10.[10]中华人民共和国农业部.中国农业统计资料2003[M].北京:中国农业出版社,2004.[11]赵俊晔,于振文.我国小麦生产现状与发展小麦生产能力的思考[J].农业现代化研究,2005(05):344-348.[12]吕永昶,王鹏.小麦根部病害诊断及防治技术[J].乡村科技,2016(14):91.[13]麦迪娜依·达吾提,阿不力米提.小麦黑穗病的防治[J].农业开发与装备,2014(09):118.[14]陈杰.小麦根部病害在豫东地区的发展趋势及防治策略[J].河南农业,2013(11):32.[15]程晓亮.耕作方式对小麦病害发生及根际真菌群落结构的影响[D].河北农业大学,2010.[16]ParmeterJR,SherwoodRT,PlattWD.AnastomosisgroupingamongisolatesofThanatephoruscucumeris[J].Phytopathology,1969,59:1270-1278.[17]LippsPE,HerrLJ.EtiologyofRhizoctoniacerealisinsharpeyespotofwheat[J].Phytopathology,1982,72(12):1574-1577.[18]AiyunWang,XueningWei,WeiRong,etal.GmPGIP3enhancedresistancetobothtake-allandcommonrootrotdiseasesintransgenicwheat[J].Functional&IntegrativeGenomics,2015,15(3):375-381.[19]贾廷祥,刘传德,吴桂本,李绍敏,王英姿.小麦根腐镰刀菌鉴定及其生物学特性[J].植物保58 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甘肃农业大学2018届硕士学位论文致谢岁月如梭、如歌。转眼间，三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝美好的记忆，甜美与欢笑也都已尘埃落定。甘肃农业大学以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的情怀胸襟、浪漫充实的校园生活育我成人。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助过我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。本论文是在导师李敏权研究员的悉心指导下完成的，从论文的选题，试验的设计、实施以及最后论文完成的一系列环节中无不凝聚着导师的汗水和心血。在研期间，老师渊博精深的学术造诣、严谨的治学态度、精益求精的科研态度、兢兢业业的敬业精神，培养了我的科研思维能力、提高了我的实操水平以及认知能力。值此论文完成之际，我谨向恩师致以最崇高的敬意和诚挚的谢意！同时还要感谢师母孟惠兰老师对我学习及生活的关心和鼓励！在此特别感谢李焕宇老师在试验、学习和生活中各个方面给予了我的无私的关心、帮助、鼓励以及支持！同时衷心感谢李惠霞教授对我的鼓励和关心！感谢同门师兄漆永红、郭成等及李雪萍、曹素芳师姐等在试验技术、方法等方面给予的热心帮助和悉心指导。在此也要特别感谢在生活和学习中给予帮助和鼓励的同学刘宁、郭苏帆、张娜等。同时，感谢本科学妹牛艳霞、包蕊蕊、罗崇玉等在实验过程中的大力帮助。在此，送上我衷心的祝福！感谢国家公益性行业（农业）科研专项“西北地区麦类及蔬菜根腐类病害综合治理技术”（项目编号：201503112-4）资助完成。感谢完成本试验的甘肃农业大学植物保护学院及甘肃省农科院植保所实验室！特别感谢在背后默默支持我的父母。感谢您们二十多年对我的默默支持、鼓励和关怀。我的每一点的进步和收获都凝聚着你们的心血和汗水。无论在任何时候您们都给予了我无限的支持与关怀，您们期盼的目光是我前进的动力，没有您们的支持和帮助，我不会坚持走到现在，谢谢您们。祝愿您们永远健康平安！谨以此文献给所有关心、爱护和帮助过我的老师、亲人、朋友和同学们！郭炜2018年5月65 甘肃农业大学2018届硕士学位论文导师简介李敏权，男，汉族，博士，教授，中共党员，博士研究生导师。1962年12月生，现任甘肃省农业科学院党委委员、副院长，甘肃省植物保护学会理事长，中国植物保护学会常务理事，中国植物病理学会理事，兰州市安宁区第十八届人大代表。1979年9月-1983年6月在甘肃农业大学学习，1988年华南农业大学助教进修班结业，2002年6月甘肃农业大学草业生态学博士毕业。2005年7月-2006年6月澳大利亚CharlesSturtUniversity留学（访问学者）。1983年毕业留校在甘肃农业大学植物保护系任教。1992年晋升讲师，1997年6月晋升副教授，2002年10月晋升教授。曾历任甘肃农业大学植保系团总支书记，甘肃农业大学团委副书记，甘肃农业大学党委学生工作部副部长，甘肃农业大学团委书记，甘肃农业大学植物保护系党总支书记，甘肃农业大学人事处处长，甘肃农业大学党委委员，2009年8月任甘肃省农业科学院党委委员，副院长。六届甘肃省青年联合会委员，七届甘肃省青年联合会委员、常委，九届甘肃团省委委员，甘肃省七届、八届、九届团代会代表，十四届全国团代会代表，甘肃省政协人口资源环境专业委员会委员，甘肃省高校思政研究会理事，兰州新区智库专家。曾荣获甘肃省首届新长征突击手称号等10余项荣誉称号。主持和参加科研项目20余项，其中12个项目分别荣获甘肃省科技进步奖和厅级科技进步奖。甘肃省葱蒜类作物腐烂病害研究与防治2016年甘肃省科技进步三等奖。甘肃省麦类作物孢囊线虫病控制技术研究2014年甘肃省科技进步二等奖。甘肃省镰刀菌及其植物病害研究2011年荣获兰州市科技进步二等奖、甘肃省科技进步三等奖。黄土高原集约化种植模式及苜蓿病害研究2006年荣获甘肃省农牧渔业丰收奖二等奖、甘肃省科技进步三等奖。河西灌区甜菜黑腐病研究2004年获甘肃省高校科技进步三等奖。黄瓜花叶病毒的致病力分化和株系间交叉保护作用的利用2004年获甘肃省高校科技进步二等奖、甘肃省科技进步三等奖。草地资源与草食动物分布研究2001年获甘肃省科技进步三等奖。甘肃中部花椒丰产技术推广1996年获甘肃省农业技术推广三等奖。花椒丰产技术体系研究1997年获甘肃省林业厅科技进步二等奖。河西干旱灌区甜菜病害调查与主要病害防治研究1995年获甘肃省农业厅科技进步三等奖。河西干旱灌区甜菜丛根病综合防治研究1994年获甘肃省农业厅科技进步二等奖。甘肃中部干旱地区豌豆根腐病研究1990年获甘肃省科技进步三等奖。在国内外学术期刊发表科技论文120余篇。66 甘肃农业大学2018届硕士学位论文作者简介郭炜，女，1992年9月出生，甘肃张掖人，中共党员。2011年就读于甘肃农业大学草业学院植物保护专业，2015年获得农学学士学位。同年9月考取甘肃农业大学草业学院植物病理学专业硕士研究生，师从李敏权研究员，主要研究方向为植物病害及其综合防治。研究生期间，在导师广阔的思路和渊博知识的熏陶下，养成了乐观、积极向上的认识态度和严谨、务实求真的治学态度。研究生期间学习勤奋，积极。同时广泛阅读与本专业相关的中外文书籍和文献，努力充实自己的专业知识。及时了解本专业和相关领域的前沿动态，使专业知识更系统，更全面，并且培养了独立思考和解决问题的能力，综合素质得到进一步的提高。在读研期间参加公益性行业（农业）科研专项作物根腐病综合治理技术（201503112），以第一作者在《甘肃农业大学学报》发表学术论文1篇。攻读硕士研究生期间发表的论文：[1]郭炜,李雪萍,漆永红,郭成,李潇,沈瑞清,雷斌,李敏权*.西北地区冬小麦茎基腐病原假禾谷镰刀菌的鉴定及种质资源抗性筛选[J].甘肃农业大学学报,已录用.[2]LiH.Y.,GuoW.,LiuD.,LiM.Q.FirstreportofFusariumsemitectumcausingrootrotofgreenhousepepper(Capsicumannuum)inChina[J].PlantDisease,已录用.[3]李雪萍,李建宏,漆永红,郭炜,李潇,李敏权.青稞根腐病对根际土壤微生物及酶活性的影响[J].生态学报,2017,37(17):5640-5649.[4]李雪萍,李建宏,漆永红,郭炜,刘丹,李敏权.青稞根腐病的发生与土壤酶活性及土壤微生物的关系[J].草业学报,已录用.[5]李雪萍,李建宏,漆永红,郭成,郭炜,李潇,李敏权*,根腐病对青稞根际土壤酶活性及土壤微生物群落结构的影响,中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会,中国湖南长沙,2017.11.08[6]LiX.P.,LiuD.,LiH.Y.,QiY.H.,GuoW.,LiX.,LiM.Q.*Screeningofpeppergermplasmresourcesresistancetorootrot,中国植物病理学会2016年学术年会,中国江苏南京,2016.08.0567 甘肃农业大学2018届硕士学位论文原创性声明68