西北地区奶牛贾第虫和隐孢子虫流行病学调查及基因型研究

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．：Ｓ８５５９：１的６４分类号单位代码密级：学号：１２７２０２４０容化怎＆扛弓学位论文西北地区奶牛贾第虫和隐抱子虫流行病学调查及基因型研究ＥｉｄｅｍｉｏｌｏｉｃａｌａｎｄＧｅｎｏｔｉｃＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＧｉａｒｄｉａａｎｄｐｇｙｐ？Ｏｙ／；化成ｉｎＤａｉｒｙＣａｔｔｌｅｉｎＮｏｒｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ研究生；谭启东指导教师：徐前明副教授合作指导教师；失兴令研究贵申请学位口类级别；农学硕ｄｒ专业名称；预防兽戾学研究方向；兽侯寄牛．虫与寄生虫病学’所在学院；动物科巧学院Ｖ答辩委员会主席；＼二零…五年六月 独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中持别加Ｗ标注和致谢的地方夕ｈ论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；１／食杳ｆ／Ｔ年月签字日期：巧ｉｇ日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阔和借阅。本人授权安徽农业大学可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据库》，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。非学位论文作者签名；’指导獅签名；轉細啤签字曰期：年ｔ月＾曰签字曰期：＾／巧／月曰学工位论文作者毕业后去向：通作单位：电话：信地扯：邮编； 摘要贾第虫（Giardia）和隐孢子虫（Cryptosporidium）是重要的人兽共患寄生性原虫，主要传播途径包括直接接触或摄入污染的食物和饮水而感染，严重威胁着动物生长发育，给畜牧养殖业带来巨大经济损失，同时，也潜在地威胁着人类健康。针对贾第虫病和隐孢子虫病，尚未研发出有效的药物和疫苗。掌握奶牛贾第虫和隐孢子虫的感染情况、流行特点及种/基因型分布等可为防控奶牛贾第虫病和隐孢子虫病提供基本依据。本研究选择了甘肃省和宁夏回族自治区3个地市的19个奶牛场，于2012年11月至2014年03月采集了不同年龄阶段的奶牛的粪便样品，对奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况进行调查研究，并对贾第虫和隐孢子虫分离株进行分子鉴定和基因分型研究。1.采用福尔马林-乙酸乙酯沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法等方法对采集到的2945份奶牛粪便样品进行显微镜检测，并采用分子生物学方法对镜检为阳性样品及疑似阳性样品进行检测。结果表明，107份样品呈贾第虫阳性的，隐孢子虫阳性样品为150份，贾第虫和隐孢子虫感染率分别为3.63%和5.09%；贾第虫在春季的感染率最高，为5.79%，而隐孢子虫则在秋季感染率最高，为6.96%；在年龄方面，3月龄及以下的奶牛的贾第虫和隐孢子虫感染率最高，分别为10.45%和14.01%。2.为掌握奶牛贾第虫的遗传特征，通过对107个贾第虫分离株进行分子鉴定，采用巢式PCR方法特异性扩增TPI基因，测定序列，并在NCBI核酸序列数据库上进行Blast检索，应用ClustalX软件比对序列以及应用Mega软件构建分子进化树，以期阐明所分离的贾第虫种类和基因型关系。结果表明：PCR扩增产物片段大小为530bp，与预期结果相一致。进化树分析结果显示107个分离株均为肠贾第虫（Giardiaintestinalis），但序列之间存在差异性，其中1个分离株属于聚集体A，106个分离株属于聚集体E。3.同样，对隐孢子虫分离株进行分子生物学方法鉴定，采用PCR方法扩增SSUrRNA基因，并对所得序列进行测序和比对分析。PCR扩增结果显示目的片段大小为830bp。序列分析发现在150份奶牛粪便样品中分离到36株为安氏隐孢子虫（Cryptosporidiumandersoni），24株为芮氏隐孢子虫（Cryptosporidiumryanae），70株为牛隐孢子虫（Cryptosporidiumbovis）和20株为微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum），其中以C.bovis感染率最高。4.此外，利用MLST技术对奶牛C.andersoni分离株进行亚型分析。20个分离株被成功分型，主要为2个MLST亚型，即A4，A4，A4，A1和A5，A4，A2，A1。甘肃省奶牛C.andersoni的遗传多样性较宁夏回族自治区更为明显。I 综上所述，本次对西北部分地区奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况调查显示感染主要以犊牛（3月龄及以下）为主，但感染季节存在差异性，贾第虫以春季感染为主，而隐孢子虫以秋季感染为主。隐孢子虫感染主要以C.bovis最为常见，且C.andersoni具有遗传多样性特征；感染奶牛的贾第虫则以G.intestinalis为主。推测主要因幼年动物免疫系统不健全等原因，其抗贾第虫和隐孢子虫能力相对较弱。应加强对上述疾病的防治。关键词：奶牛，贾第虫，隐孢子虫，流行病学调查，基因型II AbstractAstheimportantzoonoticprotozoanparasites,GiardiaandCryptosporidiumcaninfecthumanandanimalsthroughcontactingdirectlyoringestingthecontaminatedfoodandwater,anditcanthreatentohumanhealthandresultinsignificanteconomiclossestohusbandry.Nowadays,thereisnoeffectivedrugorvaccinetocontrolgiardiasisandcryptosporidiosis,hence,toinvestigatetheprevalenceandgenotypedistributionofGiardiaandCryptosporidiumwillprovidebasisforpreventionandtreatment.Inthestudy,thefecalsamplesofdifferentagestagesfrom19dairyfarms,inthreeadministrativeregionsinGansuprovinceandNingxiaHuiAutonomousRegion,werecollectedfromNovember2012toMarch2014,andtheaimwastoclarifytheprevalenceandthemolecularcharacteristicsofGiardiaandCryptosporidium.1.Atotalof2945fecalsamplesfromdairycattlewereexaminedbyusingformalin-ethylacetateprecipitation,Lugoliodinestainingandsaturatedsucrosesolutionfloatmethod,andthepositivesamplesandsuspectedpositivesamplesweredeterminedbymolecularbiologytechniques.TheresultindicatedthatGiardiacouldbefoundfrom107fecalsamples,andCryptosporidiumfrom150fecalsamples.TheinfectionrateofGiardiaandCryptosporidiumwas3.63%and5.09%respectively,thehighestprevalenceofGiardiawas5.79%inspring,whilethehighestprevalenceofCryptosporidiumwas6.96%inautumn;intermsofage,dairycattlein0-3monthsagegrouphadhighestinfectionrateofGiardiaandCryptosporidium,whichwas10.45%and14.01%,respectively.2.InordertograspthegeneticcharacteristicsofGiardia,thenestedPCRmethodwasappliedtodetectTPIgenefrom107Giardiaisolates,sequencingwastaken,meanwhilethesequenceanalysiswasmadebyBlastinNCBIanditsphylogenetictreealsowasconstructedbyMegasoftware.Theresultshowedthatthetargetgenewassuccessfullyamplifiedabout530bpfromthedetectedsamplaes,107GiardiaisolateswereallGiardiaintestinalis,butthedifferencesexistedingene-type,oneisolatewasassemblageA,other106isolateswereassemblageEamongthem.3.TheSSUrRNAgeneofCryptosporidiumwasanalyzedfrom150isolates,andsequencinganditsalignmentalsowastaken.Theresultshowedthattheaimgenewasfoundabout830bpaccordingtotheexpected,36isolateswereidentifiedasC.andersoni,24isolateswereC.ryanae,70isolateswereC.bovisand20isolateswereC.parvum.Intheprevalence,C.boviswasthehighest.4.Additionally,thesubtypeofC.andersoniisolateswasanalyzedbyMLSTIII technique.Theresultindicatedthat2MLSTsubtypesweresuccessfullytypedfrom20isolates,involvinginsubtypeofA4,A4,A4,A1andA5,A4,A2,A1,andthegeneticpolymorphismofcow-borneC.andersoniinGansuprovincewasmoreobviousthanthatofNingxiaHuiAutonomousRegion.Insummary,calvesweremoreeasilyinfectedbyGiardiaandCryptosporidiuminnorthwestChina,butthedifferencesexistedindifferentseasons,theprevalenceofGiardiawashighestinspring,whileCryptosporidiuminautumn.C.bovisandG.intestinaliswerethemostfrequentindairycattle,andC.andersonihadthecharacteristicofgeneticdiversity.ThesuppositionwasmadethatcalveswaseasiertobeinfectedbyGiardiaandCryptosporidiumforlackingofintegratedimmunesystem.Theconclusioncouldbemadethatitshouldstrengthenthepreventionandtreatmentofgiardiasisandcryptosporidiosis.Keywords:Dairycattle,Giardia,Cryptosporidium,Eidemiologicalsurvey,GenotypeIV 目录摘要......................................................................................................................................IAbstract................................................................................................................................III图表目录..........................................................................................................................VIII主要英文缩写.................................................................................................................VIIII文献综述...............................................................................................................................1引言...................................................................................................................................101材料与方法.....................................................................................................................121.1材料.......................................................................................................................121.1.1样品来源.....................................................................................................121.1.2主要仪器设备.............................................................................................121.1.3主要试剂.....................................................................................................121.1.4溶液配制.....................................................................................................121.2方法.......................................................................................................................131.2.1形态学检查.................................................................................................131.2.2隐孢子虫卵囊的分离与纯化.....................................................................141.2.3DNA提取....................................................................................................141.2.4贾第虫和隐孢子虫的分子鉴定.................................................................141.2.5C.andersoniMLST分析.............................................................................161.2.6PCR扩增产物检测......................................................................................171.2.7PCR扩增产物测序及种系发育分析..........................................................171.2.8基因序列提交.............................................................................................181.2.9数据统计与分析.........................................................................................182结果与分析.....................................................................................................................192.1贾第虫和隐孢子虫检测结果................................................................................192.1.1贾第虫和隐孢子虫形态学结果.................................................................192.1.2贾第虫和隐孢子虫流行病学统计结果.....................................................202.2贾第虫和隐孢子虫PCR扩增结果......................................................................222.2.1贾第虫PCR扩增结果................................................................................222.2.2隐孢子虫PCR扩增结果............................................................................232.3种系发育分析.......................................................................................................242.3.1贾第虫种系发育分析.................................................................................242.3.2隐孢子虫种系发育分析.............................................................................25V 2.4C.andersoniMLST分析结果...............................................................................282.4.1C.andersoniMS1、MS2、MS3和MS16基因PCR扩增结果...............282.4.2C.andersoni多位点序列类型及与年龄、季节关系.................................312.5数据统计分析结果...............................................................................................323讨论.................................................................................................................................333.1贾第虫和隐孢子虫感染情况...............................................................................333.2贾第虫分子分类...................................................................................................333.3隐孢子虫分子分类...............................................................................................343.4C.andersoni亚型分析..........................................................................................34结论...................................................................................................................................36参考文献.............................................................................................................................37致谢.....................................................................................................................................44作者简介.............................................................................................................................45VI 图表目录表1贾第虫种类/聚集体与感染宿主关系........................................................................3表1-1巢式PCR扩增贾第虫TPI基因引物..................................................................15表1-2巢式PCR扩增隐孢子虫SSUrRNA基因引物..................................................16表1-3C.andersoniMLST分型的引物序列..................................................................17图2-1贾第虫形态学观察结果........................................................................................19图2-2饱和蔗糖溶液漂浮法检测隐孢子虫结果............................................................19图2-3改良抗酸染色法检测隐孢子虫结果....................................................................20表2-1甘肃省和宁夏回族自治区不同牛场奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况............21表2-2甘肃省和宁夏回族自治区不同季节和不同年龄段的奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况..................................................................................................................................22图2-4牛源贾第虫分离株TPI基因PCR扩增结果......................................................23图2-5牛源隐孢子虫分离株SSUrRNA基因PCR扩增结果......................................23图2-6基于邻接法构建贾第虫TPI基因系统进化分析................................................25图2-7基于邻接法构建隐孢子虫SSUrRNA基因系统进化分析................................26表2-3甘肃省和宁夏回族自治区不同奶牛场感染隐孢子虫种类情况........................27表2-4甘肃省和宁夏回族自治区不同季节和不同年龄段的奶牛感染隐孢子虫种类情况..........................................................................................................................................28图2-8PCR扩增C.andersoni微卫星位点MS1结果...................................................29图2-9PCR扩增C.andersoni微卫星位点MS2结果...................................................29图2-10PCR扩增C.andersoni微卫星位点MS3结果.................................................30图2-11PCR扩增C.andersoni微卫星位点MS16结果...............................................30表2-5甘肃省和宁夏回族自治区奶牛安氏隐孢子虫亚型与季节和年龄的关系........31VII 主要英文缩写mLMilliliter毫升μlMicroliter微升μmMicrometer微米bpBasepair碱基对gGravitationalacceleration重力加速度gGram克mgMilligram毫克minMinute分钟sSecond秒rpmRevolutionperminute每分钟转数℃Degreecentigrade摄氏度kDaKilo-dalton千道尔顿PBSPhosphate-bufferedsodium磷酸盐缓冲液VIII 文献综述贾第虫病（Giardiasis）和隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由寄生性原虫贾第虫（Giardia）和隐孢子虫（Cryptosporidium）引起的以腹泻为主要临床症状的人兽共患寄生性原虫病，主要通过直接接触或摄入污染的食物和饮水而感染，呈世界性分布[1-3]。奶牛感染贾第虫病和隐孢子虫病会引起食欲下降、消瘦、肉奶产量下降和严重程度不同的胃肠道症状如腹痛、腹泻、消化不良等，甚至会引起死亡。我国是奶牛养殖大国，同时也是贾第虫病和隐孢子虫病严重流行的国家之一，掌握奶牛贾第虫和隐孢子虫的感染情况、流行特点和基因型分布等可为防控奶牛贾第虫病和隐孢子虫病提供基本依据。1贾第虫概述1.1贾第虫研究背景十二指肠贾第鞭毛虫(GiardialambliaStiles，亦称Giardiaintestinalis或Giardiaduodenalis)，又称蓝氏鞭毛贾第虫，简称贾第虫，是一种真核单细胞肠道寄生性原虫，具有鞭毛。在发展中国家，贾第虫被认为是引起传染性腹泻的主要病原，贾第虫[4]病作为人兽共患寄生性原虫病，其危害十分严重。贾第虫病在世界范围内分布广泛，8[5][6]人感染贾第虫的病例高达2.8×10个，每年新增病例近50万个。其具有广泛的宿[7]主范围，包括人类在内的哺乳动物、鸟类、两栖类和啮齿类动物。贾第虫通常引起自限性消化系统疾病，临床症状主要表现为腹痛、腹泻和消瘦等，导致宿主体质下降[8]甚至会引起死亡。而且，无症状的贾第虫病也频繁出现，尤其是在发展中国家更为[9]明显。儿童感染后，除可引起腹泻和吸收障碍，还会引起营养不良，从而导致发育[10-12]滞缓，包括无症状患者。大量资料表明，反刍动物当中，奶牛易感染贾第虫，尤其是免疫功能缺陷的奶牛更易感，如若引发继发感染，则会引起死亡率明显升高。1681年，LeeuwenHoek首次在自己腹泻的粪便中发现了贾第虫，随后在世界范围内逐渐开始增多了对贾第虫的报道。1988～1991年，蒋则孝等调查了我国全国[13]人体感染贾第虫的情况，发现总感染率为2.52%。关于牛感染贾第虫情况，世界上诸多国家如美国、澳大利亚、加拿大、马来西亚和卢旺达等均有相关调查报道，发现[14-18]其感染普遍存在。2006年，肖淑敏等通过运用分子生物学方法首次分离到一[19]株奶牛源贾第虫。经调查发现，贾第虫是奶牛腹泻病的主要病因之一，可导致肉奶产量下降，给畜牧养殖业带来了巨大的经济损失。近年来，贾第虫在奶牛中的普遍流[20-21]行和作为水源污染源潜在地威胁着人类健康，已经受到越来越多的关注。随着社会的进步和经济的发展，人直接或间接接触动物的机会逐渐增多，而宠物和家畜等动物作为贾第虫病的传染源，对人类健康构成潜在的威胁，其危害性和严重性日益凸显。1 1.2贾第虫生物学特征贾第虫发育过程中经历了营养繁殖的滋养体阶段和传播的包囊阶段。滋养体形状似倒置的梨形，两侧对称，一端宽钝，一端细窄，背面隆起，腹面扁平且含有腹吸盘，虫体大小约为9～21μm×5～15μm。中间含2个拟核，无核仁结构。虫体共有4对鞭毛，由基体发出。鲜活虫体可借助鞭毛作翻滚运动。包囊呈卵圆形，囊壁厚，且与虫体之间存在明显间隙，大小约为7.5～9μm×9～13μm。成熟包囊内有4个核，而未成熟的包囊多为2个核。囊内可见轴柱、丝状物和鞭毛等的早期结构。包囊是贾第虫的感染阶段，一经粪便排出便立刻具有传染性。包囊对外界环境具有一定的抵抗性，尤其在低温潮湿的地区可存活数月，且保持传染性，一旦环境污染，可从中迅速地积累[1]。此外，除2%碘酒和3%石碳酸对包囊有较强杀灭作用，一般消毒剂对其不敏感，如次氯酸等均不能有效杀死包囊，据报道，臭氧和紫外照射也可杀灭贾第虫包囊，有[22]望应用于饮用水消毒。贾第虫有着较为简单的生活史。当宿主摄入包囊污染的食物和饮水时，其多在十二指肠内脱囊，形成2个滋养体。虫体吸附肠壁，以二分裂方式进行繁殖。当滋养体落入肠腔到达回肠下段或结肠腔后，可形成包囊，随粪便排出体外，进入下一个循环过程。1.3贾第虫分类不同种属的贾第虫可以感染不同的宿主，包括哺乳动物、两栖类和鸟类等。过去曾基于宿主特异性和形态学特征对贾第虫进行定种，然而，基于其有限的形态学差异和宿主来源，很难对贾第虫进行分类。目前，研究人员给出了6个被普遍接受的有效种，分别为肠贾第虫(G.intestinalis)、敏捷贾第虫(G.agilis)、鹦鹉贾第虫(G.psittaci)、[1]苍鹭贾第虫(G.ardeae)、鼠贾第虫(G.muris)和微小贾第虫(G.microti)。在爬行类动物蜥蜴体内发现了一个独特的种属，类似于G.intestinalis，然而却缺少中体，包囊具[23]有双核，被称为G.varani（见表1）。其中，G.intestinalis是唯一可感染人类的贾第虫，引起人的急性或慢性感染，并[24]常伴有吸收不良综合征，同时也可感染其他哺乳动物，包括宠物和家畜等。过去人[25]们通过异型酶分析将从人体分离到的贾第虫分为2种聚集体（A和B）。通过包括小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因、谷氨酸脱氢酶（gdh）基因、β-贾第素（bg）基因和磷酸丙糖异构酶（TPI）基因等在内的基因分型工具提供的大量的核苷酸序列数据进行系统进化分析，证实了聚集体A与聚集体B的遗传特异性。大量资料表明G.intestinalis是一个复杂的集合体，至少存在8个不同的遗传学基因型聚集体(A-H)，[26-27]而且这些聚集体很多都有不同的宿主。除了可以感染人和多种动物的人兽共患型聚集体A和B，还包括主要感染犬的聚集体C和D，主要感染偶蹄动物的聚集体E，主要感染猫的聚集体F，主要感染啮齿类动物的聚集体G以及感染海洋脊椎动物的聚[28-30]集体H（见表1）。2 1.4贾第虫病诊断1.4.1病原学诊断法病原学诊断法主要采用直接涂片法、沉淀法、卢戈氏碘液染色法等方法处理粪便样品，通过光学显微镜直接观察检测，或者检查病患的十二指肠引流液或活组织，具有确诊意义。该方法易操作，成本低，结果直观，但由于操作者经验不足，或长时间观看显微镜易造成视疲劳，以及贾第虫包囊的排出具有间歇性，导致漏诊的机会较多，[31]漏检率在30%～50%，无症状病患检出率较低，而且光学显微镜诊断无法确定贾第[32]虫的种类或基因型。使用染色方法有助于区分虫体和其它微生物、粪渣和环境杂质等，大大提高了检出率。常用的染色方法包括碘液染色、铁苏木素染色、姬姆萨染色等。电子显微镜可用于鉴定某些贾第虫种类，但并不适用于日常检测。1.4.2免疫学诊断法贾第虫感染可导致宿主体内产生抗贾第虫特异性抗体，通过免疫学方法检测宿主体内贾第虫特异性抗体，或直接检测抗原，从而确诊是否感染贾第虫病。常用免疫学3 方法有荧光抗体试验（IFA）、间接血凝试验（IHA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。免疫学方法相较于病原学诊断方法具有特异性强，灵敏度高，稳定性好等优势。Ganguly等分别采用间接血凝试验和间接荧光抗体试验方法对60名患有急性腹泻的贾第虫病人进行检测，IHA所得阳性率为73.4%，抗体滴度大部分分布在1:64～1:512之间，而IFA所得阳性率为83.3%，抗体滴度多集中于1:8～1:1024，由此可知[33]采用IFA检测贾第虫的灵敏度和特异性要高于IHA。通过使用荧光显微镜和直接荧光抗体（DFA）试验检测粪便涂片和环境样品中的包囊，利用异硫氰酸荧光素结合抗贾第虫单克隆抗体识别包囊表位，其特异性高达99.8%～100%，敏感性为93%～100%。多种酶联免疫测定方法包括ELISAs已经被用于检测粪便样品中的贾第虫抗原，其特异性可达87%～100%，敏感性为63%～100%。此外，免疫学方法具有经济[34]实用性，且方便快捷，可同时检测大量样品，但其同样无法鉴定出贾第虫基因型。1.4.3分子生物学诊断法虽然病原诊断和免疫学诊断可用于诊断贾第虫病，但是却无法有效地鉴定出贾第虫的基因型。随着技术的进步，多种分子生物学技术被用于检测贾第虫和鉴定其种属间的遗传差异，其中主要依靠的是通过特异性扩增一个或多个基因位点的聚合酶链反应（PCR）。PCR等分子鉴定方法的使用提高了我们对于贾第虫的分类学、生物学、生态学、流行病学和遗传学的认识和理解，有助于预防和控制贾第虫病。常用于分类[35][36]的基因有：SSUrRNA基因、TPI基因、gdh基因、α-贾第素基因、bg基因、醛[37]缩酶基因、内含子基因、热休克蛋白-70基因等。通过分析TPI基因序列，可鉴定出贾第虫基因型以及确定虫株间遗传学关系。采用巢式PCR方法对十二指肠贾第鞭毛虫的TPI基因进行扩增，其特异性甚至可高达100%。1.5奶牛贾第虫流行情况一般来说，奶牛主要感染聚集体E，资料显示，奶牛亦可感染聚集体A和B，相比较而言，主要感染聚集体A，而感染聚集体B则较少。在我国，随着贾第虫病对奶牛养殖的危害日益凸显，近些年对贾第虫的报道研究逐渐增多。在东北地区，奶牛贾第虫的感染率为7.64%，聚集体E的流行率为7.31%，聚集体A的流行率为0.33%，[38]且聚集体EXI亚型为东北地区奶牛贾第虫主要感染种类。Wang等报道了河南奶[39]牛贾第虫的感染率为7.2%，且发现贾第虫分离株为聚集体A和聚集体E。Huang等报道了宁夏地区奶牛贾第虫的感染率为2.12%，同时发现贾第虫分离株为聚集体E和[40]聚集体B。在国外，奶牛贾第虫病同样普遍流行。Trout等调查了美国的14个奶牛场的奶[41]牛感染贾第虫的情况，结果发现其平均感染率为36%，Trout等研究还发现美国[42]奶牛犊牛贾第虫分离株87%为聚集体E，其余13%为聚集体A。在西班牙的加利西4 [43]亚地区，奶牛贾第虫感染率为30.1%，其中1～5月龄犊牛感染率最高达56.7%。[44]在挪威，Hamnes等发现6月龄以下的奶牛贾第虫的感染率为49.0%。Coklin等研究加拿大安大略省奶牛贾第虫流行率与分子特征时发现该地区贾第虫的流行率为42.0%，犊牛和怀孕的母牛的感染率比成年牛高，同时发现贾第虫分离株为聚集体B[45][46]（24.5%）和聚集体E（17.5%）。在澳大利亚发现奶牛犊牛贾第虫感染率高达89%。在巴西，通过检测200头奶牛，发现有15头感染贾第虫，感染率为7.5%，其中14[47]个分离株为聚集体E，另外一个为聚集体A。Winkworth等调查新西兰奶牛场人和奶牛贾第虫的感染情况时发现人和奶牛均是聚集体A和聚集体B混合感染，未发[48]现聚集体E的感染情况。此外，在埃及、哥伦比亚、阿根廷等国家均有关于奶牛感染贾第虫的报道。贾第虫病给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失，同时，贾第虫聚集体A型能够感染人类，给人类健康带来潜在的危险，应引起足够的重视。2隐孢子虫概述2.1隐孢子虫研究背景隐孢子虫是一种肠道寄生性原虫，可以感染包括人在内的多种动物，呈世界性分[49][50]布。儿童、免疫功能缺陷患者和未断奶动物更易感。隐孢子虫对于免疫功能健全的宿主，可引起以急性腹泻为主要临床症状的胃肠道疾病，而对于免疫功能缺陷的宿主，其致病性往往是致命的。隐孢子虫卵囊可在适宜的环境中存活很长一段时间，[51]即使少量的卵囊也可致病。奶牛感染隐孢子虫可引起腹泻、腹胀、腹痛性痉挛、厌食、发热等临床症状，导致体质下降，产奶量下降，感染严重者甚至引起死亡。1907年，Tyzzer首次从小鼠体内发现一种寄生性卵囊，命名为鼠隐孢子虫（C.[52]muris）。1912年，Tyzzer又发现了卵囊比C.muris小的微小隐孢子虫（C.parvum）[53][54]。1976年，Meisel等首次报道了人感染隐孢子虫的病例，1979年Lasser等和[55-56]Weisburger等相继分别报道了人感染隐孢子虫的病例。1982年首次报道了关于[57]艾滋病患者感染隐孢子虫从而引发死亡的病例，引起了世界范围内的广泛关注。[58]1993年，在美国，因水源被污染从而导致四十多万人同时感染隐孢子虫病，人们从此开始重视这种肉眼观察不到的寄生性原虫。此后，不断有对隐孢子虫的报道，对于隐孢子虫的认识不断深入。2.2隐孢子虫生物学特征目前，关于隐孢子虫虫种分类仍存在争议，较为认同的观点为18个有效种，它们主要是C.muris、C.parvum、C.hominis、C.andersoni、C.wrairi、C.felis、C.canis、C.suis、C.bovis、C.meleagridis、C.baileyi、C.galli、C.saurophilum、C.serpentis、C.nasorum、C.molnari、C.scophthalmi和C.macropodum。其中人兽共患的隐孢子虫虫种或基因型有9个虫种和2个基因型，主要为C.muris、C.parvum、C.hominis、C.andersoni、C.felis、C.canis、C.suis、C.baileyi和C.meleagridis。5 隐孢子虫的生活史比较清楚，随粪便排出的孢子化卵囊大小约为4μm～6μm，具备感染性。卵囊内含4个裸露的呈月牙状的子孢子和一个大的残体，当其进入宿主的消化道后，会在消化道酶等的作用下通过脱囊而释放出4个子孢子（sporozoite），并在宿主上皮细胞中完成内生发育史。研究表明：隐孢子虫脱囊过程与温度、pH、[59-60]凝集素等呈相关的。体外实验证实若卵囊暴露于唾液、粪便脂肪、丝氨酸蛋白酶[61]抑制剂等时会在一定程度上导致脱囊过程受到抑制。虫体通过外膜反复折叠形成营养器（feeder），与宿主肠上皮细胞接触，在细胞内由宿主肠上皮微绒毛融合而形成的带虫空泡（parasitophorousvacuole）包裹。C.muris不是在细胞浆内形成纳虫泡的，而是在胞浆外完成的，目前仍然不清楚隐孢子虫在肠粘膜中建立这种独特的结构是否[62]为主动入侵过程或被包囊化的。研究表明：卵囊和肠道上皮细胞粘附主要通过抗原[63]表面的N-乙酰-半乳糖胺基团发生作用的。卵囊表面的酸性配体物能够通过空间结构排斥那些妨碍卵囊粘附的固体表面，这种现象可通过蛋白酶K得以缓解，且在这个阶段4个子孢子通过卵囊的缝合线释放出来，最初通过棒状体延伸贴附于作用位点。对粘附因子的研究表明：隐孢子虫的粘附蛋白如PLA2、CSL、TRAP-C1、CP47、GP-900、GP15/40等均与隐孢子虫入侵或粘附相关。尽管诸多因素涉及到隐孢子虫粘附与入侵，业以阐明胆盐、温度、细胞骨架、胞内钙离子等因素在隐孢子虫入侵中起[64-65]到关键作用。2.3隐孢子虫病诊断目前有多种方法可以用于检测人和动物体内的隐孢子虫感染，主要包括组织学检查、粪便检查、免疫学检查和分子生物学检查等。诸如直接或间接免疫荧光染色技术，检测抗原的酶联免疫吸附试验以及检测粪便样品中的隐孢子虫的聚合酶链反应和环[66]介导等温扩增（LAMP）技术等分子生物学方法被广泛应用于诊断方面。2.3.1组织学诊断法组织学诊断法主要包括组织切片法和组织活检法。组织切片法通过取组织器官制成切片，经固定后染色，观察虫体及内部构造。组织活检法通过刮取消化道或呼吸道粘膜，制成涂片，经固定染色后镜检。此法较为简便易行，且准确率高。2.3.2粪便检查通过检测人和动物粪便中是否含有隐孢子虫卵囊，从而达到确诊的目的。目前，粪便检查主要包括集卵法和染色法。集卵法是通过应用物理方法富集粪便中的卵囊，从而便于显微镜观察的一种检测方法。集卵法主要包括沉淀法和漂浮法两种。一般情况下，漂浮法要优于沉淀法，这是因为经漂浮法处理样品后，杂质较少，且卵囊富集程度较高，便于观察和确诊。由于隐孢子虫的卵囊比较小，在光学显微镜下直接观察很难分辨，而辅以染色法检查，将会明显观察到卵囊，从而提高了检出率。常用染色方法有改良抗酸染色法、6 金胺-酚染色法、沙黄-美蓝染色法等。Henricksen等所运用的改良Zeihl-Neelsen抗酸染色法，由于其对比性强，易区分，已被广泛应用与粪便检查。韩范等运用的金胺-酚染色法在显微镜下观察卵囊同样着色明显，特征突出，易于检测。随后韩范等[67]将金胺-酚染色和改良抗酸染色结合起来，很大的提高了卵囊的检出率和准确率。2.3.3免疫学诊断法目前，已建立了多种免疫学方法用于诊断隐孢子虫病，由于其具备特异性强、灵敏度高、稳定性好等优势特点，且操作较为简便，从而得到了广泛的应用。关于隐孢子虫免疫学诊断的方法主要包括免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验、单克隆抗体（McAb）技术等，多为抗原检测或抗体检测。免疫荧光试验通过抗原和抗体特异性结合，发生免疫反应，并在荧光作用下显色从而检测隐孢子虫的存在。Rusnak等通过对比间接免疫荧光法和改良抗酸染色，结[68]果发现IFA的敏感性和特异性分别为100%和97%。IFA检测方法具有较高的灵敏度和特异性，但是IFA成本昂贵、荧光易衰退、耗时长，且必须配备荧光显微镜，从而导致其应用并不广泛。酶联免疫吸附试验具有较高的特异性、敏感性和稳定性，操作简便且易于掌握，可检测多种样品，适用于大量样品的检测与诊断。2.3.4分子生物学诊断法目前用于检测隐孢子虫的分子生物学方法主要包括PCR、核酸分子杂交技术、限制性核酸内切酶片段多态性分析法（RFLP）和随机扩增多态性DNA法（RAPD）等。所有的种属特异性PCR技术仅能检测出隐孢子虫样品中的优势基因型，并不能[69]检测出混合感染的隐孢子虫样品中的每一种基因型。目前用于区分隐孢子虫种/基因型的基因位点主要有SSUrRNA、HSP70、隐孢子虫卵囊壁蛋白（COWP）和肌动[70-72]蛋白（actin），而通过PCR方法扩增SSUrRNA基因位点，常被用于鉴定隐孢[73-75]子虫的种/基因型，这主要是由于SSUrRNA基因存在重复拷贝序列、半保守区和高变异区，能够设计属特异性引物。[76-77][78-79]随着研究的深入，亚型工具如微卫星和小卫星、60kDa糖蛋白（GP60）、[80][81]双链RNA和内转录间隔区-2（ITS-2）被越来越多的用于隐孢子虫种的鉴定和流行病学研究。微卫星和小卫星含有数量不等的碱基对重复序列，DNA在复制过程中由于会出现缺失、突变等从而导致产生的重复序列排列不同或长短不一，产生序列多态性。多位点序列分型（MLST）技术通过分析PCR扩增产物序列，检测目的基因长度多态性和单核苷酸多态性位点的变异，从而准确的对隐孢子虫进行亚型分析。基于此，Feng等建立了微卫星和小卫星的MLST技术，成功的对安氏隐孢子虫（C.andersoni）进[82]行亚型分析。7 2.4牛源隐孢子虫牛源隐孢子虫中最为常见的四种隐孢子虫分别为C.parvum、牛隐孢子虫（C.[83]bovis）、C.andersoni和芮氏隐孢子虫（C.ryanae）。C.parvum于1912年被Tyzzer首次发现。随着深入研究，发现此虫种可感染150多种哺乳动物。C.bovis首次从牛体内分离到，Fayer等根据新的隐孢子虫命名要求[84]将该基因型确立为一个新的虫种。研究发现C.bovis在断奶后的牛体内感染率较高[85]。1985年，C.andersoni被首次发现，由于该虫种的形态特征与Tyzzer之前描述的[86]C.muris极其相似，因此被错误的命名为C.muris。Lindsay等通过研究其动物感[87]染试验和分析其分子特征发现该虫种与C.muris不同，并命名为C.andersoni。2002年，Xiao等在牛体内首次发现C.ryanae；2008年，Fayer等通过分析SSUrRNA、HSP70和actin基因位点，发现该虫种是一个新的隐孢子虫种，并将其命名为C.[88]ryanae。2.5奶牛隐孢子虫流行情况隐孢子虫的感染呈世界性分布。在中国，周圣文等人于1985年首次报道奶牛犊牛隐孢子虫病，从哈尔滨、齐齐哈尔、佳木斯和富裕县12个奶牛场的腹泻犊牛中[89]采集了33份粪样，共检出27份隐孢子虫卵囊阳性粪样，阳性率高达81.81%。徐文龙等通过对安徽境内4个奶牛场进行隐孢子虫感染情况调查，结果在26头奶牛粪样中发现隐孢子虫卵囊，感染率为5.18%（26/502），经鉴定为C.muris和C.[90]parvum。在江苏南京地区，陈甫等通过运用改良抗酸染色法对采集到的奶牛粪[91]便样品进行隐孢子虫卵囊检测，阳性率为17.80%。江河等报道了广西南部7个[92]奶牛场的隐孢子虫的平均感染率为8.16%，其中1岁龄以上奶牛感染率较高。陈莉等调查了山东烟台部分地区奶牛感染隐孢子虫的情况，从4个地区6个奶牛场共采集565份新鲜粪样，采用实时荧光定量聚合酶链反应进行检测，结果显示隐孢子虫总感染率为10.44%，其中腹泻奶牛的感染率为20.13%，犊牛感染率较高，春季和冬季[93]为多发季节。在我国西北的宁夏回族自治区，1366份奶牛粪样被采集用于检测隐孢子虫卵囊，结果显示总体感染率为1.61%，经鉴定为C.parvum、C.bovis和C.[40]andersoni。在国外，关于奶牛隐孢子虫病的报道也有很多。Mahfouz等检测采集于埃及谢赫省的1697份奶牛粪便，发现隐孢子虫总的感染率为7.07%，且为C.parvum、C.bovis、[94]C.andersoni和C.ryanae。在捷克共和国，通过检测6月龄以上（含6月龄）的995[95]份奶牛粪便样品，共发现1份C.parvum，2份C.bovis和41份C.andersoni。应用SSUrRNA基因检测瑞典某牛场176份奶牛隐孢子虫阳性粪便，成功分离到15份[96]C.parvum、83份C.bovis和10份C.ryanae。此外，在澳大利亚、美国、中南美洲等地区均有隐孢子虫病流行。作为危害严重的人兽共患寄生虫，同时作为艾滋病怀疑8 指标的隐孢子虫，应当受到人们足够的重视。3结语贾第虫和隐孢子虫感染不仅给奶牛带来严重的损害，造成巨大的经济损失，同时还严重威胁着人类的健康。因此，全面调查贾第虫和隐孢子虫感染情况，并不断深入研究其基因型和遗传特征，为更好的了解和防控人兽共患贾第虫病和隐孢子虫病提供依据。同时为防控由动物源贾第虫和隐孢子虫引起的水资源污染也提供基本借鉴。9 引言奶牛养殖业在世界范围内有着重要的农业和经济地位。地处我国西北地区的甘肃省和宁夏回族自治区，奶牛养殖业在农村经济发展中占有重要比重，同时也是保障农民收入的重要手段。随着奶牛养殖业的飞速发展，贾第虫病和隐孢子虫病的危害也日益凸显。由于其广泛的传播途径，严重损害动物的健康，同时也潜在地威胁到人类。研究表明奶牛感染后会出现腹痛、腹泻、消瘦等临床症状，肉奶产量下降，严重感染者甚至会导致死亡，给养殖业带来极大的经济损失。作为机会性致病肠道寄生性原虫，贾第虫呈世界性分布，且具有广泛的宿主范围，临床症状主要表现为腹泻和发育障碍等。截止目前为止可分为6个种，分别为：主要感染包括人在内的大多数哺乳动物的G.intestinalis，主要感染爬行动物的G.agilis，主要感染鸟类的G.psittaci和G.ardeae，主要感染啮齿类动物的G.muris和G.microti。其中，只有G.intestinalis可感染人。常规的显微镜检测方法及免疫学检测方法虽可鉴别出虫体，并不能够区别其基因型。分子生物学技术可扩增出贾第虫特定基因片段的序列，通过比对分析其差异性来确定其种/基因型。大量资料表明，G.intestinalis是一个复杂的集合体，包括8种聚集体A-H，且各聚集体间仅存在微小的形态差异。以上的分类主要基于TPI基因、SSUrRNA基因和gdh基因等基因分型工具。而隐孢子虫也是一种重要的胃肠道寄生原虫，具有广泛的宿主范围，包括人类在内的哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行类等。宿主免疫功能健全，感染后多表现为腹泻，[97]当免疫力下降或免疫缺陷时则引发继发感染，常引起死亡。分子生物学技术的发展为隐孢子虫种/基因型的鉴定提供可能，目前，SSUrRNA基因的应用最为广泛。大量国内外报道表明隐孢子虫在奶牛中的感染较为普遍。分子研究进一步表明，奶牛中最为常见的四种隐孢子虫分别为C.parvum、C.bovis、C.andersoni和C.ryanae。其中，未断奶犊牛多感染C.parvum，断奶犊牛多感染C.bovis和C.ryanae，而C.andersoni则较长见于青壮年牛和成年牛。作为重要的人兽共患寄生虫病，对贾第虫和隐孢子虫的深入研究可为有效地防治上述疾病的发生，同时其在公共卫生学中也具有重要意义。随着对人兽共患的隐孢子虫病的深入研究，许多分子诊断工具用于分析隐孢子虫的基因型，且亚型分析工具也得到了发展，从最初的粘附蛋白GP60基因，到后来的多位点序列分型技术。MLST技术通过分析PCR扩增产物序列，检测目的基因长度多态性和单核苷酸多态性位点的变异，从而准确的对隐孢子虫进行亚型分析。甘肃省和宁夏回族自治区奶牛存栏量居全国前列，并已成为重要的奶源基地，了解和掌握该地区奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况、流行特点和基因型分布已十分必要。本研究选择了当地3个地市的19个奶牛场，于2012年11月至2014年3月对奶10 [98]牛贾第虫和隐孢子虫感染情况进行调查研究，并应用Sulaiman等建立的基于TPI[99]基因的巢式PCR方法对贾第虫分离株进行基因分型及参照Xiao等建立的根据隐孢子虫SSUrRNA基因巢式PCR检测方法对隐孢子虫分离株进行种、基因型鉴定，以阐明不同地区、不同季节和不同年龄奶牛感染贾第虫和隐孢子虫情况以及优势虫种和基因型特征。采用MLST技术对来自甘肃省和宁夏回族自治区的奶牛源C.andersoni进行多位点亚型分型，为对进一步理解隐孢子虫的遗传特征提供理论依据，也为病原体溯源工作提供基本手段。11 1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源2012年11月至2014年3月，在宁夏回族自治区吴忠市（1278份）、青铜峡市（410份）和甘肃省榆中县（1257份）3个地市的19个奶牛场共采集了2945份荷斯坦奶牛的新鲜粪便样品。其中春季、夏季、秋季和冬季各采集样品639份、695份、733份和878份，且小于等于3月龄未断奶犊牛样品871份，4-12月龄断奶犊牛样品1132份，13-24月龄奶牛样品308份，以及大于24月龄成年奶牛样品634份。采集样品的同时标记好每份样品对应的地点、年龄和时间等相关信息，然后置于4℃冰箱保存、待检。1.1.2主要仪器设备D90数码相机，日本尼康公司H1650高速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司CH20光学显微镜，日本奥林巴斯公司QL-901旋涡混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂立式蒸汽灭菌器LS-C35L型，北京博峰天成科技有限公司JJ300电子天平（300g/10mg），杭州汇尔仪器设备有限公司HH-W600数显三用恒温水箱，广州市深华生物技术有限公司小型号离心机，SIGMA中国有限公司微量取液器（2µL/10µL/100µL/1000µL），德国EppendorfBIO-RADPCR仪，美国BIO-RAD公司恒压恒流DF-D11型电泳仪，北京东方特力科贸中心BIO-RAD电泳系统，美国BIO-RAD公司凝胶图象分析系统，英国UVITEC公司1.1.3主要试剂碘（I2），碘化钾（KI），蔗糖，磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O），重铬酸钾（K2Cr2O7），碱性复红，孔雀绿，乙酸乙酯，苯酚，甲醛，95%乙醇，浓硫酸。E.Z.N.A.StoolDNAKit，购置美国OMEGA公司含dNTP的rTqDNA聚合酶，购置日本Takara公司DL2000DNAMarker，购置日本Takara公司1.1.4溶液配制碘液：称取13gI2和35gKI，溶于100mL蒸馏水中，稀释定容至1000mL，摇12 匀，贮存于棕色瓶中。10%中性福尔马林：称取6.5gNa2HPO4和4gNaH2PO4·H2O，加入100mL40%甲醛和900mL蒸馏水，混匀，备用。饱和蔗糖溶液：称取蔗糖500g加入到320mL蒸馏水中，加热搅拌，至蔗糖完全溶解，冷却，备用。改良抗酸染色液Ⅰ：苯酚8ml，95%乙醇20ml，碱性复红4g，dH2O100ml；改良抗酸染色液Ⅱ：浓硫酸10ml，dH2O90ml；改良抗酸染色液Ⅲ：孔雀绿2g，dH2O100ml。0.2mol/LPBS缓冲液：称取NaH2PO4.2H2O3.9g，Na2HPO4.12H2O73.1g，用蒸馏水溶解，最后定容至500mL。1:2蔗糖梯度液：将300mL饱和蔗糖溶液与600mL0.2mol/LPBS溶液混匀，再加入9mLTween-80，保存于4℃冰箱。l:4蔗糖梯度液：将200mL饱和蔗糖溶液与600mL0.2mol/LPBS溶液混匀后，再加入9mLTween-80，保存于4℃冰箱。2.5%重铬酸钾溶液：称取K2Cr2O72.5g，加入100mL蒸馏水，搅拌至完全溶解，备用。1.2方法1.2.1形态学检查对于未断奶犊牛粪便样品，可先用10%中性福尔马林-乙酸乙酯沉淀法进行脱脂，然后再使用卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法进行镜检；成年奶牛粪便样品则不需要脱脂。1.2.1.1福尔马林-乙酸乙酯沉淀法称取犊牛粪样约5g于烧杯中，加入30mL10%中性福尔马林溶液，捣碎并搅拌均匀，经80目粪筛过滤至50mL离心管中，配平，3000r/min离心5min，弃上清，向沉淀加入10%中性福尔马林溶液35mL，搅拌均匀，再加入乙酸乙酯15mL，颠倒离心管数次，使其充分混匀，3000r/min离心5min，弃上清和脂肪，以达到脱脂目的。1.2.1.2卢戈氏碘液染色法取载玻片，先在上面分别对应粪样进行编号，后滴加卢戈氏碘液，将适量通过福尔马林-乙酸乙酯沉淀法获得的粪样凃于载玻片上并与卢戈氏碘液混匀，盖上盖玻片用于显微镜观察。1.2.1.3饱和蔗糖溶液漂浮法称取粪样约5g于烧杯中，加30mL蒸馏水，捣碎并搅拌均匀，经80目粪筛过滤至50mL离心管中，配平，3000r/min离心5min，弃上清，后加入30mL饱和蔗13 糖溶液，充分搅拌均匀，3000r/min离心5min，用吊环蘸取表面液膜于载玻片上，盖上盖玻片后用于显微镜观察。1.2.1.4改良抗酸染色法称取粪样约5g于烧杯中，加5倍自来水搅匀，分别用60目、100目和160目铜筛过滤，将滤液涂片，甲醇固定，以改良抗酸染色法染色，在400倍镜下检查。改良抗酸染色法的步骤：滴加改良抗酸染色一液于已经固定的滤液膜上12min，后水洗；滴加改良抗酸染色二液，4min，水洗；滴加改良抗酸染色三液，1min，水洗。自然干燥，400倍镜下检查。镜检时，如若发现贾第虫包囊和隐孢子虫卵囊及疑似阳性粪便样品，需经沉淀法将过筛离心后的沉淀物用2.5%重铬酸钾溶液保存，置于4℃冰箱保存备用。1.2.2隐孢子虫卵囊的分离与纯化1.2.2.1分离镜检为隐孢子虫阳性或疑为阳性的粪样用自来水稀释并混匀，依次采用60、100和160目铜筛过滤后自然沉淀过夜，小心弃上清。将沉淀转移到适当离心管中，1000×g离心10min，弃上清。将沉淀与蔗糖漂浮液按3:7的比例混匀，1500×g离心20min。小心将上层糖液倒入另一离心管中，加入10~20倍体积蒸馏水，混匀后2000×g离心10min，再重复洗涤两次，最后将沉淀物保存到2.5%重铬酸钾溶液中。1.2.2.2纯化将保存在2.5%重铬酸钾溶液中的卵囊经PBS缓冲液洗涤三次。取10mL玻璃离心管，先加入3.5mL1:2蔗糖梯度液，再沿壁缓缓加入3.5mL1:4蔗糖梯度液，最后沿壁缓缓加入分离出的隐孢子虫卵囊悬液3mL，1500×g离心15min，然后用吸管轻轻吸出1:2与1:4蔗糖梯度液之间的灰白色带至另一个干净离心管中，加10倍体积PBS缓冲液，混匀后2000×g离心10min，弃上清。沉淀再用PBS缓冲液洗涤离心3次，最后沉淀物用适量2.5%重铬酸钾液稀释，4℃保存备用。1.2.3DNA提取1.2.3.1阳性样品处理在对重铬酸钾保存的阳性样品进行DNA提取之前应先用蒸馏水洗涤3～5次悬液，以避免重铬酸钾对DNA提取产生影响。1.2.3.2DNA提取步骤DNA提取步骤参考E.Z.N.A.StoolDNAKit说明。1.2.4贾第虫和隐孢子虫的分子鉴定1.2.4.1贾第虫种/基因型鉴定参照Sulaiman等建立的基于贾第虫TPI基因的巢式PCR检测方法对本研究中的镜检为贾第虫阳性样品或疑似阳性样品进行鉴定。14 应用巢式PCR检测方法扩增TPI基因，其引物见表1-1。反应体系如下：第一轮PCR反应：第二轮PCR反应：15 PCR反应前，应先将PCR反应体系涡旋混匀，并用掌式离心机短暂离心，再置于PCR仪中按照反应程序进行反应。反应程序如下：1.2.4.2隐孢子虫种/基因型鉴定参照Xiao等建立的依据隐孢子虫SSUrRNA基因巢式PCR检测方法对本研究中的镜检为隐孢子虫阳性样品或疑似阳性样品进行鉴定。应用巢式PCR检测方法扩增SSUrRNA基因，其引物见表1-2。反应体系参见1.2.4.1。反应程序如下：1.2.5C.andersoniMLST分析参照Feng等建立的多位点序列分型方法分析本研究所获得的奶牛源C.andersoni分离株的小卫星基因位点MS1、MS2、MS3和MS16，上述4个小卫星位16 点的引物及退火温度见表1-3，反应体系参见1.2.4.1。巢式PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s，退火温度X℃（X值根据表1-3中退火温度设定）45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。1.2.6PCR扩增产物检测取3μLPCR扩增产物使用含溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶检测，使用英国UVITEC公司生产的紫外凝胶成像仪。1.2.7PCR扩增产物测序及种系发育分析通过琼脂糖凝胶电泳检测，将含有目的条带的第二轮PCR扩增产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。对测序获得的核苷酸序列使用ClustalX1.83软件进行比对，对照比对结果与图谱，校正核苷酸序列，获得准确序列。在NCBI上使用BLAST检索，下载参照序列。使用Mega5.0软件邻接法构建种系发育进化树；进化树的可靠性用1000个重复的bootstrap分析，应用大于95%作为bootstrap分析显著。17 1.2.8基因序列提交将测序获得的贾第虫和隐孢子虫的基因序列提交至GenBank数据库。1.2.9数据统计与分析运用SPSS软件二元逻辑斯特回归方法对数据进行统计分析，判断贾第虫和隐孢子虫的感染率与地区、年龄和季节这些风险因素有无直接关系。18 2结果与分析2.1贾第虫和隐孢子虫检测结果2.1.1贾第虫和隐孢子虫形态学结果2.1.1.1贾第虫形态特征贾第虫包囊呈椭圆形或卵圆形，囊壁较厚，囊壁和虫体间有明显间隙。成熟包囊含有4个核，而未成熟的包囊仅有2个核。囊内可见丝状物、轴柱和鞭毛等的早期结构，大小约为7.5～9μm×9～13μm（图2-1A）。而发现的滋养体呈梨形，一端窄，一端顿，可明显发现4根鞭毛，中间含2个拟核（图2-1B）。AB图2-1贾第虫形态学观察结果（400×）注：A：包囊；B：滋养体Fig.2-1MorphologicalobservationsofGiardia（400×）Note：A:oocyst;B:trophczoite2.1.1.2隐孢子虫卵囊形态特征由图2-2可以看出，经饱和蔗糖溶液漂浮法后，可观察到隐孢子虫卵囊呈椭圆形或圆形，大小约为6μm×8μm，单层壁，且较光滑，成熟的卵囊内含有4个呈月牙形的裸露的子孢子和1个残留体。图2-2饱和蔗糖溶液漂浮法检测隐孢子虫结果（400×）Fig.2-2DeterminationofCryptosporidiumoocystsbysaturatedsucrosesolutionfloatmethod(400×)19 由图2-3可以看出通过改良抗酸染色法观察到的隐孢子虫卵囊为椭圆形或卵圆形，壁薄，呈玫瑰红色，染色背景呈蓝绿色。囊壁外周多有无色透明折光环带。卵囊内有4个香蕉形结构的子孢子，还有一团暗黑色颗粒状的残体。子孢子一般周围深染，中央淡染，无孢子囊。图2-3改良抗酸染色法检测隐孢子虫结果（400×）Fig.2-3DeterminationofCryptosporidiumoocystsbymodifiedacid-faststainmethod(400×)2.1.2贾第虫和隐孢子虫流行病学统计结果2.1.2.1地区分布显微镜检查结果显示（表2-1），甘肃省和宁夏回族自治区奶牛都存在贾第虫和隐孢子虫感染。其中，宁夏6个奶牛场均存在贾第虫感染，5个奶牛场感染隐孢子虫，畜群感染率均高于甘肃，但感染率最高的奶牛场均在甘肃。表2-2显示宁夏奶牛贾第虫和隐孢子虫的感染率分别为4.38%和5.45%，且分别高于甘肃的2.63%和4.61%。2.1.2.2季节分布由表2-2可见，在四个季节中都检测到贾第虫和隐孢子虫。其中，在四个季节中，贾第虫的感染率以春季最高，达5.79%，而冬季最低，仅为1.94%；隐孢子虫秋季的感染率为6.96%，为四季当中最高，夏季的感染率仅次于秋季为6.48%，冬季的感染率最低为3.07%。2.1.2.3年龄分布由表2-2可以看出，在所有年龄段均可检出隐孢子虫，在大于24月龄的奶牛中未检到贾第虫。对于奶牛而言，贾第虫和隐孢子虫在3月龄及以下的奶牛中感染率最高，分别为10.45%和14.01%。20 表2-1甘肃省和宁夏回族自治区不同牛场奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况Table2-1PrevalenceofGiardiaandCryptosporidiumfromdairycattleindifferentdairyfarmsinGansuprovinceandNingxiaHuiAutonomousRegion(NXHAR)贾第虫阳性数/感染率隐孢子虫阳性数/感染率地区奶牛场样品总数No.positiveGiardiaNo.positiveCryptosporidiumRegionFarmNo.samplesize(Infectiverate)(Infectiverate)12031(0.49%)0宁夏青铜峡Qingtongxia22079(4.35%)7(3.38%)331213(4.17%)11(3.53%)432823(7.01%)28(8.54%)宁夏吴忠Wuzhong53128(2.56%)6(1.92%)632620(6.13%)40(12.27%)72305(2.17%)11(4.78%)84200916403(1.83%)1016812(7.14%)27(16.07%)1147001217904(2.23%)甘肃榆中1314700Yuzhong14681(1.47%)2(2.94%)15461(2.17%)016270017244(16.67%)2(8.33%)18915(5.49%)6(6.59%)19245(20.83%)3(12.50%)合计Total2945107(3.63%)150(5.09%)21 表2-2甘肃省和宁夏回族自治区不同季节和不同年龄段的奶牛贾第虫和隐孢子虫感染情况Table2-2PrevalenceofGiardiaandCryptosporidiumfromdairycattleinGansuprovinceandNXHARatdifferentseasonsandages贾第虫阳性数/感染率隐孢子虫阳性数/感染率因素分类样品总数No.positiveGiardiaNo.positiveCryptosporidiumFactorCategoryNo.samplesize(Infectiverate)(Infectiverate)甘肃Gansu125733(2.63%)58(4.61%)地区Region宁夏Ningxia168874(4.38%)92(5.45%)春季Spring63937(5.79%)27(4.23%)夏季Summer69534(4.89%)45(6.48%)季节Season秋季Autumn73319(2.59%)51(6.96%)冬季Winter87817(1.94%)27(3.07%)≤3月87191(10.45%)122(14.01%)≤3months4-12月113215(1.33%)22(1.94%)4-12months年龄Age13-24月3081(0.32%)1(0.32%)13-24months>24月63405(0.79%)>24months合计2945107(3.63%)150(5.09%)Total2.2贾第虫和隐孢子虫PCR扩增结果2.2.1贾第虫PCR扩增结果对镜检为贾第虫阳性或疑似阳性的奶牛粪便样品采用PCR方法检测TPI基因，成功地从107份样本中扩增出目的基因，其大小为530bp，与预期结果相一致（见图2-4）。22 2.2.2隐孢子虫PCR扩增结果对镜检为隐孢子虫阳性或疑似阳性的奶牛粪便样品采用PCR方法检测SSUrRNA基因，成功地从150份样本中扩增出目的基因，其大小为830bp，与预期结果相一致（见图2-5）。23 2.3种系发育分析2.3.1贾第虫种系发育分析2.3.1.1贾第虫种系发育树构建应用巢式PCR方法共扩增出107个牛源贾第虫样品的TPI基因，片段大小约为530bp，对其测定序列，且测序获得的TPI基因序列已经提交至GenBank数据库，登录号分别为KM267534，KM267535，KM267537-KM267541和KM267555。通过进行序列分析和从GenBank下载参考序列构建种系发育关系进化树。根据种系分析软件邻接法（NJ）构建的进化树表明：甘肃、宁夏地区牛源贾第虫分离株属于肠贾第虫，形成了2个主要的分枝：聚集体A（编号KM267555）和聚集体E（编号KM267534，KM267535，KM267537-KM267541）。分离获得的1个样品和聚集体A在同一发育枝上，结合序列分析可知为聚集体A，且和聚集体A亚型1在一个分支上，可判断为A1；其余106个样品和聚集体E在同一发育枝上，为聚集体E（见图2-6）。通过序列分析和构建进化树，我们发现所分离的107个甘肃、宁夏地区奶牛贾第虫与肠贾第虫亲缘关系最接近，是同一个种，但属于不同的基因型。从中我们可以得出，在肠贾第虫种内存在不同的基因型或亚型，这种基因型或亚型上的差异很可能与地域差异有关。2.3.1.2贾第虫种类/基因型及分布特征107份奶牛贾第虫分离株被成功扩增出TPI基因的目的片段。在本研究中，所得贾第虫分离株与NCBI核苷酸数据库中已有的牛源贾第虫（GenBank中已报道相关序列号EF654682，EF654683，EF654684，EF654692，EF654693等）均有很高的相似性（>99%），结果显示107份分离株均为肠贾第虫（G.intestinalis）。在基因型分布方面，由表2-1可以看出宁夏地区奶牛场感染贾第虫的情况较为普遍，调查的6个奶牛场均有贾第虫的检出，而感染率最高的奶牛场出现在甘肃榆中地区（20.83%，5/24）。表2-2显示，宁夏地区奶牛贾第虫感染率高于甘肃地区，春季感染率最高，且3月龄及以下奶牛贾第虫感染率最高。24 图2-6基于邻接法构建贾第虫TPI基因系统进化分析（▼表示本研究鉴定的基因型）Fig.2-6Neighbor-Joining(NJ)phylogeneticanalysesofGiardiaintestinalisbasedonTPIgene(Genotypesidentifiedinthisstudyareindicatedby▼)2.3.2隐孢子虫种系发育分析2.3.2.1隐孢子虫种系发育树构建应用巢式PCR方法共扩增出150个牛源隐孢子虫样品的SSUrRNA基因，片段大小约为830bp，对其测定序列，测序获得的SSUrRNA基因序列已经提交至GenBank数据库，登录号分别为KP994912-KP994919。通过序列分析，并与GenBank参考序列构建种系发育关系进化树。根据种系分析软件邻接法（NJ）构建的进化树表明：甘肃省和宁夏回族自治区牛源隐孢子虫分离株分别属于C.andersoni，C.ryanae，C.parvum和C.bovis，形成了4个主要的分枝。分离获得的36个样品中的隐孢子虫SSUrRNA基因与已报道C.andersoni相关基因（AB777194）在同一发育枝上，由此可认为该虫种（编号25 KP994917-KP994919）为C.andersoni；24个样品和C.ryanae（FJ463193）在同一发育枝上，可认为该虫种为C.ryanae（编号KP994914，KP994915）；70个样品和C.bovis（AB777173）在同一发育枝上，可认为该虫种为C.bovis（编号KP994912，KP994913）；20个样品和C.parvum（AF093493）在同一发育枝上，可认为该虫种为C.parvum（编号KP994916）（见图2-7）。图2-7基于邻接法构建隐孢子虫SSUrRNA基因系统进化分析（▼表示本研究鉴定的基因型）Fig.2-7Neighbor-Joining(NJ)phylogeneticanalysesofCryptosporidiumbasedonSSUrRNAgene(Genotypesidentifiedinthisstudyareindicatedby▼)2.3.2.2隐孢子虫种类/基因型及分布特征150份奶牛隐孢子虫分离株均被成功扩增出SSUrRNA基因的目的片段。在本研究中，隐孢子虫分离株与NCBI核苷酸数据库中已有的牛源隐孢子虫（Genbank中已报道相关序列号FJ463193，AB777173，AF093493，AB777194）有很高的相似性（>99%），结果显示150份分离株分别为C.andersoni，C.ryanae，C.parvum和C.bovis这四种隐孢子虫。由表2-1可以看出甘肃省和宁夏回族自治区不同奶牛场隐孢子虫的感染率为0～16.07%，感染率最高的奶牛场出现在甘肃榆中地区，而从表2-3可以看出大部分的奶牛26 场多为不同种隐孢子虫混合感染。表2-4显示，宁夏地区奶牛隐孢子虫感染率高于甘肃地区，且两地均是4种隐孢子虫混合感染；四个季节中秋季感染率最高为6.96%，其中春季未检出C.parvum，秋季未检出C.andersoni，其它两个季节均检出4种隐孢子虫。同时发现3月龄及以下的奶牛隐孢子虫感染率最高，达14.01%，且小于1岁龄的奶牛混合感染更为普遍。表2-3甘肃省和宁夏回族自治区不同奶牛场感染隐孢子虫种类情况Table2-3InvestigationofCryptosporidiumspeciesfromdifferentdairyfarmsinGansuandNXHAR奶牛场样品数阳性数量感染率（%）隐孢子虫种类（数量）FarmSamplesizeNo.positivePrevalence(%)Cryptosporidiumspecies(no.)1312113.53C.andersoni(2),C.bovis(2),C.parvum(7)2328288.54C.ryanae(10),C.bovis(15),C.parvum(3)320300-420773.38C.andersoni(3),C.ryanae(2),C.bovis(2)531261.92C.bovis(5),C.parvum(1)63264012.27C.andersoni(14),C.ryanae(1),C.bovis(17),C.parvum(8)7230114.78C.andersoni(2),C.ryanae(2),C.bovis(7)84200-916431.83C.ryanae(1),C.bovis(2)101682716.07C.andersoni(4),C.ryanae(6),C.bovis(16),C.parvum(1)114700-1217942.23C.andersoni(4)1314700-146822.94C.bovis(2)154600-162700-172428.33C.andersoni(2)189166.59C.andersoni(4),C.ryanae(1),C.bovis(1)1924312.50C.andersoni(1),C.ryanae(1),C.bovis(1)合计29451505.09C.andersoni(36),C.ryanae(24),C.bovis(70),C.parvum(20)Total27 表2-4甘肃省和宁夏回族自治区不同季节和不同年龄段的奶牛感染隐孢子虫种类情况Table2-4InvestigationofCryptosporidiumspeciesondifferentseasonsandagesinGansuandNXHAR样品数因素分类阳性数量感染率隐孢子虫种类（数量）SampleFactorCategoryNo.positivePrevalence(%)Cryptosporidiumspecies(no.)size甘肃Gansu1257584.61C.andersoni(17),C.ryanae(11),C.bovis(29),C.parvum(1)地区Region宁夏Ningxia1688925.45C.andersoni(19),C.ryanae(13),C.bovis(41),C.parvum(19)春季Spring639274.23C.andersoni(5),C.ryanae(10),C.bovis(12)夏季Summer695456.48C.andersoni(27),C.ryanae(2),C.bovis(10),C.parvum(6)季节Season秋季Autumn733516.96C.ryanae(9),C.bovis(29),C.parvum(13)冬季Winter878273.07C.andersoni(4),C.ryanae(3),C.bovis(19),C.parvum(1)≤3月87112214.01C.andersoni(19),C.ryanae(23),C.bovis(62),C.parvum(18)≤3months4-12月1132221.94C.andersoni(12),C.ryanae(1),C.bovis(7),C.parvum(2)4-12months年龄Age13-24月30810.32C.andersoni(1)13-24months>24月63450.79C.andersoni(4),C.bovis(1)>24months合计Total29451505.09C.andersoni(36),C.ryanae(24),C.bovis(70),C.parvum(20)2.4C.andersoniMLST分析结果2.4.1C.andersoniMS1、MS2、MS3和MS16基因PCR扩增结果对于36份奶牛源C.andersoni分离株来说，27份（W46、W45、L14、L34、K3、K41、K51、W9、W18、W25、W28、W31、W32、W52、W81、FX14、Xing3、Lai5、1013、0927、FX15、FX4、T22、0918、Yong3、Lai6、T2），29份（W61、K3、W46、W32、W52、W25、W31、W2、L14、W18、W81、LN34、K41、K51、W23、W28、W45、W9、FD8、FX14、FX15、Lai5、T2、Lai6、Xing3、FX4、0927、1013、FX13），28份（K41、W32、W61、L34、W45、W52、W28、W2、L14、K51、W23、W46、W18、W25、K3、W9、W31、W81、FD8、FX14、FX15、Lai5、T2、T22、0927、1013、FX4、Lai6）和27份（L14、K51、W2、W18、W25、W28、W32、W52、W61、W81、W31、W23、L34、K3、W9、K41、W46、FD8、FX14、Lai5、T2、Lai6、FX4、1013、0927、Xing3、FX13）分离株分别在MS1、MS2、MS3和MS16四个基因位点上均能成功扩增出目的基因，代表样品在每个基因位点的PCR产物凝胶电泳结果见图2-8，2-9，2-10，2-11。对于C.andersoni微卫星位点MS1、MS2、MS3和MS16基因扩增，目的28 片段大小分别约为550bp、460bp、540bp和590bp，与预期结果相一致，主要重复序列见表1-3。29 30 2.4.2C.andersoni多位点序列类型及与年龄、季节关系从GenBank数据库中分别下载已报道C.andersoniMS1位点基因序列，用于参照序列，它们分别为HM565067-A1，HM565066-A2，JF732837-A3，JF732842-A4，JF732845-A5，JF732846-A6；在MS2基因位点方面，参照序列为HM565078-A1，HM565079-A2，HM565080-A3，JF732854-A4，JF732851-A5；在MS3基因位点方面，参照序列HM565095-A1，HM565097-A2，HM565094-A3，HM565096-A4；在MS16基因位点方面，参照序列HM565086-A1，JF732872-A2。使用ClustalX1.83软件将MS1、MS2、MS3和MS16基因位点测序获得的序列和在GenBank数据库中下载的相关序列进行比对。通过序列比对分析发现奶牛源C.andersoni在MS1、MS2、MS3和MS16基因位点分别具有2（A4、A5），1(A4)，2（A2、A4），1(A1)个亚型，其中20个（L14，K3，K41，K51，W9，W18，W25，W28，W31，W32，W46，W52，W81，FX4，FX14，Lai5，Lai6，T2，1013，0927）奶牛源C.andersoni样品在上述4个小卫星位点均已被成功分型，形成了2个MLST亚型。MLST亚型（A4，A4，A4，A1）来源于18头奶牛（L14，K3，K41，K51，W9，W18，W25，W28，W31，W32，W46，W52，W81，FX4，FX14，Lai5，Lai6，T2）；MLST亚型（A5，A4，A2，A1）来源于2头奶牛（1013，0927）（见表2-5）。表2-5甘肃省和宁夏回族自治区奶牛安氏隐孢子虫亚型与季节和年龄的关系Table2-5TherelationofseasonsandagestoC.andersonigenotypesfromdairycattleinGansuandNXHAR安氏阳性数量因素分类样品数亚型No.subtypesNo.positiveofC.CategorySamplesizeFactorsA4，A4，A4，A1A5，A4，A2，A1andersoni（%）甘肃Gansu125717(1.35)52地区Region宁夏Ningxia168819(1.13)130春季Spring6395(0.78)20夏季Summer69527(3.88)160季节Season秋季Autumn733000冬季Winter8784(0.46)02≤3月≤3months87119(2.18)1004-12月113212(1.06)804-12months年龄Age13-24月13-24months3081(0.32)00>24月6344(0.63)02>24months合计Total294536(1.22)18231 2.5数据统计分析结果所得数据经SPSS软件分析得出奶牛贾第虫的感染与地区、季节和年龄因素均相关（P<0.05），而隐孢子虫的感染仅与地区和年龄因素相关（P<0.05）。32 3讨论3.1贾第虫和隐孢子虫感染情况本次调查宁夏地区（4.38%）奶牛贾第虫的感染率略高于甘肃（2.63%），总体平均[39][41][43]感染率为3.63%，低于河南地区（7.2%）、美国（36%）、西班牙（30.1%）和[45]加拿大（42.0%）的关于奶牛贾第虫感染情况的调查结果，但高于我国宁夏地区报道[40]的（2.12%）奶牛贾第虫的感染率。宁夏地区（5.45%）奶牛隐孢子虫的感染率同样高[90]于甘肃（4.61%），总体平均感染率为5.09%，低于安徽省（5.18%）、山东省（10.44%）[93][91][40]、江苏省（17.80%）等的调查结果，但高于宁夏回族自治区报道的1.61%。这可能是由于地理环境和气候环境不同、饲养管理模式不同、样品采集时间与数量不同以及检测方法不同等因素造成的。在本次调查中，奶牛冬季的贾第虫和隐孢子虫感染率普遍较低，而春秋季节则普遍较高，这是主要由于冬季气温较低，且甘肃和宁夏处于中国西北地区，冬季气候干燥，这都不利于包囊/卵囊的存活，从而使其感染率大大降低；而春秋季节气温温和，雨水充沛，且奶牛活动也较为频繁，这为其传播创造有利条件。贾第虫和隐孢子虫作为机会性原虫，特别对免疫缺陷或免疫功能尚未健全的个体而言，更易感染，且难以清除。本次调查结果来看，3月龄及以下的奶牛中感染率最高，分别为10.45%和14.01%，这可能由于犊牛尚未建立相对健全的免疫系统从而更易受感染，而且奶牛场饲养管理模式、卫生条件、奶牛健康状况以及饲料质量同样也是影响奶牛感染贾第虫和隐孢子虫的重要因素。3.2贾第虫分子分类由于贾第虫的种类比较多，形态学差异不显著，因此很难准确定种。基因分析工具对于贾第虫准确分类来说是不可缺少的，弥补了形态学分类的不足。SSUrRNA基因、醛缩酶基因、TPI基因、gdh基因、bg基因等作为常用的分类基因被广泛应用于贾第虫的分子鉴定。近年来，由于PCR技术的完善、仪器设备的更新，大大地促进了贾第虫分子生物学鉴定的快速发展。聚集体E在牛源贾第虫中较为常见，聚集体A和聚集体B同样也分布较为广泛。目前，肠贾第虫已被分为8个聚集体A-H，研究发现感染牛的只有聚集体A、B和E。在本次调查中，我们从甘肃省和宁夏回族自治区3个地市19个奶牛场中分离到107份牛源贾第虫分离株。基因序列分析表明甘肃和宁夏奶牛贾第虫分离株存在2种基因型，[40]即聚集体A和聚集体E。Huang等先前报道过宁夏地区奶牛感染肠贾第虫的基因型为聚集体B和聚集体E，甘肃地区目前尚未有关于奶牛贾第虫基因型的研究报道。研究表明，聚集体A型为人兽共患型，可在人和动物之间相互传播。本研究发现存在聚集体A型，这就潜在地威胁到当地居民的健康，此发现具有重大的公共卫生意义。本研究同时33 提供了甘肃省和宁夏回族自治区部分奶牛场奶牛感染贾第虫的情况及其基因型分布特征，弥补了当地此项研究的空白，为畜牧生产提供基础数据，具有一定的指导意义。3.3隐孢子虫分子分类隐孢子虫卵囊在环境中普遍存在，可通过直接接触或摄入了被污染的食物和饮水、在被污染的游泳池内游泳等几个途径进行传播。随着分子生物学技术的逐渐发展，被用来研究隐孢子虫的分类，有助于我们更好地理解隐孢子虫，并制定相关的防治措施。目前，SSUrRNA基因被广泛用于检测隐孢子虫的基因型。有研究资料表明，未断奶犊牛体内多见C.parvum、C.bovis、C.andersoni和C.ryanae这四种隐孢子虫。一般而言，C.parvum是断奶前犊牛感染隐孢子虫的优势种类，而在[96]瑞典检测的断奶前犊牛的隐孢子虫优势种是C.bovis。本研究中，对小于等于3月龄的871份奶牛粪样进行检测，有19份为C.andersoni，有23份C.ryanae，62份C.bovis以及18份C.parvum。在1132份4～12月龄犊牛粪便中，共检查到12份C.andersoni，1份C.ryanae，7份C.bovi以及2份C.parvum。这一结果与先前的调查研究结果略有不同，例如，在黑龙江省发现断奶后犊牛主要感染C.andersoni和C.ryanae这两种隐孢子虫，其中C.[100]andersoni优势种；而在伊朗发现C.parvum和C.andersoni，同样C.andersoni为优[101][102]势种；在印度发现C.bovis、C.ryanae、C.andersoni和C.suis-like；而与在美国发现C.bovis、C.ryanae、C.parvum和C.andersoni的调查结果基本一致，且C.bovis[103]是其优势种。本研究在青年牛和成年牛中鉴定出C.andersoni和C.bovis，这一结果与在印度的小[104]母牛及成年牛粪样中检测到C.andersoni和C.bovis的调查结果相一致。但是，在其[100]他地区的青年牛和/或成年牛体内还检测出其它隐孢子虫虫种，例如在中国黑龙江的青年和/或成年奶牛体内仅检测出C.andersoni；在瑞典的青年牛体内检测到C.ryanae、[96]C.andersoni和C.bovis，其中C.bovis感染率最高，在成年牛体内仅发现C.bovis；[104-105]在美国成年牛体内检测到C.ryanae、C.andersoni、C.parvum、C.bovis和C.suis，C.andersoni为优势种。本研究分析发现不同年龄段奶牛感染隐孢子虫的种类存在差异性，且未断奶犊牛的感染率和混合感染情况都较其他年龄分组更为严重，这可能与气候差异、奶牛健康、免疫状况、样本采集数量差异有关，需要更进一步的研究。3.4C.andersoni亚型分析隐孢子虫是一种重要的人兽共患寄生性原虫。基于小卫星基因位点（MS1、MS2、MS3和MS16）的MLST分型技术主要是分析C.andersoni的序列在小卫星位点的重复拷贝数的差异。在本研究中，应用MLST分型技术分析发现奶牛C.andersoni在MS1、MS2、MS3和MS16基因位点分别具有2，1，2，1个亚型，其中20个奶牛C.andersoni34 样品在上述4个位点均已被成功分型，形成了2个MLST亚型，即A4，A4，A4，A1和A5，A4，A2，A1。其中亚型A4，A4，A4，A1是主要的MLST亚型，可从18份奶牛粪样中分离得到。由表2-5可以看出甘肃省奶牛C.andersoni存在本研究发现的2种亚型，而宁夏回族自治区仅发现其中一种亚型，由此得出，甘肃源奶牛C.andersoni的遗传多样性较宁夏回族自治区更明显。奶牛源C.andersoni可能也存在地域性差异。在我国很多省份都有报道奶牛源C.andersoniMLST优势亚型为A4，A4，A4，A1，但也存在许多其它类型。甘肃省和宁夏回族自治区奶牛C.andersoni分离株的优势亚型及其多样性是否存在地区差异还需进一步的分析验证。35 4结论1.对甘肃省和宁夏回族自治区3个地市所采集到的2945份奶牛粪便样品进行检测，发现宁夏地区奶牛贾第虫和隐孢子虫的感染率分别为4.38%和5.45%，分别高于甘肃省的2.63%和4.61%；贾第虫的感染率春季最高为5.79%，而隐孢子虫则在秋季感染率最高，为6.96%；贾第虫和隐孢子虫在3月龄及以下的奶牛中感染率最高，分别为10.45%和14.01%。2.利用分子生物学方法分析了107份贾第虫阳性样品，结果显示全部为肠贾第虫，其中，一株为聚集体A1亚型，其余106株均为聚集体E；对150份隐孢子虫阳性样品鉴定，36份为C.andersoni、24份为C.ryanae、70份为C.bovis及20份为C.parvum，其中犊牛（3月龄及以下）感染隐孢子虫最为严重，优势虫种主要为C.bovis。3.对所分离到的C.andersoni进行基因分型，可确定为2个MLST类型，即A4，A4，A4，A1和A5，A4，A2，A1。并且甘肃奶牛源C.andersoni的遗传多样性较宁夏回族自治区更明显。36 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致谢时光飞逝，转眼间三年的研究生生活就要画上句号，在论文即将截稿之际，特向指导和帮助过我的老师、同学、朋友还有关心支持我的家人致以诚挚的谢意！首先要感谢我的导师徐前明副教授和朱兴全研究员，本论文是在两位老师的悉心指导下完成的，从最初的选题、实验方案、数据结果分析到最后论文的撰写、修改和定稿，无不倾注了两位老师大量的汗水和心血。感谢徐老师和朱老师在这三年里对我学习、生活等各方面的支持和鼓励！感谢两位老师对我的教诲和辛勤培养！老师们严谨的治学态度、渊博的专业知识、开阔敏锐的科研思维和一丝不苟的工作态度将不断激励我在人生道路上奋进，再次致以崇高的敬意和真挚的感谢！感谢动科院的李培英教授、李槿年教授、孙裴教授、王桂军教授、魏建忠教授、李郁教授、刘雪兰副教授等对我三年来学习生涯的教导与帮助。同时向在实验中一直给予我热情帮助和支持的周东辉老师以及刘思嘉、徐颖、刘富、张念章、从伟、张晓轩、周春雪、杨言川、秦思源、殷铭阳、王金磊、倪晓婷、刘文阁、徐晓佩等师兄师姐、同门和师弟师妹们一并表示感谢。衷心感谢我的父母和家人，近二十年的求学生涯，他们一直是我最坚强的后盾，他们的关心、理解与支持推动我不断前进。最后，对百忙中抽出时间审阅本论文的老师，表示由衷的感谢！44 作者简介姓名：谭启东性别：男学历：硕士籍贯：安徽宿州市政治面貌：中共党员出生日期：1991.08.06个人经历：2005.09-2008.06，高中，就读于安徽省宿州市第二中学；2008.09-2012.06，本科，就读于安徽农业大学植物保护学院动植物检疫专业；2012.09-2015.06，硕士研究生，就读于安徽农业大学动物科技学院预防兽医学专业。在读期间发表的学术论文：谭启东，李知新，王晓亮，等.甘肃、宁夏地区奶牛衣原体血清流行病学调查及风险因素分析[J].中国畜牧兽医，2015,42(5)：200-204.XuY,ZhangNZ,TanQD,etal.Evaluationofimmuno-efficacyofanovelDNAvaccineencodingToxoplasmagondiirhoptryprotein38(TgROP38)againstchronictoxoplasmosisinamurinemodel[J].BmcInfectiousDiseases,2014,14:525.45