DB34∕T 4044-2021 布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法 荧光免疫层析法(安徽省)（8页）

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1、ICS11.220CCSB4134安徽省地方标准DB34/T4044—2021布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法荧光免疫层析法TheRapiddetectionmethodsforantibodiestobrucellaThehypersensitivefluorescenceimmunochromatographicassay2021-09-30发布2021-10-30实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T4044—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布

2、机构不承担识别专利的责任。本文件由阜阳市动物疫病预防与控制中心提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：阜阳市动物疫病预防与控制中心、安徽省荷森生物技术有限公司、成都微瑞生物科技有限公司、阜南县动物疫病预防与控制中心、颍上县动物疫病预防与控制中心、颍东区枣庄镇农业综合服务站、庐江县动物疫病预防与控制中心、安徽省质量认证服务中心。本文件主要起草人：高树朋、訾振义、刘雪梅、蔡强、李超、吴雪荷、张明飞、周铜铜、张贺森、高永士、杨琳、李晓辉、陈菁菁。IDB34/T4044—2021布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法荧光免疫层析法1范围本文件规定了布鲁氏杆菌病抗体快速检测荧光免

3、疫层析法的原理、仪器和试剂、样品采集与处理、操作方法、结果分析、生物安全及防污染措施。本文件适用于猪、牛、羊的布鲁氏杆菌病抗体水平的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理荧光免疫层析

4、法（TheHypersensitiveFluorescenceImmunochromatographicAssay，HFIA）快速检测布鲁氏杆菌病抗体，是采用镧系铕（Eu3+）元素荧光纳米微球作荧光示踪物，分别标记布鲁氏杆菌LPS抗原和鸡IgY,并埋置在标记垫内。硝酸纤维素膜上检测线（T）包被布鲁氏杆菌特异性单抗，参考线（C）包被兔抗鸡IgY的IgG。血清样品抗体与埋置在标记垫内标记的布鲁氏杆菌LPS抗原荧光纳米微球反应形成复合物，从而抑制与包被在硝酸纤维素膜上检测线（T）布鲁氏杆菌单抗反应，使检测线（T）荧光信号较弱。其余物质继续向前层析，在C线处包被的“荧光标记鸡Ig

5、Y+兔抗鸡IgY”结合形成免疫结合物。用高敏荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号，根据标准曲线计算得出布鲁氏杆菌病抗体效价。5仪器与试剂5.1仪器5.1.1高敏荧光分析仪：激发波长为(400±20)nm，检测波长为(615±10)nm。5.1.2单道可调移液器：10～100μL,100～1000μL。2DB34/T4044—20215.1.3离心机：转速3000～15000r/min。5.1.4冰箱：2℃～8℃，-20℃。5.2试剂5.2.1实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。5.2.2样品稀释液5.2.2.1成分：十二水磷酸氢二钠2.68g，二水磷酸二氢钠0.44g

6、，叠氮化钠1g，硫酸葡聚糖（MW:40000）5g，硫酸葡聚糖（MW:20000）10g，双蒸水1000mL。5.2.2.2制法：将上述成分溶解混匀后分装，保存于4℃备用。5.2.2.3所用试剂均为分析纯。5.2.3布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡见附录A。6样品采集与处理6.1样品采集按照NY/T541的规定，采集待检猪、牛、羊血液样品3～5mL/份。6.2样品处理血液样品用离心机3000r/min离心3min，血清量不少于500μL。6.3样品贮存血清样品在2℃～8℃可保存24h，如需长期保存应置-20℃以下。7操作方法7.1准备将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析

7、法检测试剂卡和待检血清样品回温至25℃左右。7.2稀释用样品稀释液将50µL待检血清样品按1:10稀释。7.3加样将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡水平放置，用移液器吸取已稀释好的待检样品80µL垂直滴加于加样孔内。7.4检测3DB34/T4044—2021常温下，避光层析15min后用高敏荧光分析仪检测。8结果计算8.1依据检测需求信息选择相应批次的标准曲线、高敏荧光分析仪检测的检测线（T）和质控线（C）的荧光信号，自动计算获得被检样本中布鲁氏杆菌病抗体的效价。8.2标准曲线示意图参见附录B图B.1。9判定标准如下：