荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用

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1、荧光定量PC唯肺结核临床诊断及疗效评估中的应用建立荧光定量PCR佥测结核分枝杆菌方法，评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针，建立荧光定量PC昉法。分别以荧光定量PCR集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊肺结核患者随访的痰标本，比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果荧光定量PCR勺检测灵敏度为4Copies/反应，远高于抗酸染色法和集菌培养法。荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为％、％和％。患者治疗效果的

2、随访检测结果显示，结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势。结论荧光定量PCR方法具有快速、敏感和特异性高的特点，可以快速、及时获取肺结核患者服药后的治疗效果，为医生的后续督导治疗提供依据，具有重要的临床意义。结核病是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95％在发展中国家[1]，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第2位，每年因结核病死亡的人数达到15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展[2]。结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要

3、依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方法的检出率低、培养周期长，已又t以满足临床需要[3,4]。荧光定量PC幅近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点。该研究建立了荧光定量PCR佥测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行了评价，现将结果报告如下1材料与方法标本疑似肺结核病患者采集2009-2010年5月某传染病院

4、诊断的疑似肺结核患者痰液标本168份，其中男性115份，女性53份，年龄15〜60岁。疑似肺结核病患者的确认依据结核病诊断指南，患者出现咳嗽、咳痰3周或以上，可伴有咯血、胸痛、呼吸困难，或者发热，盗汗、乏力、食欲降低、体重减轻、月经失调等症状，临床需进一步做痰和胸部X线检查的患者[5]确诊患者选择临床确诊肺结核病患者。为确保样本采集的连贯性，在争取患者同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近患者，共选取5例活动性肺结核患者。样本采集患者漱口后痰液，在服药前1d即开始留样，服药后，在随访中1〜7d内每天采集1次，后续间隔

5、2〜5d采集1次。仪器Bact/Alert3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机、Biospec-miniDNA/RNA/Proteinanalyzer(岛津)、7500荧光定量PCR扩增仪(AppliedBiosystems)、凝胶成像系统(英国UVItec)。抗酸染色法与集菌培养法操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》[5]进行。痰?DDNA勺提取取痰标本加入2倍样本体积4%的NaOH液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入灭菌水，充分振荡混匀，15000

6、r/min离心2min，去上清，重复洗涤3次；沉淀中加入506DNA提取液(1%NP-40+2%TritonX-100),充分振荡混匀，100c水浴10min；待冷却至室温，15000r/min离心5min,取上清液备用。荧光定量PC昉法引物与探针设计针对IS6110基因设计引物与探针，上游引物：5’-GTCGCCCGTCTACTTAATG-3游引物：5'-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3物长度为107bp。探针：5'FAM-CCGACGGTGCGTAAGTGGGTGCGTCGG-,DABCYL3康生物技术有

7、限公司合成。反应条件反应体系(40科l):d110xbuffer,LMg2+200医mol/LdNTP,dmol/L上下游引物，mmol/L探针，4dLDNA模板，聚合酶。扩增条件：94C3min；94c20s，52℃20s，72℃20s，40次循环。试验设定阳性对照、弱阳性对照与空白对照(notemplatecontrol,NTC)。按照荧光定量PC的析软件设定基线(baseline)与阈值(threshold)，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。标准品制备以结核分枝杆菌H37Ra为参考菌

8、株，PCRT增IS6110基因并克隆到质粒载体。提取纯化重组DNA，10倍梯度稀释至107Copies/mL作为强阳性标准品，103Copies/mL作为弱阳性标准品。特异性以结核分枝杆菌H37Ra为阳性标本，提取牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌为模板检测引物