注射用重组人促红素epo

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1、注射用重组人促红素EPO（CHO细胞）3检定3.1原液检定3.1.1蛋白质含量用4g/L碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，335nm,340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（附录IIA），在波长276nm～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长带入回归方程求得供试品溶液由于光散射

2、产生的吸光度A光散射。按下式计算，应不低于0.5mg/ml。蛋白质含量（mg/ml）=（Amax-A光散射）÷7.43×供试品稀释倍数×103.1.2生物学活性3.1.2.1体内法依法测定（附录ⅩB）。3.1.2.2体外法按酶联免疫法试剂盒说明书测定。3.1.3体内比活性每1mg蛋白质应不低于1.0×105IU。3.1.4纯度3.1.4.1电泳法依法测定（附录ⅣC）。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。

3、3.1.4.2高效液相色谱法依法测定（附录ⅢB）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20～100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。3.1.5分子量依法测定（附录ⅣC）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶

4、胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。3.1.6紫外光谱扫描依法测定（附录ⅡA），用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波长230nm-360nm下进行扫描，其最大吸收峰279nm±2nm；最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm处无吸收峰。3.1.7等电聚焦取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40%pH3-5的两性电解质溶液1.05ml、40%pH3-10的两性电解质溶液0.45ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N，N

5、，N’，N’-四甲基乙二胺15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl（浓度应在每1ml含0.5mg以上），照等电聚焦电泳法进行（附录ⅣD），同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。3.1.8唾液酸含量每1mol人促红素应不低于10.0mol(附录ⅥC)。3.1.9外源性DNA残留量每10000IU人促红素应不高于100pg（附录ⅨB）。3.1.10CHO细胞蛋白残留量用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。3.1.11细菌内毒素检查每10000IU人促红素应

6、小于2EU（附录ⅫE凝胶限量试验）。3.1.12牛血清白蛋白残留量依法测定（附录Ⅷ1），应不高于0.01%。3.1.13肽图（至少每年测定1次）供试品经透析、冻干后,用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（附录ⅧE），其中加入胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm)，柱温为45℃±0.5℃；流速为0.75ml/分钟；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80

7、%乙腈水溶液）。编号时间/分钟流速/mlA%B%10.000.75100.00.0230.000.7585.015.0375.000.7565.035.04115.000.7515.085.05120.000.750.0100.06125.000.75100.00.07145.000.75100.00.0肽图应与人促红素对照品一致。3.1.14N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次）用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val

8、-Leu-Glu-Arg-Tyr。3.2半成品检定3.2.1细菌内毒素检查依法测定,每1000IU人促红素应小于2EU（附录ⅫE凝胶限量试验）。3.2.2无菌检查依法检查（附录ⅫA），应符合规定。3.3成品检定除复溶时间、水分测定、和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。3.3.1鉴别试验按免疫印迹法（附录ⅧA）或免疫斑点法（附录ⅧB）测定，应为阳性。3.3.2物理检查3.3.2.1