丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析

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1、丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析【关键词】丙型肝炎病毒;多表位抗原;体液免疫丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)是经血液途径传播的一类肝炎病毒。目前全球约有1.7亿～2.0亿HCV感染者,此感染者中70%～85%可发展成为慢性感染,病程长达20～30年[1],约有30%可发展成为进展性肝病,包括肝硬化或肝癌[2]。目前,对HCV慢性感染尚无高效的特异性治疗方法,标准治疗方案是聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗24～72周,由于干扰素和利巴韦林副作用巨大,使部分患者无法耐受而提

2、前终止治疗[3]。因此迫切需要研发一种有效疫苗来预防HCV感染。由于HCV复制力差、感染力弱,基因组高度变异,并且缺乏有效的细胞和动物感染模型,因此采用传统方法研制丙肝疫苗难以达到目的[4]。以抗原表位预测和人工合成抗原表位基因为基础的多表位疫苗是近年来新的研究趋势[5],表位肽虽然微小,但免疫原性强,可以克服主要组织相容性复合体(majorhistopabilityplex,MHC)分子的遗传限制,同时多表位疫苗在诱生细胞免疫和克服免疫应答中的不利因素方面有着独特优势,为特异性免疫治疗和基因治疗奠定了基础

3、,因此多表位疫苗成为HCV预防和治疗性疫苗的研究突破点。我们将已合成好的HCV十表位抗原复合体在原核表达载体pBV220中成功表达,建立了纯化技术路线,并对该多表位抗原的抗原反应性做了分析,同时利用小鼠对其免疫原性进行了初步探索。　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α均由本实验室保存,带有丙型肝炎多表位抗原基因的质粒pBV220HCVe由本实验室构建。限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。纯化用分离介质购于Pharmacia公司。HCV抗体诊断试剂盒购于英科新创(厦门)生物科技有限公司。丙型肝炎

4、患者阳性血清来自昆明医学院第一附属医院。BALB/c小鼠,雌性,6～8周龄,购于医学生物学研究所灵长类实验动物中心。　　1.2方法　　1.2.1pBV220HCVe的鉴定将已连好的pBV220HCVe质粒,转化DH5α感受态细胞,酶切鉴定,筛选阳性克隆。　　1.2.2pBV220HCVe的诱导表达及表达产物的纯化挑取含重组子pBV220HCVe的阳性克隆于含Ampicillin的LB液体培养基中30℃振荡过夜,次日按1∶100的比率扩大培养2～3h后,迅速升温至42℃诱导培养4～6h,离心收集菌体,

5、经150g/LSDSPAGE检测,考马斯亮蓝染色,确定目的蛋白的表达量及相对分子量大小,挑选表达量最高的优势菌种划线涂板,以备后用。温度诱导菌体经超声波破碎,用1mol/L、2mol/L尿素逐级洗涤包涵体沉淀,离心回收沉淀,将沉淀溶于8mol/L尿素,再用1mol/LDTT和10mmol/LPB缓冲液对洗涤后的蛋白沉淀进行稀释复性。用硫酸铵分级沉淀方法从复性液中沉淀浓缩杂蛋白,后经SephadexG25脱盐柱脱盐、DEAESephroseFastFlow离子交换层析、SephadexS200排阻层析

6、柱纯化,150g/LSDSPAGE分析其纯度,福林酚法测定蛋白浓度,-20℃保存备用。　　1.2.3HCVe抗原反应性分析将纯化的HCVe蛋白进行150g/LSDSPAGE电泳,当目的蛋白迁移到适合位置时结束电泳,将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。以10g/LBSA封闭非特异性结合位点,反应1h,37℃与丙型肝炎患者阳性血清(1∶50稀释)结合,反应2h,经TTBS清洗3次后,37℃与碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶50稀释)结合,充分洗膜,DAB显色,观察结果。　　1.2.4HCVe免疫效果分析将6～8周

7、龄、雌性BALB/c小鼠,随机分为4组,10、50、100μg组,PBS对照组,每组6只。取纯化的HCVe蛋白按10、50、100μg组,以氢氧化铝(1g/L)为佐剂,皮下注射,分别免疫BALB/c小鼠,免疫后1个月加强免疫1次,共免疫2次。免疫后第2、6、8周采集小鼠尾静脉血,分离血清,用HCV抗体诊断试剂盒检测各组实验组小鼠HCV特异性抗体的产生情况。2结果　　2.1pBV220HCVe重组质粒的鉴定重组质粒pBV220HCVe经过EcoRI酶切后,得到501bp的预期片段(图1)。序列测定结果与设

8、计序列完全一致。　　2.3HCVe抗原反应性分析结果显示转移至硝酸纤维素膜上的HCVe蛋白可与特异性抗体结合,表明重新构建的HCVe蛋白具有良好的特异性HCV抗原反应性(图3)。　　2.4HCVe免疫效果分析采用HCV抗体诊断试剂盒检测实验小鼠HCV特异性抗体产生情况,表明各剂量组在HCVe第1次免疫后2周,各剂量组小鼠均产生抗HCV特异性抗体,2免后第1次采血检测(第6周)10μg及50μg剂量组小鼠特异性抗体