慢病毒载体介导半乳凝素-3-shrna沉默基因对肿瘤细胞的影响

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1、慢病毒载体介导半乳凝素?3?shRNA沉默基因对肿瘤细胞的影响王明栋，王洪，马文斌，史彦芳，王任直【摘要】目的:构建干扰半乳凝素?3（Galectin?3）的重组U6慢病毒质粒，体外评价和观察内源性小RNA干扰效果及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据siRNA设计原则，设计合成短发夹DNA，用于体内转录合成干扰Galectin?3编码序列的发夹RNA.连接，筛选，酶切，鉴定pGCL?GFP/U6Gal?3shRNA?1；以含无关序列发夹结构的质粒载体为对照，感染乳腺癌细胞系，采用RT?PCR和TT法和流式细胞检测其对细胞增殖、凋亡的干扰情况.结果:测序证实重组质粒构建成功，体外试验表

2、明，Galectin?3的mRNA和蛋白表达均一致降低，转染组为（0.028%），阴性对照组为（0.617%），空白对照组为（0.992%），转染组mRNA干扰效率达95%（P<0.05）；Galectin?3蛋白表达明显下调，与阴性对照组和空白对照组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）.MTT检测结果转染组为（0.40±3.69）%，阴性对照组（0.71±0.16）%；转染组和阴性对照组间差异均有统计学意义（P<0.05）.细胞凋亡百分率为68.78%.结论:慢病毒介导的Galectin?3?shRNA成功在体外敲减了肿瘤细胞的目的蛋白，影响了肿瘤的发生与发展

3、.【关键词】慢病毒载体；半乳糖凝集素?3；shRNA；基因沉默　　0引言　　半乳凝素?3（Galectin?3），是一种近年发现的所有脊椎动物中结构特殊、仅有的嵌合型，有两个不同的结构域，由单一LGALS3基因编码［1-2］.在甲状腺、乳腺、垂体腺等肿瘤中表达，具有多效性生物功能，如细胞黏附、抑制凋亡、细胞周期调节，pre?mRNA等［3-4］.在侵袭性垂体泌乳素腺瘤胞浆内蛋白和mRNA高表达，结合核分裂相，对判断侵袭性和预后方面有一定作用［5-6］.目前将Galectin?3基因体外敲减（konckdoallinterferenceRNAs,siRNAs)基因导入，但细胞存在着抵抗

4、性.本研究旨在通过对Galectin?3的RNAi重组含U6启动子慢病毒表达载体的构建和鉴定，体外观察和评价内源性小RNA对Galectin?3基因及肿瘤细胞凋亡、增殖等的影响，为探索侵袭性肿瘤的基因治疗提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料人乳腺癌细胞系MCF?7由本实验室保存.DMEM培养基(Dulbcco?sModifiedEagleedium)和新生小牛血清(美国Gibco公司)；慢病毒（上海吉凯基因生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶：T4DNA连接酶、大肠杆菌DH5α，Taq酶，dNTPMix(大连宝生生物有限公司)；Galecti

5、n?3试剂(美国Invitrogen公司)；山羊抗人Gal?3多克隆抗体(美国SantaCruz公司)；辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG抗体(北京中山生物技术有限公司)；甘油醛?3?磷酸?脱氢酶(上海邦成生物技术有限公司)；化学发光试剂盒、四甲基偶氮唑盐（MTT），二甲亚砜（DMSO）（美国SantaCruz公司）；总RNA抽提Trizol，SDS?硝酸纤维素膜（北京鼎国生物技术有限公司）；RNA逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；相差倒置荧光显微镜（日本Olympaic公司）；定量PCR仪(RG?3000)（美国Biochem公司）；蛋白电泳及转膜系统（美国Bio?Rad公司

6、）；测序引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.凝胶成像仪（美国GelDoc1000型Bio?Rad）摄像分析,酶联免疫检测仪（美国产DG5031型），紫外线分光光度仪（日本UV?240，Shimadzu公司），其他试剂均为进口或国产分析纯.　　1.2方法　　1.2.1构建携带特异shRNA编码序列的RNAi质粒根据人Galectin?3基因序列(GenBankNo.NM_002306)mRNA的第653位点设计合成caGGAGAGTCATTGTTTGCAA，G/C含量为42.10%，病毒载体构建框架序列为5′?TcaGGAGAGTCATTGTTTGCAATTCAAGAGATTGCA

7、AACAATGACTCTCCtgTTTTTTC?3,5′?TCGAGAAAAAAcaGGAGAGTCATTGTTTG　CAATCTCTTGAATTGCAAACAATGACTCTCCtgA?3′,经BLAST比对该序列与人其他基因无明显同源性.经双链DNAoligo制备，15mL/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE）凝胶检测双链形成效率，载体的线性化双酶切，4℃12h连接反应，转化，阳性克隆的