慢病毒载体介导半乳凝素3shRNA沉默基因对肿瘤细胞的影响.doc

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1、慢病毒载体介导半乳凝素3shRNA沉默基因对肿瘤细胞的影响作者：王明栋，王洪，马文斌，史彦芳，王任直【摘要】目的:构建干扰半乳凝素3（Galectin3）的重组U6慢病毒质粒，体外评价和观察内源性小RNA干扰效果及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据siRNA设计原则，设计合成短发夹DNA，用于体内转录合成干扰Galectin3编码序列的发夹RNA.连接，筛选，酶切，鉴定pGCLGFP/U6Gal3shRNA1；以含无关序列发夹结构的质粒载体为对照，感染乳腺癌细胞系，采用RTPCR和WesternBlot检测mRNA和蛋白表达水平与对照组的差别；MTT法和流式细

2、胞检测其对细胞增殖、凋亡的干扰情况.结果:测序证实重组质粒构建成功，体外试验表明，Galectin3的mRNA和蛋白表达均一致降低，转染组为（0.028%），阴性对照组为（0.617%），空白对照组为（0.992%），转染组mRNA干扰效率达95%（P<0.05）；Galectin3蛋白表达明显下调，与阴性对照组和空白对照组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）.MTT检测结果转染组为（0.40±3.69）%，阴性对照组（0.71±0.16）%；转染组和阴性对照组间差异均有统计学意义（P<0.05）.细胞凋亡百分率为68.78%.结论:慢病毒介导的Gal

3、ectin3shRNA成功在体外敲减了肿瘤细胞的目的蛋白，影响了肿瘤的发生与发展.【关键词】慢病毒载体；半乳糖凝集素3；shRNA；基因沉默　　0引言　　半乳凝素3（Galectin3），是一种近年发现的所有脊椎动物中结构特殊、仅有的嵌合型，有两个不同的结构域，由单一LGALS3基因编码［1-2］.在甲状腺、乳腺、垂体腺等肿瘤中表达，具有多效性生物功能，如细胞黏附、抑制凋亡、细胞周期调节，premRNA等［3-4］.在侵袭性垂体泌乳素腺瘤胞浆内蛋白和mRNA高表达，结合核分裂相，对判断侵袭性和预后方面有一定作用［5-6］.目前将Galectin3基因体外敲减（ko

4、nckdown），研究内源性小RNA对它影响的相关报道还很少.采用逆转录病毒载体，来提高外源siRNA(smallinterferenceRNAs,siRNAs)基因导入，但细胞存在着抵抗性.本研究旨在通过对Galectin3的RNAi重组含U6启动子慢病毒表达载体的构建和鉴定，体外观察和评价内源性小RNA对Galectin3基因及肿瘤细胞凋亡、增殖等的影响，为探索侵袭性肿瘤的基因治疗提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料人乳腺癌细胞系MCF7由本实验室保存.DMEM培养基(DulbccosModifiedEagleedium)6和新生小牛血清(美国Gibco公司

5、)；慢病毒（上海吉凯基因生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶：T4DNA连接酶、大肠杆菌DH5α，Taq酶，dNTPMix(大连宝生生物有限公司)；Galectin3试剂(美国Invitrogen公司)；山羊抗人Gal3多克隆抗体(美国SantaCruz公司)；辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG抗体(北京中山生物技术有限公司)；甘油醛3磷酸脱氢酶(上海邦成生物技术有限公司)；化学发光试剂盒、四甲基偶氮唑盐（MTT），二甲亚砜（DMSO）（美国SantaCruz公司）；总RNA抽提Trizol，SDS硝酸纤维素膜（北京鼎国生物技术有限公司

6、）；RNA逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；相差倒置荧光显微镜（日本Olympaic公司）；定量PCR仪(RG3000)（美国Biochem公司）；蛋白电泳及转膜系统（美国BioRad公司）；测序引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.凝胶成像仪（美国GelDoc1000型BioRad）摄像分析,酶联免疫检测仪（美国产DG5031型），紫外线分光光度仪（日本UV240，Shimadzu公司），其他试剂均为进口或国产分析纯.　　1.2方法　　1.2.1构建携带特异shRNA编码序列的RNAi质粒根据人Galectin3基因序列(GenBankNo.NM_002

7、306)mRNA的第653位点设计合成caGGAGAGTCATTGTTTGCAA，G/C含量为42.10%，病毒载体构建框架序列为5′TcaGGAGAGTCATTGTTTGCAATTCAAGAGATTGCAAACAATGACTCTCCtgTTTTTTC3,5′TCGAGAAAAAAcaGGAGAGTCATTGTTTG　CAATCTCTTGAATTGCAAACAATGACTCTCCtgA3′,经BLAST比对该序列与人其他基因无明显同源性.经双链DNAoligo制备，15mL/L非变性