DB32∕T 1730-2011 养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法.pdf

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1、ICS65.150B50备案号：DB32DB32DB32DB32江苏省地方标准DB32/T1730—2011养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法Fluorescencemicroscopycountingmethodwasusedtomeasurethecountofaquaculturewaterbacteria2011-04-15发布2011-06-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1730—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。本标准的附录

2、A为资料性附录。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所。本标准主要起草人：杨鸢劼、陈大鹏。DB32/T1730—2011养殖水体细菌总数测定--荧光显微计数法1范围本标准规定了荧光显微计数法测定养殖水体细菌总数的试剂、仪器设备、操作步骤、计数方法和计算。本标准适用于养殖水体细菌总数的测定，也适用于环境水域。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789

3、.28食品卫生微生物学检验、染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3原理细菌组织细胞经阳离子荧光探针--吖啶橙（AcridineOrange，AO）荧光色素染色后，以嵌入或静电吸引与蛋白DNA/RNA相结合。在生物荧光显微镜高压汞灯发射光谱激发光下（200~600nm），活菌细胞和受损细胞（死细胞）分别产生黄绿色到绿色荧光和橙色到红色荧光。镜检计数待检样品中活菌细胞和死菌细胞数，同时也可以计数总菌数。4试剂所用试剂除特别说明外，药品均为分析纯(AR)。无菌水均为

4、经0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水，符合Ⅰ级水的规格。4.1甲醛溶液(40%)4.2萘啶酮酸溶液（0.002%）萘啶酮酸（C12H12N2O3）0.002g无菌水100mL待萘啶酮酸充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.3酵母膏溶液（0.025%）酵母膏（生化试剂）0.025g无菌水100mL将酵母膏在无菌水中加热，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.4氢氧化钠溶液（4%）氢氧化钠（NaOH）4g无菌水100mL1DB32/T1730—20114.5磷酸盐缓冲液（pH7

5、.2±0.05）磷酸二氢钾（KH2PO4·2H2O）34g无菌水500mL待磷酸二氢钾充分溶解后，用NaOH溶液调整pH7.2±0.05，4℃保存。4.6吖啶橙染色溶液（0.1%）吖啶橙（C17H19N3·HCl·0.5ZnCll2）10mg磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05）100mL将吖啶橙和磷酸盐缓冲液混合，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌棕色试剂瓶，室温保存，有效期6个月。操作时需戴手套。4.7苏丹黑B溶液苏丹黑B（C29H24N6）100mg无水乙醇（C2H6O）75mL无菌水75mL将苏丹黑B在乙醇

6、中充分溶解后，再与无菌水混合，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置棕色试剂瓶暗处保存，有效期6个月。4.80.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)碳酸氢钠（NaHCO3）3.7g碳酸钠（Na2CO3）0.6g无菌水600mL将碳酸氢钠和碳酸钠在无菌水中充分溶解后置试剂瓶，密封保存。4.9缓冲甘油封片剂碳酸盐缓冲液(pH9.0-9.5)10mL无荧光甘油（C3H8O3）90mL按比例将碳酸盐缓冲液和无荧光甘油在搅拌器上充分混匀后4℃保存，待气泡排除后方可使用。4.10无荧光显微镜物镜镜油TypeFF（Nd=1.516）5仪

7、器及设备5.1荧光显微镜，具落射汞灯装置、摄像转换器及监视器,滤光片组：450～490nm激发，520nm屏障，目镜（10×），油镜物镜（100×）。5.2电子天平：感量0.0001g。5.3电位pH计。5.4超净工作台。5.5高压灭菌锅。5.6采样瓶，50mL螺盖聚丙烯塑料瓶。5.7醋酸纤维滤膜：ø25mm，孔径0.22μm。5.8过滤器（包含抽滤管）。5.9量筒（容量20mL）。5.10镊子（平头）。5.11酒精灯。5.12载玻片：25.4mm×76.2mm(长×宽)，厚0.80mm。5.13盖玻片：18.0mm×18

8、.0mm(长×宽)，厚0.17mm。2DB32/T1730—20116测定步骤6.1准备6.1.1采样瓶使用前用5%HCl溶液浸泡1h以上，0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水漱洗。26.1.2采样瓶密闭包装后置高压灭菌锅，1.05kg/cm（121.3℃），保持20min，冷却后，无菌室保存备用。6.1.