汉坦病毒vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选论文

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1、汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选论文.freell和1∶320～1∶1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达650～750LgCID50/ml和1∶160～1∶768；疫苗免疫家兔2针后.freell，15d左右收获，无菌取脑，用含10%小牛血清基础建立培养液(MEM)液制成鼠脑悬液，离心取上清，在Vero-E6细胞上测定病毒滴度以及利用反向被动血凝试验(RPHA)测定病毒抗原。需要传代的将脑悬液接种1～5d龄乳鼠，每只脑内002ml。16病毒在Vero细胞上的适应性传代分别将汉滩病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ

2、5株鼠脑标本研磨制成10%的鼠脑悬液，离心后取上清液接种Vero细胞，进行适应性传代，培养7d左右，取细胞刮片进行直接免疫荧光法(FA)〔5〕检查细胞感染情况，待感染量达+++～++++，将细胞瓶冻入-30℃冰箱，过夜后融化离心，取上清传代，连续传5代，每代取细胞冻融液少许，用来测定病毒和抗原滴度。17病变(CPE)观察将4株毒株感染长成单层的Vero细胞，37℃培养，每隔3d用含3%小牛血清的MEM换液1次，并逐日在倒置显微镜下观察细胞病变发展情况，连续观察12d。18敏感动物发病情况观察候选的4株毒株在Vero细胞上适应了5代后，将细胞冻融后离心的上清液(CP5)

3、腹腔注射2～5d龄的乳沙鼠，01ml/只，观察乳鼠的发病情况并记录发病或死亡时间。19FA法检测病毒滴度(LgCCID50/ml)用025%胰酶消化生长良好的Vero-E6细胞，以适应细胞浓度接种96孔微量培养板，每孔150μl，置37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长成单层，取待检毒种液，做10倍系列稀释，分别接种到E6单层细胞孔，接种量为10μl/孔，每个稀释度接种4种，置37℃、5%CO2条件下吸附2h，然后加3%小牛血清MEM的细胞培养液150μl/孔，再置37℃孵箱培养6～7d，用FA检查细胞感染病毒的情况，计算病毒滴度。110RPHA检测病毒抗原量采用

4、96孔120°“V”型微量反应板，每孔加25μlRPHA稀释液，取25μl待检毒种液于第一孔作1∶2，1∶4，1∶8……倍比稀释，然后每孔加25μl致敏血球悬液，于微量震荡器上混匀并置37℃水浴1～2h观察结果。111Vero细胞灭活疫苗的研制选用ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5株作为疫苗株，将此毒株感染Vero单层细胞，培养后按生物制品规程中肾综合征出血热疫苗生产的方法研制疫苗〔6〕，最后以1∶4000β丙内脂灭活。112免疫血清的制备和中和抗体效价的测定制成的疫苗经安全试验合格后(Vero-E6细胞盲传3代阴性)，用于免疫家兔，每批4只，后腿肌肉注射10ml，7

5、d后以同法再免疫1次，第1次免疫后4周采血分离血清。每只家兔于免疫前4周采血，分离血清作为对照。应用间接免疫荧光法(IFA)〔5〕和本实验室建立的半微量直接免疫酶斑减少中和试验(DPPRNT)〔7〕测定荧光抗体和中和抗体的效价。病毒用汉坦病毒国际标准株76-118和UR株。2结果21汉坦病毒在乳鼠脑内传代后病毒和抗原滴度的情况ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株在乳沙鼠脑中连续传了8，8，5，7代，其鼠脑冰冻切片经直接免疫荧光检查均呈强阳性，鼠脑悬液经离心，上清液的病毒滴度和抗原滴度均较强。22各汉坦病毒在Vero细胞上的适应性传代4株毒株对Vero细胞均很敏感，但适应

6、能力存在一定差异。ZJ4、ZJ7株接种Vero细胞第2代的免疫荧光强度即达到+++，而ZJ2、ZJ5株荧光相对较弱，经5次传代，4株毒株的免疫荧光强度和病毒滴度均有明显的提高，免疫荧光强度均可以达到++++，ZJ2、ZJ4、ZJ7三株HTN型病毒呈片状荧光，ZJ5株SEO型病毒呈颗粒状荧光，结果传5代后4株毒株的病毒滴度均达到650LgCCID50/ml，最高达750LgCCID50/ml，病毒抗原量均达到1∶160，最高达1∶768，随着适应代数的增加，病毒滴度和病毒抗原量呈递增趋势，递增情况(表1)。23毒株对Vero细胞致病变的观察连续观察12d，4株毒株的1

7、～5代均不使Vero细胞产生病变。24毒株致乳沙鼠发病情况的观察4株毒株的CP5攻击乳鼠，7d后均发现乳鼠活动减少，精神萎靡，卷缩，后肢麻痹等症状发生，9d后出现死亡。表14株毒株经Vero细胞传代后不同代次的病毒滴度和抗原滴度（略）25家兔免疫疫苗后中和抗体的应答情况用ZJ4株和ZJ5株制备的2批单价原液灭活疫苗免疫家兔，2针后的免疫血清经DPPRNT测定，对同型毒株的中和抗体效价，3/4只家兔不低于1∶10。3讨论本结果显示，经5代传代后，病毒在Vero细胞上已较好适应，病毒滴度和抗原量均有明显提高。病毒滴度均稳定在6