坦布苏病毒毒株间毒力差异的分子基础

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1、：１１分类号：单位代码００９Ｂ１：３０４３４９密级：学号ｆ曲少Ｉｔ乂聲博±学位论文坦布苏病毒毒株间毒力差异的分子基础Ｍｏｌｅｃ山ａｒＢａｓｉｓｆｏｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔＶｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＴｅｍｂｕｓｕＶｉｒｕｓｅｓ研究生：梁特指导教师：张大丙教授申请学位口类级别：农学博壬专业名称：预防兽医学研究方向；动物分子病毒学与免疫学所在学院：动物医学院２０１７年５月Ｐｈ．Ｄ．ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＭｏｌｅｃ山ａｒＢａｓｉｓｆｏｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔＶｉｒｕｌｅｎ

2、ｃｅｏｆＴｅｍｂｕｓｕＶｉｒｕｓｅｓＰｌｉ．Ｄ．Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：恥ＬｉａｎｇＳｕｅｒｖｉｓｏｒ：ＤａｂｉｎＺｈａｎｐｇｇＭａｏｒ：ＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅｊｙＲｅｓｅａｒｃｈｆｉｅｌｄ：ＡｎｉｍａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＶｉｒｏｌｏ＆ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｇｙＣｈｉｎａＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｙ２０１７，独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用巧致谢的内容外，论文中不

3、包含本人和其他人己经发表或撰写过的一，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材斜研究成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部口和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博±学位论文全文数据库》或《中国优秀硕：ｔ学位论文全文数据库》进行出版，并享受相

4、关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）（学位论文作者签名：时间：＞在曰／声／导师签名：时间：月曰加（Ｔ严Ｉ摘要坦布苏病毒（Ｔｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ，ＴＭＵＶ）感染是危害养鸭业的新发传染病，对于我国养鸭业具有重要的经济意义。迄今为止。，ＴＭＵＶ的分子致病机制尚不清楚本研究［＾毒力存在差异的ＴＭＵＶ分离株为材料，对决定毒株间毒力差异的关键基因和位点进行分析和鉴定，Ｗ期为阐明ＴＭＵＶ的分子致病机制提供数据。一－２０￣１４年１０月，两个３４周齡麻鸭群发生了种Ｗ雍疾为特征的疾病。经ＲＴＰＣＲ检测、病（）毒分离、间接免疫费光检

5、测和动物试验，确定致病病原为ＴＭＵＶ。将第３代鸭胜分离株ＧＬ株经脑内途径接种２日龄北京鸭￣６ｄ，可复制出与自然病例相似的症状，在接种后３维鸭死亡率达１００％。结果表明，该ＴＭＵＶ分离株对北京鸭维鸭具有高致病性。为观察ＴＭＵＶ不同毒株的毒力差异，Ｗ２日龄北京鸭为动物模型，巧ＰＳ株、Ｙ株和ＧＬ株经脑内途径进行感染试验。结果显示，感染Ｙ株和ＧＬ株后，维鸭表现出严重的临床症状和组织病理变化，且死亡率分别为８０％和７０％。而ＰＳ株未导致维鸭死亡，仅影响维鸭增重，所引起的组织病理学变化也较轻微，ＹＳ。由此可见株和ＧＬ株对维鸭的毒力湿著高于Ｐ株。基因组测序和

6、序列比较结果显示，在非编码区，ＰＳ株分别与Ｙ株和ＧＬ株存在３个和４个碱基差异；在聚１蛋白氨基酸水平，ＰＳ株分别与Ｙ株和ＧＬ株存在６个和９个，，运些１氨基酸差异结果提示差异位点可能是决定毒株间毒力差异的分子基础。－为鉴定ＴＭＵＶ毒力相关基因和位点，构建了ＰＳ株的反向遗传操作技术平台ＰＣＲＪ＾ＰＳ。用ＲＴ株基因组进行了分段扩增，获得５个（称为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｅ）基因片段，并由此构建重组质粒Ｒ３２２－ＡＢ和民３２２－ＢＣＤＥＰＢ班。Ｗ这两个质粒为模板进行ＰＣＲ扩增，并利用融合ＰＣＲ方法获得ＰＳｃＤＮＡ。经体外转录－株的全长，用纯化后的ＲＮＡ转染ＢＨＫ

7、２１细胞，成功搔救出病毒。比较结果显－示，姪救病毒在ＢＨＫ２１细胞上的生长特性Ｗ及对小鼠的致病性均与亲本病毒相似，除遗传标记一外，搔救病毒与亲本病毒序列致。Ｉ在上述工作基础上，ＷＰＳ株基因組为骨架，分别构建了含Ｙ株不同基因区（５ＵＴＲ、３ＵＴＲ、Ｉ－Ｅ３ＵＴＲ）的嵌合毒株．巧ＰＳ巧和ＮＳ１（ｒＰＳＹ５ｕＴＲ、Ｓｙｕｔｒ、ｒＹＥ和Ｓ＞ｊｉ－３ＴＪＴＲ）。致病性试验结果显３ｙｓ示，嵌合病毒巧Ｓｙｅ可使７０％的维鸭死亡，与Ｙ株的毒力相近，由此可见，用Ｙ株的Ｅ基因替换ＰＳ株的Ｅ基因，可显著提高ＰＳ株对维鸭的致病性