虾青素对ecv304细胞的抗氧化作用及其作用机制

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1、虾青素对ECV304细胞的抗氧化作用及其作用机制【摘要】目的研究虾青素的抗氧化作用并探讨其作用机制。方法MTT、LDH释放实验检测了虾青素对ECV304细胞活力的影响，超氧化物歧化酶（SOD）、二氨基二苯甲烷（MDA）、细胞内氧化应激活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）的测量实验检测了虾青素对ECV304细胞的抗氧化作用，ATP、细胞色素C氧化酶（COX）、线粒体跨膜电位的测量实验检测了虾青素对ECV304细胞线粒体的保护作用。结果虾青素能保护细胞膜不受损伤，提高细胞活力，降低ROS、MDA的含量，升高SOD活性和NO含量。同时，虾青素还能显著升高ATP水平和COX活性，线粒体

2、跨膜电位有所升高。结论虾青素的抗氧化作用可能是通过保护线粒体功能实现的。【关键词】虾青素；抗氧化作用；线粒体跨膜电位；ATP【Abstract】ObjectiveTostudyastaxanthinantioxidativeactioninECV304cellsanditsmechanism.MethodsTheeffectsofastaxanthinoncellviabilityethods.TheeffectsofastaxanthinonantioxidativeactioninedbySODactivityandthecontentsofMDA,ROSandNO.Thep

3、rotectiveeffectsonmitochondriaitochondrialmembranepotential.ResultsAstaxanthincouldprotectcellmembrane,increasecellviability,SODactivity,NOcontent,ATPlevel,COXactivityandmitochondrialmembranepotential.Meanightbepletedthroughthepathitochondria.【Keyitochondrialmembranepotential，ATP正常情况下，机体的自由基处于

4、不断产生与清除的动态平衡之中，是机体有效的防御系统。但自由基如果产生过多或清除过慢，它可以通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病，其中包括常见的肿瘤、动脉硬化、中风、心脏病、白内障、糖尿病等［1～6］，因此寻找清除自由基和抗氧化的药物是非常重要的。虾青素(astaxanthin)是唯一能通过血脑屏障的酮式类胡萝卜素，在其分子中，有很长的共轭双键、羟基和在共轭双键链末端的不饱和的酮基，其中羟基和酮基又构成α羟基酮，这些结构都具有比较活泼的电子效应，能向自由基提供电子，使得虾青素具有抗氧化作用。本实验

5、通过虾青素对H2O2氧化损伤人血管内皮细胞ECV304的保护作用，初步研究了虾青素的抗氧化作用及其作用机制。1材料与方法1.1仪器和试剂虾青素、DMEM粉剂、MTT购自Sigma公司，LDH、MDA、SOD测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，NO、ROS、ATP、线粒体分离试剂盒、线粒体跨膜电位测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，荧光分光光度计购自美国埃尔默公司，酶标仪购自上海雷勃分析仪器有限公司，流式细胞仪购自美国贝克曼公司。1.2细胞培养人血管内皮细胞ECV304购自美国ATCC，细胞接种于培养瓶内，加入含10％胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM细胞培养液，每2～3d更换

6、1次培养液，待培养形成的细胞汇合成单层细胞以后，用0.25％胰蛋白酶消化传代或接种于培养板上，保持细胞状态良好以备实验使用。1.3ECV304细胞分组处理将ECV304细胞分为对照组、模型组、高/中/低不同剂量药物组。对照组和模型组使用正常培养液进行培养,高、中、低不同剂量药物组分别用含0.2、2.0和20μg/L的虾青素培养液培养,48h后除对照组外均用100μmol/L的H2O2进行处理8min,离心去掉上清液备用。1.4MTT检测将ECV304细胞接种于96孔板，药物处理后每孔加15μl染料溶液MTT，放入37℃、5%CO2培养箱中培养4h，吸弃上述溶液后，加100μl

7、异丙醇终止液，室温30min，酶标仪上570nm处测定OD值。1.5乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）释放检测收集24孔板中处理后的细胞和细胞培养液，按照LDH试剂盒说明，分别测定细胞和细胞培养液A值，按照公式计算乳酸脱氢酶活力，LDH释放百分比=（测定管A值-测定空白管A值）×α×1000ml/样品取样量（ml）×测试前样品稀释倍数，α为标准曲线斜率倒数，此处为0.380。1.6超氧化物歧化酶（SOD）活性检测到预定时间，收集6孔板上的E