壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究论文

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1、壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究论文【摘要】目的：研究壳聚糖纳米颗粒在体外和体内实验中的转染能力。方法：用亚硝酸钠降解壳聚糖的方法制得低分子质量壳聚糖，用zeta电位仪测定粒径、多分散度、zeta电位，并使用乌式黏度计法测定其相对分子质量;通过静电吸附复合绿色荧光蛋白表达质粒pIRESeGFP（报告基因），采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力;用体外和体内基因转染实验,评价纳米颗粒的转染能力。结果：制得的壳聚糖粒径200600nm，多分散度最好的达到0.005，zeta电位0.89mV，相对分子质量7.7

2、×107,粒径250nm。体外对3T3细胞的转染实验显示，该壳聚糖具有一定的转染效率；体内对Balbc57/BL6小鼠的股四头肌肌肉的转染实验显示.freelolecularolecularentsCorporation公司提供的90PlusParticleSizeAnalyzer。1.2方法1.2.1NaNO2法降解壳聚糖称取2.5g壳聚糖，慢慢加入到250ml0.5%乙酸溶液中，保持室温搅拌，壳聚糖被浸润成棉絮状。称取75mgNaNO2，加入到壳聚糖溶液中，不断搅拌，溶液黏度明显下降。分别在30、60、90、12

3、0min后，取出50ml溶液，分别标记为A、B、C、D。使用zeta电位仪测定A、B、C、D4份样品的颗粒大小和zeta电位值，再使用乌式黏度计法测定相对分子质量，以备后用。1.2.2细胞水平转染实验使用壳聚糖，对细胞汇合度约70％的3T3细胞进行转染实验，同时制备脂质体/DNA复合物作为阳性对照，裸质粒DNA作为阴性对照，共同培养36h，通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达，定量检测转染效率。1.2.3动物体内转染实验取Balbc57/BL6小鼠24只，分为6组，每组4只，每组中1只为空白对照组，另外3只为实验组，

4、由10μgGFP质粒(1μg·μl-1)、30μlPBS和20μg壳聚糖（1μg·μl-1）配成的复合物共60μl，孵育30min，用注射器注入小鼠股四头肌肉中，对照组注射10μgGFP质粒和20μlPBS的混合物，分别于注射1、2、3、4、5、6d后，对6组小鼠进行解剖，取大腿股四头肌注射部位进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察荧光表达强度。2结果2.1NaNO2法降解壳聚糖4种壳聚糖物理特征见表1。表14种壳聚糖物理特征由表1可知，A壳聚糖平均粒径较小，通过细胞膜的通透性较好，分布比较集中，zeta电位也为正值，有利

5、于与带负电荷的质粒结合，B、C壳聚糖粒径较大，且zeta电位为负，D壳聚糖虽然粒径小于A，但是多分散度差，即其中包含的有效小粒径比较少，因此，也不利于对于细胞的转染。后续的细胞转染结果也显示壳聚糖A的转染效率最好。对原料壳聚糖和A壳聚糖使用乌式黏度计法7测定其黏度，根据公式η＝κ（MV）α，κ=6.589×10－3，α＝0.88，计算得到原料壳聚糖相对分子质量为46×107，降解30min后的壳聚糖相对分子质量为7.7×107，说明降解是有效的。2.2细胞水平转染实验取降解时间为30min的壳聚糖，按质粒与壳聚糖质量

6、比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5复合后对3T3细胞进行转染，结果如图1所示，可以发现，在两者质量比为1∶3时，转染效率最高。所以，按照最优比例1∶3，分别选用A、B、C、D壳聚糖进行转染实验，结果如图2所示，A壳聚糖转染效率最高。虽然它们的转染效率都低于阳性对照（脂质体）介导的转染，但是壳聚糖几乎无细胞毒性，这一点大大优于脂质体。因此，决定使用A壳聚糖，以质粒与壳聚糖质量比为1∶3的比例制备复合物，进行以下体内水平转染实验。2.3动物水平转染实验分别在第1、2、3、4、5、6天对小鼠肌肉冰冻切片进行荧光观察。结果显

7、示，只有在转染后第4天观察到有绿色荧光蛋白的表达，强度中等，而对照组则无明显的绿色荧光表达，同时发现第4天时，有的小鼠肌肉注射处有炎症反应，炎症反应处绿色荧光特别强烈。图1流式细胞仪测得质粒与壳聚糖不同质量比的转染率3讨论本实验中，通过降解高分子质量壳聚糖，制备获得了一系列适用于转染的粒径大小8在200nm到500nm之间的壳聚糖。在细胞转染中，壳聚糖对3T3细胞具有一定的转染效率，尽管低于脂质体，但是由于其为天然产物，对细胞毒性低9，因此具有更好的应用前景。在动物水平，壳聚糖/质粒复合物体现出好于细胞水平的转染效率

8、。这可能是由于：在细胞转染阶段，壳聚糖颗粒小，便于细胞对质粒/壳聚糖复合物的吞噬，以及该复合物易于从细胞溶酶体中逃逸10，从而有利于质粒表达。在体内转染中，存在一个复合物如何不被细胞间质和体液代谢掉的问题，与肿瘤治疗中EPR效应相仿(即肿瘤组织所特有的高渗透性和高保留性)，颗粒较大的高分子质量壳聚糖比较容易积聚在注射部位，从而实现对注射部位肌肉