温莪术蛋白双向电泳技术的建立

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1、温莪术蛋白双向电泳技术的建立【关键词】蛋白提取;双向电泳;TCA/丙酮沉降法;超速离心　　Abstract:Objective:Toestablishthesystemof2-DgelelectrophoresisproteomeoftheleafofCurcumaethodandultracentrifugation，andthenseparatedbytensionalelectrophoresis(2-DE)，mobilepHgradientstripsusedinandtheEttanTMDaltⅡsysteminSDS-PAGE.The2-Dgelethod.Conclusion:　

2、　Asystemoftensionalelectrophoresisofcurcumaensionalelectrophoresis(2-DE);trichloroaceticacid(TCA)/acetoneprecipitationmethod;ultracentrifugation　　O’Farrell于1995年创立的聚丙烯酰胺双向电泳技术(tensionalelectrophoresis，2-DE)是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具之一。近年来，双向电泳技术在植物中应用日多，但主要集中在拟南芥、水稻、小麦等典型植物上，而在药材中的应用报道较少[1-3]。温州的地道药材——温郁金

3、(Curcumaasham公司);丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、SDS、尿素、硫尿、低分子量标准蛋白均购自Sigma公司;DTT、碘乙酰胺进口分装，其他为国产试剂。样品提取液(25mmol/LTrisHCl，10mmol/LKCl，20mmol/LMgCl2，1mmol/LPMSF，2mmol/LEDTA，10mmol/LDTT);蛋白裂解液(7mol/L尿素，2mol/L硫尿，2%CHAPS，40mmol/LTris-base);水化液(7mol/L尿素，2mol/L硫尿，2%CHAPS);平衡缓冲液(储存液)[50mol/LTrisHCl(pH8.8)，6mol/L尿素，30%甘油，2

4、%SDS，0.25%溴酚蓝溶液];平衡液I(1%DTT的储存液);平衡液II(2.5%碘乙酰胺的储存液);染色液：经典银染法中的各种溶液(固定液，增敏液，银染液，显影液，终止液);琼脂糖封胶液(0.5%琼脂糖/0.002%溴酚兰的电极液)。　　1.1.3主要仪器：IPGphorTMIII等电聚焦仪器(美国GE公司);冷冻台式高速离心机(德国eppendorf公司);SDS-PAGE垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司);超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司，型号：ProteomeLabXL-A/XL-I);Tytoon9100扫描仪(美国GE公司)。　　1.2方法　　1.2.1蛋白提取：取新鲜莪

5、术，在液氮中研磨成粉末，称取莪术粉末0.4g，加入3mL提取液，DTT在PMSF加入5min后加入，混匀，超声破碎5min;4℃放置2h，每半小时混匀一次。离心(12000r/min，15min，4℃)，取上清再离心一次。取上清，加10倍体积的TCA/丙酮溶液沉淀过夜，离心(12000r/min，10min，4℃)，用2mL乙醇洗两次，再用2mL丙酮/0.07%DTT溶液洗2次，离心后，沉淀自然干燥，加裂解液200μL，室温放置5h，离心取上清备用。　　1.2.2蛋白浓度测定：采用Bradford法，取10只0.5mL的EP管，依次编号1至10，编号10加入的蛋白为样品溶液，按照表1依次加入各

6、试剂并且测量595nm下的吸光度值制作标准曲线，并画出BSA标准曲线图并计算出待测样品蛋白浓度为：1.053mg/mL。　　1.2.3等电聚焦：取出一根7cm的IPG胶条室温解冻。然后取50μL样品溶液加入60μL水化液，再加入20μL1mol/L的DTT储液、1μLIPGbuffer(pH4～7)和1μL0.5%的溴酚兰溶液。混匀后，12000r/min离心10min，取125μL上清加入胶条槽中，去掉胶条的保护模，胶面朝下，将IPG胶条尖端(+端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，使水化液浸湿整个胶条。最后加入适量的覆盖油。按表2所列参数进行IP

7、G胶条的泡涨和等电聚焦电泳，并且最大电流为50mA/根胶条;温度为20℃。　　1.2.4胶条的平衡及SDS-PAGE：等电聚焦结束后用去离子水冲洗掉胶条表面的矿物油，进行第一次平衡：将IPG胶条放置在事先盛有5mL平衡液I的平衡管中平衡15min，再用去离子水冲洗掉胶条表面，用镊子夹住胶条的一端，使胶条的侧边接触滤纸，吸干多余的液体，然后进行第二次平衡：在平衡液II中平衡15min，最后用去离子水