高表达jnk3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡论文

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1、高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡论文【摘要】目的：构建人cJun氨基末端激酶3（JNK3）真核表达载体，转染HEK293细胞，建立稳定表达细胞系；以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方法：以pDBLeuJNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1/mycHisB，经PCR和酶切鉴定，DNA测序正确，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培养.freel氨基末端激酶真核表达载体转染因表细胞凋亡0引言cJun氨基末端激酶(cJunNt

2、erminalkinases，JNKs)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)超家族之一.在脊椎动物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三种基因编码，表达的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于细胞质，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.JNK3与JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一个与位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸残基融合在一起的延长的N末端区域［1］；JNK1，JNK2在组织内广泛表达，JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达.近年来研究发现JNK3参与神经细胞凋亡的

3、调控，可促进缺血、缺氧和有毒化学物质导致的神经细胞的凋亡.目前对JNK3促细胞凋亡机制还不是很清楚.我们通过构建稳定转染JNK3基因的细胞系，以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡的关系，为研究JNK3促进细胞凋亡机制提供细胞模型.1材料和方法1.1材料菌株E.coliJM109，质粒pDBLeuJNK3，pcDNA3.1/mycHisB和HEK293细胞由本实验室保存.DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（LifeTechnologies公司）；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒（

4、Promega公司）；DNAMarker，DNA限制性内切酶(EcoRⅤ，XhoⅠ)、pyrobestDNApolymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4DNA连接酶（Neine2000（Invitrogen公司）；AnnexinⅤFITC试剂盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗体、actin抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和ECL检测试剂（SantaCruz公司）；其余试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人JNK3基因的序列(序列号为NM_002753)设计引物,上游引物为：5′

5、ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT3′，下游引物为：5′ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG3′，分别在上游引物和下游引物的5′端加入EcoRV，XhoI的酶切位点和3个保护碱基，引物由赛百盛公司合成.1.2.2人JNK3基因全长的获取以pDBLeuJNK3质粒为模板，采用PCR扩增人JNK3基因，全长1269bp.PCR50μL反应体系中加pDBLeuJNK3质粒模板1μL，10×PCRBuffer5μL，2.5mmol/LdNTPMix4μL,10μmol/LJNK3上下游引物各2

6、μL，pyrobestDNApolymerase0.25μL，加无菌水至50μL.反应条件：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃80s，35个循环；72℃10min.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并胶回收纯化.1.2.3人JNK3真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1/mycHisB质粒分别用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4DNA连接酶连接后转化E.coliJM109感受态，铺在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，选取阳性克隆进行菌落PCR和酶

7、切鉴定，阳性克隆经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1JNK3.1.2.4建立稳定表达人JNK3的HEK293细胞系HEK293细胞在含100mL/L小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50mL/LCO2的饱和湿度下培养.待细胞融合至70％～80％时按照Lipofectamine2000操作说明书进行重组质粒pcDNA3.1JNK3和空质粒pcDNA3.1/mycHisB的转染.转染48h后，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺在直径为10cm的细胞培养皿中，待细胞贴壁后，换含有G418(1400mg/L)的选择性培养基加压培养2ock

8、细胞.1.2.5RTPCR检测JNK3的表达收集HEK293JNK3细胞和HEK293mock细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书进行反转录.取1μg定量后的RNA，加