高表达jnk3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡

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1、高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡【摘要】目的：构建人cJun氨基末端激酶3（JNK3）真核表达载体，转染HEK293细胞，建立稳定表达细胞系；以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方法：以pDBLeuJNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1/mycHisB，经PCR和酶切鉴定，DNA测序正确，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培养，建立稳定表达细胞系.RTPCR，yc标签的JNK3融合蛋白的表达，流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用.结果：

2、成功构建了pcDNA3.1JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞，建立了稳定表达细胞系，成功地表达目的基因；与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡.结论：JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡，为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.【关键词】CJum氨基末端激酶真核表达载体转染因表细胞凋亡　　0引言　　cJun氨基末端激酶(cJunNterminalkinases，JNKs)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)超家族之一.

3、在脊椎动物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三种基因编码，表达的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于细胞质，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.JNK3与JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一个与位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸残基融合在一起的延长的N末端区域〔1〕；JNK1，JNK2在组织内广泛表达，JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达.近年来研究发现JNK3参与神经细胞凋亡的调控，可促进缺血、缺氧和有毒化学物质导致的神经细胞的凋亡.目前对JNK3促细胞凋亡机制还不是很清楚.我们通过构建稳定转染JNK3基因的细胞系，以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡

4、的关系，为研究JNK3促进细胞凋亡机制提供细胞模型.　　1材料和方法　　1.1材料菌株E.coliJM109，质粒pDBLeuJNK3，pcDNA3.1/mycHisB和HEK293细胞由本实验室保存.DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（LifeTechnologies公司）；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；DNAMarker，DNA限制性内切酶(EcoRⅤ，XhoⅠ)、pyrobestDNApolymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4DNA连接酶（Neine2000（Invitrogen公司

5、）；AnnexinⅤFITC试剂盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗体、actin抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和ECL检测试剂（SantaCruz公司）；其余试剂均为国产分析纯.　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人JNK3基因的序列(序列号为NM_002753)设计引物,上游引物为：5＇ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT3＇，下游引物为：5＇ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG3＇，分别在上游引物和下游引物的5＇端加入EcoRV，XhoI的酶切位点和3个保护碱基，引物由赛百盛公司合成.　　1.2

6、.2人JNK3基因全长的获取以pDBLeuJNK3质粒为模板，采用PCR扩增人JNK3基因，全长1269bp.PCR50μL反应体系中加pDBLeuJNK3质粒模板1μL，10×PCRBuffer5μL，2.5mmol/LdNTPMix4μL,10μmol/LJNK3上下游引物各2μL，pyrobestDNApolymerase0.25μL，加无菌水至50μL.反应条件：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃80s，35个循环；72℃10min.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并胶回收纯化.　　1.2.3人JNK3真核表达载体的构建将上述PCR产物和p

7、cDNA3.1/mycHisB质粒分别用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4DNA连接酶连接后转化E.coliJM109感受态，铺在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，选取阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1JNK3.　　1.2.4建立稳定表达人JNK3的HEK293细胞系HEK293细胞在含100mL/L小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50mL/LCO2的饱和湿度下培养.待细胞