尾加压素ⅱ促进乳鼠心肌成纤维细胞分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制论文

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1、尾加压素Ⅱ促进乳鼠心肌成纤维细胞分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制论文宋庆刚，吕建庄，杨竞霄【摘要】目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)促进乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制。方法体外培养CFs，采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法分别观察不同浓度UⅡ作用下，CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度和CFs培养上清中胶原含量的变化；蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrinechloride(Che)、ERK1/2抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclospo

2、rinA(CsA)各自对UⅡ诱导的细胞增殖的影响。结果在1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/LUⅡ作用下，CFs培养上清中胶原含量均较对照组明显增加，而CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度均较对照组有显著降低(P0.01)；在1×10-7mol/LUⅡ作用下，上述各参数与对照组比较无统计学意义(P0.05)。1×10-6mol/LChe+1×10-8mol/LUⅡ组、1×10-5mol/LPD98059+1×10-8mol/LUⅡ组和5μg/mLCsA+1×10-8mol/LUⅡ组的胶原含量

3、均高于对照组而低于1×10-8mol/LUⅡ组(P0.05)。1×10-6mol/LChe+1×10-8mol/LUⅡ组、1×10-5mol/LPD98059+1×10-8mol/LUⅡ组和5μg/mLCsA+1×10-8mol/LUⅡ组的pERK1/2的灰度低于对照组(P0.01)；1×10-6mol/LChe+1×108mol/LUⅡ组和5μg/mLCsA+1×10-8mol/LUⅡ组的pERK1/2的灰度高于1×10-8mol/LUⅡ组(P0.01).freelol/LPD98059+1×1

4、0-8mol/LUⅡ组与之比较则无统计学意义(P0.05)。结论UⅡ具有促进CFs分泌胶原及增殖的作用，其作用可能是通过PKC/MAPK/CaN途径实现的。【关键词】尾加压素Ⅱ；心肌；成纤维细胞；细胞分裂尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一种生长抑素样环形结构的神经肽，最早提取于硬骨鱼的尾部下垂体，1998年首次在人体中克隆成功1。UⅡ广泛存在于神经系统和心血管系统，属于神经内分泌肽，其特异性受体为孤儿G蛋白耦连受体GPR1424。文献报道，UⅡ是迄今为止发现的最强的血管收缩剂，比内皮素强1

5、0余倍，对心血管系统的调节有着重要的作用。但UⅡ对CFs分泌胶原及增殖的影响及其影响机制尚不清楚。本研究是在体外培养CFs，再采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法，分别观察加入蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrinechloride(Che)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclosporinA(CsA)对UⅡ诱导的CFs细胞增殖及胶原合成的影响，旨在探讨UⅡ诱导的CFs细胞增殖作用和胶原合成的细胞内信号转导机制，从而在细

6、胞及分子水平上为心肌纤维化的发生提供新的理论依据。1材料与方法1.1动物、试剂及仪器SD乳鼠购自本校实验动物中心。RatUⅡ、DMEM、DAB显色剂、碘化丙啶、兔pERK1/2蛋白多克隆抗体、Che、PD98059和CsA均为Sigma产品；胎牛血清(FCS)购自浙江杭州靖湖犊牛利用研究所；大鼠抗兔二抗ABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；羟脯氨酸含量测定试剂盒购自南京建成生物公司；链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒购自福州迈新生物公司；台盼蓝购自西安化学试剂厂。3550型自动酶联检

7、测仪为美国Beckman公司产品，721型可见光分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。1.2CFs的培养和鉴定在无菌环境下取出生2-3d的SD仔鼠心室，剪碎，DMEM冲洗，用0.7g/L胰酶消化细胞，每10min收集一次细胞，收集4-6次，筛网过滤，1000r/min离心4-5min，将收集的细胞采用差速贴壁法分离纯化CFs。待CFs生长近融合时以1∶2传代。经倒置显微镜、透射电镜确认，SABC法免疫组化染色，纤维粘连蛋白染色阳性、血管平滑肌肌动蛋白VⅢ因子和结蛋白染色阴性证实所培养的细胞为CFs。实验采

8、用2-4代细胞。1.3CFs培养上清中的胶原含量测定采用羟脯氨酸比色法测定。将对数生长期的CFs用2.5g/L胰蛋白酶消化，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为2.5×107/L，加入96孔培养板，每孔200μL，静置培养至细胞接近融合。加入条件培养液干预，每孔加液体最终达300μL。24h后吸取培养上清50μL，加入玻璃试管中，用考马斯亮兰染色，分光光度计测定吸光度(A)值，计算上清中的总蛋白含量；再用羟脯氨酸比色法测