山茱萸多糖提取工艺及理化性质研究

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1、山茱萸多糖提取工艺及理化性质研究赵晓华，王一飞，刘秋英，安卫征【摘要】　　通过单因素和正交实验,以多糖得率为指标,确定山茱萸多糖的最佳提取工艺,同时对山茱萸多糖理化性质进行分析,结果表明，山茱萸多糖最佳水提工艺条件:温度80℃，料液比1∶60，时间5h,在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经DEAE-52纤维素离子交换和SephadexG-200柱层析法得到组分S21,经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出。【关键词】山茱萸多糖;提取；分离纯化；理化性质　　中药山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornusofficinali

2、sSieb.etZuce的干燥成熟果实，主要产于浙江、安徽、河南等地。其味酸涩，性微温，归肝肾经，具有补益肝肾，收敛固涩的作用。现代药理研究表明山茱萸果肉及果核中含有丰富的糖类和多种氨基酸、VitB1、VitB12等〔1〕。山茱萸多糖具有免疫调节活性及明显的抗氧化作用〔2，3〕随着我国社会经济文化的发展，人们的生活质量普遍提高，因此具有保健预防功能的山茱萸越来越引起国人的重视。本实验以多糖得率为指标，采用正交实验对山茱萸多糖的提取工艺进行优选，以期找出合理可行的制备工艺并研究分析其部分理化性质。　　1器材和方法　　1.1材料　　供试山茱萸干燥果实产于安徽,

3、购于广州中医药大学大药房有限公司中药饮片厂，将山茱萸原料粉碎,置干燥器中备用。　　1.2试剂　　浓硫酸，质量分数为6%的苯酚(分析纯重蒸馏试剂),质量分数为95%的乙醇,氯仿,正丁醇,葡萄糖,氯化钠等,以上试剂均为分析纯。　　1.3仪器　　核酸蛋白测定仪,德国Hettich公司；自动收样器,美国g,加蒸馏水至50ml,配成120μg/ml的样品溶液。吸取样品液1.0ml，按标准曲线同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量。　　1.4.3得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料质量(g)×100%。　　1.4.4单因素分

4、析及正交实验　　本实验选取温度、时间、料液比、pH值这4个因素进行分析,并从中选取3个因素水平根据单因素分析结果,采用L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观指标，以确定最佳提取工艺。　　1.4.5山茱萸多糖的分离纯化　　按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水,用Sevag〔5〕法除蛋白,重复3次,加95%乙醇至30%,离心,得到粗多糖(ZB),上清液继续加95%乙醇至60%,4℃静置过夜,丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品(ZC)。称取样品AC200mg,溶于100ml蒸馏水中,

5、然后加到DEAE-cellulose-52离子交换柱洗脱(2.6cm×26cm)上,依次用蒸馏水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0mol/L的NaCl水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为1ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析3d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山茱萸多糖的两个分离产物S1和S2。　　1.4.6纯度测定　　凝胶色谱法:用0.05mol/LNaCl溶液充分溶胀葡聚糖凝胶SephadexG200,超声脱气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、

6、紧密。柱型(2.6cm×33cm)，装柱完成后,用0.05mol/L的NaCl溶液平衡48h。称取经DEAE柱分离得到的多糖样品20mg,溶于0.05mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝胶柱中,洗脱液控制流速为0.1ml/min,用自动收集仪收集洗脱组分,2ml/管,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上。　　1.5山茱萸多糖理化性质　　1.5.1物理性质　　山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等。　　1.5.2化学性质〔6〕　　Mol

7、ish反应,硫酸-苯酚反应,Fehling试剂反应,碘-碘化钾反应，三氯化铁反应。　　1.5.3蛋白含量测定考马斯亮蓝法:以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以OD595值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。　　1.5.4多糖基本元素分析　　通过CHNS/O元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成。　　2结果　　2.1山茱萸多糖提取条件的单因素分析　　2.1.1乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到3倍时，多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用3倍体积乙醇沉淀多糖。见

8、图1。　　2.1.2提取温度温度是影响多糖得率的重要因素。不同温度