山茱萸多糖提取工艺及理化性质研究论文

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1、山茱萸多糖提取工艺及理化性质研究论文赵晓华，王一飞，刘秋英，安卫征【摘要】通过单因素和正交实验,以多糖得率为指标,确定山茱萸多糖的最佳提取工艺,同时对山茱萸多糖理化性质进行分析,结果表明，山茱萸多糖最佳水提工艺条件:温度80℃，料液比1∶60，时间5h,在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经DEAE-52纤维素离子交换和SephadexG-200柱层析法得到组分S21,经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%.freelg,加蒸馏水至50ml,配成120μg/ml的样品溶液。吸取样品液1.0ml，按标准曲线

2、同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量。1.4.3得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料质量(g)×100%。1.4.4单因素分析及正交实验本实验选取温度、时间、料液比、pH值这4个因素进行分析,并从中选取3个因素水平根据单因素分析结果,采用L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观指标，以确定最佳提取工艺。1.4.5山茱萸多糖的分离纯化按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水,用Sevag［5］法除蛋白,重复3次,加95%乙醇至30%

3、,离心,得到粗多糖(ZB),上清液继续加95%乙醇至60%,4℃静置过夜,丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品(ZC)。称取样品AC200mg,溶于100ml蒸馏水中,然后加到DEAE-cellulose-52离子交换柱洗脱(2.6cm×26cm)上,依次用蒸馏水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0mol/L的NaCl水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为1ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析3d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山

4、茱萸多糖的两个分离产物S1和S2。1.4.6纯度测定凝胶色谱法:用0.05mol/LNaCl溶液充分溶胀葡聚糖凝胶SephadexG200,超声脱气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、紧密。柱型(2.6cm×33cm)，装柱完成后,用0.05mol/L的NaCl溶液平衡48h。称取经DEAE柱分离得到的多糖样品20mg,溶于0.05mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝胶柱中,洗脱液控制流速为0.1ml/min,用自动收集仪收集洗脱组分,2ml/管

5、,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上。1.5山茱萸多糖理化性质1.5.1物理性质山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等。1.5.2化学性质［6］Molish反应,硫酸-苯酚反应,Fehling试剂反应,碘-碘化钾反应，三氯化铁反应。1.5.3蛋白含量测定考马斯亮蓝法:以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以OD595值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。1.5.4多糖

6、基本元素分析通过CHNS/O元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成。2结果2.1山茱萸多糖提取条件的单因素分析2.1.1乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到3倍时，多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用3倍体积乙醇沉淀多糖。见图1。2.1.2提取温度温度是影响多糖得率的重要因素。不同温度(40，50，60，70，80，90℃)对多糖得率产生影响:多糖得率随温度升高而升高,40～60℃升高较慢60～80℃较快,80℃达到最高值,因此确定正交实验温度3水平为60，70，80℃。见图

7、2。2.1.3提取时间提取时间是影响多糖得率的另一个重要因素,不同时间(1，2，3，4，5，6h)对多糖得率的影响如图3所示。多糖得率随时间升高而升高,1～3h升高较慢,3～5h升高较快,因此确定正交实验提取时间水平为3，4，5h。见图3。2.1.4加水量不同加水量(30，40，50，60，70，80倍)对多糖得率的影响如图4所示。多糖得率随加水量增加而增加。30～50倍水升高较慢,60～80倍水升高较快,因此确定正交实验加水量的水平为60，70，80倍水。见图4。2.1.5pH值不同pH值(1～7)对多糖得率的影响

8、见图5。在酸性条件下多糖得率明显降低,pH3时对多糖得率影响不大,可能在强酸环境下,多糖被降解,并且水提法成本低,所以酸提山茱萸多糖意义不大。2.2正交实验根据以上的单因素实验分析,确定L9(34)表的3个因素温度、时间、料液比的3个水平。结果见表1。表1正交实验的因素及水平（略）正交实验确定最佳提取条件。结果见表2。表2正交设计及实验结果（略