人膜蛋白cd81原核表达及纯化

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1、人膜蛋白CD81原核表达及纯化摘要：以高效原核表达载体pColdTF为载体骨架，应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法，将pColdTF中的六聚组氨酸（HisTag）序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT，构建不含HisTag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时，通过PCR引物在目的基因3′端添加HisTag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的TriggerFactor（TF）助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化，并使用FactorXa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白，获得3′端含有HisTag

2、的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化，为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.关键词：载体；人CD81；蛋白表达；纯化中图分类号：Q816文献标识码：ApColdTF原核表达载体是一种插入蛋白可溶性标签的融合型冷休克表达载体，空载体融合表达的顺序为六聚组氨酸（HisTag）、TriggerFactor（TF）、蛋白酶切位点和多克隆位点序列.蛋白酶切位点依次为HRV3C5protease，Thrombin和FactorXa，用于去除

3、融合蛋白的可溶性标签.TF是一种原核的核糖体结合伴侣蛋白，相对分子质量约4.8×104，它能够促进新生肽链的共翻译折叠，与目的蛋白融合表达，提高目的蛋白的可溶性.载体上带有冷休克表达系统，严格控制载体在低温条件下才能表达目的蛋白，进一步促进了目的蛋白的可溶性表达.人CD81是一种四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞内的N端和C端、4个跨膜结构域、胞外小环和胞外大环4部分组成，相对分子质量约2.6×104，在B细胞、T细胞、肝细胞等多种细胞中均有表达.CD81参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞增殖和分化等生物学功能［1］，是细胞表面的免疫调节分子［2］，并

4、参与丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染宿主细胞，作为HCV的一个受体介导病毒颗粒进入宿主细胞［3］，HCV包膜蛋白E2与CD81胞外大环相互结合实现HCV的感染［4-5］.针对CD81的靶向药物及特异性抗体具有抑制HCV感染的潜在功能［6-7］，人膜蛋白CD81的原核表达与纯化，为今后靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81与HCV之间的关系奠定了基础.湖南大学学报(自然科学版)2012年第8期朱海珍等：人膜蛋白CD81的原核表达与纯化5pET28b是一种常规的原核表达载体，含有T7启动子、乳糖操纵子和多克隆位点序列等基本功

5、能元件，在蛋白原核表达与纯化实验体系中应用广泛.在预实验中，将人cd81基因克隆到pET28b载体中尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达.pColdTF不仅有pET28b中的基本功能元件，还包含了冷休克表达系统和TF助溶蛋白，通过严格控制目的蛋白低温表达，以及TF的可溶性标记功能和分子伴侣作用，可以使一些表达困难的基因获得更高概率的可溶性表达.本课题改造pColdTF载体，在保留冷休克及融合表达系统的前提下，去除原载体上的HisTag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表达的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，获得不含助溶蛋白标签的

6、全长人CD81蛋白.1材料与方法3讨论pColdTF载体拥有冷休克表达系统和TF助溶蛋白，一些表达困难的基因在pColdTF中有更高概率的可溶性表达.但是目的基因在pCold5TF中表达得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白标签，标签的分子质量偏大，对目的蛋白结构及功能有较大的影响，而去除TF却不方便，因为融合蛋白表达的顺序为HisTag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白，利用蛋白酶对融合蛋白进行酶切后，目的蛋白将和HisTag、TF助溶蛋白分开成为两个蛋白片段，目的蛋白不含HisTag，不利于目的蛋白的再回收.本文对pColdTF载体进行改造，

7、使之不含HisTag序列，将目的基因克隆到该载体时，通过在目的基因3′端引物添加HisTag序列，其融合蛋白表达的顺序为TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白、HisTag，其中HisTag不仅可用于融合蛋白的纯化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的纯化，因为HisTag仍然保留在目的蛋白上，也可作为标签用于Westernblot中目的蛋白的检测，以及结合在NiNTA等载体上，用于进一步目的蛋白功能研究和特异性药物筛选等.通过对pColdTF载体序列中限制性酶切位点的分析，发现位于HisTag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是载