原核表达及纯化方法

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原核表达及纯化-Histag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mLLB培养基中（注意抗生素抗性）。37℃，过夜摇菌。2.次日，将菌液接种到1LLB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。根据这个结果选择纯化方法。（1）各用30μL4×SDSLoadingbuffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL1×BindingBuffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL4×SDSLoadingbuffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL4×SDSLoadingbuffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。（5）各取10μL用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。三、小量富集实验样品制备：7 取5mL诱导全菌，用500μL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。2.平衡：向离心管中加200μL1×BindingBuffer（8MUrea），混匀1min，700g离心1min，去上清；重复一次。3.上样：将制备的上清蛋白加到离心管中，混匀30min（混匀仪上）。700g离心1min，上清即为穿透（留样做SDS-PAGE）。4.淋洗：加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，5mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，10mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，20mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；5.洗脱：加50μL1×ElutionBuffer（8MUrea，50mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，3000mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；6.取少量柱料做SDS-PAGE；注：用定量工作液估计蛋白的浓度：2μL待测蛋白溶液+180μL定量工作液，根据颜色的变化可以估计蛋白的浓度。对富集过程进行监控。一、大量富集实验样品制备：用50mL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解菌体，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高压破碎仪（推荐）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：将1mLNi柱料装入层析柱，7 用至少三个柱体积的超纯水以工作流速（每滴/3S）压实柱料，以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。注：以下的层析操作流速不要超过装柱流速的1.75倍。1.柱平衡：三个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea）平衡柱料。注：柱子挂上镍离子后，可在Binging溶液中过夜，4℃。2.上样：视样品的多少可选用LOOP或由泵直接上样两种方式，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。3.淋洗：去除非特异结合的蛋白质，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。10个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea）；6个柱体积的WASHBuffer（分别是含有10mM咪唑，20mM咪唑的1×BindingBuffer（8MUrea））；注：也可以根据定量工作液错落估计蛋白的浓度，以确定每步的淋洗是否完全。4.洗脱：6个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea，50mM咪唑）；6个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea，100mM咪唑）；6个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea，300mM咪唑）；留样做SDS-PAGE；注：也可以不使用含100mM咪唑的洗脱液；至于每步用多少体积的洗脱液，可根据粗略定量而定；最好每管收集0.5mL富集的蛋白。一、SDS-PAGE检测：可溶性分析：Marker诱导前全菌空诱导后全菌空可溶性蛋白空包涵体蛋白空空纯化检测：Marker纯化前穿透10mM咪唑20mM咪唑50mM咪唑100mM咪唑300mM咪唑注：每个咪唑浓度均可以Loading7 多个样品，如果一块胶不够的的话可以考用用多个。一、Bradford定量根据蛋白的浓度和纯度，将相近的合并到一起。采用Bradford定量。1.启动VersaMicroplateReader,预热5-10分钟；2.在Eppendorf离心管中制备一系列浓度的BSA标准蛋白，较适的浓度范围为，0.1-1mg/ml，7到8个浓度；可配置5mg/ml的储液，用时稀释到0.2mg/ml。3．加入20ml标准蛋白至微板孔中，以水或相应的缓冲液为空白对照；4．加入20ml样品液，如果样品蛋白浓度较高，可考虑用样品缓冲液稀释，但是加入微板孔中的样品体积必须维持在20ml；5.加入180ml的过滤的Bradford定量工作液；1234567891011样品BSA0.2μg/μL00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0-012345678910-ddH2OμL1817161514131211109818Buffer(或样品)μL222222222222Bradford1801801801801801801801801801801801806.将微板置于VersaMicroplateReader；7.选择自动混合功能，震动一分钟；8.室温下静止5分钟；9．选择光吸收波长为595nm；10．按“Read”键,读取数据；11．输出数据，计算定量结果。7 注：1．该机器所读出的数据可通过及其自身的软件进行处理（请参见软件的说明），也可以直接paste数据至Excel中，再行处理；2．所配的标准蛋白也必须充分考虑到样品制备液对Bradford试剂的干扰。一般说来，标准蛋白储液可以样品制备液来稀释；3.所测的样品，无论是标准蛋白质还是样本，都必须平行测定至少两次。4.配置上述反应体系时，一定要认真细心，要尽量减小平行微孔的差别。七、溶液配制1、8×Binding溶液40mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.92、4×Elute溶液4M咪唑2MNaCl80mMTris-HClPh7.93、8×charge溶液4、8×Wash溶液160mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.95、4×strip溶液40mMEDTA2MNaCl80mMTris-HCl7 Ph7.9注：（1）如样品在变性状态下，则应在Binding，Elute，Wash溶液中加入4~8M的尿素。（2）PH的调节应在加完尿素和稀释完储液后调节。一、注意事项：（1）层析具体操作中各缓冲溶液的注入量以PH及电导基线基本不再变化为止。（2）所有的样品和溶液层析前，应脱气和过膜（0.45μm）。（3）当柱流速明显减低或层析介质被charge后不再变蓝时，需再生柱子。再生的方法：依次将以下的溶液按建议的体积数处理介质。两个柱体积的8Ｍ的尿素，两个柱体积的水，一个柱体积的２％　ＳＤＳ，一个柱体积25%的乙醇，一个柱体积50%的乙醇，一个柱体积75%乙醇，一个柱体积100%乙醇，一个柱体积75%乙醇，一个柱体积50%乙醇，一个柱体积25%乙醇，一个柱体积水，五个柱体积100mM的ＥＤＴＡ(PH=8.0)，三个柱体积水，三个柱体积20%的乙醇，储存于4℃。（4）加变性剂的Binding溶液应在平衡的最后步骤中使用，故应配两组Binding溶液，即8×且不含尿素和1×含尿素。（5）ＤＴＴ，ＢＭＥ，ＥＤＴＡ应避免在层析溶液中，因为ＤＴＴ，ＢＭＥ会与镍离子形成棕色沉淀，而ＥＤＴＡ会剥离镍离子。（6）为减少样品的粘度，可用Dnase处理（不用超声时），方法如下：在样品液中加入终浓度为10mMMgSO4，20μg／mlDnase室温放置20分。但此种处理方法会增加样品被蛋白酶水解的危险。（7）加入蛋白酶抑制0.2Ｍ的乙醇溶液，－20℃储藏。工作浓度为储液稀释200倍。（ＰＭＳＦ在水溶液中的半衰期短）。（8）Ｗash溶液的咪唑需调节，与组氨酸的长度有关。如六个组氨酸所需的淋洗浓度低于十个组氨酸所需的淋洗浓度。7 （9）变性蛋白质的一般复性方法。Ａ、透析既逐步降低变性剂的浓度；Ｂ、稀释法（10）可将变性剂直接加入到Binding，Washing,Elute溶液中，但需在加入变性剂后调节PH至所需的值。7