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1、丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎影响【摘要】目的探讨丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效。方法雄性SD大鼠36只随机分组,对照组、模型组及丹酚酸B治疗组各12只,对照组给予普通饲料,其余各组均给予高脂饲料。于12周处死模型组。治疗组每天以浓度为1mg/ml的丹酚酸B溶液20ml/kg灌胃,同时继续高脂饲料喂养,对照组以20ml/kg蒸馏水灌胃,同时继续普通饲料喂养。于实验第24周处死剩余实验动物。测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及肝组织丙二醛(MDA)含量,同时观察
2、肝组织病理学改变,免疫组化法检测肝组织TIMP�1的表达,RT�PCR法检测肝组织TGF�β1mRNA的表达。结果与正常对照组相比,模型组肝指数、血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA水平显著升高(P1�4肝脏生化指标测定在相同部位精确称取肝脏1�0g,加入预冷的生理盐水,在冰水中制成10%的均浆,4℃3000r/min离心156min,提取上清液,用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量(试剂盒购自南京建成生物工程研究所),所有操作均按产品说明书进行。�1�5组织病理学检测福尔马林固定肝标本,石蜡切片进行HE染色,在光镜下观察肝脂肪变
3、性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性判断标准:肝小叶未见脂滴肝细胞为阴性,脂滴肝细胞占肝细胞总数小于1/3为(+),1/3～2/3为(++),大于2/3为(+++),几乎均呈脂滴肝细胞为(++++)。炎症活动度计分标准参考Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数(HAI)进行计分,分为汇管区炎症(P),小叶内炎症(L),碎屑坏死(PN)及桥状坏死(BN,包括多小叶坏死)四项,每项依此计分为1、2、3、4分,因为BN、PN的严重程度与预后直接相关,故计分2倍于其他病变,计分公式为P+L+2(PN+BN)。�1�6免疫组织化学检测肝组织TI
4、MP�1的表达采用SP法作免疫组织化学染色,切片常规脱蜡、水化、抗原修复、脱水、透明、树胶封片。采用KL型免疫图象处理系统进行半定量指标判断:未见阳性细胞为(�),阳性细胞占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+),1/3～2/3为(++),2/3以上为(+++)。为保证实验结果的可靠性,特别是免疫组织化学的特异性,本实验采用省略一抗和二抗,用PBS代替一抗作阴性对照。�1�7RT�PCR法检测肝组织TGF�β1mRNA的表达采用美国GIBCO公司生产的一步法。�6总RNA提取试剂盒,TRIZOL试剂按说明书操作提取总RNA,PCR反应体
5、系内含cDNA2μl、10хbuffer5μl、4хdNTP(2mmol)2μl、TGF�β1、GAPDH引物各2μl,Taq酶1U,超重水补至20μl。TGF�β1上游引物5’CTTCAGCTCCACAGAGAACTGC3’,下游引物5’CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC3’,GAPDH上游引物5’CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG3’,下游引物5’CATGGTGGTGAAGACGCCAG3’。各取1μg总RNA抽取物加入此反应体系进行PCR循环,循环参数为:97℃2min、94℃30sec、56℃3
6、0sec、72℃50sec,50次循环。取PCR扩增产物10μl加入2%琼脂糖凝胶中在TAE缓冲液50V1h电泳,溴化乙锭显色成像定量分析,结果经计算机图像灰度扫描数字转换后进行统计学处理,以目的基因条带光密度值与内对照GAPDH条带光密度值的比表示目的基因相对表达量。�1�8统计学方法采用SPSS11�5统计软件分析,计量资料采用方差分析,等级资料采用秩和检验。�2结果�2�1生化指标的检测:与对照组相比,模型组血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA等显著增高,治疗组较模型组显著下降。见表1。�表1各组大鼠生化指标的检测结果(
7、x±s)6组别nALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)MDA(nmol/mg蛋白)对照组1242�50±5�58112�43±16�720�82±0�321�32±0�272�36±0�24模型组1272�48±8�32��a�215�53±29�83��a�1�36±0�44��a�2�15±0�42��a�4�82±0�57��a�治疗组1239�16±8�25��b�102�26±18�41��b�0�73±0�53��b�1�16±0�54��b�2�68±0�87��b�注:��a�模型组与
8、对照组比较,P值均丹酚酸B为丹参干燥根及根茎中提取的有效成分,是丹参水溶性成分中最重要的活性物质,具有很强的抗氧化作用。本研究表明丹酚酸B治疗组炎症活动度计分、MDA含量及TIMP�1和TGF�β�1mRNA的表达均显著
