聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎50例论文

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1、聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎50例论文.freelans;meningoencephalitis;polymerasechainreaction;Chineseinksmear;fungalcultureAbstract:AIMToevaluatetheclinicvalueofpolymerasechainreaction（PCR）inthediagnosisofcryptococcusneofor-mansmeningoencephalitis.METHODSPCR，Chineseinksmearandfungalcultureansincerebrosp

2、inalfluidof50patients.RESULTSAmongthecerebrospinalfluidofthe50cases.freeleardetection，and9casesbyfungalculture.CONCLU┐SIONAsaneethodofmolecularbiology，thePCRde-tectioncanbeusedinthequickdiagnosisofcryptococcusneo-formansmeningoencephalitisbycerebrospinalfluid.ThisPCR-baseddetectionandi

3、dentificationprovidesarapidlabo-ratorymethodforthediagnosisofcryptococcusneoformansmeningoencephalitisandshoin，弃上清，沉淀中加碱性裂解液（2mmolL-1NaOH，1gL-1吐温-20，1gL-1Teetin，7000g离心5min，取上清做模板.1.2.2PCR扩增反应总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，4×dNTP1.5μL，引物各0.25μL，无菌去离子水9.5μL，模板10μL，TaqDNA聚合酶IUμL-1，以无菌石蜡油30μL覆

4、盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，32个循环，最后72℃延伸5min.PCR扩增产物用2gL-1琼脂糖凝胶（含EB）电泳100V，30min，紫外灯下观察结果，出现特异性条带者为阳性.1.2.3直接涂片墨汁复染将脑脊液7000g离心5min，弃上清，取沉淀制片，滴加墨汁复染3～5min，显微镜观察.1.2.4真菌培养取脑脊液于沙氏肉汤中37℃（24h）增菌培养，转种于血液琼脂平板上37℃培养24h，待菌落生长后，然后进行涂片、生化鉴定.2结果本组50例患者临床最后诊断为新型隐球菌脑膜脑炎11例，结核性脑膜

5、炎15例，病毒性脑膜炎及其他24例.50例患者死亡2例，余48例经治疗临床症状均有不同程度的恢复.在50例脑脊液标本中检测新型隐球菌:应用PCR技术阳性11例22%（Fig1），直接涂片墨汁复染阳性7例14%（Fig2），真菌培养阳性9例（18%）.3种检测方法结果比较，无统计学差异.其临床符合率分别为:PCR技术90.9%，直接涂片墨汁复染63.3%、真菌培养81.8%;PCR的假阳性2.0%.11例PCR阳性标本中，包括7例直接涂片墨汁复染阳性和9例真菌培养阳性的标本，未见直接涂片墨汁复染和真菌培养阳性而PCR阴性者.图1－图2略3讨论近年来，由于大量抗生素、激

6、素或免疫抑制剂的应用，新型隐球菌在临床上的感染有明显增加的趋势.新型隐球菌感染一般为外源性，也有少部分为内源性.新型隐球菌感染发生时，病原体往往由肺部经血而进入中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜脑炎的发生.隐球菌性脑膜脑炎病情一般较严重，其临床表现与许多中枢神经系统感染性疾病特别是与结核性脑膜脑炎的临床表现十分相似，其误诊率甚至可高达50%以上.因此，隐球菌性脑膜脑炎患者往往被延误诊治，出现多种并发症与后遗症，甚至死亡.隐球菌性脑膜脑炎确诊的惟一依据是脑脊液的病原学检查，以往主要采用直接涂片墨汁染色或真菌培养法对脑脊液进行病原学检查.国内曾报道［4］隐球菌性脑膜脑炎患者

7、脑脊液直接涂片墨汁染色阳性率可达到54%～74%，真菌培养阳性率可达到95%，与本组病例中直接涂片墨汁复染准确率63.3%，真菌培养准确率81.8%的结果基本一致.但在临床实践中，直接涂片墨汁染色法虽然简便、快速，但阳性率低;而真菌培养虽然可以提高阳性率，但也存在培养时间长的缺陷.目前本病治疗效果欠佳、病死率较高很大程度上与不能及时、准确的诊断有关［5，6］.为此，快速、准确实验室诊断方法对诊断脑膜脑炎尤为重要.随着临床分子生物学技术的发展和应用，近年来PCR技术已经发展成为一种较为成熟、敏感的临床快速诊断方法［7］.应用PCR技术可以为感染疾病、遗传性疾病等的