聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎例_论文

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1、聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎50例作者：王津存　苏明权　王卫东　王洪典　夏峰　万琪【关键词】脑膜脑炎关键词:隐球菌，新型;脑膜脑炎;聚合酶链反应;墨汁复染;真菌培养摘要:目的探讨聚合酶链反应（PCR）在新型隐球菌脑膜脑炎快速诊断的临床价值.方法应用聚合酶链反应检测50例临床脑脊液标本中的新型隐球菌，同时用直接涂片墨汁复染、真菌培养进行对比检测.结果在50例患者临床脑脊液标本中，PCR检测阳性11例;直接涂片墨汁复染阳性7例阳性;真菌培养阳性9例.结论用PCR方法具有简便、快速、特异、敏感的特点，从脑脊液标本中直

2、接检测新型隐球菌，提供病原学诊断依据，对新型隐球菌脑膜脑炎的快速诊断具有重要的临床意义.Keywords:cryptococcusneoformans;meningoencephalitis;polymerasechainreaction;Chineseinksmear;fungalculture9/9Abstract:AIMToevaluatetheclinicvalueofpolymerasechainreaction（PCR），Chineseinksmearandfungalculturewereusedres

3、pectivelyinthedetec-tionofcryptococcusneoformansincerebrospinalfluidof50，11caseswerepositivebyPCR，7casesbyChineseinksmeardetection，┐SIONAsanewmethodofmolecularbiology，thePCRde-tectioncanbeusedinthequickdiagnosisoymethodforthediagnosisofcryptococcusneoformansmen

4、ingoencephalitisandshowsitspotentialvalueforclinicalapplications.0引言9/9隐球菌病是一种由新型隐球菌所引起的人兽共患性疾病，各种哺乳动物均可为该菌的常见宿主，病原菌是新型隐球菌，鸽子是人类的主要感染源，在人类感染中有嗜中枢神经系统的倾向.免疫机能正常（细胞免疫为主）可阻止发病.近年来由于抗生素和肾上腺皮质类固醇的广泛应用，新型隐球菌性脑膜脑炎的发病率呈逐年升高的趋势.目前对该病的诊断主要依据脑脊液直接涂片墨汁复染及真菌培养两种方法，但由于前者阳性率较

5、低，而后者所需时间较长，使得许多患者失去了抢救的机会.聚合酶链反应（PCR）诊断技术，由于具有操作简便、准确率高的特点，为快速诊断新型隐球菌脑膜炎提供了可能.本研究中，我们以新型隐球菌全基因序列选择高度特异的保守区基因为引物，采用PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌，并与直接涂片墨汁复染、真菌培养和结合临床诊断隐球菌性脑膜脑炎的方法进行比较，以探讨PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌在临床快速诊断隐球菌性脑膜脑炎中的价值和意义.1材料和方法材料9/9标本源脑脊液标本50例，均为临床疑诊为隐球菌脑膜脑炎的住院患者，

6、具有脑膜脑炎的症状、体征和脑脊液改变.其中男性33例，女性27例，年龄12～64（平均）岁.本组50例患者中有接触鸽子史者2例;有程度不等的头痛者48例，头疼多为持续性;有恶心、呕吐者44例，均为喷射性呕吐;低至中度发热者43例，高热者7例;神志障碍及精神症状者17例;癫痫发作者8例，病程中出现偏瘫者6例，巴彬斯基征阳性23例.所有患者查体均脑膜刺激征阳性，另45例患者眼底视乳头水肿.全部患者脑脊液压力均升高，脑脊液外观无色透明者23例，微混浊4例，白细胞数正常9例.头部CT检查示颅内片状低密度灶5例，侧脑室扩大16

7、例.新型隐球菌特异性引物序列的设计与合成［1］根据goldkeY数据库中新型隐球菌全基因序列分析，选取URA保守序列，扩增片段为:426bp，由上海生工生化工程公司合成.TaqDNA酶、4×dNTP购自华美生物工程公司;墨汁为优质印度墨汁;沙氏真菌培养基为西京医院检验科细菌室制备.方法脑脊液标本模板DNA的提取取脑脊液200μL，7000g离心5min，弃上清，沉淀中加碱性裂解液（2mmol・L-1NaOH，1g・L-1吐温-20，1g・L-1TeetwoX100，1g・L-1NP-40）98℃10min，7000g

8、离心5min，取上清做模板.9/9扩增反应总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液μL，4×μL，引物各μL，无菌去离子水μL，模板10μL，TaqDNA聚合酶IU・μL-1，以无菌石蜡油30μL覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，32个循环，最后72℃延伸扩增产物用2g・L-1琼脂