卵巢癌患者exosomes来源初探

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1、卵巢癌患者exosomes来源初探李奇灵孙阳珍于月成方静张媛丽辛晓燕【关键词】exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术　　parisonofextractionmethodsofexosomesfrompatientsethodsofexosomesfromtissueorascitesofanadvancedovariancancerpatient,todetecttheexpressionofexosomesoftes.METHODS:Thetissueofovariancancerthesamep

2、atient.Theexosomesthecellculturesupernatantandtheascitesandinedunderelectronmicroscope.HSP70,HSP90,MHCclassⅠmoleculeandMHCclassⅡmoleculeonexosomesesethod.RESULTS:Thetimeforthecentrifugationofascitesescouldbeobtainedfromallofthesupernatantsandtheascitestheas

3、citesesexpressedMHCclassⅠmolecule,HSP70andHSP90exceptMHCclassⅡmolecule.Theproteinconcentrationofexosomesintheascitesesfortheovariancancerpatientalignanteffusionescanbeextractedfromovariancancertissueforthepatientses;ascites;ovarianneoplasms;cellculturetechn

4、iques　　【摘要】目的：同一晚期卵巢癌患者，对组织来源和腹水来源的exosomes进行方法和数量的比较，探讨获得卵巢癌患者exosomes的最佳途径.方法：收集晚期卵巢癌患者卵巢癌组织，分离癌细胞进行培养，留上清液，取同一患者的腹水，通过超速离心和超滤等方法提取上清液及腹水中的exosomes,电镜下检测；HCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达；用BCA蛋白测定法测定exosomes的蛋白浓度,计算蛋白总含量.结果：腹水离心时间比上清液离心时间长，所有细胞培养上清液和癌细胞阳性的腹水均能分离出exosomes

5、，癌细胞阴性的腹水中未分离出exosomes；两种来源的exosomes共同表达MHCⅠ类分子、HSP70和HSP90，均不表达MHCⅡ类分子，腹水中分离出来的exosomes蛋白含量比细胞培养上清液的含量高（P0.05）.结论：腹水中癌细胞阳性的患者，腹水是exosomes的比较理想的来源；无腹水或腹水中癌细胞阴性的患者，exosomes可来源于卵巢癌组织.　　【关键词】exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术　　0引言　　exosomes是许多种细胞都能分泌的直径30～90nm的小囊泡，由蛋白质和脂

6、质组成的亚细胞器.近年来，癌症患者的肿瘤细胞和树突状细胞（dendriticcell,DC）分泌的exosomes，由于它携带所分泌细胞的一些抗原信息，被作为肿瘤特异性抗原的来源，用于恶性肿瘤免疫治疗〔1-2〕的研究.由DC分泌的exosomes已经在黑色素瘤和非小细胞肺癌进入了临床Ⅰ期试验〔3〕,但exosomes在卵巢癌中的研究进展较慢.本研究我们对晚期卵巢癌患者组织来源和腹水来源的exosomes分离方法、获得量比较，探讨卵巢癌患者最佳exosomes来源途径.　　1对象和方法　　1.1对象选择2005

7、01/200512在西安交通大学第一附属医院妇产科住院的原发性卵巢癌患者15例，年龄（53±6）岁.临床分期Ⅲ～Ⅳ期，均伴有腹水，腹水中查出癌细胞者10例(10/15)，腹水中癌细胞阴性者5例(5/15).取标本前未经化疗，均为第一次剖腹探查，术中无菌操作留取卵巢癌组织，术前或术中留取腹水.术后病理诊断，浆液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例.　　99.93%重水购自Sigma公司；RPMI1640培养液购自Gibco公司；Centriplus离心超滤管（100KDa）、AmiconUltra高回收率高流速切向流

8、超滤离心管（100KDa）购自美国Millipore公司；兔抗人热休克蛋白（HSP70）多克隆抗体、兔抗人HSP90多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；鼠抗人MHCⅠ类分子(HLAABC)mAb、鼠抗人MHCⅡ类分子（HLADR）mAb购自华美公司；I1640全培养液中，于37℃含50mL/LCO2细胞培养箱中常规培养，隔日传代,待细胞生长至对数期时，收集上清液.用25g/L胰酶消化收集细胞，用P